DE69019388T2 - Verwendung von N-Methyl-Sphingosin als Zell-Wachstums-Inhibitor. - Google Patents
Verwendung von N-Methyl-Sphingosin als Zell-Wachstums-Inhibitor.Info
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Description
- Die Erfindung betrifft Zellwachstumsinhibitoren, deren Wirkung zum Teil auf der Inhibierung einiger Proteinkinasen und auch auf andere, bislang unerforschte Mechanismen beruht, und insbesondere betrifft die Erfindung jüngste Erkenntnisse der Erfinder, daß N-Methylsphingosin ein besonders starker Inhibitor des Wachstums vieler Zellen, einschließlich von Tumorzellen, von Zellen, die an der Immunantwort beteiligt sind, und Zellen, die bei Entzündungsreaktionen beteiligt sind, ist. Diese Erkenntnis eröffnet die Möglichkeit der Verwendung dieser Verbindungen als wirksame Wachstumsinhibitoren von Zellen, wie solche, die oben erwähnt wurden. Sofern nicht anders angegeben, bedeutet "Sphingosin" Sphingosin, gleich ob in der D- oder L- oder Erythro- oder Threo-Konfiguration. Wenn nicht anders angegeben, bedeutet "N-Methylsphingosin" N,N-Dimethylsphingosin oder N- Monomethylsphingosin, gleich ob in der D- oder L- oder Erythro- oder Threo- Konfiguration.
- Sphingosin und Sphingoidbase wurden als Inhibitoren der C-Kinase und EGF-Rezeptor assozierter Tyrosinkinase angesehen (Hannun und Bell, Science, 235, 670-674, 1987; Hannun, et al JBC, 261, 12604-12609, 1986; Kreutter, et al, JBC, 262, 1632-1637, 1987) . Jedoch stammte das bei diesen Untersuchungen verwendete Sphingosin aus einer handelsüblichen Quelle (Sigma Chemical Company) . Die Präparation enthielt verschiedene Verunreinigungen, wie 3-O, 5-O-Methylsphingosin und N-Methylsphingosin, da das handelsüblich erhältliche Sphingosin nach Methanolyse von Sphingomyelin oder Cerebrosid hergestellt wird, und diese Verunreinigungen während der Methanolyse eingeführt werden. Ferner wird die "Backbone"-Struktur des Sphingosins, d.h. die D-Erythro-Konfiguration, teilweise in die D-Threo- Konfiguration umgewandelt. Daher bleibt die beobachtete Behauptung, daß Sphingosin ein wichtiger Inhibitor für die C-Kinase wie auch für die EGF- Rezeptor-Kinase ist, aufgrund dieser Veränderungen und verschiedenen Strukturen, die in handelsüblichem Sphingosin vorliegen, zweifelhaft.
- Jedoch bleibt dieses Gebiet aufgrund der potentiellen Wachstumsmodifizierenden Aktivitäten von Sphingosin- und Sphingoidbase und daher der möglichen Anwendung dieser Verbindungen zur Modulation von Zellwachstum ein anregendes Forschungsgebiet.
- WO88/01869 beschreibt die Inhibierung von Proteinkinase-C durch Sphingosin und Analoge davon. Struktur/Aktivitäts-Tests führen zu dem Schluß daß eine lange Alkylkette und eine freie Aminogruppe für die Aktivität essentiell waren.
- Es wurde nun unerwartet gefunden, daß eine freie Aminogruppe für die lnhibierung der Proteinkinase-Aktivität nicht zwingend ist.
- Demnach wird erfindungsgemäß ein Medikament zur Verfügung gestellt, umfassend:
- i Einen oder mehrere Zellwachstuminhibitoren, ausgewählt aus synthetisch hergestelltem N-Methylsphingosin, N-Methylsphingosin hergestellt aus natürlich vorkommendem Sphingolipid, und pharmazeutisch annehmbare Salze davon, und
- ii einen pharmazeutisch annehmbaren Träger, Verdünner oder Exzipienten.
- Erfindungsgemäß wird ein oder werden mehrere Zellwachstumsinhibitoren, ausgewählt aus synthetisch hergestelltem N-Methylsphingosin, N- Methylsphingosin, hergestellt aus natürlich vorkommendem Sphingolipid, und pharmazeutisch annehmbare Salze zur Verwendung als ein Medikament zur Verfügung gestellt.
- Erfindungsgemäß wird die Verwendung von einem oder mehreren Zellwachstumsinhibitoren, ausgewählt aus synthetisch hergestelltem N- Methylsphingosin, N-Methylsphingosin, hergestellt aus natürlich vorkommmendem Sphingolipid, und pharmazeutisch annehmbaren Salzen davon für die Herstellung eines Medikaments zur Inhibierung des Wachstums von Human-, Säuger- oder anderen tierischen Tumoren, zur Verfügung gestellt.
- Erfindungsgemäß wird die Verwendung von einem oder mehreren Zellwachstumsinhibitoren, ausgewählt aus synthetisch hergestelltem N- Methylsphingosin, N-Methylsphingosin, hergestellt aus natürlich vorkommendem Sphingolipid, und pharmazeutisch annehmbaren Salzen davon zur Herstellung eines Medikaments zur lnhibierung der Metastase von Human-, Säuger- oder anderen tierischen Tumoren, zur Verfügung gestellt.
- Erfindungsgemäß wird die Verwendung von einem oder mehreren Zellwachstumsinhibitoren, ausgewählt aus synthetisch hergestelltem N- Methylsphingosin, N-Methylsphingosin, hergestellt aus natürlich vorkommendem Sphingolipid, und pharmazeutisch annehmbaren Salzen davon, zur Herstellung eines Medikaments für die Inhibierung von humaner und tierischer, vorzugsweise der Säuger-Immunantwort, zumindestens teilweise aufgrund von Lymphocyten-Mitogenese, zur Verfügung gestellt.
- Erfindungsgemäß wird die Verwendung von einem oder mehreren Zellwachstumsinhibitoren, ausgewählt aus synthetisch hergestelltem N- Methylsphingosin, N-Methylsphingosin, hergestellt aus natürlich vorkommendem Sphingolipid, und pharmazeutisch annehmbaren Salzen davon für die Herstellung eines Medikaments zur Inhibierung von human oder tierischen Entzündungsreaktionen, zumindestens teilweise wegen der Granulocyten- oder Lymphocyten-vermittelten Mitogenese zur Verfügung gestellt.
- Es wird erfindungsgemäß ein anderes Verfahren zur Inhibierung von humanem oder tierischem Zellwachstum als ein Verfahren zur Behandlung des humanen oder tierischen Körpers durch chirurgische Methoden oder durch am humanen oder tierischen Körper erfolgte Diagnose zur Verfügung gestellt, umfassend das In-Kontaktbringen der Zellen mit einem oder mehreren Zellwachstumsinhibitoren, ausgewählt aus synthisch hergestelltem N- Methylsphingosin, N-Methylsphingosin, hergestellt aus natürlich vorkommendem Sphingolipid, und pharmazeutisch annehmbaren Salzen davon.
- In bevorzugten Ausführungsformen umfaßt der Wachstumsinhibitor synthetisch hergestelltes N, N-Dimethyl-D-erythrosphingenin, synthetisch hergestelltes N,N-Dimethyl-L-erythro-sphingenin oder pharmazeutisch annehmbare Salze davon. Besonders bevorzugt ist synthetisch hergestelltes N,N-Dimethyl-D-erythro-sphingenin oder pharmazeutisch annehmbare Salze davon
- Fig. 1 zeigt die Strukturen von Sphingosin und verschiedenen synthetisch hergestellten Sphingosinderivaten.
- Fig. 2 ist eine graphische Darstellung des Inhibitoreffektes von Sphingosin und verschiedenen synthetisch hergestellten Sphingosinderivaten auf die Aktivität von C-Kinase. Die Abzisse gibt die Konzentration an Sphingosin, synthetisch hergestellten Sphingosinderivaten, Sphingosin, hergestellt aus natürlich vorkommendem Sphingolipid oder Sulfatid im /uM wieder. Die Ordinate gibt relative Aktivität von C-Kinase (%) wieder. Geschlossene Kreise: Synthetisch hergestelltes N,N-Dimethyl-D-erythrosphingenin (N,N-DiMe-D-erythro) oder Sphingosin, bevorzugt aus natürlich vorkommendem Sphingolipid (Sphingosin); offene Kreise: N,N-Dimethyl-L- erythro-sphingenin (N,N-DiMe-L-erythro); geschlossene Quadrate: L-Erythrosphingenin (L-Erythro); offene Quadrate: D-Erythro-sphingenin (D-Erythro); offene Dreiecke: Sulfatid.
- Fig. 3 ist eine graphische Darstellung des Inhibitoreffektes von Gangliosiden und Sulfatiden auf die Aktivität von C-Kinase. Die Abzisse gibt die Konzentration der Ganglioside oder von Sulfatid in /uM wieder. Die Ordinate gibt die relative Aktivität von C-Kinase (%) wieder. Geschlossene Kreise: GT1b; offene Kreise: GM&sub3;; offene Dreiecke: Sulfatid. Die Glykolipide werden nach dem System von Svennerholm (Svennerholm, L. J.Neurochem. 10, 613-623, 1963) abgekürzt.
- Fig. 4 ist eine graphische Darstellung der Wirksamkeit des N- Methylsphingosins, hergestellt aus natürlich vorkommendem Sphingolipid, auf das Wachstum von humanen Colon-Krebszellen HRT-18. Die Abzisse gibt die Konzentration des Sphingosinderivats oder Ceramids in /uM wieder. Die Ordinate gibt die relative Inhibierung an Zellwachstum (%) wieder. Offene Kreise: Ceramid (Cer); offene Dreiecke: N-Äcetylsphingosin (NAc); geschlossene Quadrate: N,N-Dimethylsphingosin. (N,N-DiMe), hergestellt von natürlich vorkommendem Sphingolipid; geschlossene Kreise: N- Monomethylsphingosin (N-MonoMe), hergestellt aus natürlich vorkommendem Sphingolipid; offene Quadrate: N-N-Dimethyl-L-threo-sphingosin (N,N-DiMe- L-threo), hergestellt aus natürlich vorkommendem Sphingolipid.
- Fig. 5 ist eine graphische Darstellung der Inhibierung von humanem Krebszellwachstum in Nacktmäusen mit N,N-Dimethylsphingosin (N,N- DiMe), hergestellt aus natürlich vorkommendem Sphingolipid. Die Abzisse gibt die Tage wieder. Die Ordinate gibt das Tumorgewicht (mg) wieder. Die Kontrolle war Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS).
- Fig. 6 ist eine graphische Darstellung der Inhibierung der Concanavalin-A-induzierten Mitogenese von humanen peripheren Blutlymphocyten durch N-N-Dimethylsphingosin, hergestellt aus natürlich vorkommendem Sphingolipid. Die Abzisse gibt die Konzentration von N,N- Dimethylsphingosin (N,N-DiMe: geschlossene Kreise), hergestellt aus natürlich vorkommendem Sphingolipid, Sphingosin (offene Dreiecke) oder N- Acetylsphingosin (NAC: offene Kreise) in /uM wieder. Die Ordinate gibt die relative Inhibierung der DNA-Synthese (%) wieder.
- Fig. 7 ist eine graphische Darstellung der Inhibierung der IL-2- induzierten Mitogenese von humanen peripheren Blutlymphocyten durch N,N- Dimethylsphingosin, hergestellt aus natürlich vorkommendem Sphingolipid. Die Abzisse gibt die Konzentration von N,N-Dimethylsphingosin (N,N-DiMe: geschlossene Kreise), hergestellt aus natürlich vorkommendem Sphingolipid, Sphingosin (offene Dreiecke) oder N-Acetylsphingosin (NAc: offene Kreise) in /uM wieder. Die Ordinate gibt die relative Inhibierung der DNA-Synthese (%) wieder.
- Wie hier verwendet, bedeutet "Sphingosin" Sphingosin, unabhängig von der D- oder L- oder Erythro- oder Threo-Konfiguration.
- Wie hierin verwendet, bedeutet "N-Methylsphingosin" N,N- Dimethylsphingosin oder N-Monomethylsphingosin, unabhängig von der D- oder L-/Erythro- oder Threo-Konfiguration, sofern nicht anders angegeben.
- Ebenfalls bedeutet, wie hierin verwendet, "Inhibierung" "verhindern und/oder verlangsamen".
- Ferner bedeutet, wie hierin verwendet, "synthetisch hergestellt" N- Methylsphingosin, N-Methylsphingosin, hergestellt aus einem synthetisch hergestellten Sphingosin-"Backbone", d.h. die Struktur ist ein synthetisches Produkt, und N-Methylsphingosin, "hergestellt aus natürlich vorkommendem Sphingolipid" bedeutet N-Methylsphingosin, hergestellt aus Sphingolipiden, die natürlich vorkommen, wie z.B. Sphingomyelin, Cerebrosid usw.
- Zur Klärung der Zweideutigkeit, ob Sphingosin ein wichtiger Inhibitor der Proteinkinasen ist, einschließlich der C-Kinase und EGF-Rezeptor-Kinase und daher ein potentieller Kandidat zur Inhibierung von Zellwachstum ist, verwendeten die Erfinder synthetisch hergestelltes, chemisch gut definiertes D- und L-Erythro- und Threo-sphingosin und ihre N,N- Dimethylderivate, wie auch Sphingosin, hergestellt aus natürlich vorkommendem Sphingolipid, gezeigt in Fig. 1 , und bewerteten die Inhibitor-Wirkung dieser Verbindungen auf die Proteinkinase. Ein Vergleich der Wirkung von chemisch gut definierten synthetisch hergestellten Stereoisomeren von Sphingosin und Derivaten auf die C-Kinase-Aktivität aus A413-Zellen (Human-Epidermol-Karzinomzellen) ist in Fig. 2, Fig. 3 und den Tabellen I und II gezeigt (s. Beispiel 2) .
- Es konnten die folgenden Schlußfolgerungen gezogen werden:
- 1. D-Erythro- und L-Erythrosphingenin zeigten eine schwache und ähnliche Inhibitor-Wirkung
- 2. Synthetisch hergestelltes N,N-Dimethyl-D-erythrosphingenin zeigte eine deutlich starke Inhibitor-Wirkung für C-Kinase. Synthetisch hergestelltes N,N-Dimethyl-D-erythrosphingenin zeigte eine schwächere Inhibitor-Wirkung, die aber noch stärker war als bei nichtsubstituiertem Sphingenin mit freien Aminogruppe.
- 3. Die Inhibitor-Wirkung von synthetisch hergestelltem N,N- Dimethyl-D-erythrosphingenin war höher als N-Acetyl-GM&sub3;, N-Glykolyl-GM&sub3; und CD1a -Gangliosiden, hatte aber einen ähnlichen Bereich an Inhibitoraktivität wie das am potenteste Inhibitor-Gangliosid GT1b.
- 4. Aufgrund der Analogie erwartet man, daß synthetisch hergestelltes N,N-Dimethyl-D-erythrosphingenin und synthetisch hergestelltes N,N-Dimethyl-L-erytbrosphingenin ähnliche Aktivität auf die EGF-Rezeptor-Kinase zeigen.
- Synthetisch hergestellte N-Methylsphingosine, einschließlich N,N- Dimethyl-D-erythrosphingenin und N-Methyl-L-erythrosphingenin können nach bekannten Verfahren hergestellt werden, umfassend die reduktive Methylierung des entsprechenden nichtmethylierten Sophingosins, z.B. D(+ ) - Erythrosphingenin und L(-) -Erythrosphingenin, in Gegenwart von Formaldehyd und Natriumborhydrid (Means und Feeney, Biochemistry, 7, 2192, 1968; Chemical Modification of Proteins, Holden-Day, Inc., San Francisco, Seite 217, 1971) . Das erhaltene synthetisch hergestellte N,N-Dimethylsphingosin oder die Sphingeninderivate können durch TLC oder HPLC gereinigt werden. N- Monomethylderivate wurden aus Backbone-Sphingenin durch aufeinanderfolgende N-tert-Butyloxycarbonylierung (Di-ter-Butyldicarbonat-NaHCO&sub3;), O- Acetylierung (Essigsäureanhydrid-Pyridin), N-Methylierung (Methyljodid- Natriumhydrid-Dimethylformamid) und Schutzgruppenentfernung synthetisiert. Die erhaltenen Verbindungen wurden ebenfalls mit TLC und HPLC gereinigt.
- Die synthetisch hergestellten Backbone-Sphingenine, D(+ ) - Erythrosphingenin und L(-) Erythrosphingenin können nach verschiedenen bekannten Verfahren hergestellt werden, entweder ausgehend vom L-Serin (Radunz H-E, Devant RM, Eiermann V, Liebigs Ann Chem 1103-1105, 1988; Nimkar S, Menaldino D, Merrill AH, Liotta D, Tetrahedron Lett. 29: 3037- 3040, 1988; Herold P. Helvetica Chimica Acta 71: 354-362, 1988), oder ausgehend von D-Glucose (Koike, K., et al Carbohydrate Research, 158, 113- 123, 1986; Koike, K., et al An efficient synthesis of ceramide from D- Glucose, Glycoconjugate Journal, 1, 107-109, 1984) . Die Struktur des Sphingosins und der N-Methylderivate kann durch NMR-Spektrometrie und "Fast-Atom-Bombardment"-Massenspektrometrie bestätigt werden.
- Zusätzlich haben die Erfinder gefunden, daß N-Methylsphingosin, hergestellt aus natürlich vorkommendem Sphingolipid, eine qualitativ analoge Wirkung, wie synthetisch hergestelltes N-Methylsphingosin hat.
- Das Sphingosin-Backbone kann hergestellt werden nach zwei bekannten Verfahren: (1) Methanolyse von natürlichem Sphingolipid nach Tielfelder, H. und Klenk, E. (Die Chemie der Cerebrocide und Phosphatide, J. Springer, Berlin, 1930) und modifiziert von Gaver, R.C. und Sweeley, C.C. (J. Am. Oils Chem. Soc., 42: 294-298 1965); und (2) enzymatische Hydrolyse von natürlichen Sphingolipiden durch Glykosidase und Ceramiden, wie beschrieben bei Kanfer in Hakomori, S., Handbook of Lipid Research, Volume 3, Sphingolipid Biochemistry, Kafer, J.N. und Hakamori, S. (Eds.) , Plenum, New York, Seiten 167-247 (1983) .
- N-Methylsphingosin kann aus natürlich vorkommendem Sphingolipid durch N-Methylierung in Gegenwart von Formaldehyd und Natriumborhydrid hergestellt werden (Means, G.E. & Feeney, R.E., Biochemistry, 7, 2192-2201, 1968) .
- Geeignete Quellen an natürlich vorkommendem Sphingolipid umfassen Gehirn, Niere, Milz, Blutzellen und andere Organe und Gewebe von Tieren. Man erwartet, daß Hefe und Pflanzenkörner ebenfalls geeignete Quellen von natürlich vorkommendem Sphingolipid sind.
- Die Struktur des Sphingosins oder N-Methylsphingosins kann durch Massenspektrometrie und ¹H-NMR-Spektroskopie bestätigt werden.
- Einige der Erfinder verglichen die Wirkung von aus natürlich vorkommendem Sphingolipid hergestellten N-Methylsphingosin mit nichtmethyliertem Sphingosin. Die Vergleiche sind in den Figuren 4 bis 7 gezeigt. Aus diesen Daten können die folgenden Schlüsse gezogen werden.
- 1. N,N-Dimethylsphingosin, N-Monomethylsphingosin und N,N- Dimethyl-L-threosphingosin, hergestellt aus natürlich vorkommendem Sphingolipid, zeigten eine starke Inbibitor-Aktivität auf das Wachstum von humanen Colon-Krebszellen in vitro.
- 2. Aus natürlich vorkommendem Sphingolipid hergestelltes N,N- Dimethylsphingosin zeigte einen statistisch signifikanten Inhibitor-Effekt auf das in vivo -Wachstum von humanen Tumorzellen in nackten Mäusen.
- 3. Aus natürlich vorkommendem Sphingolipid hergestelltes N,N- Dimethylsphingosin zeigte einen starken Inhibitor-Effekt auf die Concanavalin-A-induzierte Mitogenese von humanen peripheren Blutlymphocyten und von Maussplenocyten.
- 4. Aus natürlich vorkommendem Sphingolipid hergestelltes N,N- Dimethylsphingosin zeigte einen starken Inhibitor-Effekt auf die IL-2- abhängige Mitogenese von humanen peripheren Blutlymphocyten und von Maussplenocyten
- Man erwartet, daß die erfindungsgemäßen Medikamente und Verfahren zur Inhibierung des Wachstums von Tumorzellen, von Tumoren und der Metastase von Tumoren besonders wirksam sind, wenn sie in Kombination mit vorhandenen chemotherapeutischen Mitteln, wie z.B. Mitomycin und 5-Fluoruracil eingesetzt werden.
- Geeignete pharmazeutisch annehmbare Salze von synthetisch hergestelltem Sphingosin, synthetisch hergestelltem N-Methylsphingosin, aus natürlich vorkommendem Sphingolipid hergestellten Sphingosin und aus natürlich vorkommendem Sphingolipid hergestellten N-Methylsphingosin können durch den Fachmann leicht festgelegt werden.
- Geeignete pharmazeutisch annehmbare Träger, Verdünner oder Exzipienten für Medikamente gemäß der vorliegenden Erfindung hängen von der bestimmten medizinischen Verwendung des Medikaments ab und können durch den Fachmann leicht festgelegt werden.
- Geeignete Verabreichungsverfahren für die erfindungsgemäßen Medikamente hängen von der bestimmten medizinischen Anwendung ab und können leicht durch den Fachmann festgelegt werden.
- Geeignete Dosierungen der erfindungsgemäßen Medikamente hängen von der jeweiligen medizinischen Anwendung, wie auch dem Gewicht des Patienten usw., ab und können leicht vom Fachmann, z.B. durch Extrapolation aus den in vitro-Daten, wie z.B. in Fig. 2 und Tabelle I für aus natürlich vorkommendem Sphingolipid hergestellten Sphingosin und synthetisch hergestelltem N-Methylsphingosin, und wie in Fig. 4 gezeigt, für aus natürlich vorkommendem Sphingolipid hergestellten N-Methylsphingosin, oder aus in vivo-Daten, wie solchen, wie in Fig. 5 für aus natürlich vorkommendem Sphingolipid hergestellten N-Methylsphingosin gezeigt, abgeleitet werden.
- Die Erfindung wird im folgenden unter Bezugnahme auf spezifische Beispiele beschrieben. Sofern nicht anders angegeben, sind alle Prozentangaben, Verhältnisangaben usw. auf das Gewicht bezogen.
- D(+) -Erythrosphingenin, L(-) -Erythrosphingenin, L(-) -Threosphingenin und L(-)-Threosphingenin wurden wie zuvor beschrieben hergestellt (Koike, K. et al Carbohydrate Research, 158, 113-123, 1986, Koike, K. et al, An efficient synthesis of ceramide from D-Glucose, Glycoconjugate Journal, 1, 107-109, 1984) . N,N-Dimethylderivate wurden durch reduktive Methylierung von Erythrosphingenin in Gegenwart von Formaldehyd und Natriumborhydrid hergestellt (Means & Feeney, Biochemistry, 7, 2192, 1968; Chemical Modification of Proteins, ; Holden-Day, Inc., San Francisco, Seite 217, 1971) .
- Die synthetisch hergestellten Backbone-Sphingenine, D(+ ) - Erythrosphingenin und L(-) -Erythrosphingenin können ebenfalls nach verschiedenen bekannten Verfahren, entweder ausgehend von L-Serin (Radunz H-E, Devant RM, Eiermann V, Liebigs Ann Chem 1103-1105, 1988; Nimkar S, Senaldino D, Merrill AH, Liotta D, Tetrahedron Lett, 29: 3037-3040, 1988; Herold P, Helvetica Chimica Acta 71: 354-362, 1988), oder ausgehend von D- Glukose (Koike et al, supra) hergestellt werden.
- Für einen Vergleich wurde rohes Sphingosin aus Cerebrosid durch Methanolyse, wie ursprünglich von Tierfelder und Klenk beschrieben (Die Chemie von Cerebrosid und Phosphatid, Springer Verlag, Berlin, 1932), hergestellt.
- Die Strukturen der N,N-Dimethylsphingosinderivate wurden durch NMR- Spektroskopie und "Fast Atom Bombardment"-Massenspektrometrie bestätigt.
- A431-Zellen wurden in einer Mischung von DME und Ham's F-12-Medium (Gewichtsverhältnis 1:1), ergänzt mit 10 fötalem Kalbsserum (FCS), kultiviert. Aus 50 150 cm-Schalen geernteten Zellen wurden gleichzeitig für die partielle Reinigung von C-Kinase nach dem Verfahren von Kreutter et al (JBC 262, 1633-1637, 1987) behandelt. Das heißt, die Zellen wurden mit einem Gummiwischer abgekratzt, in 50 ml 20 mM Tris-HCI (pH 7,5), 2 mM EDTA, 0,5 mM EGTA, 0,15 Einheiten/ml Aprotinin und 0,25 M Saccharose suspendiert und mit 50 Schlägen bei 4ºC in einem Dounce-Homogenisator (40 ml Größe, Wheaton) homogenisiert. Die homogenisierten Zellen wurden bei 100.000 x g 60 min ultrazentrifugiert. Der Überstand wurde auf einer DE52-Säule, equilibriert mit 20 mM Tris-HCl (pH 7,5), 2 MM EDTA und 0,5 mM EGTA (Puffer P) gereinigt und gut mit diesem Puffer gewaschen. Die C-Kinase-Aktivität wurde mit Puffer B, enthaltend 0,1 M NaCl, eluiert. Die Aktivität in dieser Fraktion war 200 bis 500 pmol P/min/mg Protein. Die Fraktion, die frei von A-Kinase und anderen Kinasen war, wurde in Aliquots aufgeteilt und bei - 80ºC gehalten.
- Im Hinblick auf die extrem variablen Ergebnisse, die in einem gemischten Micellsystem erhalten werden, wie von Beil und Hannun (Science 235, 670-674, 1987) beschrieben, wurde das Standard-Liposomverfahren, beschrieben von Kreutter et al, (JBC, 260 5979-5986, 1985) leicht modifiziert, und der Effekt von Sphingosin und Sphingosinderivaten (nichtglykosyliert und glykolsyliert) unter diesen Bedingungen untersucht. In konischen Röhrchen (1,5 ml Inhalt, Sarstedt) wurden Phosphatidylserin (5/ug/Röhrchen) und 1,2-Diolein (0,05/ug/Röhrchen) mit oder ohne geeigneter Menge von Sphingosin (Sphingosin, hergestellt aus natürlich vorkommendem Sphingolipid wurde wie in Beispiel 3 beschrieben, hergestellt), seine Derivate oder Sulfatide in einem organischen Lösungsmittel (Ethanol oder Chloroform-Methanol) zugegeben, und die Mischung wurde unter -einem N&sub2;-Strom verdampft. Die Lipidmischung wurde in 30/ul 20 mM Tris-HCl (pH 7,5) 30 Minuten lang Ultraschall-behandelt. Die Liposome in dem Röhrchen wurden mit der Reaktionsmischung, bestehend aus 25 mM Tris-HCl (pH 7,5), 10 mM MgCl&sub2;, 400/uM EDTA, 50/uM EGTA, 500/uM CaCl&sub2;, 200/ug/ml Histon III-S und 20/uM gamma-[³²P]-ATP (2 x 10&sup6; cpm) ergänzt; Endvolumen war 90/ul.
- Die Reaktion wurde durch Zugabe von 10/ul C-Kinase-Fraktion (enthaltend 1-2/ug Protein), hergestellt wie oben beschrieben, gestartet, und die Reaktionsmischung wurde 10 min bei 30ºC inkubiert. Die Reaktion wurde durch Zugabe von 1 ml 25% TCA mit 200/ul 1 RSA in 1 mM ATP-Lösung (ph 7,5) abgebrochen. Das Präzipitat wurde zentrifugiert, zweimal mit 1 ml 25 % TCE gewaschen, in 1 ml 1 N NaOH, enthaltend 0,1 Deoxycholat, unter leichter Erwärmung (80ºC für 10 min) gelöst und in einem Scintillationszähler gezählt. Der Wert ohne Phosphatidylserin, 1,2-Diolein, oder Ca²&spplus; wurde als Kontrolle verwendet. Die Effekte von Sphingosin und Sphingosinderivaten sind in Figur 2 und Figur 3 gezeigt und sind in Tabelle I und Tabelle II im folgenden zusammengefaßt. TABELLE I Inhibitoreffekt von Sphingosin und verschiedenen Sphingosinderivaten auf C-Kinase-Aktivitä Zugesetztes Sphingolipid Inhibierung der C-Kinase (Konzentration in /uM unter Erhalt einer 50 %igen Inhibierung) A. Sphingosine und nichtglykosylierte Derivate Ceramid Sphingosin (D-Erythro, SigmaSM) Sphingosin (D-Erythro, SigmaCer) Sphingosin (D-Erythro) Sphingosin (L-Erythro) Sphingenin (L-Threo) Sphingenin (DL-Erythro, Sigma) keine Date N-Acetylsphingosin D-Erythro-N, N-dimethylsphingosin L-Erythro-N, N-dimethylsphingosin Sphingosin, hergestellt aus natürlich vorkommendem Sphingolipid B. Glyokosylierte Derivate Lactosylsphingosin GM&sub3; (N-Acetyl) GM&sub3; (N-Glykolyl) keine Inhibierung keine Daten TABELLE II Inhibierung der C-Kinase-Aktivität durch Sphingosine Zugesetztes Lipid Menge (/uM) C-Kinase ³²P Einbau Phosphatidylserin, Diolein, Ca²&spplus; D-Erythrosphingenin L-Erythrosphingenin N,N-Dimethyl-D-erythrosphingenin N, N-Dimethyl-L-erythrosphingenin 10/um 25583 + 1931 65 + 5 * Siehe Text
- Aus den in Tabelle I und Tabelle II angegebenen Daten und den Ergebnissen in Fig. 2 und Fig. 3 können die folgenden Schlüsse gezogen werden
- 1. Synthetisch hergestelltes D-Erythro- und L-Erythrosphingenin zeigten eine schwache und ähnliche Inhibitoraktivität.
- 2. Synthetisch hergestelltes N,N-Dimethyl-D-erythrosphingenin zeigte eine überzeugend starke Inhibitoraktivität auf C-Kinase. N,N- Dimethyl-L-erythrosphingenin zeigte eine schwächere Inhibitoraktivität, die aber immernoch stärker war als bei nicht-substituiertem Sphingenin mit freien Aminogruppen.
- 3. Die Inhibitoraktivität von synthetisch hergestelltem N,N- Dimethyl-D-erythrosphingenin war höher als N-Acetyl-GM&sub3;, N-Glykolyl-GM&sub3; und GD1a-Gangliosiden, hatte jedoch einen ähnlichen Bereich bei der Inhibitoraktivität als das wirksamste Inhibitorgangliosid GT1B.
- Sphingosin wurde nach Methanolyse von Gehirnsphingolipid-Fraktion nach dem Verfahren, ursprünglich beschrieben von Thierfelder H. & Klenk E. (Die Chemie der Cerebroside und Phosphatide, J. Springer, Berlin 1930) und modifiziert von Gaver R.C. und Sweeley C.C. (J Am Oil Chem Soc 42: 294-298, 1965) hergestellt. Das heißt, rohes Sphingolipid wurde in Methanol, enthaltend 0,1 M HCl (hergestellt aus wäßrig-konzentrierter HCl) gelöst und unter Rückfluß über Nacht erhitzt. Die methanolische HCl-Lösung wurde mit Petrolether (Hexan) unter Abtrennung der Fettsäuren ausgeschüttelt. Die untere Phase wurde neutralisiert, der ph auf 10 mit NaOH eingestellt, worauf Ausschütteln mit Ethylether folgte. Die Ethyletherschicht (obere Schicht), enthaltend Sphingosinbase, wurde zur Trockne eingedampft und weiter auf HPLC gereinigt, und der Peak, entsprechend dem D- Erythrosphingenin wurde abgetrennt.
- Sphingosin kann auch durch Hydrolyse von Sphingolipiden mit Glykosidasen und Phosphodiesterasen und anschließender Behandlung mit Ceramidase (Kanfer J.N., Seiten 167-247 in Kanfer J.N. & Hakomori S. (eds.) Sphingolipid biochemistry (Handbook of Lipid Research, Band 3, Plenum, NY, 1983) hergestellt werden. Das heißt, Cerebrosid kann mit 3-Galactosidase oder β-Glukosidase in Gegenwart von Triton X-100 behandelt werden. Sphingomyelin kann mit Phosphodiesterase in Gegenwart von Triton X-100 behandelt werden. Daher kann das freigesetzte Ceramid mit Cermidase unter Freisetzung von Sphingosin hydrolysiert werden. Kürzlich wurde eine Ceramidase, die direkt auf Sphingolipide einwirkt, in Nocardia sp. gefunden (Hirabayashi Y., et al, J. Biochem. (Tokyo) 103: 1-4, 1988).
- N,N-Dimethyl- und N-Monomethylsphingosin, wie in den Beispielen 4 bis 7 verwendet, wurde ausschließlich aus Sphingosinpräparationen, stammend aus Gehirnsphingolipiden, und anschließender N-Methylierung in Gegenwart von Formaldehyd und Natriumborhydrid (Means, G.E. & Feeney, R.E., Biochemistry, 7, 2192-2201, 1968) hergestellt, und seine Struktur wurde durch Massenspektrometrie und ¹H-NMR-Spektroskopie identifiziert.
- Die Wirkung von N,N-Dimethylsphingosin, N-Monomethylsphingosin und N,N-Dimethyl-L-threosphingosin (alle hergestellt aus natürlich vorkommenden Sphingolipiden, wie in Beispiel 3 beschrieben ) auf das Wachstum humaner Colonkrebszellen HRT-18 (erhalten von ATCC) wurde in Dulbecco's modifiziertem Eagle's-Medium wie folgt getestet.
- HRT-18-Zellen wurden auf Platten in Dulbecoo's modifiziertem Eagle's- Medium, ergänzt mit 10 fötalem Kalbsserum (5 x 10&sup5; - Zellen pro jeweils 3 cm Platte) ausgesät. Nachdem die Zellen über Nacht kultiviert wurden, wurde das Medium mit dem gleichen Medium, enthaltend verschiedene Konzentrationen von N,N-Dimethyl- oder N-Monomethylphingosin, N-Acetylsphingosin und Ceramid, wie in Fig. 4 gezeigt, ersetzt. Die Kultur wurde weiter 3 Tage fortgesetzt, und die Anzahl der Zellen wurde festgestellt. Die Prozentinhibierung der Zellzahlen in Gegenwart von Reagenzien wurde als Prozentwert der Kontrollschalen berechnet, die keine Sphingosinderivate enthielten.
- Die Ergebnisse sind in Fig. 4 gezeigt.
- In Fig. 4 ist auf der Abzisse die Konzentration des Sphingosins oder Ceramids in /uM angegeben. Auf der Ordinate ist die relative Inhibierung des Zellwachstums (%) angegeben. Offene Kreise: Ceramid (Cer); offene Dreiecke: N-Acetylsphingosin (NAc); geschlossene Quadrate: N,N- Dimethylsphingosin (N,N-DiMe), hergestellt aus natürlich vorkommendem Sphingolipid; geschlossene Kreise: N-Monomethylsphingosin (N-MonoMe), hergestellt aus natürlich vorkommendem Sphingolipid; offene Quadrate: N,N- Dimethyl-L-threosphingosin (N,N-DiMe-L-threo), hergestelt aus natürlich vorkommendem Sphingolipid.
- Die Ergebnisse zeigen, daß N,N-Dimethylsphingosin wie auch N- Monomethylsphingosin und N,N-Dimethyl-L-threosphingosin deutlich bei 12/5/uM Konzentration inhibierten, wogegen Ceramid oder N-Acetylsphingosin eine minimale Inhibierung auch bei einer 150/um Konzentration zeigten.
- Die Wirkung von N,N-Dimethylsphingosin, hergestellt aus natürlich vorkommendem Sphingolipid, wie in Beispiel 3 beschrieben, auf das in vivo- Wachstum von HRT18-Tumorzellen in Nacktmäusen wurde wie folgt bestimmt.
- 1 x 10&sup6; HRT-18 humane Colonkrebszellcn wurden in Nacktmäusen am Tag 0 nach bekannten Verfahren inokuliert. N,N-Dimethylsphingosin, emulgiert ind Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS) (44/ug/200/ul) wurde am Tag 7, 11 und 15 injiziert. Das Tumorwachstumsgewicht in mg wurde aufgrund der Größe der Tumore geschätzt. Jede Gruppe bestand aus zehn Tieren.
- Die Ergebnisse sind in Fig. 5 gezeigt.
- In Fig. 5 sind auf der Abzisse die Tage und auf der Ordinate das Turmogewicht (mg) aufgetragen. Die offenen Kreise bedeuten die Kontrolle, PBS allein. Die geschlossenen Kreise bedeuten N,N-Dimethylsphingosin (N,N- DiMe) .
- Die Ergebnisse zeigen, daß das in vivo-Wachstum von HRT18-Tumorzellen in Nacktmäusen durch N,N-Dimethylsphingosin inhibiert war. Die Inhibierung des Wachstums war mehr als 50 %, und eine statistische Aufarbeitung zeigte, daß die Inhibierung signifikant war (p> 0,005) .
- Der Effekt von N,N-Dimethylsphingosin (hergestellt aus natürlich vorkommendem Sphingolipid, wie in Beispiel 3 beschrieben) auf Concanavalin- A (con-A)-induzierter Mitogenese wurde unter Verwendung humaner peripherer Blutlymphocyten und Maussplenocyten getestet.
- Periphere Blutlymphocyten, isoliert aus humanem Blut nach bekannten Verfahren, wurde in RPMI, enthaltend 2/ug con-A/ml 18 Stunden in multiplen Wells kultiviert. Anschließend wurden verschiedene Konzentrationen von N,N- Dimethylsphingosin, Sphingosin oder N-Acetylphingosin, wie in Fig. 6 gezeigt, zu den Kulturmedien zugegeben und kontinuierlich 5 Stunden kultiviert, worauf Zugabe von ³H-Thymidin folgte. Die Thymidinaufnahme über einen 5-Stunden-Zeitraum wurde bestimmt.
- Die Prozentinhibierung der Mitogenese wurde auf Basis der Kontrollwerte (ohne Zugabe eines Inhibitors) berechnet.
- Inhibierung von con-A-induzierter Mitogenese auf Maussplenocyten wurde in einer analogen Weise bestimmt. Die Ergebnisse für periphere Blutlymphocyten sind in Fig. 6 wiedergegeben.
- In Fig. 6 ist auf der Abzisse die Konzentration in /uM von N,N- Dimethylsphingosin (N,N-DiMe: geschlossene Kreise), hergestellt aus natürlich vorkommendem Sphingolipid, Sphingosin (offene Dreiecke) oder N- Acetylsphingosin (NAc: offene Kreise) wiedergegeben. Auf der Ordinate ist die relative Inhibierung der DNA-Synthese (%) aufgetragen.
- Die in Fig. 6 gezeigten Daten zeigen, daß con-A-abhängige Wachstumsstimulierung in hohem Maße in Gegenwart von N,N- Dimethylsphingosin, aber nicht in Gegenwart von unsubstituiertem Sphingosin oder N-Acetylsphingosin inhibiert wurde.
- Abnliche Ergebnisse wurden unter Verwendung von Maussplenocyten erhalten.
- Die Wirkung von N,N-Dimethylsphingosin (hergestellt aus natürlich vorkommendem Sphingolipid, wie in Beispiel 3 beschrieben) auf die IL-2- abhängige Mitogenese wurde unter Verwendung humaner peripherer Blutlymphocyten und Maussplenocyten getestet.
- Humane periphere Blutlymphocyten, isoliert aus humanem Blut nach bekannten Verfahren, wurden in RPMI, enthaltend 0,5 Einheiten/ml IL-2 kultiviert. Anschließend wurde das Medium mit Medium, das verschiedene Konzentrationen von N,N-Dimethylsphingosin, Sphingosin und N- Acetylsphingosin, wie in Fig. 7 gezeigt, ersetzt, worauf die Zugabe von ³H- Thymidin folgte. Die Mitogenese wurde durch Einbau von ³H-Thymidin in die DNA über einen 5-stündigen Zeitraum gemessen. Der Prozentsatz der Inhibierung im Vergleich zum Kontrollwert (ohne Zugabe eines Inhibitors) wurde bestimmt.
- Die Inhibierung der IL-2-induzierten Mitogenese auf Maussplenocyten wurde in analoger Weise bestimmt.
- Die Ergebnisse für periphere Blutlymphocyten sind in Fig. 7 wiedergegeben.
- In Fig. 7 ist auf der Abzisse die Konzentration in /uM von N,N- Dimethylsphingosin (N,N-DiMe: geschlossene Kreise), hergestellt aus natürlich vorkommendem Sphingolipid, Sphingosin (offene Dreiecke) oder N- Acetylsphingosin (NAc: offene Kreise) wiedergegeben. Auf der Ordinate ist die relative Inhibierung der DNA-Synthese (%) aufgetragen.
- Die Daten in Fig. 7 zeigen, daß die Mitogenese ohne Veränderung in Gegenwart von N,N-Dimethylsphingosin, jedoch weniger in Gegenwart von unsubstituiertem Sphingosin oder N-Acetylsphingosin inhibiert war.
- Ähnliche Ergebnisse wurden unter Verwendung von Maussplenocyten erhalten.
- Aus den Ergebnissen der Beispiele 4 bis 7 können die folgenden Schlüsse gezogen werden:
- 1. N,N-Dimethylsphingosin, N-Monomethylsphingosin und N,N- Dimethyl-L-threosphingosin, hergestellt aus natürlich vorkommendem Sphingolipid, zeigten eine starke Inhibitoraktivität auf das Wachstum humaner Colonkrebszellen in vitro.
- 2. N,N-Dimethylsphingosin, hergestellt aus natürlich vorkommendem Sphingolipid, zeigte einen statistisch signifikanten Inhibitoreffekt auf das in vivo-Wachstum von humanen Tumorzellen in Nacktmäusen.
- 3. N,N-Dimethylsphingosin, hergestellt aus natürlich vorkommendem Sphingolipid, zeigte einen starken Inhibitoreffekt auf die Concanavalin-A- induzierte Mitogenese von humanen peripheren Blutlymphocyten und Maussplenocyten.
- 4. N,N-Dimethylsphingosin, hergestellt aus natürlich vorkommendem Sphingolipid, zeigte einen starken Inhibitoreffekt auf die IL-2-abhängige Mitogenese humaner peripherer Blutlymphocyten und Maussplenocyten.
- Während die Erfindung in Einzelheiten unter Bezugnahme auf spezifische Ausführungsformen beschrieben wurde, ist es für den Fachmann offensichtlich, daß verschiedene Veränderungen und Modifikationen gemacht werden können.
Claims (24)
1. Einer oder mehrere Zellwachstumsinhibitoren, ausgewählt aus
synthetisch hergestelltem n-Methylsphingos in, N-Methylsphingosin,
hergestellt aus natürlich vorkommendem Sphingolipid, und pharzmazeutisch
annehmbaren Salzen zur Verwendung als Arzneimittel.
2. Zellwachstumsinhibitor gemäß Anspruch 1, umfassend N,N-
Dimethylsphingosin, hergestellt aus natürlich vorkommendem Sphingolipid,
oder N-Monomethylsphingosin, hergestellt aus natürlich vorkommendem
Sphingolipid, oder synthetisch hergestelltes N-N-Dimethyl-D-
erythrosphingenin, synthetisch hergestelltes N,N-Dimethyl-L-
erythrosphingenin oder pharmazeutisch annehmbare Salze.
3. Zellwachstumsinhibitor gemäß Anspruch 2, umfassend synthetisch
hergestelltes N,N-Dimethyl-D-erythrosphingenin oder N,N-Dimethylsphingosin,
hergestellt aus natürlich vorkommendem Sphingolipid, oder pharmazeutisch
annehmbare Salze.
4. Zellwachstumsinhibitor gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3 zur
Verwendung als Arzmeimittel für die Inhibierung von Säugerzellwachstum.
5. Zellwachstumsinhibitor gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3 zur
Verwendung als Arzneimittel bei der Behandlung bösartiger oder gutartiger
Tumorzellen
6. Verwendung von einem oder mehreren Zellwachstumsinhibitoren,
ausgewählt aus synthetisch hergestelltem N-Methylsphingosin, N-
Methylsphingosin, hergestellt aus natürlichem Sphingolipid, und
pharmazeutisch annehmbaren Salzen davon, zur Herstellung eines
Arzneimittels für die Inhibierung des Wachstums von Tumoren bei Menschen,
Säugern oder anderen Tieren.
7. Verwendung von einem oder mehreren Zellwachstumsinhibitoren,
ausgewählt aus synthetisch hergestelltem N-Methylsphinosin, N-
Methylsphingosin, hergestellt aus natürlich vorkommendem Sphingolipid, und
pharmazeutisch annehmbaren Salzen davon zur Herstellung eines Arzneimittels
für die Inhibierung der Metastase von Tumoren bei Menschen, Säugern oder
anderen Tieren.
8. Verwendung von einem oder mehreren Zellwachstumsinhibitoren,
ausgewählt aus synthetisch hergestelltem N-Methylsphingosin, N-
Methylsphingosin, hergestellt aus natürlich vorkommendem Sphingolipid, und
pharmazeutisch annehmbaren Salzen davon zur Herstellung eines Arzneimittels
für die Inhibierung von Immunreaktionen bei Mensch und Tier, vorzugsweise
Säugern, mindestens teilweise beruhend auf von Lymphocyten-Mitogenese.
9. Verwendung gemäß Anspruch 8 zur Herstellung eines
Arzneimittels für die Inhibierung einer Autoimmunantwort.
10. Verwendung gemäß Anspruch 9 zur Herstellung eines
Arzneimittels für die Inhibierung einer Autoimmunantwort, mindestens
teilweise beruhend auf dem Wachstum von IL-2-abhängigen T-Zellen.
11. Verwendung gemäß Anspruch 8 oder 9 zur Herstellung eines
Arzneimittels für die Inhibierung einer Immunantwort, mindestens teilweise
beruhend auf Conconavalin-A-induzierter Mitogenese von Lymphocyten.
12. Verwendung gemäß Anspruch 8 oder 9 zur Herstellung eines
Arzneimittels für die Inhibierung einer Immunantwort, mindestens teilweise
beruhend auf Phytohämagglutinin-A induzierter Mitogenese von Lymphocyten.
13. Verwendung von einem oder mehreren Wachstumsinhibitoren,
ausgewählt aus synthetisch hergestelltem N-Methylsphingosin, N-
Methylsphingosin, hergestellt aus natürlich vorkommendem Sphingolipid, und
pharmazeutisch annehmbaren Salzen davon zur Herstellung eines Arzneimittels
für die Inhibierung von menschlichen oder tierischen Entzündungsreaktionen,
mindestens teilweise beruhend auf Granulocyten- oder Lymphocyten-
Mitogenese.
14. Verwendung gemäß Anspruch 13 zur Herstellung eines
Arzneimittels für die Inhibierung von Entzündungsreaktionen bei Säugern.
15. Verwendung gemäß Anspruch 13, worin die Entzündungsreaktion
zumindestens teilweise auf Conconavalin-A induzierte Mitogenese von
Lymphocyten oder Phytohämagglutinin-A induzierte Mitogenese von Lymphocyten
beruht.
16. Verwendung gemäß einem der Ansprüche 6 bis 15, worin die
Zellwachstumsinhibitoren N,N-Dimethylsphingosin, hergestellt aus natürlich
vorkommendem Sphingolipid, oder N-Monomethylsphingosin, hergestellt aus
natürlich vorkommendem Sphingolipid oder synthetisch hergestelltes N-N-
Dimethyl-D-erythrosphingenin, synthetisch hergestelltes N-N-Dimethyl-L-
erythrosphingenin, oder pharmazeutisch annehmbare Salze umfassen.
17. Verwendung gemäß Anspruch 16, worin der Zellwachstumsinhibitor
synthetisch hergestelltes N,N-Dimethyl-D-erythrosphingenin oder N,N-
Dimethylsphingosin, hergestellt aus natürlichem Sphinoglipid, oder
pharmazeutisch annehmbare Salze umfaßt.
18. Verfahren zur Inhibierung des Wachstums von humanen oder
tierischen Zellen, das jedoch kein Verfahren zur Behandlung des
menschlichen oder tierischen Körpers durch Eingriff oder Diagnose ist, das
am menschlichen oder tierischen Körper durchgeführt wird, umfassend das In-
Kontaktbringen der Zellen mit einem oder mehreren Zellwachstumsinhibitoren,
ausgewählt aus synthetisch hergestelltem N-Methylsphingosin, N-
Methylsphingosin, hergestellt aus natürlich vorkommendem Sphingolipid, und
pharmazeutisch annehmbaren Salzen davon.
19. Verfahren gemäß Anspruch 18, worin der Zellwachstumsinhibitor
N,N-Dimethylsphingosin, hergestellt aus natürlich vorkommendem
Sphingolipid, oder N-46-Monomethylsphingosin, hergestellt aus natürlich
vorkommendem Sphingolipid, oder synthetisch hergestelltes N,N-Dimethyl-D-
erythrosphingenin, synthetisch hergestelltes N,N-Dimethyl-L-
erythrosphingenin oder pharmazeutisch annehmbare Salze umfaßt.
20. Verfahren gemäß Anspruch 19, worin der Zellwachstumsinhibitor
synthetisch hergestelltes N,N-Dimethyl-D-erythrosphingenin, oder N,N-
Dimethylsphingosin, hergestellt aus natürlich vorkommendem Sphingolipid,
oder pharmazeutisch annehmbare Salze umfaßt.
21. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 18, 19 oder 20, worin die
Zellen Säugerzellen sind.
22. Verfahren nach einem der Ansprüche 18, 19 oder 20, worin die
Zellen bösartige oder gutartige Tumorzellen sind.
23. Arzneimittel, umfassend:
i einen oder mehrere Zellwachstumsinhibitoren, ausgewählt aus
synthetisch hergestelltem N-Methylsphingosin, N-Methylsphingosin,
hergestellt aus natürlich vorkommendem Sphingolipid, und pharmazeutisch
annehmbare Salze davon, und
ii einen pharmazeutisch annehmbaren Träger, Verdünner oder
Exzipienten.
24. Arzneimittel gemäß Anspruch 23, worin der
Zellwachstumsinhibitor N,N-Dimethylsphingosin, hergestellt aus natürlich
vorkommendem Sphingolipid, N-Monomethylsphingosin, hergestellt aus
natürlich vorkommendem Sphingolipid oder synthetisch hergestelltes N,N-
Dimethyl-D-erythrosphingenin, synthetisch hergestelltes N, N-Dimethyl-L-
erythrosphingenin oder pharmazeutisch annehmbare Salze umfaßt.
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