DE69937301T2

DE69937301T2 - Aminosterolderivate und ihre verwendungen

Info

Publication number: DE69937301T2
Application number: DE69937301T
Authority: DE
Inventors: Meena Monmouth Junction RAO; Binyamin Ambler FEIBUSH; William Newtown KINNEY; Michael Merion ZASLOFF; Lincoln Gilbertsville NOECKER
Original assignee: Genaera Corp
Current assignee: Genaera Corp
Priority date: 1998-08-12
Filing date: 1999-08-12
Publication date: 2008-08-14
Anticipated expiration: 2019-08-13
Also published as: EP1105407A2; WO2000009137A2; DE69937301D1; WO2000009137A3; CA2339174A1; JP2002522501A; US6388108B1; EP1105407B1; ATE375359T1; AU5557599A; CA2339174C; EP1105407A4; AU773038B2

Description

Bezugnahme auf verwandte Anmeldungen
Diese Anmeldung nimmt die Priorität nach 35 U.S.C. § 119(e) der vorläufigen US-Patentanmeldung Serien-Nr.: 60/096,337 in Anspruch, die am 12. August 1998 eingereicht wurde, welche hiermit in ihrer Gesamtheit durch Bezugnahme aufgenommen ist.
Hintergrund der Erfindung
Erfindungsgebiet
Die Erfindung betrifft neue isolierte Aminosterol-Verbindungen. Derartige Aminosterol-Verbindungen sind in einer Vielzahl pharmazeutischer Zusammensetzungen nützlich, wie auch in Verfahren zur Behandlung zahlreicher Erkrankungen wie beispielsweise einer mikrobiellen Infektion.
Beschreibung des verwandten Stands der Technik
über die letzten Jahre ist eine zunehmende Zahl niedrigmolekulargewichtiger Antibiotika aus diversen Arten von Wirbeltieren isoliert worden, wie beispielsweise Fröschen (Zasloff, 1987), Schweinen (Lee et al., 1989), Mäusen (Oullette et al., 1989) und Menschen (Jones et al., 1992). Diese antibiotischen Mittel, einschließlich Peptiden (Steiner et al., 1981; Ganz et al., 1985; Zasloff, 1987), Lipiden (Kabra et al., 1977; Bibel et al., 1989) und Alkaloiden (Daly et al., 1987; Preusser et al., 1975) spielen vermutlich eine Hauptrolle bei der Abwehr eines Wirts gegen Umweltmikroben.
Die Suche nach neuen Wirtsabwehrmitteln führte zur Entdeckung des Aminosterolsqualamins. Squalamin wurde aus dem Hundshai Squalus acanthias isoliert und zeigte sich als Breitbandantibiotikum wirksam. US-Patent 5,192,756 . Squalamin wies auch interessante antiangiogene und Anti-Tumoreigenschaften auf. Versuche eine große Menge an Squalamin zu isolieren, haben jetzt zur Entdeckung, Isolierung und Reinigung mehrerer neuer Aminosterol-Verbindungen geführt, die Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind.
US-A-5,763,430 (Zasloff, 9. Juni 1998) offenbart ein Verfahren zur Behandlung einer viralen Infektion durch die Verabreichung einer Steroid-Verbindung.
US-A-5,733,899 (Frye et al., 31. März 1998) offenbart ein Verfahren zur Behandlung einer Infektion zur Verwendung von auf einer Steroiden basierenden pharmazeutischen Zusammensetzung.
US-A-5,637,691 (Lech L. Frye et al., 10. Juni 1997) offenbart Steroid-Derivate, pharmazeutischen Zusammensetzungen die sie enthalten, und ihre Verwendung als Antibiotika oder Desinfektionsmittel.
US-A-5,192,756 (Zasloff et al., 9. März 1003) offenbart ein Aminosterolantibiotikum.
US-A-5,721,226 (Leh L. et al., 24. Februar 1998) offenbart ein Verfahren zur Inhibierung der Angiogenese unter Verwendung von Squalamin und Squalaminsteroid-Derivaten.
Zusammenfassung der Erfindung
Die Erfindung stellt neue isolierte Aminosterol-Verbindungen und pharmazeutisch annehmbare Salze davon bereit.
Die Erfindung stellt ferner pharmazeutische Zusammensetzungen bereit, die mindestens eine Aminosterol-Verbindung der Erfindung umfassen, oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon und einen pharmazeutisch annehmbaren Träger.
Die Anmeldung beschreibt ferner ein Verfahren zur Behandlung einer mikrobiellen Infektion, umfassend die Verabreichung einer therapeutisch wirksamen Menge mindestens einer Aminosterol-Verbindung der Erfindung oder eines pharmazeutisch annehmbaren Salzes davon.
Kurze Beschreibung der Figuren
1: Struktur der Aminsterol-Verbindungen (1)–(11).
2: Zusammensetzung der strukturellen Diversität innerhalb der Aminosterol-Verbindungen (1)–(11).
3: Allgemeines Numerierungsschema für Aminosterol-Verbindungen (1)–(11).
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Die Erfindung stellt neue isolierte Aminosterol-Verbindungen bereit. Die Struktur der Aminosterol-Verbindungen der Erfindung ist in 1 dargestellt. Wie in 2 dargestellt ist, hat jede der Aminosterol-Verbindungen der Erfindung einen Steroidkern, einen Polyaminrest, der an den Steroidkern gebunden ist und eine Cholestan-verwandte Seitenkette. Der Steroidkern einer Aminosterol-Verbindung der Erfindung hat eine trans-AB- Ringverbindung (Wehrli et al., 1993). Die C7- und/oder die C12-Position der Aminosterol-Verbindung der Erfindung (siehe 3 bezüglich der Numerierung der Aminosterol-Verbindungen) kann ferner durch eine Hydroxyl-Gruppe oder einen Carbonyl-Rest substituiert sein.
Die erfindungsgemäßen Aminosterol-Verbindungen sind an der C3-Position des Steroidkerns äquatorial mit einem Polyaminrest substituiert. Der Polyaminrest kann entweder ein Spermidinrest sein (d. h. -NH-(CH₂)₃-NH-(CH₂)₄-NH₂) oder ein Sperminrest -NH-(CH₂)₃-NH-(CH₂)₄-NH₂(CH₂)₂-NH₂). Wie in 1 dargestellt ist, enthalten die Aminosterol-Verbindungen (1)–(2) und (6) einen Spermidinrest an der C3-Position.
In einer bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsform können die Aminosterol-Verbindungen der Erfindung in isolierter oder gereinigter Form aus Geweben (z. B. Lebergewebe) des Hundhais, Squalus acanthias, gewonnen werden.
Isolierung
Frische zermahlene Leber des Hundshais Squalus acanthias wird mit ungefähr 12 wäßriger Essigsäure bei ungefähr 75°C für ungefähr eine Stunde behandelt. Als nächstes werden Ammoniumsulfat und ungefähr 95% Ethanol zugegeben, gefolgt von einer heftigen Durchmischung für ungefähr 5 Minuten. Der daraus resultierenden Suspension wird dann eine Phasentrennung ermöglicht, d. h. eine Trennung in eine organische Phase und eine wäßrige Phase für ungefähr 6 Tage ungefähr bei Umgebungstemperatur. Die wäßrige Phase wird dann abgetrennt und durch Seihtuch filtriert. Das Filtrat wird dann langsam mit XAD-16-Harz (kommerziell erhältlich von Supelco in Bellefonte, PA) für ungefähr 20 Stunden langsam gerührt. Das Harz wird dann eingesammelt, mit Wasser gewaschen und mit ungefähr 70% Ethanol 20 Minuten resuspendiert. Die Entfernung des Harzes läßt eine alkoholische Lösung zurück, die die Aminsterol-Verbindungen der Erfindung enthält.
Reinigung und Analyse
Die Alkohol-Lösung, die die Aminosterol-Verbindungen (1), (2) und (6) enthält, wie oben beschrieben wurde, wird dann durch einen 5 μm Polypure DCF-Filter (kommerziell erhältlich von Gelman Sciences in Ann Arbor, MI) filtriert. Das Filtrat wird dann auf eine Propylsulfonsäure-Säule geladen (kommerziell erhältlich von J. T. Baker in Phillipsburg, NJ). Die Säule wird dann mit 20% Isopropylalkohol gewaschen, bis die Ablesung der Adsorption von ungefähr 254 nm (A254) ein konstantes Niveau erreicht. Die Säule kann dann mit ungefähr 0,4 M Kaliumacetat in ungefähr 10% Isopropylalkohol gewaschen werden, bis der A254 wieder ein konstantes Niveau erreicht. Die Aminsterol-Verbindungen der Erfindung werden dann entweder mit 3,6 M oder ungefähr 4,5 M Kaliumacetat (ungefähr pH 4) in ungefähr 10% Isopropylalkohol von der Säule eluiert.
Die ungefähr 3,6 M- und ungefähr 4,5 M-Kaliumacetat-Eluate werden separat durch eine 0,2 μm-Sartopure-GF-Kapsel filtriert (kommerziell erhältlich von Sartorius in Edgewood, NY), verdünnt mit Wasser bis auf ungefähr 1,0 M Salzkonzentration und auf eine YMC-ODS-Säule (kommerziell erhältlich von YMC in Wilmington, NC). Zwei Puffer, Puffer A und Puffer B werden verwendet, um die Aminosterole der Erfindung von der Säule zu eluieren. Puffer A besteht aus ungefähr 0,1 Trifluoressigsäure in Wasser, während Puffer B aus ungefähr 0,1 Trifluoressigsäure in Acetonitril besteht. Die Säulen werden zuerst mit Puffer A gewaschen, und dann mit ungefähr 25% Puffer B-Lösung. Die erfindungsgemäßen Aminosterole werden dann unter Verwendung eines Gradienten aus ungefähr 25–34% Puffer B von der Säule eluiert, gefolgt von einem Gradienten von ungefähr 34–40% Puffer B.
Die eluierten Fraktionen in dem ungefähr 25–34% Puffer B-Gradientensystem und die Fraktionen, die mit dem ungefähr 34–40% Puffer B-Gradientensystem können dann auf eine zweite Propylsulfonsäure-Säule geladen werden. Die Propylsulfonsäure-Säule wird gewaschen und die Aminsterol-Verbindungen der Erfindung werden mit den ungefähr 3,6 M und ungefähr 4,5 M Kaliumacetat-Lösungen eluiert, wie oben beschrieben wurde. Die Eluate der ungefähr 3,6 M und ungefähr 4,5 M Kaliumacetat-Lösungen werden eingesammelt und mit Dünnschichtchromatographie und HPLC analysiert. Die Eluate können durch eine Spiralmembranpatrone mit einem 3-Kilo-Dalton-Cutoff (kommerziell erhältlich von Amicon of Woburn, MA) ultrafiltriert werden, um höhermolekulargewichtige restliche Pigmente und Proteine zu entfernen. Das erhaltene Permeat wird dann auf eine YMC-ODS-Säule oder Dynamax-Säule (kommerziell erhältlich von Ranin of Woburn, MA), geladen, mit Puffer A gewaschen, wie oben beschrieben wurde und mit einem geeigneten Gradienten aus Puffer B eluiert, wie oben beschrieben wurde. Die Eluate können weiter auf einer analytischen Umkehrphasen (RP)-Säule unter Verwendung einer Präsäulen-o-Phthalaldehyd-(OPA)-Derivatisierung analysiert werden und weiter auf Phenomenex Luna C18 gereinigt werden, Phenomenex Phenyl-Hexyl- oder Microsorb-C18-Säule (kommerziell erhältlich von Ranin of Woburn, MA).
Als Ergebnis einer derartigen Isolierung und Reinigung wird eine im wesentlichen homogene Zusammensetzung jeder Aminosterol-Verbindung der Erfindung, die hier beschrieben ist, hergestellt. "Im wesentlichen homogene Zusammensetzung" wird als eine Zusammensetzung definiert, die gleich oder größer als ungefähr 95% rein ist, ausschließlich der Salzgegenionen, wie durch Dünnschichtchromatographie, o-Phthalaldehyd-Analyse und NMR demonstriert wird. Aminosterol-Verbindung (1) kann aus Lebergewebe des gewöhnlichen Hundshais, Squalus acanthias, in Mengen von ungefähr 0,5–2,5 mg pro Kilogramm Lebergewebe isoliert und gereinigt werden und wird als "Hauptaminosterole" bezeichnet. Aminosterol-Verbindungen (2) und (6) können in Mengen von weniger als ungefähr 0,05 mg pro Kilogramm Lebergewebe isoliert und gereinigt werden und werden als "Minor Aminosterole" bezeichnet. Die Aminosterol-Verbindungen der Erfindung sind auf Grundlage der Reihenfolge ihrer Eluierung unter Hochleistungs-Flüssigchromatographie (HPLC)-Bedingungen, wie hier beschrieben wird als (1), (2) und (6) numeriert worden.
Analytische Daten
Die Hauptaminosterole
Die Struktur der Haupt-Aminosterole, d. h. Aminosterol-Verbindung (1) wurde unter Verwendung von Massenspektroskopie und zweidimensionaler Protonen-(¹H)-NMR- und Kohlenstoff-13-(¹³C)-NMR-Experimente, durch hetero-nukleäre chemische Shift-Korrelierungsspektren (HMQC), Protonen-Nachweis-Kohlenstoffprotonen-Mehrfachbindung-Korrelationsspektren (HMBC) und Phasesensitive korrelierte Spektroskopie (COSY) bestimmt. Die Ergebnisse wurden gegen ähnliche Daten von Squalamin für die Strukturbestimmung der Aminosterole verglichen. Die ¹H-NMR- und ¹³C-NMR-Daten der Hauptaminosterole werden in den Tabellen 1 bzw. 2 zusammengefaßt. Massenspektroskopiedaten der Aminsterol-Verbindungen der Erfindung sind in Tabelle 4 zusammengefaßt.
Wie in Tabelle 4 gezeigt ist, ergab die Aminosterol-Verbindung (1) eine positive Ionenmasse durch "fast atom bombardment-Massenspektroskoie (FAB)[M⁺H]⁺ bei m/z 665 und Fraktionion bei m/z 578 und m/z 546, welche den Verlust der α-Aminopropionsäure bzw. des Cysteins anzeigen. Aminosterol-Verbindung (1) ergab auch eine positive Ionenmasse durch Hochauflösungsmassenspektroskopie (HRMS) (FAB) [M⁺H]⁺ bei m/z 665,5043, was mit dem berechneten Wert von 665,5039 übereinstimmt.
Wie in Tabelle 1 gezeigt ist, wiesen die eindimensionalen ¹H-NMR-Daten der Aminosterol-Verbindungen (1) das charakteristische Erscheinungsbild eines Steroids auf, mit zwei Singuletts für die angulären Methyl- Gruppen an den C18- und C19-Positionen und zwei Dubletts für die Methyl-Gruppen an den C21- und C26-Positionen (siehe 3). Zusätzlich stellt die C25-Keto-Gruppe der Aminosterol-Verbindung (1) ein charakteristisches Multiplett zwischen δ 2,4–2,8 dar, was für zwei Protonen integriert wird, die als Methylenprotonen an der C23-Position identifiziert wurden. Aminsterol-Verbindung (1) weist auch ein Multiplett am α-Proton des Cysteins bei δ 3,96 auf. Der Spermidin-Rest an der C3-Position umfaßt typischerweise 9 Protonen, 8 Methylenprotonen direkt neben einer NH-Gruppe des Spermidins und das axiale C3-Proton. Bei der Aminosterol-Verbindung (1) überlappen die vier Methylprotonen an C27 und C28 neben dem Schwefelatom auch in diesem Bereich, zusätzlich zum CH-Proton an C25. Der Rest der Steroidprotonen, einschließlich des Wasserstoffs an der C7-Position bei δ 3,80 ist identisch mit Squalamin.
Die chemischen Verschiebungen im ¹³C-NMR der Aminosterol-Verbindung (1), welche in der Tabelle 2 zusammengefaßt ist, wurde unter Verwendung der Anzahl an Experimenten, die eine "Verzerrungsverstärkung durch Polarisierungsübertragung (DEPT-135), HMQC, HMBC und phasensensitive Doppelquanten-filtrierte korrelierte Spektroskopie (DQF COSY) und auch durch einen Vergleich mit Squalamin zugeordnet. HMBC long-range ¹H- und ¹³C-Verbindungen waren besonders wichtig, um die Strukturen der Aminosterol-Verbindungen der Erfindung zu bestätigen. In der Aminsterol-Verbindung (1), etablieren die folgenden Korrelationen, daß das Cystein-Schwefelatom mit dem C27 Kohlenstoff verbunden ist: C24 Carbonylkohlenstoff an δ 216,27 und das C26-Kohlenstoff an δ 17,14 stellen die Korrelationen der Protonen an der C27-Position bei δ 2,62 und δ 2,85 dar; das C27-Kohlenstoff an δ 35,49 durch S mit den Protonen an der C28-Position an δ 2,97 und δ 3,14; das C28-Kohlenstoff an δ 34,21 durch S, zu dem Proton an der C27-Position bei 82,62 und δ 2,85; das C29 Cystein-2-Kohlenstoff bei δ 54,47 zu den Protonen an der C28-Position bei δ 2,97 und δ 3,14.
Alle bis hier beschriebenen Aminosterole haben ein Spermidin, welches an der C3-Position in der äquatorialen Position substituiert ist, wie durch große diaxiale Verbindungskonstanten, die für das axiale Proton an der C3-Position bestätigt wurde, mit dem Axialproton an der C4-Position und der Axialposition an der C2-Position in einem Phasen-empfindlichen DQF COSY-Experiment beobachtet wurde. Es wird vermutet, daß, da alle Aminostyrole, einschließlich Squalamin, von der gleichen natürlichen Quelle stammen, das Spermidin am Steroidkern an dessen Dreier-Carbonende gebunden ist, wie für das Squalamin durch TOCSY (Gesamtkorrelationsspektroskopie)-Korrelation gezeigt wurde.
Die "Unter-Aminosterole"
Die Strukturen der Unter-Aminosterole, d. h. der Aminosterol-Verbindungen (2) und (6) wurden durch Massenspektroskopie und ¹H-NMR bestimmt. Die Ergebnisse, die jeweils in den Tabellen 3 bzw. 4 zusammengefaßt sind, wurden mit ähnlichen Daten für Squalamin verglichen.
Die Aminosterol-Verbindung (2) ist an der C25-Position der Cholestan-ähnlichen Seitenkette hydroxyliert. Die Aminosterol-Verbindung (2) ist an der C24-Position mit einer Keto-Gruppe substituiert. Die Massenspektrumsdaten der Aminosterol-Verbindung (2) zeigt nur eine einzelne Masse im positiven Modus (MALDI) [M⁺H]⁺ bei m/z 562,1 bzw. m/z 547,8. Die Aminosterol-Verbindung (2) zeigt auch eine positive Ionenmasse in der Hochauflösungsmassenspektroskopie (FAB) [M⁺H]⁺ bei m/z 562,4966. Dieser Wert ist mit dem berechneten Wert von 562,4947 in Übereinstimmung. Die ¹H-NMR-Spektren dieser Aminosterole identifizieren eindeutig den Steroidbereich, Singuletts für anguläre Methyl-Protonen an den C18- und C19-Positionen und einem Dublett der Methyl-Gruppe an der C21-Position. Die Isopropylprotonen erzeugen ein Singulett, welches 6 Protonen feldabwärts bei δ 1,28 der Aminosterol-Verbindung (2) einschließt, aufgrund der Substituierung an der C15-Position. Zusätzlich hat die Aminosterol-Verbindung (2) ein Multiplett, welches zwei Protonen bei δ 2,65 der Methylprotonen an der C23-Position einschließt, die typisch für 24 Ketoaminosterole ist. Das C7-Proton neben der Hydroxyl-Gruppe in diesen Aminosterolen ist ein Singulett bei δ 3,79 der Aminosterol-Verbindung (2), während die Polyaminregion an der C3-Position für Spermidin charakteristisch ist.
Die Minor-Aminosterol-Verbindung (6).

Eine eindimensionale ¹H-NMR kann die Aminsterol-Verbindung (6) leicht unterscheiden. Die angulären Methyl-Gruppen an den C18- und C19-Position sind Singuletts, während die an den C21- und C26-Positionen gut-getrennte Dubletts sind. Aminosterol-Verbindung (6) ist ein 24-Ketoaminosterol und, typisch für Ketoaminosterole, zeigen sich die Methyl-Protonen an der C23-Position bei δ 2,53. Das Proton an der C25-Position, welches in den meisten Kektoaminosterolen für gewöhnlich im Polyaminbereich versteckt ist, ist vom Polyaminbereich von Multiplett bei δ 2,78 getrennt, wie im Fall der Aminosterol-Verbindung (6). Die C27-Position der Aminosterol-Verbindung (6) ist hydroxyliert und daher sind die Protonen an der C27-Position diastereotop und teilen sich in ein Dublett aus Dubletts bei δ 3,55 und δ 3,68 auf. Zusätzlich zeigt die Aminosterol-Verbindung (6) ein (MALDI) [M⁺H]⁺ bei m/z von 562,1 auf. Aminosterol-Verbindung (6) zeigt auch eine positive Ionenmasse in der Hochauflösungsmassenspektroskopie (FAB) [M⁺H]⁺ bei m/z 562,4954, was mit dem berechneten Wert von 562,4948 übereinstimmt. Tabelle 1 Ausgewählte ¹H-NMR-Daten der Haupt-Aminosterol-Verbindung (1)

Position	Aminosterol (1)
1ax	1,12
1äq	1,86
2ax	1,56
2äq	1,96
3	3,13
4ax	1,43
4äq	1,81
5	1,74
6ax	1,53
6äq	1,45
7	3,80 (s)
8	1,44
9	1,23
11ax	1,35
11äq	1,54
12ax	1,13
12äq	1,98
14	143
15a, 15b	1,78, 1,14
16a, 16b	1,35, 1,89
17	1,14
18	0,70 (3, s)
19	0,86 (3, s)
20	1,43
21	0,94 (3, d)
22a, 22b	1,23, 1,70
23a, 23b	2,54, 2,54
24
25	2,89
26	1,15 (3, d)
27a, 27b	2,62, 2,85
28a, 28b	2,97, 3,14
29	3,96 (1, m)
30
31	3,15
32	2,11
33	3,15
34	3,08
35	1,80
36	1,75
37	2,98

Tabelle 2 Ausgewählte ¹³C-Daten der Aminsterol-Verbindung (1)

Position	Aminosterol (1)
1	37,72
2	26,03
3	59,03
4	32,16
5	38,66
6	27,72
7	68,39
8	41,05
9	46,90
10	36,79
11	22,14
12	40,99
13	43,83
14	51,78
15	24,58
16	29,31
17	57,63
18	12,42
19	11,54
20	36,86
21	19,11
22	30,82
23	40,12
24	216,27
25	47,53
26	17,14
27	35,49
28	34,21
29	54,47
30	171,69
31	46,03
32	24,58
33	42,91
34	48,94
35	24,36
36	25,70
37	40,12

Tabelle 3 Ausgewählte ¹H-NMR (400 MHz in CD₃OD)-Daten der Unter-Aminosterole (2), (6)

Position	(2)	(6)
7	3,79 (1, s)
18	0,69 (3, s)	0,69 (3, s)
19	0,85 (3, s)	0,86 (3, s)
21	0,94 (3, d)	0,93 (3, d)
23	2,85 (2, m)	2,53 (1, m)
24
25		2,78 (1, m)
26	1,28 (6, s)	1,01 (3, d)
27a		3,55 (1, dd)
27b		3,68 (1, dd)

Tabelle 4 Massenspektroskopiedaten der Aminosterol-Verbindungen (1), (2) und (6)

	Formel	MALDI M+1	MALDI M-1	FAB	HRMS	RT
1	C₃₇H₆₈N₄O₄S			665 (100%) 578 (38%) 546 (17%)	665,5043 (e) 665,5039 (c)	22,9
2	C₃₄H₆₃N₃O₃	562,1 (100%)			562,4966 (e) 582,4947 (c)	20,1

RT-OPA HPLC-Retentionszeit (Minuten).
(e) Experimenteller Wert, (c) berechneter Wert.
In einer weiteren bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsform können die Aminosterol-Verbindungen der Erfindung in isolierter oder gereinigter Form durch chemische Synthesemittel gewonnen werden. Die Aminosterol-Verbindungen der Erfindung können mit Hilfe irgendeines im Fachgebiet bekannten Weges synthetisiert und isoliert und dann gereinigt werden. US-Patente 5,637,691 , 5,721,226 , 5,733,899 , 5,763,430 , 5,792,635 , 5,795,885 , 5,840,740 , 5,840,936 , 5,847,172 , 5,856,535 und 5,874,597 und WO 94/19366 . Synthetisierte und isolierte oder gereinigte Derivate der Aminosterol-Verbindungen der Erfindung werden ebenfalls in Erwägung gezogen. Beispielsweise können die Aminosterol-Verbindungen synthetisiert werden, indem der Spermidinpolyamin-Rest an der C3-Position durch einen Sperminpolyamin-Rest ersetzt ist.
Erfindungsgemäß können pharmazeutisch annehmbare Salze jeder der Aminosterol-Verbindungen (1), (2) oder (6) oder Derivate davon, die jeweils oben beschrieben worden sind, durch irgendein bekanntes Mittel im Fachgebiet hergestellt werden. Solche Salze schließen, ein (sind aber nicht beschränkt auf) Natrium, Kalium, Ammonium, Chlorid, Trifluoracetat, Lactat und Acetatsalze.
Die Erfindung stellt auch eine pharmazeutische Zusammensetzung bereit, die mindestens eines der Aminosterole der Erfindung oder ein Derivat davon als Wirkstoff, der in einer therapeutisch wirksamen Menge vorhanden ist, und einen pharmazeutisch annehmbaren Träger umfaßt. Die Aminosterol-Verbindung oder das Derivat davon sind die oben beschriebenen, und der therapeutische annehmbare Träger kann irgendein Träger sein, der im Fachgebiet bekannt ist, vorzugsweise ein pharmazeutisch annehmbarer, nicht-toxischer steriler Träger, wie von Fachleuten auf dem Gebiet erkannt wird. Durch Fachleute auf dem Gebiet wird ebenfalls erkannt, daß "therapeutische wirksame Menge" von Fall zu Fall zu bestimmen ist. Faktoren, die in Betracht gezogen werden, schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf die zu behandelnde Störung und die physiologischen Eigenschaften des an der Erkrankung Leidenden. Demgemäß wird eine "therapeutisch wirksame Menge" am besten durch Routineexperimente bestimmt. Vorzugsweise enthält die erfindungsgemäße Zusammensetzung zwischen ungefähr 0,001 und ungefähr 5,0 Gew.%, vorzugsweise zwischen ungefähr 0,01 bis ungefähr 1,0 Gew.% einer Aminosterol-Verbindung der Erfindung. Eine erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung kann mit Mitteln, die im Fachgebiet bekannt sind, hergestellt werden.
Eine pharmazeutische Zusammensetzung der Erfindung kann beispielsweise fest sein (z. B. Pulver, Pille, Tablette), flüssig (z. B. Sirup. Elixier), beispielsweise eine Suspension oder Emulsion und kann für die systemische Verabreichung angepaßt sein. Andere Darreichungswege einer pharmazeutischen Zusammensetzung der Erfindung schließen, abhängig von dem Zustand der pharmazeutischen Zusammensetzung, bekannte Verfahren im Fachgebiet, wie beispielsweise (aber nicht beschränkt auf) die orale Verabreichung, die topische Anwendung, die parenterale, intravenöse, intranasale, intraokuläre, intrakranielle, die Ablagerung unter der Haut, intramuskuläre oder intraperitoneale Injektion ein. Vorzugsweise wird eine pharmazeutische Zusammensetzung der Erfindung als topische Formulierung verabreicht. Jede gewöhnliche topische Formulierung, wie beispielsweise eine Lösung, Suspension, ein Gel, eine Salbe oder eine Salve kann verwendet werden. Eine topische Formulierung einer erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzung kann auch als Pulver oder als Spray, insbesondere in Aerosolform verabreicht werden. Die Herstellung solcher topischer Formulierungen ist in dem Fachgebiet gut bekannt, wie in Remington's Pharmaceutical Sciences, 19. Ausgabe, Mack Publishing Company, 1995, beispielhaft angegeben wird.
Obwohl die Menge der pharmazeutischen Zusammensetzung, die systemisch verabreicht wird, von einer Fall-zu-Fall-Basis abhängt, wie oben beschrieben wurde, werden vorzugsweise zwischen ungefähr 0,01–100 mg/kg Körpergewicht pro Tag, mehr bevorzugt zwischen ungefähr 0,1–10 mg/kg Körpergewicht pro Tag verabreicht werden.
Erfindungsgemäß können einer pharmazeutischen Zusammensetzung der Erfindung zusätzliche therapeutische Mittel zugefügt werden, Das therapeutische Mittel kann jedes synthetische oder natürlich auftretende biologisch wirksame therapeutische Mittel sein, das in dem Fachgebiet bekannt ist. Beispiele geeigneter therapeutischer Mittel schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf Antibiotika, Steroide, genomische DNA, cDNA, mRNA, Antisense-Oligonukleotide, Plasmide, Peptide, Peptid-Fragmente, kleine Moleküle und andere biologisch wirksame Makromoleküle wie beispielsweise Proteine und Enzyme.
Die erfindungsgemäßen Aminosterol-Verbindungen weisen ein breites Spektrum antimikrobieller Wirkung oder eine starke antibiotische Wirkung gegen eine Vielzahl an Mikroorganismen oder Mikroben auf, einschließlich, aber nicht beschränkt auf Gram-positive und Gram-negative Bakterien, Pilze, Protozoen und ähnliche. Die Erfindung stellt ein Behandlungsverfahren oder die Kontrolle einer Infektion oder Kontaminierung durch derartige Mikroorganismen oder Mikroben bereit, welches die Verabreichung einer therapeutisch wirksamen Menge mindestens einer Aminosterol-Verbindung der Erfindung, eines Derivates davon, oder eines pharmazeutisch annehmbaren Salzes davon umfaßt, wie oben beschrieben wurde. Gemäß einem Verfahren der Erfindung wird ein Wirt oder ein Gewebe, das für eine mikrobielle Infektion anfällig ist oder davon befallen ist mit einer therapeutisch wirksamen Menge mindestens einer der Aminosterol-Verbindungen der Erfindung, deren Derivat oder deren pharmazeutisch annehmbaren Salz, wie oben beschrieben wurde, behandelt. Eine "therapeutisch wirksame Menge", wie oben beschrieben wurde, wird auf einer Grundlage von Fall zu Fall bestimmt, die auf Routineexperimenten beruht, wie Fachleuten auf dem Gebiet klar ist. Jedoch ist im allgemeinen eine "therapeutisch wirksame Menge", jede ausreichende Menge, um eine antimikrobielle oder antibiotische Wirkung in einen anfälligen oder befallenen Wirt oder Gewebe zu erzeugen. Alternativ dazu können die Aminosterol-Verbindungen der Erfindung aufgrund ihrer antibiotischen Eigenschaften auch als Konservierungsmittel oder als Sterilisierungsmittel für Materialien verwendet werden, die für eine mikrobielle Kontaminierung anfällig sind.
Die erfindungsgemäßen Aminosterol-Verbindungen, deren Derivate oder deren pharmazeutisch annehmbaren Salze, die jeweils oben beschrieben wurden, können auch andere Wirkungen aufweisen, einschließlich, aber nicht beschränkt auf, antiangiogene Wirkung, direkte Inhibierung des Wachstums zahlreicher Zelltypen, Appetitzügelung, Inhibierung einer Asthma-Reaktion, Inhibierung des Natrium/Portonen-Austauschers NHE3, und Lokalisierung bestimmter Zellarten und Gewebearten. Entsprechend können die Aminosterol-Verbindungen der Erfindung, deren Derivate oder deren pharmazeutisch annehmbaren Salz, die jeweils oben beschrieben wurden, in Verfahren zur: Inhibierung der angiogenen Wirkung (z. B. Inhibierung des Krebswachstums und der Metastasierung, der Inhibierung des Wachstums neuer Blutgefäße im Auge); die direkte Inhibierung des Wachstums von Zellen (z. B. Endothelzellen, Prostatatumorzellen (in Verbindung mit VEGF), und Melanomen); der Appetitzügelung, welche beispielsweise zu Gewichtsverlust und/oder Wachstumsverzögerung führt; der Inhibierung einer Asthmaantwort auf ein Allergen; der Inhibierung des Natrium/Protonen-Austausches NHE3; oder einer Zellart oder Gewebeartlokalisierung verwendet werden, vorzugsweise in einigen oder allen Fällen oder Geweben, der an der Steroidogenese oder am Steroidmetabolismus beteiligt sind. Es wird jedoch klar sein, daß die Erfindung nicht auf die spezifischen Bedingungen oder Details beschränkt ist, die in diesen Beispielen beschrieben sind.
Beispiel 1
Isolierung von Aminosterolen aus Hundshaileber.
20 kg frischgemahlener Hundshaileber wurden in 82 l 12%iger wäßriger Essigsäure bei 75°C für 1 Stunde suspendiert. 18 kg Ammoniumsulfat und 17 l 95% Ethanol wurden zugegeben, gefolgt von einer heftigen Durchmischung für 5 Minuten. Die Suspension wurde für 6 Tage bei Umgebungstemperatur einer Phasentrennung unterworfen. Die wäßrige Phase wurde dann abgetrennt und durch Seihtuch filtriert. Die kombinierten Filtrate von zwei derartigen Mengen wurden langsam mit 5 kg XAD-16-Harz gerührt (kommerziell erhältlich von Supelco in Bellefonte, PA) für 20 Stunden. Das Harz wurde eingesammelt, mit 10 l Wasser gewaschen und in 20 l 70% Ethanol für ungefähr 20 Minuten resuspendiert. Eine alkoholische Lösung, die die Aminosterole (1), (2) und (6) (siehe 1) enthält, wurde nach der Entfernung des Harzes gewonnen.
Die Alkohol-Lösungen aus 10 Haileberpräparaten wurden zusammengegeben (ungefähr 200 l) und weiter unter Verwendung eines 5 μm Polypure DCF-Filters filtriert (kommerziell erhältlich von Gelman Sciences in Ann Arbor, MI). Das Filtrat wurde auf eine 3 kg-Propylsulfonsäure-Säule (kommerziell erhältlich von J. T. Baker in Phillipsburg, NJ) geladen. Die Säule wurde mit 20 Isopropylalkohol gewaschen, bis die Adsorption bei 254 nm (A254) ein konstantes Niveau erreichte. Die Säule wurde mit 0,4 M Kaliumacetat in 10% Isopropylalkohol gewaschen, bis A254 wieder ein konstantes Niveau erreichte. Aminosterol-Verbindungen (1), (2) und (6) wurden nacheinander von der Säule eluiert, entweder mit 3,6 M oder 4,5 M Kaliumacetat (pH 4) in 10% Isopropylalkohol (15–30 l bis A254 konstant war). Die 3,6 M und 4,5 M Kaliumacetat-Eluate enthielten verschiedene Zusammensetzungen oder verschiedene Mischungen der Aminosterole.
Die 3,6 M und 4,5 M Kaliumacetat-Eluate wurden dann separat durch 0,2 μm Sartopure GF-Kapseln filtriert (kommerziell erhältlich von Sartorius in Edgewood, NY), mit Wasser auf 1,0 M Salzkonzentration verdünnt und auf einer 10 × 25 cm YMC-ODS-Säule geladen (kommerziell erhältlich von YMC in Wilmington, NC). Zwei Puffer wurden verwendet, um die Aminosterole von der Säule zu eluieren. Puffer A bestand aus 0,1% Trifluoressigsäure in Wasser, während Puffer B aus 0,1% Trifluoressigsäure in Acetonitril bestand. Die Säule wurde zuerst mit einer Fließrate von 470 ml pro Minute mit 40 l Puffer A gewaschen, dann mit 10 l 25% Puffer B. Aminosterole wurden dann von der Säule durch einen 13-minütigen Gradienten aus 25–34% Puffer B, gefolgt von einem 22-minütigem Gradienten aus 34–40% Puffer B eluiert. 5 l-Fraktionen wurden während der 25–34% Eluierung eingesammelt, gefolgt von den 235 ml-Fraktionen, während der 34–40% Eluierung. Die Nebenfraktionen, die weniger häufig Aminosterole enthalten, wurden zusammengegeben, gemäß ihrer aufeinanderfolgenden Elutionsreihenfolge.
Jeder der Pools aus Aminosterolen (ungefähr 35 l) wurde separat auf eine 700 ml-Propylsulfonsäure-Säule geladen. Die Säule wurde gewaschen und die Aminosterol-Verbindungen (1), (2) und (6) unter den gleichen Bedingungen, wie oben beschrieben wurde, eluiert. Die Eluate der 3,6 M und 4,5 M Kaliumacetat-Lösungen wurden in 2 l-Fraktionen gesammelt und durch Dünnschichtchromatographie und HPLC analysiert. Die Fraktionen, die eine ähnliche Zusammensetzung der Aminosterole enthalten, wurden kombiniert, während solche, die keine Aminosterole enthielten, verworfen wurden. Wenn eine kombinierte Mischung nicht klar war, wurde die Lösung durch eine Spiralmembranpatrone mit einem 3 kDa Cutoff ultrafiltriert (kommerziell erhältlich von Amicon in Woburn, MA), um höhermolekulargewichtige Reste, Pigmente und Proteine zu entfernen. Das Permeat wurde dann auf 1 × 25 cm YMC-ODS oder 4 × 25 cm Dynamax geladen (kommerziell erhältlich von Ranin in Woburn, MA) Säule, gewaschen mit Puffer A und eluiert mit einem geeigneten Gradienten aus Puffer B. Die Fraktionen wurden eingesammelt und mittels Dünnschichtchromatographie analysiert. Nach dem Dünnschichtchromatographieprofil wurde die Fraktionen weiter auf einer analytischen Umkehrphasen-(RP)-Säule unter Verwendung von O-Phthalaldehyd (OPA)-Derivatisierung vor der Benutzung der Säule analysiert. Reine Fraktionen wurden zusammengegeben, während solche, die eine weitere Reinigung benötigten, gereinigt wurden, indem optimierte chromatographische Bedingungen verwendet wurden. Die Endreinigungen wurden auf einer Phenomenex Luna C18, Phenomenexphenyl hexyl oder Microsorb C18-Säulen durchgeführt (kommerziell erhältlich von Ranin of Woburn, MA).
Beispiel 2
Antimikrobielle Wirkung der Aminosterole
Die Aminosterol-Verbindungen (1), (2) und (6) wurden in vitro gegen mehrere mikrobielle Organismen untersucht, um ihr Wirkspektrum zu testen. Die minimalen inhibitorischen Konzentrationen (MIC) für Bakterien und Hefen wurden durch Inkubieren von 0,9–1,1 e5 Kolonie-bildenden Einheiten pro Milliliter von Mikroben in der Log-Phase in 0,5% Tryptikase-Sojalösung mit ansteigenden Konzentrationen der Probe in 96-Well-Mikrotiterplatten (kommerziell erhältlich von Corning in Corning, NY) bei 37°C für 18 bis 24 Stunden bestimmt. Die minimale inhibitorische Konzentration (MIC) ist die niedrigste Konzentration einer Probe, bei der kein Wachstum beobachtet wurde. Eine Kontrollinkubation in Abwesenheit von Bakterien diente als Grundwert. Die ursprünglichen Probenkonzentrationen war 2 mg/ml in 250 mM Natriumacetat, pH 6,6. Die minimalen inhibitorischen Konzentrationen sind in Tabelle 5 zusammengefaßt. Tabelle 5 MIC-Werte für Aminosterol-Verbindun (1), (2) und (6)

Aminosterol S. aureus E. coli P. aeruginosa C. albicans

(1) 8–16 μg/ml 256 μg/ml 256 μg/ml 128 μg/ml

(2) 31 μg/ml 125 μg/ml >250 μg/ml

(6) 8 μg/ml 63 μg/ml >250 μg/ml
Während die Erfindung hier durch Bezugnahme auf zahlreiche spezifische Materialien, Verfahren und Beispiele beschrieben und dargestellt worden ist, ist klar, daß die Erfindung nicht auf die bestimmten Kombinationen aus Materialien und Verfahren beschränkt ist, die für diesen Zweck ausgewählt wurden. Zahlreiche Variierungen derartiger Details können in Erwägung gezogen werden und werden von Fachleuten auf dem Gebiet erkannt.
Referenzen

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Es ist klar daß die Diskussion und die Beispiele oben nur eine detaillierte Beschreibung einiger bevorzugter Ausführungsformen darstellen. Es ist für gewöhnliche Fachleute auf dem Gebiet klar, daß zahlreiche Modifikationen und Äquivalente durchgeführt werden können, ohne vom Geist und Schutzbereich der Erfindung abzuweichen.

Claims

Verbindung mit der folgenden Struktur:
oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon.
Verbindung mit der folgenden Struktur:
oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon.
Verbindung mit der folgenden Struktur:
oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon.
Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend mindestens eine Verbindung wie in einem der Ansprüche 1 bis 3 definiert, und einen pharmazeutisch annehmbaren Träger.
Verwendung einer therapeutisch wirksamen Menge mindestens einer Verbindung wie in einem der Ansprüche 1 bis 3 definiert, zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Behandlung einer mikrobiellen Infektion.