DE69218222T2

DE69218222T2 - Neue ganglioside-derivaten

Info

Publication number: DE69218222T2
Application number: DE69218222T
Authority: DE
Inventors: Alberta Leon; Aurelio Romeo; Gino Toffano
Original assignee: Fidia SpA
Current assignee: Fidia SpA
Priority date: 1991-08-01
Filing date: 1992-08-01
Publication date: 1997-10-09
Anticipated expiration: 2012-08-02
Also published as: PT100756A; EP0599908B1; PT100756B; ITPD910139A0; EP0599908A1; ITPD910139A1; ES2100360T3; WO1993003049A1; IT1253832B; JPH06509350A; ATE150028T1; DE69218222D1; US5350841A; AU2426592A

Description

HINTERGRUND UND GEBIET DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung betrifft bestimmte neuartige Gangliosid- Derivate, insbesondere Gangliosid-Derivate, die aus einem basischen natürlichen oder semisynthetischen Gangliosid bestehen, in dem die Carboxyl- Gruppe im Sialinsäureteil des natürlichen oder semisynthetischen Gangliosids in ein Carboxylamid mit einer aliphatischen Aminosäure mit einer Carbonsäure- oder Sulfonsäure-Funktion umgewandelt wird, und Salze davon. Die semisynthetischen Gangliosid-Bestandteile können aus der Gruppe gewählt sein, die aus N-Acyl-N-lyso-gangliosiden, N'Acyl-N'lyso-gangliosiden und N,N'Diacyl-N,N'di-lyso-gangliosiden besteht, wobei die N-Acyl- und N'Acyl- Gruppen identisch oder verschieden sind und jede eine Gruppe einer wahlweise substituierten aliphathischen Säure ist. Die vorliegende Erfindung betrifft auch pharmazeutische Präparate, die diese Verbindungen als Wirkstoff enthalten, und die therapeutische Verwendung der neuartigen Produkte und der entsprechenden pharmazeutischen Präparate.

Technischer Hintergrund

Einige Gangliosid-Amide sind bereits in der Literatur beschrieben worden, beispielsweise in dem am 15.12.1987 erteilten US-Patent 4,713,374. Ihre neuronotrophe Wirkung ist besser als die von Gangliosiden, was sich in einer längeren Aktivität zeigt. Aufgrund ihrer neuronotrophen Eigenschaften, wobei ihre Wirkung in einer Stimulierung der "Sprossung" von Nervenzellen und folglich einer Wiederherstellung der Nervenfunktion besteht, lassen sich diese Verbindungen sowie Ganglioside und ihre vorstehend erwähnten semisynthetischen Derivate bei verschiedenen Therapien zur Behandlung von Erkrankungen des Nervensystems, insbesondere des peripheren und zentralen Nervensystems, als Arzneimittel verwenden. Ihre Anwendung kann bei Krankheiten des peripheren Nervensystems empfohlen werden, die auf Trauma, Druck, Degeneration, den Stoffwechsel oder eine toxische Infektion zurückgehen, wobei eine Nervenregeneration und Wiederherstellung neuromuskulärer Funktionen stimuliert werden müssen, sowie bei Krankheiten des Zentralnervensystems, die auf Trauma, Anoxie, Degeneration oder eine toxische Infektion zurückgehen, wobei neuronale Prozesse zur funktionellen Wiederherstellung stimuliert werden müssen.
Es ist auch wohlbekannt, daß Ganglioside, beispielsweise das Gangliosid GM&sub1;, außerdem eine anti-neuronotoxische Aktivität besitzen, d.h. sie können eine durch exzitatorische Aminosäuren ((EAA) induzierte Neurotoxizität einschränken, die bei ausreichender Intensität zu einer schweren Schädigung des Zentralnervensystems führen kann (J. W. Olney, Excitotoxic amino acids and neuropsychiatric disorders, Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 30 (1990), 47-71). Eine akute Hirnschädigung kann verschiedene Ursachen haben, wobei das Ergebnis jedoch immer eine Neuronenschädigung mit dem nachfolgenden Tod einiger Neuronen ist, ganz gleich, was ihr Ursprung ist. Die geschädigten Neuronen können nicht nur während und/oder unmittelbar nach Schädigung absterben (primärer Neuronentod), sondern auch später (sekundärer Neuronentod).
Eine sekundäre Neurodegeneration wird durch die Übererregung von Rezeptoren exzitatorischer Aminosäuren vermittelt, deren Aktivierung eine Kaskade zellulärer Prozesse auslöst (Ca²&spplus;-abhängige Enzymaktivierung, Ca²&spplus;Fluß, Aktivierung sekundärer Botenstoffe, usw.), die zum Neuronentod führen. Die überlebenden Neuronen können neuroplastische Reparatur-Prozesse durchführen, die durch neuronotrophe Faktoren (NTF) reguliert werden. Dank ihres Doppelmechanismus (neuronotrophe und anti-neuronotoxische Wirkungen) können Ganglioside nicht nur langfristige degenerative Prozesse, wie die vorstehend erwähnten, praktisch einschränken, sondern auch die EAA- induzierte Neurotoxizität einschränken und/oder verhindern und deshalb eine aus diesen Krankheiten resultierende mögliche Schädigung bekämpfen.

KURZE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Die erfindungsgemäßen neuartigen Amide besitzen diese beiden Mechanismen in einer besonders vorteilhaften Weise, wo bei sie eine weit stärkere neuronotrophe Aktivität als Ganglioside und deren bekannte Ester oder Amide und eine antineuronotoxische Aktivität aufweisen, die die Aktivitäts-Obergrenze von Gangliosiden und ihrer funktionellen Derivate erreicht und übersteigt. Die neuartigen Verbindungen sind daher als Arzneimittel zur Behandlung der beschriebenen Krankheitszustände sehr geeignet.

GENAUE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

(Basische) Ausgangs-Gangliosidverbindungen zur Herstellung von erfindungsgemäßen Amiden können sein:
1) natürliche Ganglioside wie die, die durch Extraktion aus Geweben und Organen des Nervensystems gewonnen werden;
2) semisynthetische Gangliosid-Derivate, bei denen die Amino-Gruppen der Ceramid- und/oder Neuraminsäure-Teile natürlicher Ganglioside deacyliert und eine oder beide dieser Amino-Gruppen erneut mit Acyl-Einheiten aus reinen aliphatischen Säuren acyliert worden sind, die wie nachstehend erklärt wahlweise substituiert sind.
Gruppe 1) umfaßt die verschiedenen Produkte, die mittels Extraktion gewonnen werden und in der Literatur beschrieben sind, wobei diese Produkte im allgemeinen Gemische chemischer Verbindungen darstellen, insbesondere im Hinblick auf den Ceramid-Teil, der bekanntlich verschiedene höhere aliphatische Säuren umfaßt. Ausgangs-Ganglioside können daher diejenigen sein, bei denen das Oligosaccharid durch maximal 4 Hexose- oder N' Acetylhexosamin-Reste gebildet wird, wobei jedoch mindestens ein Hexose-Rest vorhanden ist, und bei denen diese Saccharid-Einheit chemisch einheitlich ist. Die Hexose-Reste werden vorzugsweise aus der Gruppe gewählt, die aus Glucose und Galactose gebildet wird, und die N-Acetylhexosamine aus der Gruppe, die aus N-Acetylglucosamin und N-Acetylgalactosamin gebildet wird. Die Anzahl der vorhandenen Sialinsäure-Gruppen kann 1, 2, 3, 4 oder 5 betragen, wobei die Sialinsäuren vorzugsweise N-Acetylneuraminsäure und N-Glycolylneuraminsäure sind. Die Sialinsäuren können an einer der in ihren Strukturen vorhandenen Hydroxyl-Gruppen acyliert sein, beispielsweise an der Hydroxyl-Gruppe an Position 8, wenn diese nicht bereits durch eine Ketose- Bindung besetzt ist, die sie an einen anderen Sialinsäure-Rest bindet. Die Ceramid-Einheit kann eine unterschiedlich lange Sphingosin- Kohlenstoffatomkette aufweisen, die 12 bis 22 Kohlenstoffatome enthalten kann, ebenso wie einen unterschiedlich langen Acyl-Rest, dessen Größe auch in diesem Bereich liegen kann. Abgesehen davon, kann der Ceramid-Rest aufgrund des Vorhandenseins oder Fehlens der Doppelbindung im Sphingosin unterschiedlich sein, wobei im allgemeinen dieser Rest hauptsächlich aus einem ungesättigten N-acylierten Sphingosin und einem geringen Prozentsatz der entsprechenden gesättigten Verbindung besteht. Eine besonders wichtige Gangliosid-Gruppe enthält im Ceramid-Rest Sphingosine mit Doppelbindung, die mit einer Kette von 18 oder 20 Kohlenstoffatomen acetyliert sind, und die entsprechenden gesättigten Verbindungen, wobei ihre gesättigte oder ungesättigte Acyl-Gruppe, die durch Hydroxyl-Gruppen substituiert ist oder nicht, auch die gleiche Anzahl von 18 oder 20 Kohlenstoffatomen besitzt.
Zu den Gangliosiden dieser Gruppe gehören beispielsweise die aus Vertebraten-Gehirnen extrahierten Ganglioside, wie die im Artikel "Gangliosides of the Nervous System" in "Glycolipid Methodology", Herausgeber Lioyd A. Witting, American Oil Chemists Society, Champaign, III (1976), 187, 214, beschriebenen (vgl. insbesondere Tafel 1), z.B. die Ganglioside GM&sub4;, GM&sub3;, GM&sub2;, GM&sub1;-Glc NAc, GD&sub2;, GD1a-GalNac, GT1c, GQ, GT&sub1; (Gruppe A) und insbesondere die folgenden Ganglioside (Gruppe B):
wobei Glc Glucose bedeutet, GalNAC N-Acetylgalactosamin, Gal Galactose und NANA N-Acetylneuraminsäure.
Zur besseren Veranschaulichung der Struktur der vorstehend beschriebenen Ganglioside, die im wesentlichen die gleiche ist wie für die erfindungsgemäßen Derivate, und insbesondere des Charakters der Bindungen zwischen den Saccharid-Einheiten, Sialinsäuren und Ceramiden, stellt die folgende Formel die vollständige Formel eines "reinen" Gangliosids GM&sub1; dar, das nur eine Sialinsäure (die N-Acetylneuraminsäure oder N-Glykolylneuraminsäure ist, d.h. Y = H bzw. OH) enthält. Ceramid Y=H oder OH
Zum Schutzumfang der vorliegenden Erfindung gehören Gemische neuartiger Gangliosid-Amide, insbesondere Gemische, die von Gangliosid- Gemischen abgeleitet sind, die in Extrakten aus verschiedenen tierischen Geweben, z.B. in "Gesamt"-Extrakten, oder in verschiedenen Fraktionen vorhanden sind, z.B. in den in der Literatur beschriebenen Fraktionen, wie in den vorstehend erwähnten Artikeln und auch in den Artikeln "Extraction and analysis of materials containing lipid bound sialic acid" im vorstehend erwähnten Journal (1976), Seiten 159-186, und in "Gangliosides of the Nervous System", gleiche Veröffentlichung, Seiten 187-214, sowie im Deutschen Patent 25 49 680. Zu den wichtigsten Gangliosid-Gemischen, die als Ausgangsprodukte zu verwenden sind, gehören Gangliosid-Extrakte, die aus dem Nervensystem, insbesondere aus dem Gehirn, gewonnen werden und die die bereits erwähnten Ganglioside GM&sub1;, GD1a, GD1b und GT1b enthalten. Die zur Herstellung des Gangliosid-Carboxylamids verwendeten natürlichen basischen Ganglioside werden vorzugsweise in gereinigter Form verwendet.
Semisynthetische Ganglioside der Gruppe 2 sind in der Literatur beschrieben, z.B. in den folgenden Europäischen Patentanmeldungen: "New Lysoganglioside Derivatives", Veröffentlichungsnummer 0373039, "Semisynthetic Analogues of Gangliosides", Veröffentlichungsnummer 0410881, und "New Di-lysoganglioside Derivatives", Veröffentlichungsnummer 0410883. Ihre Amide, die auch allgemein in diese Patenten einbezogen sind, besitzen pharmakologische Eigenschaften, die denen von Gangliosiden sowie ihren Amiden und Estern ähnlich sind.
Die vorliegende Erfindung betrifft jedoch eine bestimmte Auswahl von Amiden, die von aliphatischen Aminosäuren mit einer Carbonsäure- oder Sulfonsäure-Funktion dieser semisynthetischen Gangliosid-Analoge abgeleitet sind.
Wie vorstehend dargelegt, wird das semisynthetische basische Gangliosid aus der Gruppe gewählt, die aus N-Acyl-N-lyso-gangliosiden, N'Acyl-N'lyso- gangliosiden und N,N'Diacyl-N,N'di-lyso-gangliosiden besteht, in denen die N- - und N'Acyl-Gruppen identisch oder verschieden sind und jede ein Rest einer wahlweise substituierten aliphatischen Säure ist. Die wahlweise substituierte aliphatische Säure besitzt vorzugsweise 1 bis 24 Kohlenstoffatome und kann gesättigt oder ungesättigt sein.
Die als Ausgangsverbindungen verwendeten N-Acyl-N-lyso-ganglioside werden erhalten, indem zuerst natürliche oder gereinigte Ganglioside (der Gruppe 1) am Stickstoffatom der Sphingosin-Einheit deacyliert und danach die Verbindungen, die mit einem reaktiven Derivat einer aliphatischen Säure, vorzugsweise einer Säure mit 1 bis 24 Kohlenstoffatomen, gebildet wurden, erneut acyliert werden. Von besonderem Interesse sind die Verbindungen, die von höheren aliphatischen Säuren mit 12 bis 22 Kohlenstoffatomen, wie Palmitinsäure, Stearinsäure, Laurinsäure oder Myristinsäure, oder entsprechenden ungesättigten Säuren, wie Ölsäure oder Arachidonsäure, abgeleitet sind.
Eine andere besonders interessante Gruppe von Säuren wird von aliphatischen Säuren mit 2 bis 10 Kohlenstoffatomen gebildet, wie Essigsäure, Propionsäure, Buttersäure, Valeriansäure, Trimethylessigsäure, Oenanthsäure oder Capronsäure.
Alle diese Säuren können substituiert werden, vorzugsweise durch polare Einheiten, z.B. Halogenatome wie Chlor-, Brom- oder Fluoratome, Hydroxyl- Gruppen, die frei, verestert oder verethert sind, oder Amino-Gruppen, die frei oder mono- bzw. dialkyliert sind. Die Anzahl polarer Substituenten, falls diese vorhanden sind, an jeder Acyl-Gruppe beträgt 1 - 3, wobei 2 bevorzugt sind. Wenn mehr als ein polarer Substituent vorhanden ist, können sie identisch oder voneinander verschieden sein. Vorzugsweise sind sie identisch.
Es ist auch möglich, als Ausgangsmaterialien zur Herstellung der erfindungsgemäßen Amide N'Acyl-N;-lyso-ganglioside und N,N'Diacyl-N,N' di-lyso-ganglioside zu verwenden. N-Acyl-N-lyso-ganglioside, N'Acyl-N'lyso- ganglioside und N,N'Diacyl-N,N'di-lyso-ganglioside können beispielsweise, wie in den vorstehend erwähnten Europäischen Patentanmeldungen beschrieben, hergestellt werden. Vorzugsweise werden Gangliosid-Derivate mit Acyl-Gruppen verwendet, die von den vorstehend angebenen Säuren abgeleitet sind. Die vorstehend erwähnte Präferenz für Acyl-Gruppen gilt auch in den zuletzt erwähnten Fällen.
Interessante Ausgangsmaterialien sind
N-Lauroyl-N-lyso-GM&sub1;
N-Stearoyl-N-lyso-GM&sub1;
N-Oleyl-N-lyso-GM&sub1;
N-Palmitoyl-N-lyso-GM&sub1;
N-Acetyl-N-lyso-GM&sub1;
N-Propionyl-N-lyso-GM&sub1;
N-Butyryl-N-lyso-GM&sub1;
N-Valeroyl-N-lyso-GM&sub1;
N-Trimethylacetyl-N-lyso-GM&sub1;
N-Enantoyl-N-lyso-GM&sub1;
N-Caproyl-N-lyso-GM&sub1;
N-Dichloracetyl-N-lyso-GM&sub1;
N-Chloracetyl-N-lyso-GM&sub1;
N-3-Chlorpivaloyl-N-lyso-GM&sub1;
N-Hydroxyacetyl-N-lyso-GM&sub1;
N-Trifluoracetyl-N-lyso-GM&sub1;
N-Tribromacetyl-N-lyso-GM&sub1;
N-Mercaptoacetyl-N-lyso-GM&sub1;
N-Maleyl-N-lyso-GM&sub1;
N-12-Hydroxystearoyl-N-lyso-GM&sub1;
N-2-Hydroxybutyroyl-N-lyso-GM&sub1;
N-Fluoroacetyl-N-lyso-GM&sub1;
N-Difluoracetyl-N-lyso-GM&sub1;
N-3-Aminopropionyl-N-lyso-GM&sub1;
N-Cyanoacetyl-N-lyso-GM&sub1;
N-(3-Diethylaminopropionyl)-N-lyso-GM&sub1;
N-Aminoacetyl-N-lyso-GM&sub1;
N'Lauroyl-N'lyso-GM&sub1;
N'Stearoyl-N'lyso-GM&sub1;
N'Oleyl-N'lyso-GM&sub1;
N'Palmitoyl-N'lyso-GM&sub1;
N'Acetyl-N'lyso-GM&sub1;
N'Propionyl-N'lyso-GM&sub1;
N'Butyryl-N'lyso-GM&sub1;
N'Valeroyl-N'lyso-GM&sub1;
N'Trimethylacetyl-N'lyso-GM&sub1;
N'Enantoyl-N'lyso-GM&sub1;
N'Caproyl-N'lyso-GM&sub1;
N'Dichloracetyl-N'lyso-GM&sub1;
N'Chloracetyl-N'lyso-GM&sub1;
N'3-Chlorpivaloyl-N'lyso-GM&sub1;
N'Hydroxyacetyl-N'lyso-GM&sub1;
N'Trifluoracetyl-N'lyso-GM&sub1;
N'Tribromacetyl-N'lyso-GM&sub1;
N'Mercaptoacetyl-N'lyso-GM&sub1;
N'Maleyl-N'lyso-GM&sub1;
N'12-Hydroxystearoyl-N'lyso-GM&sub1;
N'2-Hydroxybutyroyl-N'lyso-GM&sub1;
N'Fluoracetyl-N'lyso-GM&sub1;
N'Difluoracetyl-N'lyso-GM&sub1;
N'3-Aminopropionyl-N'lyso-GM&sub1;
N'Cyanoacetyl-N'lyso-GM&sub1;
N'(3-Diethylaminopropionyl)-N'lyso-GM&sub1;
N'Aminoacetyl-N'lyso-GM&sub1;
N,N'Di-formyl-N,N'di-lyso-GM&sub1;
N,N'Di-acetyl-N,N'di-lyso-GM&sub1;
N,N-Di-propionyl-N,N'di-lyso-GM&sub1;
N,N-Di-butyryl-N,N'di-lyso-GM&sub1;
N,N'Di-pivaloyl-N,N'di-lyso-GM&sub1;
N,N'Di-valeryl-N,N'di-lyso-GM&sub1;
N,N'Di-octanoyl-N,N'di-lyso-GM&sub1;
N,N'Di-lauroyl-N,N'di-lyso-GM&sub1;
N,N'Di-2-propylpentanoyl-N,N'di-lyso-GM&sub1;
N,N'Di-hexanoyl-N,N'di-lyso-GM&sub1;
N,N'Di-isovaleryl-N,N'di-lyso-GM&sub1;
N,N'Di-enanthyl-N,N'di-lyso-GM&sub1;
N,N'Di-pelargonoyl-N,N'di-lyso-GM&sub1;
N,N'Di-tert-butylacetyl-N,N'di-lyso-GM&sub1;
N,N'Di-palmitoyl-N,N'di-lyso-GM&sub1;
N,N'Di-lauroyl-N,N'di-lyso-GM&sub1;
N,N'Di-stearoyl-N,N'di-lyso-GM&sub1;
N,N'Di-oleyl-N,N'di-lyso-GM&sub1;
N,N'Di-dichloracetyl-N,N'di-lyso-GM&sub1;
N,N'Di-monochloracetyl-N,N'di-lyso-GM&sub1;
N,N'Di-(3-chlorpivaloyl)-N,N'di-lyso-GM&sub1;
N,N'Di-monohydroxyacetyl-N,N'di-lyso-GM&sub1;
N,N'Di-trifluoracetyl-N,N'di-lyso-GM&sub1;
N,N'Di-trichloracetyl-N,N'di-lyso-GM&sub1;
N,N'Di-tribromacetyl-N,N'di-lyso-GM&sub1;
N,N'Di-monomercaptoacetyl-N,N'di-lyso-GM&sub1;
N,N'Di-maleyl-N,N'di-lyso-GM&sub1;
N,N'Di-(12-hydroxystearoyl)-N,N'di-lyso-GM&sub1;
N,N'Di-(2-hydroxybutyryl)-N,N'di-lyso-GM&sub1;
N,N'Di-monofluoracetyl-N,N'di-lyso-GM&sub1;
N,N'Di-difluoracetyl-N,N'di-lyso-GM&sub1;
N,N'Di-(3-aminopropionyl)-N,N'di-lyso-GM&sub1;
N,N'Di-cyanoacetyl-N,N'di-lyso-GM&sub1;
N,N'Di-(3-diethylaminopropionyl)-N,N'di-lyso-GM&sub1;
N,N'Di-aminoacetyl-N,N'di-lyso-GM&sub1;
N-Dichloracetyl-N'acetyl-N,N'di-lyso-GM&sub1;
N-Dichloracetyl-N'propionyl-N,N'di-lyso-GM&sub1;
N-Monochloracetyl-N'pivaloyl-N,N'di-lyso-GM&sub1;
N-Monohydroxyacetyl-N'acetyl-N,N'di-lyso-GM&sub1;
N-Cyanoacetyl-N'butyryl-N,N'di-lyso-GM&sub1;
N-Monofluoracetyl-N'palmitoyl-N,N'di-lyso-GM&sub1;
N-Mercaptoacetyl-N'pivaloyl-N,N'di-lyso-GM&sub1;
N-Trichloracetyl-N'formyl-N,N'di-lyso-GM&sub1;
N-3-Chlorpivaloy-N'2-propylpentanoyl-N,N'di-lyso-GM&sub1;
N-3-Aminopropionyl-N'oleyl-N,N'di-lyso-GM&sub1;
N-Aminoacetyl-N'tert-butylacetyl-N,N'di-lyso-GM&sub1; und die entsprechenden GM&sub2;-, GM&sub3;-, GD1a-, GD1b-, GD&sub2;-, GT&sub1;- und GT1b- Derivate.
Die erfindungsgemäßen neuartigen Gangliosid-Derivate enthalten entsprechend der im Gangliosid oder basischen semisynthetischen Derivat vorhandenen Anzahl von Sialinsäure-Resten eine oder mehrere Amid- Gruppen. Bei den Derivaten von Verbindungen mit Sialinsäure-Resten ist es auch möglich, partielle Amide herzustellen, d.h. Verbindungen, bei denen nicht alle Sialinsäure-Reste amidiert sind, wobei partiell amidierte Verbindungen auch einen Teil der Erfindung bilden.
Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung bedeutet eine aliphatische Aminosäure eine Verbindung, bei der sowohl die Säure-Gruppe als auch die Amino-Gruppe an einen aliphatischen Kohlenwasserstoff-Rest gebunden sind. Die Amino-Gruppe kann in bezug auf die Säure-Gruppe an jeder Position der aliphatischen Kette vorhanden sein, d.h. an den Positionen α, β, γ, δ, &epsi; bis ω und kann wie in Glycin primär oder wie in Prolin sekundär sein. Die eine Carboxyl-Gruppe enthaltenden Aminosäuren besitzen vorzugsweise maximal 22 Kohlenstoffatome und können durch andere Funktionen substituiert sein, insbesondere durch eine oder mehrere Hydroxyl-, Amino-, Mercapto-, Alkoxy- oder Alkylmercapto-Gruppen oder ein oder mehrere Halogenatome. Die Anzahl substituierender Funktionen beträgt vorzugsweise 1 - 3, wobei 1 besonders bevorzugt ist. Die substituierenden Funktionen sind vorzugsweise identisch, wenn es mehr als eine ist. Außerdem können sie in der aliphatischen Kette durch andere Kohlenwasserstoff-Einheiten, wie Aryl-, Cycloalkyl- oder heterozyklische Einheiten, substituiert oder unterbrochen sein.
Vorzugsweise werden natürlich vorkommende Aminosäuren der L-Form verwendet. Spezifische Beispiele von Aminosäuren sind α-Aminosäuren, wie Glycin, Alanin, Serin, Cystein, Cystin, Valin, Norvalin, Leucin, Isoleucin, Phenylalanin, Tyrosin, Dijodtyrosin, Tryptophan, Histidin, α-Aminobuttersäure, Methionin, Norleucin, Arginin, Ornithin, Lysin, Asparaginsäure, Asparagin, Glutaminsäure, Oxyglutaminsäure, Glutamin, Dioxyphenylalanin und Threonin sowie γ-Aminobuttersäure.
Die erfindungsgemäßen Carboxylamide können auch von Aminosäuren mit einer Sulfonsäure-Gruppe abgeleitet werden, d.h. die anstelle einer Carbonsäure-Gruppe eine Sulfonsäure-Gruppe enthalten. Diese Aminosäuren sind bekannt oder können auf eine bekannte Weise hergestellt werden. Vorzugsweise werden Aminosäuren mit einer Sulfonsäure-Gruppe verwendet, die den vorstehend erwähnten Aminosäuren mit einer Carboxyl-Gruppe ähnlich sind, beispielsweise die verschiedenen natürlichen L-Formen. Spezielle Beispiele sind Taurin, Cysteinsäure und Homocysteinsäure.
Bevorzugte erfindungsgemäße Verbindungen sind die Amide von Gangliosiden, die mit diesen natürlichen Aminosäuren hergestellt wurden, insbesondere Glycin, Alanin, Serin, Valin, Leucin, α-Amino- und γ- Aminobuttersäure, Glutaminsäure oder Asparaginsäure, wobei es sich um Ganglioside der Gruppe (B) handelt, insbesondere um das Gangliosid GM&sub1;, und ihre semisynthetischen Derivate, wie N-Acyl-N-lyso-gangliosid, N'Acyl-N' lyso-gangliosid und N,N'Diacyl-N,N'di-lyso-gangliosid, wobei die Acyl-Reste Einheiten von Säuren sind, die aus der aus Gruppe gewählt sind, die aus nichtsubstituierten niederen oder höheren aliphatischen Säuren mit 2 bis 22 Kohlenstoffatomen gebildet wird, insbesondere 2 - 8 und 9 - 22 Kohlenstoffatomen, bzw. aus entsprechenden Säuren mit einer Doppelbindung oder aus aliphatischen Säuren mit 2 bis 10 Kohlenstoffatomen, die nicht-substituiert, durch ein oder zwei Chlor-, Brom- oder Fluoratome, niedere Hydroxy- oder Alkoxy-Gruppen oder freie Amino-Gruppen substituiert oder mit niederen Kohlenwasserstoffen mit maximal 4 Kohlenstoffatomen mono- bzw. dialkyliert sind. Bevorzugte Gangliosid-Amide sind die Amide, die, wie vorstehend beschrieben, mit N-Acyl-N-lyso-gangliosiden, N'Acyl-N'lyso-gangliosiden und N,N'Di-acyl-N,N'di-lyso-gangliosiden als Ausgangsverbindungen hergestellt wurden, insbesondere mit N-Acyl-N-lyso-gangliosiden, N'Acyl-N' lyso-gangliosiden und N,N'Di-acyl-N,N'di-lyso-gangliosiden, bei denen in den ersten beiden erwähnten Ausgangsmaterialien die Acyl-Gruppe und im N,N' Diacyl-N,N-di-lyso-gangliosid mindestens eine der Acyl-Gruppen von Palmitinsäure, Stearinsäure, Laurinsäure, Myristinsäure oder einer entsprechenden ungesättigten Säure abgeleitet ist, wobei jede Verbindung vollständig oder partiell in ein Amid überführt wird und wobei die Amino- Gruppe von einer Aminosäure stammt, die aus der Gruppe gewählt ist, die aus Glycin, Alanin, Serin, Gystein, Cystin, Valin, Norvalin, Leucin, Isoleucin, Phenylalanin, Tyrosin, Dijodtyrosin, Tryptophan, Histidin, α- Aminobuttersäure, Methionin, Norleucin, Arginin, Ornithin, Lysin, Asparaginsäure, Asparagin, Glutaminsäure, Oxyglutaminsäure, Glutamin, Dioxyphenylalanin, Threonin, γ-Aminobuttersäure, Taurin, Cysteinsäure und Homocysteinsäure besteht.
Wie vorstehend dargelegt, besitzen die erfindungsgemäßen Amide, abgesehen von den für Gangliosiden charakteristischen antineuronotoxischen Eigenschaften, eine stärkere proneuronotrophe Wirkung, als sie meistens in Gangliosiden festzustellen ist. Diese doppelte Wirkung kann zur Therapie oder Prophylaxe der mit Neuronen-Tod und/oder akutem bzw. chronischem Neuronen-Mangel verbundenen vorstehend erwähnten Krankheiten verwendet werden, wo es erforderlich ist, neurodegenerative Phänomene zu hemmen und gleichzeitig die Neuronen-Plastizität weitestgehend zu fördern, um die Wiederherstellung beeinträchtigter neurologischer Funktionen zu erleichtern.
Durch die experimentelle und klinische Forschung ist die wichtige Rolle exzitatorischer Aminosäuren (EAA) wie Glutamat und Aspartat bei der Erregungsübertragung durch die Nerven des Wirbeltier-ZNS ausführlich gezeigt worden. Es wurde angnommen, daß EAA an der Entwicklung verschiedener physiologischer Prozesse, die sich aus der Nervenaktivität ableiten, wie Neuronen-Überleben, Verstärkung der Axonstruktur, Synaptogenese und Synapsen-Plastizität, beteiligt sind. EAA spielen auch bei dem Aufbau neuronaler Schaltungen und bei Lern- und Gedächtnis- Phänomenen eine grundlegende Rolle.
Es hat sich gezeigt, daß die physiologische Aktivität von Glutamat- Rezeptoren eine Reihe von Prozessen induziert, zu denen die Aktivierung "früher Gene" (wie der Proto-Oncogene C-fos und C-Jun) gehört, die ihrerseits einer Reihe neuroplastischer Prozesse vorangeht. Tatsächlich induziert der physiologisch durch Glutamat aktivierte Transduktions-Mechanismus eine Erhöhung der C-fos-mRNA-Menge und daher eine Anreicherung des entsprechenden codierten Proteins im Kern, was seinerseits die koordinierte Expression spezifischer mRNAs fördert, die Proteine codieren, die die mit einer physiologischen Stimulation des Glutamat-Rezeptors verbundenen Langzeit- Reaktionen wie die Neuronen-Plastizität vermitteln.
Es gibt Berichte mit immer mehr Beweisen, daß es bei Hirnleiden eine kontinuierliche paroxysmale Freisetzung von Glutamat gibt. An der Basis sekundärer Hirnschädigungen und im Bereich um Läsionen, die durch Sauerstoffmangel, Trauma oder Hypoglykämie verursacht werden, gibt es deshalb eine unkontrollierte Glutamat-Freisetzung und folglich eine langfristige "mißbräuchliche" Aktivierung der Rezeptoren exzitatorischer Aminosäuren.
Das führt zu einer kontinuierlichen Aktivierung des Calcium-Kanals, was eine Erhöhung der Ca&spplus;&spplus;-Konzentration im Cytoplasma und deshalb eine permanente Aktivierung von Proteinkinase C (PKC) zur Folge hat. Dadurch wird eine Kaskade von Ereignissen ausgelöst, die zur Aktivierung zellulärer Prozesse führt, die zwangsläufig im Neuronentod resultieren.
Angesichts dieser Tatsachen ist es erkennbar wichtig, nach neuen Arzneimitteln zu forschen, die neuronoplastische ("pro-neuronotrophe Aktivität") und neuronotoxische ("anti-neuronotoxische Aktivität") Mechanismen physiologisch beeinflussen können. In den letzten Jahren hat der neuronotoxische Aspekt durch eine neuartige pharmakologische Verfahrensweise zunehmend an Stichhaltigkeit gewonnen, die sich von anderen "unspezifischen" Therapien (z.B. isostere Antagonisten von Glutamat- Rezeptoren) unterscheidet, bei denen alle im Gehirn vorhandenen Glutamat- Rezeptoren unterschiedslos blockiert werden, wobei schwere Nebenwirkungen verursacht werden.
Im Gegensatz dazu umfaßt diese neuartige pharmakologische Verfahrensweise die Verwendung von Wirkstoffen, die nur dort wirken, wo es einen anhaltenden neurotoxischen Mechanismus gibt. Diese Klasse von Wirkstoffen, die als "RADA" ("Receptor Abuse-Dependent Antagonists") bezeichnet wird, wirkt den pathologischen Wirkungen einer paroxysmalen und kontinuierlichen (mißbräuchlichen) Stimulation von Rezeptoren exzitatorischer Aminosäuren entgegen. Ganglioside gehören zu dieser als RADA bekannten Wirkstoff-Klasse.
Im Hinblick auf die vorstehend erwähnte Schutzwirkung gegen eine Glutamat-induzierte Neurotoxizität ist berichtet worden, daß eine Vorbehandlung mit natürlichen Glycosphingolipiden (Favaron, M., et al., Gangliosides prevent glutamate and kainate neurotoxicity in primary neuronal cultures of neonatal rat cerebellum and cortex, Proc. Natl. Acad. Sci. 85 (1988), 7351-7355) sowohl unter normalen als auch unter Sauerstoffmangel- Bedingungen das aus einer längeren mißbräuchlichen Aktivierung von EAA- Rezeptoren resultierende Neuronen-Absterben vermindert (Facci, L., et al., Monosialoganglioside protects against anoxic and kainic-acid-induced neuronal death in vitro, J. Neuroch. Bd. 52 (Ergänzungsband) S (1989), 183). Es ist auch berichtet worden, daß für die Stärke und Wirksamkeit dieser Sphingolipide bei der Verhinderung des durch Glutamat induzierten Neuronenabsterbens und der PKC-Hemmung strukturelle Veränderungen in Gangliosid-Molekülen, wie die Anzahl von Sialinsäure-Resten und/oder Substitution in der basischen Sphingolipid-Struktur, entscheidend sind (Costa, E, et al., Signal transduction at excitatory amino acid receptors: modulation by gangliosides, Neurology and Neurobiology 46 (1988), 29-38). Es sollte erwähnt werden, daß diese Wirkungen von Gangliosiden nicht durch eine Hemmung der Rezeptor-Funktion herbeigeführt werden, sondern durch ihre gegen die Folgen einer mißbräuchlichen Stimulation von Glutamat-Rezeptoren (d.h. längerzeitige hohe Ca&spplus;&spplus;-Mengen im Cytosol und andauernde PKC-Aktivierung) gerichtete Aktivität. Es handelt sich deshalb um eine RADA-Wirkung, da die Blockierung der durch Glutamat verursachten Neurotoxizität nach der "paroxysmalen Aktivierung" des Rezeptors erfolgt, wobei die Wirkungen davon verhindert werden, ohne daß die Physiologie der Synapsen-Übertragung durch Glutamat verändert wird.
Bei den bisher durchgeführten Untersuchungen ist kein Zusammenhang zwischen der anti-neuronotoxischen Wirkung von Gangliosiden und Veränderungen von C-fos festgestellt worden, dem Gen, dessen Aktivierung (wie vorstehend zitiert) einer Reihe neuronoplastischer Ereignisse vorangeht.
Abgesehen von den für Ganglioside charakteristischen anti-neuronotoxischen Eigenschaften besitzen die erfindungsgemäßen Amide eine deutliche proneuronotrophe Wirkung, die größer als die von Gangliosiden ist. Die vorstehend beschriebenen Wirkungen der erfindungsgemäßen neuartigen Produkte lassen sich durch die folgenden Experimente zeigen, die mit einem typischen erfindungsgemäßen Produkt, dem nachstehend als AGF&sub1;&sub1;&sub8; bezeichneten Glycinamid des Gangliosids GM&sub1;, durchgeführt wurden. Insbesondere wurden die folgenden in vitro-Experimente durchgeführt:
1. proneuronotrophe Wirkung in Kulturen von Kleinhirnkörnerzellen: Gehalt an C-fos-mRNA und C-Jun-mRNA nach Glutamat-induzierter Stimulation
2. Schutzwirkung auf die von endogenem Glutamat induzierte Neurotoxizität.
Die so bestimmten Wirkungen sind mit den entsprechenden Wirkungen vergleichbar, die mit Gangliosid GM&sub1; oder mit GM&sub1; und seinen Estern bzw. Amiden erhalten wurden.
1. Proneuronotrophe Wirkung von AGF&sub1;&sub1;&sub8; (gegenüber GM&sub1;) in Kleinhirnkörnerzell-Kulturen: Gehalt an C-fos-mRNA und C-Jun-mRNA nach Glutamat-induzierter Stimulation.

Ziel

Die vorliegenden Experimente zielten darauf ab, in einem Modell für die physiologische Aktivierung des Glutamat-Rezeptors die proneuronotrophe Aktivität des Glycinamid-Derivats von GM&sub1; im Vergleich zu der des GM&sub1;- Vorläufers zu bestimmen. Die proneuronotrophe Aktivität wurde als Erhöhung der Proto-Oncogene C-fos und C-Jun (bestimmt als Gehalt der jeweiligen mRNA) bestimmt. In der Literatur ist beschrieben, daß die physiologische Aktivierung der Glutamat-Rezeptoren eine Reihe von Prozessen einschließlich der Aktivierung des C-fos-Proto-Oncogens induziert, die ihrerseits einer Reihe neuroplastischer Prozesse (einschließlich der Synthese spezifischer Proteine mit neuronotropher Aktivität) vorangeht. Es ist auch berichtet worden, daß unter den Bedingungen einer längeren Stimulation des Glutamat-Rezeptors die antineuronotoxische Aktivität von Gangliosiden (GT1b) nicht mit C-fos- Veränderungen zusammenhängt (Favaron, M., et al., Gangliosides prevent glutamate und kainate neurotoxicity in primary neuronal cultures of neonatal rat cerebellum and cortex, Proc. Natl. Acad. Sci. 85 (1988), 7351-7355).

MATERIALIEN UND VERFAHREN

Zellkulturen

Von 8 Tage alten Sprague-Dawley-Ratten wurden Primärkulturen von Kleinhirnkörnerzellen hergestellt (Gallo, V., et al., Selective release of glutamate from cerebellar granule cells differentiating in culture, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79 (1982), 7919-7923).
Die Kulturen wurden in 35 mm-Schalen in Gegenwart eines spezifischen Kulturmediums 7 - 8 Tage bei 37ºC bei feuchten Bedingungen (95% Luft und 5% CO&sub2;) gezüchtet. Zu diesem Zeitpunkt bestanden die Zellen hauptsächlich aus Körnerzellen (< 95%) und zu einem geringen Prozentsatz aus Glia-Zellen (< 5%) (Alho, H., et al., Subset of Gabaergic neurons in dissociated cell cultures of neonatal rat cerebral cortex show colocalization with specific modulator peptides, Dev. Brain Res. 39 (1988), 193-204). Die Proliferation von Glia-Zellen wurde mit Cytosinarabinofuranosid verhindert.

Testprodukte (Solubilisierung und Konzentrationen)

Es wurden die folgenden Produkte getestet:
- Monosialogangliosid GM&sub1; (GM&sub1;)
- Glycinamid von GM&sub1; (AGF&sub1;&sub1;&sub8;)
Die Ganglioside (10&supmin;&sup4; M) wurden unter einem Stickstoffstrom in Methanol/H&sub2;O (95:5) verdünnt und ein geeignetes Volumen von Locke-Lösung wurde zugegeben, wobei die Endkonzentration eingestellt wurde.

Behandlung mit Glutamat (+ PCP) und Testprodukten (AGF&sub1;&sub1;&sub8;-GM&sub1;)

Die Zellkulturen (an den Tagen 7 - 8) wurden in Gegenwart der Testprodukte (AGF&sub1;&sub1;&sub8;-GM&sub1;) inkubiert (2 h bei 37º0).
Die Kulturen wurden dann 3mal mit Locke-Lösung (1 ml) ohne Magnesium gewaschen und danach 30 Minuten mit Glutamat (10 µM) inkubiert. Nach Inkubation mit Glutamat und mit oder ohne Phencyclidin (PCP, 1 µM) wurden die einzelligen Schichten mit Locke-Lösung (3mal) gewaschen, es wurde ein spezifisches konditioniertes Kulturmedium zugegeben und die Zellen wurden 24 h unter feuchten Bedingungen inkubiert (wie vorstehend beschrieben).

RNA-Extraktion und Northern-Blot-Analyse

Es wurden die von Szekely et al. beschriebenen Verfahren (Szekely, A. M., et al., Activation of specific glutamate receptor subtypes increases C-fos protooncogene expression in primary cultures of neonatal rat cerebellar granule cells, Neuropharmacology Bd. 26, Nr.12 (1987), 1779-1782) verwendet. Kurz zusammengefaßt, wurden die Zellen (2 x 10&sup8;/Probe) gesammelt und die Gesamt- RNA wurde mittels Ultrazentrifugation unter Verwendung eines Cäsiumchlorid/Isothiocyanatoguanidin-Gradienten isoliert.
Poly(A&spplus;)-RNA wurde mittels Chromatographie mit Oligo(dT)-Cellulose isoliert, in 1,1%-iger Agarose in 2,2 M Formaldehyd fraktioniert und danach auf Nitrocellulose (in 20 x SSC) übertragen. Nach 2-stündigem Erhitzen bei 80ºC wurden die Filter 2 - 5 h bei 42ºC vorhybridisiert. Es wurde das 1,2 kb große Sau I-Fragment verwendet, das das Exon 4 des Maus-C-fos-Gens codiert und, wie bereits beschrieben (Curran, R., et al., Structure of the FBJ murine osteosarcoma virus genome: molecular doning of its associated helper virus and the cellular homolog of the v-fos gene from mouse and human cells, Mol. Cell. Biol. 3 (1983), 914-921), von einem C-fos-Clon erhalten wurde. Die spezifische Aktivität der translatierten Sondenfraktion (mit ³²P markiert) lag bei 5 x 10&sup8; bis 10&sup9; CpM/µg. Die C-fos-mRNA-Menge in den verschiedenen Proben wurde mittels Laser-Densitometrie mit einer LKB-2002-Ultrascan- Vorrichtung gemessen und in bezug auf Unterschiede in der auf das Gel aufgetragenen Poly(A&spplus;)-RNA-Menge korrigiert, wobei als Referenzstandard die Hybridisierung einer cDNA-Sonde für das beta-Actin-Strukturprotein verwendet wurde. Die Hybridisierung wurde 16 - 20 h bei 42ºC unter spezifischen Bedingungen durchgeführt. Danach wurden die Filter für die C- fos- und beta-Actin-spezifischen Sonden gewaschen und einem Kodak-x-Omat- Film bei einer Verstärkung ausgesetzt, wobei die Verstärkung bei -70ºC wirkt (discriminates).
Der durch die Blot-Analyse gezeigte Gehalt an C-fos-mRNA wurde in subjektiv festgelegten Einheiten angegeben, wobei 1 Einheit definiert wurde als der Bereich des densitometrischen Peaks der C-fos-mRNA-Hybridisierung, dividiert durch den entsprechenden Bereich des densitometrischen Peaks der Hybridisierung der beta-Actin-mRNA (als Referenzstandard verwendet).
Zur Bestimmung des entsprechenden C-Jun-mRNA-Gehalts wurde nach einem ähnlichen Verfahren gearbeitet.

ERGEBNISSE

Die erhaltenen Ergebnisse zeigen eine deutliche Wirkung von AGF&sub1;&sub1;&sub8; sowohl auf den C-fos-mRNA-Gehalt als auch auf den C-Jun-mRNA-Gehalt (im Gegensatz zu der geringen Stimulation, die durch GM&sub1; induziert wurde). Die auf den C-fos-mRNA-Gehalt (Tabelle 1) und den C-Jun-mRNA-Gehalt (Tabelle 2) bezogenen Daten zeigen insbesondere, daß:
- Glutamat bei beiden Genen einen erhöhten mRNA-Gehalt induziert
- eine Vorinkubation mit GM&sub1;(10&supmin;&sup4; M, 2 h) die Wirkung von Glutamat nicht wesentlich beeinflußt (der Gehalt an C-fos-mRNA und C-Jun-mRNA ist in Gegenwart von GM&sub1; nur etwas höher)
- eine Vorinkubation mit AGF&sub1;&sub1;&sub8; (10&supmin;&sup4; M, 2 h) die durch Glutamat stimulierte Erhöhung der C-fos- und C-Jun-mRNA-Mengen beträchtlich verstärkt.
Diese Beobachtungen zeigen daher eine interessante proneuronotrophe Wirkung von AGF&sub1;&sub1;&sub8;, die beträchtlich größer ist als die von GM&sub1;. Tabelle 1: Wirkung von AGF&sub1;&sub1;&sub8; und GM&sub1; auf den Gehalt an C-fos-mRNA, die durch physiologische Stimulation des Glutamat-Rezeptors in Kleinhirnzellkulturen induziert wird
* Die Testprodukte wurden bei einer Konzentration von 10&supmin;&sup4; M getestet (2-stündige Vorinkubation).
* * Bestimmung nach Stimulation mit Glutamat (10 µM, 30 min) + PCP (1 µM, 30 min). Die Daten sind Durchschnittswerte von 4 Wiederholungen pro Probe. Tabelle 2: Wirkung von AGF&sub1;&sub1;&sub8; und GM&sub1; auf den Gehalt an C-Jun-mRNA, die durch physiologische Stimulation des Glutamat-Rezeptors in Kleinhirnzellkulturen induziert wird
* Die Testprodukte wurden bei einer Konzentration von 10&supmin;&sup4; M getestet (2-stündige Vorinkubation).
* * Bestimmung nach Stimulation mit Glutamat (10 µM, 30 min) + PCP (1 µM, 30 min). Die Daten sind Durchschnittswerte von 4 Wiederholungen pro Probe.
2. Schutzwirkung von AGF&sub1;&sub1;&sub8; (im Vergleich zu GM&sub1;, GM&sub1;-Amiden und GM&sub1;- Estern) auf die durch endogenes Glutamat induzierte Neurotoxizität Ziel:
Die vorliegenden Experimente zielten darauf ab, die Schutzwirkung des Glycinamid-Derivats von GM&sub1; auf die durch endogenes Glutamat induzierte Neurotoxizität zu bestimmen.
In einem Modellsystem für eine durch Blutzuckerverminderung verursachte Neurotoxizität (Facci, L., et al., Hypoglycemic neurotoxicity in vitro: involvement of excitatory amino acid receptors and attenuation by monosialoganglioside GM&sub1;, Neuroscience (1990), im Druck) wurde eine vergleichende Untersuchung mit dem Vorläufer-Gangliosid GM&sub1; und anderen Amid- und Ester-Derivaten von GM&sub1; (bekannten Produkten, die bereits in dem am 15. Dezember 1987 erteilten US-Patent 4,713,374 beschrieben sind) durchgeführt.

MATERIALIEN UND VERFAHREN

Zellkulturen

Es wurden Kleinhirnkörnerzellkulturen verwendet, die aus 8 Tage alten Sprague-Dawley-Ratten mit den vorher beschriebenen Merkmalen hergestellt wurden (Gallo, V., et al., Selective release of glutamate from cerebellar granule cells differentiating in culture, Proc. Natl. Sci. USA 79 (1982), 7919-7923).
Die Kulturen (3 x 10&sup6; Zellen/Schale) wurden am 11. Tag verwendet.

Testprodukte und jeweilige Solubilisierung

Es wurden die folgenden Produkte getestet:
- Monosialogangliosid GM&sub1; (GM&sub1;)
- Glycinamid von GM&sub1; (AGF&sub1;&sub1;&sub8;)
- Methylamid von GM&sub1; (AGF&sub1;&sub2;)
- Diethylamid von GM&sub1; (AGF&sub2;&sub2;)
- Benzylamid von GM&sub1; (AGF&sub1;&sub6;)
- Isopropylamid von GM&sub1; (AGF&sub1;&sub8;)
- N-Pyrrolidin-2-ethylamid von GM&sub1; (AGF&sub1;&sub0;&sub8;)
- Ethylester von GM&sub1; (AGF&sub4;&sub2;)
- Benzylester von GM&sub1; (AGF&sub4;&sub8;)
GM&sub1; und die jeweiligen Gangliosid-Derivate wurden in Chloroform/Methanol (2:1) solubilisiert, unter einem Stickstoffstrom getrocknet und in Locke-Lösung (in Gegenwart von Mg²&spplus;) resuspendiert, wobei Glucose fehlte. Die Konzentrationen der verschiedenen Produkte betrug 5 x 10&supmin;&sup5; M.

Induktion von Neurotoxizität durch Glucose-Mangel

Das Kulturmedium wurde aus den Schalen abgesaugt (und in geeigneter Weise aufbewahrt) und durch Glucose-freie Locke-Lösung (in Gegenwart von Mg²&spplus;) ersetzt. Mit dieser Lösung wurde 3mal gewaschen und dann wurden die Lösungen zugegeben, die die Testprodukte enthielten (5 x 10&supmin;&sup4;M). In einem Inkubator erfolgte eine 4-stündige Inkubation bei 37ºC (5% CO&sub2;). (Ebenso wurden die Kontrollkulturen 4 h mit Glucose enthaltender Locke-Lösung inkubiert.) Die behandelten Zellen wurden danach mit Mg²&spplus;-Ionen und Glucose enthaltender Locke-Lösung gewaschen und in Gegenwart des ersten Kulturmediums (das in geeigneter Weise aufbewahrt worden war) 24 h bei 37ºC in einem Inkubator (5% CO&sub2;) inkubiert.
Am Ende der Inkubation wurde die Lebensfähigkeit der Zellen bestimmt und mittels des kolorimetrischen MTT-Tests (Mosmann, T., Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assays, J. Immunol. Meth. 65 (1983), 55-63) quantitativ ermittelt. Sie wurde als Prozentsatz überlebender Zellen im Vergleich zu den Kontrollen angegeben, die ohne Glucose-Mangel gezüchtet worden waren.

ERGEBNISSE

Die Daten (Tabelle 3) zeigen, daß GM&sub1; und die verschiedenen getesteten Derivate allesamt Körnerzellen vor der durch endogenes Glutamat induzierten Neurotoxizität schützen können.
Es ist besonders erwähnenswert, daß die Wirkung einer Vorinkubation mit AGF&sub1;&sub1;&sub8; mit der von GM&sub1; vergleichbar und sogar noch größer als diese ist.
Die anderen Gangliosid-Derivate, d.h. sowohl Ester als auch Amide, besitzen eine Schutzaktivität wie GM&sub1;. Tabelle 3: Wirkung von AGF&sub1;&sub1;&sub8; (im Vergleich zu GM&sub1; und anderen Amid- und Ester- Derivaten von GM&sub1;) auf die durch endogenes Glutamat induzierte Neurotoxizität
* Die Produkte wurden bei einer Konzentration von 5 x 10&supmin;&sup5; M (4 h bei 37ºC) getestet. Die Daten sind Durchschnittswerte von 4 Wiederholungen pro Probe.
Aufgrund der vorstehend beschriebenen Aktivitäten eignen sich die erfindungsgemäßen neuartigen Carboxylamide zur pharmakologischen Anwendung bei verschiedenen Krankheiten des Zentralnervensystems, wo es erforderlich ist, die neuronotrophen Wirkungen zu verstärken und Schutz gegen eine durch exzitatorische Aminosäuren induzierte Neurotoxizität zu bieten. Sie sind besonders zur Therapie von Krankheiten geeignet, wo es eine neuronale Schädigung gibt, wie bei Hypoxie-Ischämie, Hypoglykämie, Epilepsie, Trauma, Hirnalterung sowie chronischen und toxisch-infektiösen neurodegenerativen Krankheiten.
Interessante erfindungsgemäße Verbindungen sind:
das Amid von Glycin von Gangliosid GM&sub1;
das Amid von L-Alanin von Gangliosid GM&sub1;
das Amid von L-Serin von Gangliosid GM&sub1;
das Amid von γ-Aminobuttersäure von Gangliosid GM&sub1;
das Amid von L-Cystein von Gangliosid GM&sub1;
das Amid von Taurin von Gangliosid GM&sub1;
das Amid von Cysteinsäure von Gangliosid GM&sub1;
das Amid von Homocysteinsäure von Gangliosid GM&sub1;
das Amid von Glycin von N-Lauroyl-N-lyso-GM&sub1;
das Amid von Glycin von N-Stearoyl-N-lyso-GM&sub1;
das Amid von L-Alanin von N-Oleyl-N-lyso-GM&sub1;
das Amid von L-Alanin von N-Palmitoyl-N-lyso-GM&sub1;
das Amid von L-Serin von N-Acetyl-N-lyso-GM&sub1;
das Amid von γ-Aminobuttersäure von N-Propionyl-N-lyso-GM&sub1;
das Amid von L-Cystein von N-Valeryl-N-lyso-GM&sub1;
das Amid von Glycin von N'Lauroyl-N'lyso-GM&sub1;
das Amid von Glycin von N'Stearoyl-N'lyso-GM&sub1;
das Amid von L-Alanin von N'Oleyl-N'lyso-GM&sub1;
das Amid von L-Alanin von N'Palmitoyl-N'lyso-GM&sub1;
das Amid von L-Serin von N'Acetyl-N'lyso-GM&sub1;
das Amid von γ-Aminobuttersäure von N'Propionyl-N'lyso-GM&sub1;
das Amid von L-Cystein von N'Valeryi-N'lyso-GM&sub1;
das Amid von Glycin von N,N'Dilauroyl-N,N'di-lyso-GM&sub1;
das Amid von Glycin von N,N'Distearoyl-N,N'di-lyso-GM&sub1;
das Amid von L-Alanin von N,N'Dioleyl-N,N'di-lyso-GM&sub1;
das Amid von L-Alanin von N,N'Dipalmitoyl-N,N'di-lyso-GM&sub1;
das Amid von L-Serin von N,N'Diacetyl-N,N'di-lyso-GM&sub1;
das Amid von γ-Aminobuttersäure von N,N'Dipropionyl-N,N'di-lyso-GM&sub1;
das Amid von L-Cystein von N,N'Divaleryl-N,N'di-lyso-GM&sub1;
das Amid von Taurin von N-Acetyl-N-lyso-GM&sub1;
das Amid von Taurin von N'Lauryl-N'lyso-GM&sub1;
das Amid von Taurin von N,N'Dioleyl-N,N'di-lyso-GM&sub1;
das Amid von Cysteinsäure von N-Propionyl-N-lyso-GM&sub1;
das Amid von Cysteinsäure von N'Stearoyl-N'lyso-GM&sub1;
das Amid von Cysteinsäure von N,N'Divaleryl-N,N'di-lyso-GM&sub1;
und die Verbindungen, die all diesen entsprechen und als Gangliosid-Base anstelle von GM&sub1; ein Gangliosid besitzen, das aus der die Ganglioside GD1a, GD1b und GT1b umfassenden Gruppe gewählt ist.
Die vorliegende Erfindung umfaßt auch Verfahren zur Herstellung der neuartigen Gangliosid-Amide und ihrer vorstehend erwähnten semisynthetischen Derivate. Die Verfahren sind im wesentlichen diejenigen, die bereits im US-Patent 4,713,374 beschrieben sind. Sie umfassen die folgenden Verfahren:
a) Umsetzung der inneren Ester der Ganglioside oder ihrer semisynthetischen Derivate mit den Aminosäuren, deren Amid-Gruppen eingeführt werden sollen.
b) Umsetzung der Carboxylester der Ganglioside oder ihrer semisynthetischen Derivate mit den Aminosäuren, deren Amid-Gruppen eingeführt werden sollen.
c) Umsetzung der Ganglioside oder ihrer semisnthetischen Derivate mit der Aminosäure, die der einzuführenden Amid-Gruppe entspricht, wobei die Carbonsäure- oder Sulfonsäure-Funktion in der Aminosäure geschützt ist.
Reaktion a) kann mit oder ohne Lösungsmittel durch direkte Behandlung des Gangliosids (oder des analogen semisynthetischen Derivats) in Form seines inneren Esters mit der Aminosäure durchgeführt werden. Die Reaktion kann auch bei sehr niedrigen Temperaturen, beispielsweise bei -5ºC bis +10ºC, durchgeführt werden, erfolgt jedoch vorzugsweise bei Raumtemperatur oder höheren Temperaturen, z.B. bei 30ºC bis 120ºC. Als Lösungsmittel können Ketone, aromatische Kohlenwasserstoffe, Dimethylformamid, Dimethylsulfoxid, Dioxan oder Tetrahydrofuran verwendet werden. Reaktion b) wird vorzugsweise auch unter den für a) beschriebenen Bedingungen durchgeführt. Außer aliphatischen Estern können auch andere Ester verwendet werden, z.B. Ester mit Phenol-Gruppen.
Bei in der Peptidchemie bekannten Verfahren wird Reaktion c) zur Aktivierung der Carboxyl-Gruppe verwendet, wobei Verfahren vermieden werden, die zu saure oder zu basische Bedingungen umfassen, die zu einem Abbau des Gangliosid-Moleküls oder seiner semisynthetischen Analoge führen würden. Wenn die Ausgangs-Ganglioside beispielsweise in Form von Natrium- Salzen vorliegen, ist es ratsam, das Salz zuerst mit einem Ionenaustauscherharz vom Dowex-Typ oder einem anderen sauren Ionenaustauscher zu behandeln. Es ist beispielsweise möglich, das Kondensationsverfahren in Gegenwart von Carbodiimiden, wie Dicyclohexylcarbodiimid, Benzylisopropylcarbodiimid oder Benzylethylcarbodiimid, in Gegenwart von 1-Hydroxybenzotriazol oder in Gegenwart von N,N'Carbonyldiimidazol zu verwenden.
Verbindungen, die entsprechend diesen Verfahren gewonnen wurden, können auf Wunsch in ihre Salze umgewandelt werden, die auch einen Teil der vorliegenden Erfindung bilden und selbst zur Herstellung von Medikamenten verwendet werden können zur Verwendung zur Therapie wie die freien Verbindungen. Aufgrund der wesentlichen Äquivalenz zwischen Salzen und Amiden in freier Form sind die vorstehend für die Verbindungen in freier Form besonders im Hinblick auf pharmazeutische Anwendungen und Medikamente gemachten Aussagen auch für die entsprechenden Salze gültig, sofern es sich dabei um therapeutisch verträgliche Salze handelt. Sie sind daher ein bevorzugter Gegenstand der vorliegenden Erfindung. Die Salze können jedoch auch zur Aufreinigung der Amide verwendet werden. In diesem Fall ist es möglich, für die Salzbildung auch Basen oder Säuren zu verwenden, die sich nicht zur Therapie eignen, z.B. Pikrinsäure oder Pikrolinsäure.
Die Salze können Salze sein, bei denen die vorhandenen Carbonsäure- oder Sulfonsäure-Gruppen der Aminosäuren mit Metallen oder organischen Basen in Salze überführt wurden. Therapeutisch verträgliche Salze von diesem Typ sind beispielsweise Alkalimetall-Salze, wie Natrium-, Kalium- und Lithiumsalze, und Erdalkalimetall-Salze, wie Calcium- und Magnesiumsalze. Auf Wunsch ist es auch möglich, Schwermetall-Salze, wie Eisensalze, zu verwenden. Salze organischer Basen können dann z.B. von primären, sekundären oder tertiären, aliphatischen oder aromatischen oder heterocyclischen Ammen, wie Methylamin, Ethylamin, Propylamin, Piperdin, Morpholin, Ephedrin, Furfurylamin, Cholin, Ethylendiamin und Aminoethanol, hergestellt werden.
Eine zweite Gruppe von Salzen wird von Salzen gebildet, die durch Säureaddition erhalten wurden, besonders in Fällen, wo im Amid-Bestandteil eine freie Amino-Funktion vorhanden ist. Insbesondere sollten Salze mit anorganischen Säuren, wie Salzsäure, Bromwasserstoffsäure, Phosphorsäure und Schwefelsäure, und niederen aliphatischen Säuren mit maximal 7 Kohlenstoffatomen, wie Ameisensäure, Essigsäure, Propionsäure, Bemsteinsäure oder Maleinsäure, erwähnt werden.
Ein anderes Ziel der vorliegenden Erfindung sind pharmazeutische Präparate, die als Wirkstoff ein oder mehrere der vorstehend definierten neuartigen Amid-Derivate enthalten, insbesondere die vorstehend ausdrücklich erwähnten Amid-Derivate, wie die Derivate der Gangliosid- Gruppen A und B sowie die in den zur Veranschaulichung dienenden Beispielen spezifisch aufgelisteten oder beschriebenen Derivate. Diese pharmazeutischen Präparate können oral, rektal, parenteral, lokal oder intradermal verwendet werden. Sie liegen daher in fester oder halbfester Form vor, z.B. als Pillen, Tabletten, Gelatinekapseln, Kapseln oder Weichgelatine- Zäpfchen. Zur parenteralen Anwendung können zur intramuskulären, subkutanen oder intradermalen Verabreichung oder für Infusionen oder Injektionen geeignete Formen verwendet werden. Sie können daher als Wirkstoff-Lösungen oder als gefriergetrocknete Wirkstoff-Pulver hergestellt werden, die mit einem oder mehreren Excipienten oder pharmazeutisch verträglichen Verdünnungsmitteln zu mischen sind, die sich für die vorstehend beschriebenen Anwendungen eignen und eine mit physiologischen Flüssigkeiten kompatibele Osmolarität besitzen. Die pharmazeutischen Präparate können normale pharmazeutisch verträgliche Excipienten, wie Verdünnungsmittel, Bindemittel, Aromastoffe, Farbstoffe, Konservierungsmittel und Abbaumittel entsprechend der üblichen pharmazeutischen Praxis in einer Art und Weise, die dem Fachmann bei der Formulierung von Gangliosid-Präparaten bekannt ist, umfassen. Bei lokaler Anwendung sollten zur topischen Verabreichung Präparate in Form von Sprays wie Nasensprays, Cremes oder Salben und bei intradermaler Verabreichung in geeigneter Weise behandelte Pflaster in Betracht gezogen werden. Die erfindungsgemäßen Präparate können sowohl dem Menschen als auch Tieren verabreicht werden.
In pharmazeutischen Präparaten können die erfindungsgemäßen Gangliosid-Derivate als einziger Wirkstoff oder in Kombination mit anderen pharmazeutischen Wirkstoffen vorhanden sein.
Präparate in Form von Lösungen, Sprays, Salben und Cremes enthalten vorzugsweise 0,01% bis 10% Wirkstoff und Präparate in fester Form 1% bis 100%, vorzugsweise 5% bis 50% Wirkstoff. Zu verabreichende Dosen hängen von der Indikation, der gewünschten Wirkung und dem gewählten Verabreichungsweg ab.
Zur therapeutischen oder möglicherweise nur präventiven Anwendung über den parenteralen Weg schwanken die Dosen vorzugsweise zwischen 0,05 mg und 10 mg Wirkstoff pro kg Körpergewicht/Tag, besonders bevorzugt zwischen 0,05 mg ud 2 mg pro kg Körpergewicht/Tag.
Noch ein anderes Ziel der vorliegenden Erfindung betrifft ein Verfahren zur Behandlung von Krankheiten des Nervensystems sowohl des zentralen Nervensystems als auch des peripheren Nervensystems. Ein interessanter Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft ein Verfahren zur Behandlung von Krankheiten, die mit neuronaler Schädigung verbunden sind, insbesondere von Hypoxie-Ischämie, Hypoglykämie, Epilepsie, Trauma, Hirnalterung sowie chronischen und toxisch-infektiösen neurodegenerativen Krankheiten. Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele erläutert, die die Erfindung nicht beschränken sollen.

Beispiel 1:

10 g innerer Ester von GM&sub1; (6,6 mmol) werden in 100 ml wasserfreiem Pyridin gelöst. Der Lösung werden 3,2 g (1)-Glycinmethylester-HCl (5:1) und 5 ml Triethylamin zugegeben. Dann läßt man die Reaktion 24 h bei 40ºC ablaufen.
Die Lösung wird getrocknet und in 50 ml 0,01 M Na&sub2;CO&sub3; augenommen. Man läßt sie 1 h bei 60ºC stehen. Danach wird die Lösung gegen 5 Volumina destilliertes Wasser dialysiert.
Sie wird getrocknet und zur Entfernung von nicht-umgesetztem GM&sub1; auf einer Kieselgel-Säule einer Chromatographie unterworfen, wobei die Elution mit Chloroform/Methanol/wäßrigem (NH&sub4;)&sub2;CO&sub3; (60:35:8) durchgeführt wird.
Ausbeute an Trockenprodukt: 4,5 g.
Durch Kieselgel-Chromatographie unter Verwendung von 0,3% Chloroform/Methanol/CaCl&sub2; (60:35:8) als Lösungsmittel wird gezeigt, daß das Produkt das Glycin-Amid von Gangliosid GM&sub1; mit einem Rf-Wert = 0,42 (GM&sub1; = 0,4) ist.

Beispiel 2:

10 g innerer Ester (6,6 mmol) GM&sub1; werden in 100 ml wasserfreiem Pyridin gelöst. Der Lösung werden 4,5 g L-Alaninmethylester-HCl (5:1) und 5 ml Triethylamin zugegeben. Man läßt die Reaktion 24 h bei 40ºC ablaufen.
Die Lösung wird getrocknet und in 50 ml 0,01 M Na&sub2;CO&sub3; aufgenommen. Man läßt sie 1 h bei 60ºC stehen. Danach wird die Lösung gegen 5 Volumina destilliertes Wasser dialysiert.
Sie wird getrocknet und zur Entfernung von nicht-umgesetztem GM&sub1; auf einer Kieselgel-Säule einer Chromatographie unterworfen, wobei die Elution mit Chloroform/Methanol/wäßrigem (NH&sub4;)&sub2;CO&sub3; (60:35:8) durchgeführt wird.
Ausbeute an Trockenprodukt: 4,3 g.
Durch Kieselgel-Chromatographie unter Verwendung von 0,3% Chloroform/Methanol/CaCl&sub2; (60:35:8) als Lösungsmittel wird gezeigt, daß das Produkt das Amid des L-Alanins von Gangliosid GM&sub1; mit einem Rf-Wert = 0,61 (GM&sub1; = 0,4) ist.

Beispiel 3:

10 g innerer Ester (6,6 mmol) von GM&sub1; werden in 100 ml wasserfreiem Pyridin gelöst. Der Lösung werden 5 g L-Serinmethylester-HCl (5:1) und 5 ml Triethylamin zugegeben. Man läßt die Reaktion 24 h bei 40ºC ablaufen.
Die Lösung wird getrocknet und in 50 ml 0,01 M NA&sub2;CO&sub3; aufgenommen. Man läßt sie 1 h bei 60ºC stehen. Danach wird die Lösung gegen 5 Volumina destilliertes Wasser dialysiert.
Sie wird getrocknet und zur Entfernung von nicht-umgesetztem GM&sub1; auf einer Kieselgel-Säule einer Chromatographie unterworfen, wobei die Elution mit Chloroform/Methanol/wäßrigem (NH&sub4;)&sub2;CO&sub3; (60:35:8) durchgeführt wird. Ausbeute an Trockenprodukt: 4 g.
Durch Kieselgel-Chromatographie unter Verwendung von 0,3% Chloroform/Methanol/CaCl&sub2; (60:35:8) als Lösungsmittel wird gezeigt, daß das Produkt das Amid des L-Serins von Gangliosid GM&sub1; mit einem Rf-Wert = 0,58 (GM&sub1; = 0,4) ist.

Beispiel 4:

10 g innerer Ester (6,6 mmol) von GM&sub1; werden in 100 ml wasserfreiem Pyridin gelöst. Der Lösung werden 5 g γ-Aminobuttersäuremethylester-HCl (5:1) und 5 ml Triethylamin zugegeben. Man läßt die Reaktion 24 h bei 40ºC ablaufen.
Die Lösung wird getrocknet und in 50 ml 0,01 M Na&sub2;CO&sub3; aufgenommen. Man läßt sie 1 h bei 60ºC stehen. Danach wird die Lösung gegen 5 Volumina destilliertes Wasser dialysiert.
Sie wird getrocknet und zur Entfernung von nicht-umgesetztem GM&sub1; auf einer Kieselgel-Säule einer Chromatographie unterworfen, wobei die Elution mit Chloroform/Methanol/wäßrigem (NH&sub4;)&sub2;CO&sub3; (60:35:8) durchgeführt wird. Ausbeute an Trockenprodukt: 3 g.
Durch Kieselgel-Chromatographie unter Verwendung von 0,3% Chloroform/Methanol/CaCl&sub2; (60:35:8) als Lösungsmittel wird gezeigt, daß das Produkt das Amid der γ-Aminobuttersäure von Gangliosid GM&sub1; mit einem Rf- Wert =0,27 (GM&sub1; = 0,4) ist

Beispiel 5:

10 g innerer Ester (6,6 mmol) von GM&sub1; werden in 100 ml wasserfreiem Pyridin gelöst. Der Lösung werden 3,9 g L-Cystein (5:1) und 5 ml Triethylamin zugegeben. Man läßt die Reaktion 24 h bei 40ºC ablaufen.
Zur Entfernung von nicht-umgesetztem Cystein wird die Lösung filtriert und danach getrocknet.
Zur Entfernung von nicht-umgesetztem GM&sub1; wird sie auf einer Kieselgel- Säule einer Chromatographie unterworfen, wobei die Elution mit Chloroform/Methanol/wäßrigem (NH&sub4;)&sub2;CO&sub3; (60:35:8) durchgeführt wird. Ausbeute an Trockenprodukt: 4,5 g.
Durch Kieselgel-Chromatographie unter Verwendung von 0,3% Chloroform/Methanol/CaCl&sub2; (60:35:8) als Lösungsmittel wird gezeigt, daß das Produkt das Amid von Lcystein von Gangliosid GM&sub1; mit einem Rf-Wert = 0,31 (GM&sub1; = 0,4) ist.

Beispiel 6:

In 10 ml eines Wasser/Tetrahydrofuran-Gemisches (1:3), das mit 0,1 N HCl bei pH-kontrollierten Bedingungen bei einem pH-Wert von 4,7 gehalten wird, werden die folgenden Verbindungen in der angegebenen Reihenfolge gelöst: 500 mg (3,9 mmol) 2-Aminoethansulfonsäure (Taurin), 500 mg (0,22 mmol) peracyliertes GM&sub1; und 1,25 g (6,5 mmol) 1-(3-Dimethylaminopropyl)-3- ethylcarbodiimid. Die Umsetzung wird 4 h bei Raumtemperatur durchgeführt. Zum Schluß wird das Rohprodukt vakuumgetrocknet, mit 10 ml 1 N Na&sub2;CO&sub3; 24 h bei 70ºC behandelt, gegen destilliertes Wasser dialysiert und erneut vakuumgetrocknet. Die letzte Aufreinigung wird mittels Kieselgel- Chromatographie durchgeführt, wobei mit einem Chloroform/ Methanol/Wasser-Gemisch (60:35:8) eluiert wird.
Ausbeute an Trockenprodukt: 85 mg (theoretisch 23%).
Durch Kieselgel-Chromatographie unter Verwendung von 0,3% Chloroform/Methanol/CaCl&sub2; (50:42:11) als Lösungsmittel wird gezeigt, daß das Produkt das Amid des Taurins von Gangliosid GM&sub1; mit einem Rf-Wert = 0,53 (GM&sub1; = 0,43) ist.

Beispiel 7:

Pharmazeutische Präparate in Lösung zur Injektion

Präparat Nr.1 - eine 2 ml-Ampulle enthält:

Wirkstoff 5 mg
Natriumchlorid 16 mg
Citratpuffer, pH 6, in Wasser zur Injektion, q.s. ad 2 ml

Präparat Nr.2 - eine 2 ml-Ampulle enthält:

Wirkstoff 50 mg
Natriumchlorid 16 mg
Citratpuffer, pH 6, in Wasser zur Injektion, q.s. ad 2 ml

Präparat Nr.3 - eine 4 ml-Ampulle enthält:

Wirkstoff 100 mg
Natriumchlorid 32 mg
Citratpuffer, pH 6, in Wasser zur Injektion, q.s. ad 4 ml

Beispiel 8:

In zwei Fläschchen hergestellte Arzneimittel

Die in diesem Beispiel beschriebenen Präparate werden in zwei Fläschchen hergestellt. Das erste Fläschchen enthält den Wirkstoff in Form eines gefriergetrockneten Pulvers in Mengen, die zwischen 10 Gew.-% und 90 Gew.- % schwanken, zusammen mit einem pharmazeutisch verträglichen Excipienten, d.h. mit Glycin oder Mannit. Das zweite Fläschchen enthält eine Natriumchlorid-Lösung und einen Citratpuffer als Lösungsmittel.

System Nr. 1:

a. ein gefriergetrocknetes 2 ml-Fläschchen enthält:

Wirkstoff 5 mg
Glycin 30 mg

b. eine 2 ml-Ampulle mit Lösungsmittel enthält:

Natriumchlorid 16 mg
Citratpuffer in Wasser zur Injektion, q.s. ad 2 ml

System Nr. 2:

a. ein gefriergetrocknetes 3 ml-Fläschchen enthält:

Wirkstoff 50 mg
Glycin 25 mg

b. eine 3 ml-Ampulle mit Lösungsmittel enthält:

Natriumchlorid 24 mg
Citratpuffer in Wasser zur Injektion, q.s. ad 3ml

System Nr. 3:

a. ein gefriergetrocknetes 5 ml-Fläschchen enthält:

Wirkstoff 150 mg
Glycin 50 mg

b. eine 4 ml-Ampulle mit Lösungsmittel enthält:

Natriumchlorid 32 mg
Citratpuffer in Wasser zur Injektion, q.s. ad 4 ml

Claims

1. Gangliosid-Derivat aus einem basischen, natürlichen oder semisynthetischen Gangliosid, wobei die Carboxylgruppe im Sialinsäureteil des natürlichen oder semisynthetischen Gangliosids mit einer aliphatischen Aminosäure mit einer Carbon- oder Sulfonsäurefunktion in ein Carboxylamid umgewandelt ist, und Salze hiervon.

2. Gangliosid nach Anspruch 1, wobei das semisynthetische Gangliosid aus der N-Acyl-N-lyso-ganglioside, N'Acyl-N'lyso-ganglioside und N,N'Diacyl- N,N'di-lyso-ganglioside umfassenden Gruppe gewählt ist, worin die N- und N' Acylgruppen identisch oder voneinander verschieden sind, und jede eine Gruppe aus einer wahlweise substituierten aliphatischen Säure ist.

3. Gangliosid nach Anspruch 2, wobei die wahlweise substituierte aliphatische Säure 1-24 Kohlenstoffatome umfaßt.

4. Gangliosid-Derivat nach Anspruch 1, wobei das basische natürliche Gangliosid aus Geweben und Organen des Nervensystems in gereinigter Form erhalten worden ist.

5. Gangliosid-Derivat nach Anspruch 4, wobei das basische natürliche Gangliosid ein Oligosaccharid enthält, das durch maximal 4 Hexose- oder N- Acetylhexosaminreste gebildet ist, wobei mindestens 1 Hexoserest vorliegt, und dieser Saccharidteil unitär ist.

6. Gangliosid-Derivat nach Anspruch 5, wobei das Gangliosid aus der die Ganglioside GM&sub4;, GM&sub3;, GM&sub2;, GM&sub1;-GlcNAC, GD&sub2;, GD1a-GalNAC, und Gt1c umfassenden Gruppe oder aus der die Ganglioside GM&sub1;, Gd1a, GD1b und GT1b umfassenden Gruppe gewählt ist.

7. Gangliosid-Derivat nach Anspruch 2, wobei die basische semisynthetische Gangliosidkomponente ein N-Acyl-N-lyso-gangliosid ist, worin die Acylgruppe von einer wahlweise substituierten aliphatischen Säure mit 12-22 Kohlenstoffatomen abgeleitet ist.

8. Gangliosid-Derivat nach Anspruch 7, wobei die Acylgruppe von Palmitin säure, Stearinsäure Laurinsäure, Myristinsäure oder einer korrespondierenden ungesättigten Säure abgeleitet ist.

9. Gangliosid-Derivat nach Anspruch 2, wobei die Acylgruppe von einer aliphatischen Carbonsäure mit 2-10 Kohlenstoffatomen abgeleitet ist.

10. Gangliosid-Derivat nach Anspruch 2, wobei das basische semisynthetische Gangliosid ein N'Acyl-N'lyso-gangliosid ist, worin die N'Acylgruppe von einer Säure mit 12-22 Kohlenstoffatomen abgeleitet ist.

11. Gangliosid-Derivat nach Anspruch 10, wobei die Acylgruppe von Palmitinsäure, Stearinsäure Laurinsäure Myristinsäure oder von einer korrespondierenden ungesättigten Säure abgeleitet ist.

12. Gangliosid-Derivat nach Anspruch 2, wobei das basische semisynthetische Gangliosid N'Acyl-N'lyso-gangliosid ist, worin die Acylgruppe von einer aliphatischen Carbonsäuren mit 2-10 Kohlenstoffatomen abgeleitet ist.

13. Gangliosid-Derivat nach mindestens einem der Ansprüche 7-12, wobei die Acylgruppe durch 2 polare Einheiten substituiert ist, wobei die polaren Einheiten identisch oder voneinander verschieden sind.

14. Gangliosid-Derivat nach Anspruch 13, wobei die polaren Einheiten aus der Chlor-, Brom- und Fluoratome, freie Hydroxylgruppen, veresterte oder veretherte Hydroxylgruppen, freie Aminogruppen und mono- oder dialkylierte Aminogruppen umfassenden Gruppe gewählt sind.

15. Gangliosid-Derivat nach Anspruch 2, wobei das basische semisynthetische Gangliosid ein N,N'Diacyl-N,N'di-lyso-gangliosid ist, worin die Acylgruppen von identischen oder verschiedenen, wahlweise substituierten aliphatischen Säuren mit 1-24 Kohlenstoffatomen abgeleitet sind.

16. Gangliosid-Derivat nach Anspruch 15, wobei mindestens eine der Acylgruppen von einer höheren aliphatischen Säure mit 12-22 Kohlenstoffatomen abgeleitet ist.

17. Gangliosid-Derivat nach Anspruch 16, wobei mindestens eine der Acylgruppen von Palmitinsäure, Stearinsäure Laurinsäure, Myristinsäure oder von einer korrespondierenden ungesättigten Säure abgeleitet ist.

18. Gangliosid-Derivat nach Anspruch 15, wobei mindestens eine der Acylgruppen von einer aliphatischen Säure mit 2-10 Kohlenstoffatomen abgeleitet ist.

19. Gangliosid-Derivat nach mindestens einem der Ansprüche 15-18, wobei mindestens eine der aliphatischen Säuren mit 2 polaren Einheiten substituiert ist.

20. Gangliosid-Derivat nach mindestens einem der Ansprüche 1-19, wobei das Carboxylamid von einer aliphatischen Aminosäure mit einer Carbonsäure funktion und mit maximal 22 Kohlenstoffatomen abgeleitet ist.

21. Gangliosid-Derivat nach Anspruch 20, das von einer Aminosäure abgeleitet ist, in welcher die Aminofunktion primär oder sekundär ist.

22. Gangliosid-Derivat nach Anspruch 1, wobei die aliphatische Aminosäure eine natürlich vorkommende L-Aminosäure ist.

23. Gangliosid-Derivat nach Anspruch 1, wobei die aliphatische Aminosäure aus der Glycin, Alanin, Serin, Cystein, Cystin, Valin, Norvalin, Leucin, Isoleucin, Phenylalanin, Tyrosin, Dilodotyrosin, Tryptophan, Histidin, α-Aminobuttersäure, Methionin, Norleucin, Arginin, Ornithin, Lysin, Asparaginsäure, Aspargin, Glutaminsäure, Oxyglutaminsäure, Glutamin, Dioxyphenylalanin, Threonin und γ-Aminobuttersäure umfassenden Gruppe gewählt ist.

24. Gangliosid-Derivat nach mindestens einem der Ansprüche 1-19, wobei das Carboxylamid von einer aliphatischen Aminosäure mit einer Sulfonsäurefunktion abgeleitet ist.

25. Gangliosid-Derivat nach Anspruch 24, welches von einer Aminosäure, gewählt aus der Taurin, Cystein- und Homocysteinsäure umfassenden Gruppe, abgeleitet ist.

26. Gangliosld-Derivat nach Anspruch 1, wobei die Aminosäure aus der Glycin, Alanin, Serin, Valin, Leucin, α- und γ-Aminobuttersäure, Asparaginsäure, Glutaminsäure umfassenden Gruppe gewählt ist, und wobei die basische Gangliosidkomponente aus der GM&sub4;, GM&sub3;, GM&sub2;, GM&sub1;, GlcN, GD&sub2;, Gd1a-GalNAC und GT1c umfassenden Gruppe gewählt ist.

27. Gangliosid-Derivat nach Anspruch 1, wobei die Aminosäure aus der Glycin, Alanin, Serin, Valin, Leucin, α- und γ-Aminobuttersäure, Asparaginsäure und Glutaminsäure umfassenden Gruppe gewählt ist, und wobei die Gangliosidkomponente aus der GM&sub1;, GD1a, GD1b und GT1b umfassenden Gruppe gewählt ist.

28. Gangliosid-Derivat nach Anspruch 1, wobei die Aminosäure aus der Glycin, Alanin, Serin, Valin, Leucin, α- und γ-Aminobuttersäure, Asparaginsäure und Glutaminsäure umfassenden Gruppe gewählt ist, und wobei die Gangliosidkomponente ein semisynthetisches Gangliosid ist, gewählt aus der N-Acyl- N-lyso-ganglioside umfassenden Gruppe, worin die N-Acylgruppen von wahlweise substituierten aliphatischen Säuren mit 1-24 Kohlenstoffatomen, vorzugsweise mit 12-22 Kohlenstoffatomen; abgeleitet sind.

29. Gangliosid-Derivat nach Anspruch 1, wobei die Aminosäure aus der Glycin, Alanin, Serin, Valin, Leucin, α- und γ-Aminobuttersäure, Asparaginsäure und Glutaminsäure umfassenden Gruppe abgeleitet ist, und wobei die Gangliosidkomponente aus N'Acyl-N'lyso-gangliosiden gewählt ist, worin die N'Acylgruppen von wahlweise substituierten aliphatischen Säuren mit 1-24 Kohlen stoffatomen, vorzugsweise 12-22 Kohlenstoffatomen, abgeleitet sind.

30. Gangliosid-Derivat nach Anspruch 1, wobei die Aminosäure aus der Glycin, Alanin, Serin, Valin, Leucin, α- und γ-Aminobuttersäure, Asparaginsäure und Glutaminsäure umfassenden Gruppe gewählt ist, und wobei die Gangliosidkomponente ein N,N'Diacyl-N,N'di-lyso-gangliosid ist, worin die Acylgruppen aus identischen oder verschiedenen wahlweise substituierten aliphatischen Säuren mit 1-24 Kohlenstoffatomen, vorzugsweise 12-22 Kohlenstoffatomen, abgeleitet sind.

31. Gangliosid-Derivat nach Anspruch 1, gewählt aus der das Amid von Glycin von Gangliosid GM&sub1;, das Amid von L-Alanin von Gangliosid GM&sub1;, das Amid von L-Serin von Gangliosid GM&sub1;, das Amid von γ-Aminobuttersäure von Gangliosid GM&sub1;, und das Amid von L-Cystein von Gangliosid GM&sub1; umfassenden Gruppe.

32. Gangliosid-Derivat nach Anspruch 1, gewählt aus der das Amid von Taurin von Gangliosid GM&sub1;, das Amid von Cysteinsäure von Gangliosid GM&sub1;, und das Amid von Homocysteinsäure von Gangliosid GM&sub1; umfassenden Gruppe.

33. Gangliosid-Derivat nach Anspruch 1, gewählt aus der das Amid von Glycin von N-Lauroyl-N-lyso-GM&sub1;, das Amid von Glycin von N-Stearoyl-N-lyso- GM&sub1;, das Amid von L-Alanin von N-Oleyl-N-lyso-GM&sub1;, das Amid von L-Alanin von N-Palmitoyl-N-lyso-GM&sub1;, das Amid von L-Serin von N-Acetyl-N-lyso-GM&sub1;, das Amid von γ-Aminobuttersäure von N-Propionyl-N-lyso-GM&sub1;, das Amid von L-Cystein von N-Valeryl-N-lyso-GM&sub1;, das Amid von Glycin von N'Lauroyl-N' lyso-GM&sub1;, das Amid von Glycin von N'Stearoyl-N'lyso-GM&sub1;, das Amid von L- Alanin von N'Oleyl-N'lyso-GM&sub1;, das Amid von L-Alanin von N'Palmitoyl-N' lyso-GM&sub1;, das Amid von L-Serin von N'Acetyl-N'lyso-GM&sub1;, das Amid von γ- Aminobuttersäure von N'Propionyl-N'lyso-GM&sub1;, das Amid von L-Cystein von N'Valeryl-N'lyso-GM&sub1;, das Amid von Glycin von N,N'Dilauroyl-N,N'di-lyso- GM&sub1;, das Amid von Glycin von N,N'Distearoyl-N,N'di-lyso-GM&sub1;, das Amid von Lalanin von N,N'Dioleyl-N,N'di-lyso-GM&sub1;, das Amid von L-Alanin von N,N' Dipalmitoyl-N,N'di-lyso-GM&sub1;, das Amid von L-Serin von N,N'Diacetyl-N,N' di-lyso-GM&sub1;, das Amid von γ-Aminobuttersäure von N,N'Dipropionyl-N,N'di- lyso-GM&sub1;, das Amid von L-Cystein von N,N'Divaleryl-N,N'di-lyso-GM&sub1;, das Amid von Taurin von N-Acetyl-N-lyso-GM&sub1;, das Amid von Taurin von N'Lauryl- N'lyso-GM&sub1;, das Amid von Taurin von N,N'Dioleyl-N,N'di-lyso-GM&sub1;, das Amid von Cysteinsäure von N-Propionyl-N-lyso-GM&sub1;, das Amid von Cysteinsäure von N'Stearoyl-N'lyso-GM&sub1;, und das Amid von Cysteinsäure von N,N' Divaleryl-N,N'di-lyso-GM&sub1; umfassenden Gruppe.

34. Therapeutisch annehmbare Salze der Verbindungen nach Anspruch 1.

35. Salze nach Anspruch 34, gewählt aus der Metallsalze, Alkali- und Erdalkalimetallsalze, und organische Basensalze umfassenden Gruppe.

36. Salze nach Anspruch 34, gewählt aus der Säureadditionsalze umfassenden Gruppe.

37. Salze nach Anspruch 36, gewählt aus der Gruppe von Salzen, die aus anorganischen Säuren hergestellt worden sind.

38. Verfahren zur Herstellung der Carboxylamide gemäß Anspruch 1, wobei ein Gangliosid oder eines seiner semisynthetischen Derivate mit der zu der einzuführenden Amidgruppe korrespondierenden Aminosäure oder einem ihrer reaktiven Derivate in an sich bekannter Weise umgesetzt wird.

39. Verfahren nach Anspruch 38, wobei ein innerer Ester eines Gangliosids oder eines seiner semisynthetischen Derivate mit der zu der einzuführenden Amidgruppe korrespondierenden Aminosäure umgesetzt wird.

40. Verfahren nach Anspruch 38, wobei ein Carboxyester eines Gangliosids oder eines seiner semisynthetischen Derivate mit der zu der einzuführenden Amidgruppe korrespondierenden Aminosäure umgesetzt wird.

41. Verfahren nach Anspruch 38, wobei ein Gangliosid oder eines seiner semisynthetischen Derivate mit der zu der einzuführenden Amidgruppe korrespondierenden Aminosäure, wobei die Carbonsäure- oder Sulfonsäurefunktion in der Aminosäure geschützt ist, umgesetzt wird.

42. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 38-40, wobei die erhaltenen Produkte in ihre Metall- oder organischen Basensalze oder In deren Säureadditionssalze in an sich bekannter Weise überführt werden.

43. Carboxylamide gemäß Anspruch 1 zur Verwendung in der Therapie.

44. Pharmazeutische Zubereitung, umfassend als Wirkstoff ein Gangliosid- Derivat, bestehend aus einem natürlichen oder semisynthetischen Gangliosid, wobei die Carboxylgruppe in dem Sialinsäureteil des natürlichen oder semisynthetischen Gangliosids mit einer Aminosäure mit einer Carbonsäure oder Sulfonsäurefunktion in ein Carboxylamid umgewandelt worden ist, oder ein Salz hiervon, zusammen mit einem therapeutisch inerten Träger.

45. Pharmazeutische Zubereitungen nach Anspruch 44, wobei das natürliche Gangliosid aus Geweben und Organen des Nervensystems in gereinigter Form erhalten worden ist.

46. Pharmazeutische Zubereitungen nach Anspruch 44, wobei das semisynthetische Gangliosid aus der N-Acyl-N-lyso-ganglioside, N'Acyl-N'lyso-ganglioside und N,N'Diacyl-N,N'dl-lyso-ganglioside umfassenden Gruppe gewählt ist, worin die N- und N'Acylgruppen gleich oder verschieden sind und jede eine Gruppe aus einer wahlweise substituierten aliphatischen Säure ist.