DE3855801T2

DE3855801T2 - Anwendungsgebiete von beta-adrenergenen Agonisten

Info

Publication number: DE3855801T2
Application number: DE3855801T
Authority: DE
Inventors: Charlotte Anne Maltin
Original assignee: Rowett Research Institute
Current assignee: Rowett Research Institute
Priority date: 1987-09-15
Filing date: 1988-09-12
Publication date: 1997-07-03
Anticipated expiration: 2008-09-13
Also published as: EP0308157A3; ES2100148T3; EP0662324A1; EP0308157B1; ATE149089T1; EP0308157A2; DE3855801D1

Description

Diese Erfindung bezieht sich auf therapeutische Anwendungen von β-adrenergen Agonisten. Es gibt Umstande, unter denen es wünschenswert ist, daß ein innervierte Muskeln einschließender lebender Körper auf eine Art und Weise ernährt wird, die zu einer Verstärkung der Ablagerung von Körperproteinen und nicht von Fett führt. Darüber hinaus ist es wünschenswert, daß in einem lebenden Körper, in dem es durch Unfall, Krankheit oder Chirurgie zur Muskeldenervation gekommen ist, die normalerweise als Folge auftretende Atrophie der denervierten Muskeln vor deren Auftreten inhibiert wird oder rückgängig gemacht wird, falls die Atrophie bereits eingesetzt hat.
Zeman berichtet im Journal of American Physiological Society (1987, Seiten E152-E154) über die Wirkung von Clenbuterol bei gesunden Ratten nach vorhergehender einfacher Denervation der Hinterbeinmuskeln urunittelbar vor der Behandlung mit Clenbuterol. Es gibt jedoch keine genaue Beschreibung über die therapeutische Anwendung von Clenbuterol für durch Krankheit beeinträchtigte Muskel.
Nach einem Aspekt der Erfindung wird die Anwendung des β-adrenergen Clenbuterol oder eines seiner Analoga für die Herstellung eines Medikamentes bereitgestellt, um den Funktionsverlust von gestreiftem Muskel rückgängig zu machen, hervorgerufen durch:
a) einer humoral bedingten katabolischen Stoffwechsellage und/oder
b) zeitweiligen Nichtgebrauch besagter Muskel.
Der β-adrenerge Agonist ist hinsichtlich aller oder Teilen seiner Funktion vorzugsweise ein b- sympatomimetisches Agens.
Der β-adrenerge Agonist ist Clenbuterol, also (4-Amino-3,5-dichlorphenyl)-2-tert.butyl-amino- ethanol-Hydrochlorid), d.h. ein biokompatibles Säureadditionssalz derjenigen Verbindung, deren Formel in dem Patentanspruch der deutschen Offenlegungsschrift 1793416 gezeigt ist.
Für anabole Effekte auf Skelettmuskeln ist Clenbuterol der am meisten bevorzugte β-adrenerge Agonist, wohingegen Orciprenalin, Isoetharin, Fenoterol, Cimaterol, und Ractopamin ebenfalls als Mittel angesehen werden, die signifikante anabole Effekte auf eine oder mehrere Muskelarten aufweisen.
Für katabole Effekte auf Körperfett ist Clenbuterol der am meisten bevorzugte β-adrenerge Agonist, obwohl andere der aufgeführten β-adrenergen Agonisten auch potentiell signifikante Effekte auf Körperfett haben sollen.
In spezifischen Untersuchungen erhöhte Clenbuterol merklich die Masse an Beinmuskulatur in Testversuchen an der Ratte und reduzierte die Körperfeilmenge in Ratten. Eine signifikante Beziehung zwischen Abnahme an Körperfett und Lebermasse wurde entdeckt, wohingegen Veränderungen in der Beinmuskelmasse in siglikanter Weise mit einer Zunahme an Körperprotein korrelierte.
Die Erfinder haben eine weitere überraschende Entdeckung gemacht, indem sie herausfanden, daß den unerwünschten Nebenwirkungen β-adrenerger Agonisten mit anabolen Eigenschalten substantiell durch die gleichzeitige Verwendung eines geeigneten Anteils eines β-adrenergen Antagonisten, vorzugsweise eines gemischt β-adrenergen Antagonisten entgegengewirkt werden kann, ohne jedoch alle therapeutischen Eigenschaften des β-adrenergen Agonisten aufzuheben (wobei einige der Wirkungen des Agonisten verringert werden können, ohne jedoch notwendigerweise vollständig zu verschwinden).
Die β-adrenergen Antagonisten können Propranolol, Atenolol, oder die Hoffman La Roche- Verbindung Ro 22-4574 sein. Die bevorzugte Kombination ist Clenbuterol (oder ein Clenbuterol- Analog) und Propranolol.
Als Beispiele für die oben genannten medizinischen Indikationen seien die folgenden spezifischen Indikationen genannt:
(1) Linderung oder Verzögerung von kachektischen Zuständen - bei malignen Erkrankungen (inklusive der krebsinduzierten Kachexie), um eine mit Verlust von Gesamtmuskelmasse einhergehende Befindlichkeitsverschlechterung bei Fällen des erworbenen Immuniumgelsyndroms zu verzögern und ein Muskelversagen bei septischen Zustanden oder größerem Trauma zu begrenzen;
(2) Einsatz von muskelspezifischen proteinanabolen Effekten und gleichzeitiger reduzierter Proteinzunahme im gastromtestinalen Trakt, um eine Reduktion der Nährstoffversorgung (besonders Protein) zu intestinalen Tumoren zu erreichen und dadurch deren Wachstum zu begrenzen;
(3) Begrenzung der Atrophie als Folge zeitlich begrenzter Nichtverwendung wie bei neurologischen Erkrankungen und bei Zuständen beabsichtigter Ruhigstellung, beispielsweise bei eingegipsten Gliedmaßen und Schenkelmuskeln nach Knorpeloperationen;
(4) zum medizinischen Vorteil im Fall von kombinierten medizinischen Indikationen bei gleichzeitiger fortgeschrittener respiratorischer Erkrankung und schlechter Atemwegsmuskulatur und in Fällen, in denen eine erhöhte Gesamtmasse an Atemwegsmuskulatur die Atmungsfunktionen unterstützen könnte, mit möglichem doppelten Vorteil, falls der für die vorteilhaften Wirkungen auf Muskulatur ausgewählte β-adrenerge Agonist auch ein Bronchodilator ist (wie dies besonders der Fall ist, wenn der β-adrenerge Agonist Clenbuterol ist, das für die Behandlung von Bronchospasmen indiziert ist);
(5) zur Wachstumsförderung bei Vorliegen von Erkrankungen, die mit Substanzverlust einhergehen, wie zystische Fibrose und Zerebralparalysen bei Kindern (bei denen die Kinder eine Tendenz zeigen, schlecht zu wachsen und wenig Muskelmasse auszubilden).
In Hinblick auf alle von der Erfindung umfaßten medizinische Indikationen ist der β-adrenerge Agonist Clenbuterol (oder ein effektives Analog von Clenbuterol).
Ohne die Absicht, daß die folgenden Annahmen irgendeinen limitierenden Effekt auf die Erfindung haben sollten, wird davon ausgegangen, daß den neuartigen Reaktionen der denervierten Muskel auf den ausgewählten β-adrenergen Agonisten mindestens zwei Mechanismen zugrunde liegen. Der erste Mechanismus beinhaltet bei heruntergeregeltem, denervierten Zustand Veränderungen in der Translationseffizienz und Kapazität, die an die klassischen pleiotypischen Reaktionen von Zellen auf Wachstumsfaktoren erinnert. Der zweite Mechanismus ist eine spezifische Verringerung des Proteinabbaus. Bei Muskeln, die sich in einem innervierten Zustand befinden, wird der erste Mechanismus nicht beobachtet, weil die Muskeln bereits auf andere Stimuli reagiert haben, wohingegen der zweite Mechanismus manifest ist. Es könnte in Betracht gezogen werden, daß die Unterschiede in der Reaktion von innerviertem und denerviertem Muskel auf Clenbuterol mit einer erhöhten Anzahl von β-adrenergen Rezeptoren in der Membran des denervierten Muskeln einhergeht, doch scheint dies nicht der Fall zu sein, da selbst in Anwesenheit des gemischten β-Antagonisten Propranolol in einer Dosis, die nachgewiesenermaßen die kardiale Hypertrophie und die Reduktion an Körperfettmasse hemmt, Clenbuterol weiterhin wirksam bleibt in der Umkehr des Muskelproteinverlustes nach Denervierung. Dies könnte den Schluß nahe legen, daß Clenbuterol möglicherweise über einen anderen Rezeptor als die β-1- und β-2-Rezeptoren wirkt, die auf Propranolol ansprechen.
Ausführungsbeispiele der Erfindung werden im Folgenden anhand von Beispielen beschrieben. Die nachfolgende beispielhafte Beschreibung gliedert sich in acht Abschnitte, von denen jede jeweils einen unterschiedlichen Satz von Wirkungen auf Muskeln oder auf muskelbezogene medizinische Indikationen von einem oder mehr β-adrenergen Agonisten (entweder allein oder in Kombination mit einem β-adrenergen Antagonisten) behandelt. Jeder dieser acht Abschnitte ist weiter unterteilt in verschiedene, mit Überschriften versehene Unterabschnitte mit selbst erklärenden Unterüberschriften.

Abschnitt 1:

Die Wirkung eines wachstumsfördernden Medikamentes, Clenbuterol, auf Faserhäufigkeit und - fläche bei Hinterlaufmuskeln von jungen männlichen Ratten.

Zusammenfassung:

Die Wirkung von mit der Nahrung verabreichtem Clenbuterol auf Soleus- und Extensor digitorum longus- Muskeln wurde nach vier und 21 Tagen untersucht. Beide Muskeln zeigten eine Zunahme an Feuchtgewicht mit keiner signifikanten Veränderung in der Gesamtanzahl der Fasern. Nach vier Tagen waren die Querschnitttslächen der Fasern im Soleus vergrößert, nicht jedoch im Extensor digitorum longus, und nach 21 Tagen gab es eine Veränderung in den Faserhäufigkeiten im Extensor digitorum longus, aber nicht im Soleus-Muskel.

EINLEITUNG

Seit kurzem gibt es ein beträchtliches Interesse an Wegen, das Wachstum zu manipulieren und die Deposition von Körperprotein gegenüber der Fett-Deposition zu erhöhen. Dies hat zu einer Untersuchung der Wirkungen einer Anzahl von wachstumsfördernden Wirkstoffen auf Skelettmuskel geführt, unter denen sich Medikamente wie der β-adrenerge Agonist Clenbuterol befinden.
Frühere Studien mit Clenbuterol haben charakteristischerweise eine Vermehrung des Muskelwachstums gezeigt, die Modifikationen im Protein-Turnover zugeschrieben wurden. Obwohl eine generelle Zunahme des Muskelproteins durch das Medikament hervorgerufen wird, wurde die Art, wie sich dies in Veränderungen der Anzahl von Muskelfasern oder Muskelfasergröße ausdrückt, nicht untersucht. Darüberhinaus wurde in anderen Situationen, in denen der Protein-Turnover modifiziert wird, beispielsweise durch Insulin, beobachtet, daß unterschiedliche Muskeln unterschiedliche Empfindlichkeiten auf die Behandlung aufweisen. Folglich war es von Interesse herauszufinden, wie die Wachstumsantwort sich im Skelettmuskel bemerkbar macht und ob Muskel, wie der Soleus und Extensor digitorum longus, mit unterschiedlichen Anteilen von Fasertypen gegenüber Clenbuterol unterschiedliche Empfindlichkeiten aufweisen.

MATERIALIEN UND METHODEN

Tiere und Fütterungsschema

Mannliche Hooded-Lister Ratten (Rowett Stamm) wurden im Alter von 19 Tagen entwöhnt und in Gruppen von je 6 Tieren mit gleichem mittlerem Gewicht eingeteilt. Anfänglich wurden die Tiere gruppenweise gehalten und bekamen Rattentrockenfütter (CRM nuts, Labsure, K & K Greif, Croydon, England) zur freien Verfügung angeboten. Die Ratten wurden täglich gewogen und wurden nach vier Tagen, falls notwendig, neu gruppiert, so daß die Gruppen ein gleiches mittleres Gewicht aufwiesen. Die Ratten wurden dann einzeln gehalten und drei Tage lang mit einem halbsynthetischen, frei verfügbaren Futter gefüttert (PW3; Pullar und Webster, British Journal of Nutrition, Band 37, Seiten 355-63, 1977). Die Gruppen von Tieren wurden dann entweder mit PW3, das kein Clenbuterol enthielt, gehalten (Kontrollgruppen), oder mit PW3 gefüttert, das das Medikament zu 2 mg/kg Futter enthielt (Clenbuterol-Gruppen). Futteraufnahme und Körpergewichte wurden während der Studie, die entweder 4 oder 21 Tage dauerte, täglich gemessen.

Histochemie

Die Tiere wurden durch zervikale Dislokation getötet und die Soleus- und Extensor digitorum longus-Muskeln des linken Hinterbeines wurden schnell entfernt. Der mittlere Teil von jedem Muskel wurde isoliert und für die Herstellung von Transversalschnitten positioniert. Die Probe von jedem Muskel wurde auf ein kleines Stück Kork positioniert, mit Optimalschnittemperatur-Medium umgeben, mit Talkumpuder bedeckt und in flüssigem Stickstoff eingefroren. Serielle Transversal-Kryostatschnitte wurden angefertigt und jeweils für einen der nachfolgenden Enzymnachweise angefärbt: Ca²&spplus;-aktivierte myofibrilläre ATPase, Nicotinamid-Adenin-Dinucleotid-Diaphorase, L-Glucan-Phosphorylase oder β- Glycerophosphat-Dehydrogenase (Vitamin K3-verknüpft). Das Fasertypprofil von jedem Muskel wurde aufgrund der Muskelfärbecharakteristika mit jeder der oben genannten Färbungen (siehe Tabelle 1) bestimmt. Sowohl Soleus- als auch Extensor digitorum longus-Muskeln von Kontrollratten wiesen drei Fasertypen auf: schnell kontrahierende, glykolytisch aktive (FG), schnell kontrahierende, oxidativ und glykolytisch aktive (FOG), und langsam kontrahierende, oxidativ aktive (SO), die in unterschiedlichen Anteilen in jedem Muskeltyp vorkamen. Die prozentuale Häufigkeit jedes Fasertyps wurde aus einer Probe von nicht weniger als 200 Fasern pro Muskel geschätzt. Die Querschnittsfläche von jedem Fasertyp wurde mit Hilfe eines Hipad Digitalisierttabletts (Bausch und Lomb, Austin, Texas) gemessen, das an einem Prime 550 Computer Prime Computer Inc., Framingliam, Massachusetts) angeschlossen war, der so programmiert war, daß er die auf dem Tablett umfahrene Fläche berechnen konnte. Die durchschnittliche Prozentfläche, die von jedem Fasertyp eingenommen wurde, wurde geschätzt, indem die mittleren Flächen von jedem Fasertyp mit ihrer prozentualen Häufigkeit zu einem Gesamtprodukt multipliziert wurden, und durch Angabe der Einzelprodukte als Prozentanteile dieses Gesamtprodukts. Die Gesamtanzahl von Fasern im gesamten Muskel wurde bestimmt durch Auswertung von Fotografien ganzer Muskelquerschnitte, die für myofibrilläre ATPase angefärbt wurden.
Sudanschwarz wurde verwendet, um intramuskuläre Lipide in Muskeln von beiden Gruppen nach 4 bis 21 Tagen Fütterungsversuch anzufärben. Tabelle 1 Histochemische Beschreibung der Fasertypen in Rattenmuskel

Reagenzien

Die für die Histochemie verwendeten Reagenzien wurden von Sigma (Poole, Dorset, England) oder BDH (Poole, Dorset, England) erhalten. Clenbuterol wurde von Boehringer-Ingelheim (Bracknell, Berks, England) erhalten.

Statistik

Alle Daten werden als Mittelwerte nut Standardabweichungen angegeben. Statistische Analysen wurden mit Hilfe eines zweiseitigen 1-Tests durchgeführt, in dem, falls zutreffend, ungleiche Varianzen berücksichtigt werden konnten.

ERGEBNISSE

Die Muskeln der mit Clenbuterol behandelten Tiere wiesen ein größeres Feuchtgewicht auf als die von Kontrolltieren (Tabelle 2). Mit Ausnahme der Extensor digitorum longus-Muskeln am vierten Tag (P =0,06), war dieser Unterschied zu beiden Zeitpunkten signifikant, jedoch war der Effekt am deutlichsten im Soleus nach vier Tagen. Eine Untersuchung der histochemischen Fasertypen und Faserflächen in den Soleus- und Extensor digitorum longus-Muskeln von Clenbuterol-behandelten Tieren und Kontrolltieren nach 4 oder 21 Tagen des Experiments ist in Tabelle 2 gezeigt.

Soleus

Nach nur 4 Tagen der Medikanientenbehandlung ergab sich eine beträchtliche Erhöhung in der mittleren Querschnitttsläche der Fasern in Muskeln der mit Clenbuterol behandelten Ratten. Diese Größenzunahme gegenüber den Kontrollen war nur signifikant in FOG- und SO-Fasertypen: während FG-Fasern größer als in den Kontrollen zu sein schienen, war der Unterschied nicht signifikant. Hinsichtlich der prozentualen Häufigkeit oder der Prozentfläche irgendeines Fasertyps gab es keine Unterschiede zwischen Muskeln von Kontrolltieren und mit Clenbuterol behandelten Tieren. Nach 21 Tagen des Fütterungsversuches gab es immer noch einen Unterschied in der Fasergröße zwischen Kontrolltieren und Behandlungsgruppen, er war jedoch nicht länger signifikant. Daher war die beobachtete Reaktion auf Clenbuterol maximal während der ersten vier Tage der Behandlung, und die nachfolgenden Wachstumsraten zwischen dem vierten und dem einundzwanzigsten Tag waren in beiden Gruppen ähnlich. Allerdings zeigte die Berechnung der mittleren Prozentilächen (die die fünktionelle Fläche eines bestimmten Fasertyps widerspiegelt) nach 21 Tagen für FOG-Fasertppen eine signifikante Zunahme und für SO-Fasern eine signifikante Abnahme im Vergleich zu Kontrollen.

Extensor digitorum longus

Nach vier Tagen des Fütterungsversuches gab es keinen statistisch signifikanten Unterschied zwischen den Kontroll- und Behandlungsgruppen in Hinblick auf irgendeinen untersuchten Parameter. Die Daten für SO-Fasern erlauben keine Aussagen über die Signifikanz wegen der kleinen Stichprobengröße: SO-Fasern wurden nur in 2 der 6 untersuchten behandelten Muskeln nachgewiesen. Nach 21 Tagen des Fütterungsversuchs waren die kleinen Zunahmen in den Faserflächen mit Clenbuterol-Behandlung nicht signifikant, aber es gab signifikante Veränderungen in den Verhältnissen der Fasertypen. Diese wurden ausgedrückt in einer statistisch signifikanten Abnahme der FOG-Häufigkeit und einer Zunahme der FG-Häufigkeit. Beide Veränderungen waren verknüpft mit ähnlichen, aber größeren Veränderungen in den mittleren Prozentfiächen. Keine SO-Fasern wurden im Extensor digitorum longus von behandelten Ratten gefünden obwohl eine wenige in den Kontrollen nach 21 Tagen gesehen wurden.

Fettgehalt

Nach einer Behandlung mit Clenbuterol für 4 oder 21 Tage zeigten beide Muskeln qualitativ weniger intramuskuläres Fett als die entsprechenden Kontrollen. Untersuchungen der Muskelschnitte zeigten dies mit Hilfe der Sudanschwarz-Färbung, die gespeichertes Fett anzeigt. In Kontrolltieren gaben die Soleus-Muskeln die positivste Färbung in Übereinstimmung mit ihrem stark oxidativen Metabolismus. Soleus-Muskeln von Clenbuterol-behandelten Tieren gaben sehr schwache Färbemuster, und dies zeigt eine deutliche Reduktion des gespeicherten Fetts. Obwohl eine ähnliche Relation zwischen Extensor digitorum longus-Muskeln von Kontroll- und Behandlungsgruppen gezeigt werden konnte, waren die Unterschiede nicht so markant. Tabelle 2 (Abschnitt 1): Tabelle 2. Der Effekt von Clenbuterol-Behandlung auf Gesamtfaseranzahl, -Fläche und -Häufigkeit in Muskeln der Ratte
nr = nicht gemessen ap < 0,05, bp < 0,01, cp < 0,005.
Alle Parameter sind angegeben als Mittelwerte mit Standardabweichung, n = 6 für alle Gruppen mit Ausnahme von dn = 2 und en = 5

DISKUSSION

Die vorliegende Studie zeigte, daß Clenbuterol die Größe und den Proteingehalt von Rattenskelettmuskeln erhöht und daß der wachstumsfördernde Effekt auf die Muskelfaserfläche sowohl selektiv war als auch mit der Zeit abnahm. Die Wachstumsförderung war im Soleus nach 4 Tagen sichtbar, war jedoch nach 21 Tagen bis zur Bedeutungslosigkeit verringert. Sie war zu beiden Zeitpunkten weniger ausgeprägt im Emensor digitorum longus.
Unterschiede zwischen Muskeln wurden auch hinsichflich des intramuskulären Fettes beobachtet. Da Clenbuterol als β-adrenerger Agonist wirkt, war die beobachtete Abnahme an intramuskulärem Fett nicht unerwartet. Die lipolytische Aktivität von β-Agonisten ist dokumentiert, und andere Studien, in denen Glenbuterol verwendet wurde, haben über eine allgemeine Abnahme an Körperfett berichtet. Allerdings war es bemerkenswert, daß Clenbuterol den Fettgehalt des Soleus sehr viel stärker reduzierte als den des Extensor digitorum longus. Dies legt auch den Schluß nahe, daß der Soleus gegenüber den Wirkungen von Clenbuterol eine besondere Empfindlichkeit autweist, und dies ist im Einklang mit einer positiven Korrelation zwischen oxidativer Kapazität und adrenerger Rezeptordichte.
Die vorliegenden Ergebnisse legen den Schluß nahe, daß die anfängliche Erhöhung des Soleus- Gewichts nach 4 Tagen auf eine Zunahme in der Größe der zwei hauptsächlich vorkommenden Fasertypen, FOG und SO, zurückzuführen war (Tabelle 2). Allerdings schienen diese ausgeprägten Effekte auf FOG- und SO-Fasergröße merkwürdig spezifisch für den Soleus zu sein. Obwohl der Extensor digitorum longus einen beträchflichen Gehalt an FOG-Fasern aufweist und eine Zunahme an Feuchtgewicht nach 4 Tagen zeigte, gab es keine signifikante Veränderung in der Faserfläche von FOG- und irgendwelchen anderen Fasertypen. Außerdem gab es keine signifikante Veränderung in der geschätzten Gesamtfaseranzahl in beiden dieser Muskeltypen. Daher ist es wahrscheinlich, daß eine Zunahme der Fasergröße und nicht der Faseranzahl für die Gewichtszunahme des Soleus verantwortlich war. Die Erklärung für die signifikante Zunahme an Feuchtgewicht der Extensor digitorum longus-Muskeln nach 21 Tagen ist unklar, aber die signifikant erhöhte Prozentfläche der FOG-Fasern (siehe unten) könnte zusammen mit dem Trend zu mehr Fasern eine Zunahme in der Gesamtquerschnittsfläche dieser Muskeln bedeuten.
Beobachtete Zunahmen an Muskelfeuchtgewicht sind mit Zunahmen an Muskelproteinablagerung in Verbindung gebracht worden. Proteinablagerung stellt das Nettogleichgewicht zwischen den Raten gleichzeitig ablaufender Proteinsynthese und Proteindegradierung dar. Daher kann die schnelle Wachstumsantwort im Soleus einer Erhöhung der Synthese, einer Erniedrigung des Abbaus, oder einer Kombination beider Vorgänge zugeschrieben werden. In voll entwickelten Ratten, die subkutan mit Clenbuterol behandelt wurden, waren die Raten der Proteinbiosynthese in Gastrocnemius-Muskeln um 34 % gegenüber den Kontrollen erhöht. In einer systematischen Untersuchung, auf die sich das vorliegende Protokoll stützt und deren Ergebnisse daber mit denen aus der vorliegenden Studie vergleichbar sind, wurde jedoch gezeigt, daß nach 4 oder 21 Tagen der mit dem Futter verabreichten Clenbuterol- Behandlung keine Unterschiede in Syntheseraten in Soleus-Muskeln junger Ratten im Vergleich zu Kontrollen existierten. Folglich schlugen sie vor, daß das Medikament dergestalt wirkte, daß die Abbaurate erniedrigt wurde und die Wirkung weniger über einen Effekt auf die Synthese erfolgte. Dieses Konzept ist interessant im Kontext der vorliegenden Ergebnisse, da es implizieren wurde, daß die schnelle Zunahme der Faserfläche in behandelten Soleus-Muskeln über eine Veränderung der Proteinabbaurate erfolgt, die entweder in ähnlichen Fasertypen aus den Extensor digitorum longum- Muskeln fehlt oder nicht signifikant ist.
Während die Extensor digitorum longus-Muskeln nicht signifikant auf die Behandlung nach vier Tagen ansprach, gab es nach 21 Tagen signifikante Veränderungen in der Prozenthäufigkeit und Prozentlläche der FOG- und FG-Fasertypen (Tabelle 2). Der Soleus zeigte außerdem signifikante, aber offensichtlich entgegengesetzte Veränderungen in diesen Parametern nach 21 Tagen (Tabelle 2). Betrachtet man allerdings die Daten unter physiologischen Gesichtspunkten, so legen sie den Schluß nahe, daß in beiden Muskeln die Behandlung mit Clenbuterol zu einer Zunahme in der funktionellen, zum glykolytischen Metabolismus befahigten Fläche führte, begleitet von einer Abnahme der langsam kontrahierenden Fasern. Während die wachstumsfördernden Effekte von Clenbuterol daher zunächst spezifisch für den Soleus zu sein scheinen, schien das Medikament Veränderungen in der Faserhaufigkeit hervorzurufen, die physiologisch zwischen beiden Muskeln vergleichbar waren. Der Mechanismus und die Bedeutung dieser Befunde ist unklar, aber man kann spekulieren, daß Clenbuterol (entweder direkt oder indirekt) nicht nur die Wachstumsrate beeinflußt, sondern auch die kontraktilen und metabolischen Eigenschaften der Fasern in beiden Muskeln beeinflußt.

Abschnitt 2

Inhibierung und Aufhebung der denervationsinduzierten Atrophie durch den β-agonistisch wirksamen Wachstumsförderer Clenbuterol

Zusammenfassung:

Die mit der Nahrung erfolgende Verabreichung des Wachstumsförderers Clenbuterol verbessert die denervationsinduzierte Atrophie in Ratten-Soleus-Muskeln. In aktit denervierten Muskeln inhibiert das Medikament das Auftreten der Atrophie, und in chronisch denervierten Muskeln wurde die Atrophie fast vollständig rückgängig gemacht. Die Reaktionen in langsam kontrahierenden, oxidativ aktiven Fasern waren besonders ausgeprägt.

EINLEITUNG

Die jüngste Aufmerksamkeit gegenüber wachstumsfördernden Mitteln hat sich auf eine begrenzte Anzahl von β2-adrenergen Agonisten konzentriert. Frühere Experimente, in denen eines dieser Medikamente, Clenbuterol, oral an männliche säugende Ratten verabreicht wurde, haben eine Zunahme der Proteinablagerung und eine Reduktion an Körperfett mit wenigen Auswirkungen auf aufgenommene Nahrungsmittelmengen und Körpergewicht gezeigt. Die Wachstumsförderung schien muskelspezifisch zu sein und die Reaktion wurde von einer Zunahme der Fasergröße begleitet. Ausführliche histochemische Analyse zeigte, daß Muskeln, wie der Soleus, in denen Typ 1-Fasern vorherrschen, eine schnellere und im allgemeinen ausgeprägtere Reaktion zeigen.
Messungen des Protein-Turnover in jungen Ratten, die chronisch Clenbuterol ausgesetzt wurden, legen den Schluß nahe, daß die Wirkung des Medikaments durch eine Reduktion der Muskelproteindegradierung und weniger durch eine Zunahme der Proteinsynthese vermittelt zu sein schien. Folglich war es von Interesse herauszufinden, ob ein Muskel, der der Atrophie unterliegt und in dem die Proteolyse erhöht sein könnte, immer noch auf die wachstumsfördernden Einflüsse des Medikaments reagieren wurde. Die denervationsinduzierte Atrophie wurde für die Untersuchung gewählt, da diese Form der Atrophie hauptsächlich auf einer Erhöhung des Proteinabbaus zu beruhen scheint.

MATERIALIEN UND METHODEN

Tiere und experimentelles Protokoll

Männliche Rowett Hooded Lister-Ratten (Rowett Stamm) wurden 19 Tage nach der Geburt entwöhnt und in Gruppen zu 6 Tieren gleichen mittleren Gewichts eingeteilt. Der ursprüngliche Fütterungsplan und die Dosis von Clenbuterol war genau so wie vorher geschrieben. Die Tiere wurden in Käfigen gehalten mit einem Drahtgitterboden, und ihre Körpergewichte wurden täglich gemessen. Zwei Experimente wurden durchgeführt, die auf der Induktion der Denervationsatrophie im Soleus- Muskel beruhten. Der Begriff "Atrophie" wird hier verwendet, um sowohl eine Reduktion des Muskelproteingehalts als auch eine Reduktion der Fasergröße im Vergleich zu den innervierten Kontrollmuskeln zu beschreiben.
(i) "Akute" Denervation. Die Wechselwirkung gleichzeitiger Denervierung und Verabreichung von Clenbuterol wurde untersucht, um herauszufinden, ob das Medikament den Beginn der Denervationsatrophie verhindern könnte. Ratten (60±2 g Körpergewicht), die an das Kontrollfutter (PW3) 4 Tage gewöhnt worden waren, wurden mit Ether betäubt, und eine kurze Strecke (1 cm) des linken Ischiasnerves wurde unter aseptischen Bedingungen entfernt. Für die nächsten vier Tage wurde den Ratten das Kontrollfütter zur freien Verfügung gegeben oder das gleiche Futter, dem Clenbuterol (2 mg/kg) zugesetzt worden war. Die Tiere wurden anschließend getötet.
(ii) "Chronische" Denervation. Das zweite Experiment wurde konzipiert, um zu testen, ob Clenbuterol das Wachstum in einem Muskel wiederherstellen konnte, der bereits Anzeichen von Atrophie aufivies. Unilaterale Denervation des Ischiasnervs wurde durchgeführt an Tieren mit gleichem Körpergewicht wie in Experiment 1 und nach dem chirurgischen Eingriff wurde den Tiere das Kontrollfütter für 3 Tage angeboten. Nach diesem Zeitpunkt wurden die Tiere entweder weiter mit dem Kontrollfutter gehalten oder ihnen wurde für weitere 4 Tage das Futter mit Clenbuterol angeboten. Die Tiere wurden nach diesem Zeitraum getötet.
Die Tiere wurden durch zervikale Dislokation getötet und die Soleus-Muskeln von beiden Gliedmaßen wurden schnell herauspräpariert und gewogen. Kleine Proben aus der Mitte des Muskeln wurden für die histochemische Analyse entfernt. Der restliche Muskel wurde in flüssigem Stickstoff eingefroren und bei -20ºC bis zur weiteren Analyse aufbewahrt.

Histochemie

Die histochemische Analyse der Muskelschnitte wurde nach dem gleichen, bereits beschriebenen Verfahren durchgeführt. In diesen Experimenten basierte jedoch die Fasertypisierung ausschließlich auf der Verwendung der Ca²&spplus;-aktivierten myofibrillären ATPase. Im Soleus-Muskel gab es drei Fasertypen: langsam kontrahierende, oxidativ aktive (SO), schnell kontrahierende, oxidativ und glykolytisch aktive (FOG) und schnell kontrahierende, glykolytisch aktive (FG), die in unterschiedlichen Häufigkeiten vorkamen. Da die FG-Fasern in einer sehr niedrigen Häufigkeit (< 5 %) vorkamen, wurden sie in dem chronischen Denervationsexperiment von den Schatzungen der Flächenverteilung und Prozentflächen ausgenommen.

Bestimmung des Muskelproteins

Gewogene Teile der Muskeln wurden bei 4ºC in 3 ml 0,5 M Perchlorsäure (PCA) in einer motorbetriebenen Ganzglas-Gewebemühle homogenisiert. Das Homogenat wurde bei 3000 g für 15 Minuten zentrifugiert, und der Niederschlag wurde mit weiteren 2 ml PCA gewaschen. Nach der Zentrifügation wurde der Niederschlag bei 37ºC in 0,3 M NaOH für eine Stunde inkubiert. Aliquots wurden mit Rinderserumalbumin als Standards auf Protein getestet.

Statistik

Die Signifikanz der Unterschiede zwischen den Mittelwerten wurden durch den zweigeteilten Student t-Test ermittelt.

ERGEBNISSE

Experiment 1 (Tabelle 1)

Nach unilateraler Durchtrennung des Ischiasnervs zeigten alle Tiere eine geringfügige Reduktion der Nahrungsaufnahme und der Gewichtszunahme. Dieses Anhalten des Wachstums war am deutlichsten ausgeprägt in der Gruppe der mit Clenbuterol behandelten Tiere und war wahrscheinlich zurückzuführen auf die Erholung vom chirurgischen Eingriff und einer transienten Reduktion der Nahrungsmittelaufnahme von Clenbuterol-behandelten Ratten, die wir bereits vorher bemerkt hatten. Dieser anfängliche Wachsstumsstop könnte die ein bißchen verringerte Reaktion auf Clenbuterol erklären, die in den innervierten Muskeln beobachtet worden war. Nichtsdestotrotz ergab die Exposition gegenüber Clenbuterol eine signifikante Zunahme sowohl an Gewicht als auch des Proteingehalts des innervierten Soleus.
Die denervierten Muskeln waren signifikant leichter und enthielten signifikant weniger Protein als die kontralateral innervierten Muskeln der Kontrolle und der Clenbuterol-behandelten Ratten. Allerdings inhibierte die Behandlung mit Clenbuterol signifikant die volle Ausprägung der mit der Denervation assoziierten Reaktionen. Sowohl das Gewicht als auch der Proteingehalt der denervierten Muskeln von Clenbuterol-behandelten Ratten waren signifikant größer als die der denervierten Muskeln der Kontrolltiere (P < 0,005).
Die Verbesserung der mit der Denervation verbundenen Reaktionen war besonders in den SO- Fasern bemerkbar. Die Querschnittfläche der SO-Fasern von denervierten Muskeln der Clenbuterolbehandelten Tiere unterschied sich nicht signifikant von der der SO-Fasern von innervierten Kontrollmuskeln. Während jedoch FOG-Fasern von denervierten Muskeln von Clenbuterol-behandelten Tieren signifikant größer (P < 0,005) als die entsprechenden Fasern in denervierten Muskeln von unbehandelten Tieren waren, waren sie immer noch signifkant kleiner (P < 0,01) als die entsprechenden Fasern in innervierten Muskeln von Kontrolltieren. Die Unterschiede in der durchschnittlichen Faserquerschnillsfläche war nicht begleitet von Veränderungen in der Häufigkeit von Fasern unterschiedlicher Typen, aber die Unterschiede in den Faserflächen spiegelten sich wider in signifikanten Veränderungen in den funktionellen, durch die Anwesenheit von SO- und FOG-Fasern erklärbaren Flächen. Tabelle 1 (Abschnitt 2): Tabelle 1. Experiment 1. Der Effekt auf Muskel von gleichzeitiger Denervation und Verabreichung von Clenbuterol Mittelwerte zusammen mit 1 Standardabweichung in Klammern angegeben.
FOG = Schnell kontrahierend oxidativ glykolytisch; FG = schnell kontrahierend glykolytisch; SO = langsam kontrahierend oxidativ.
Innerhalb eines Fasertyps, bezogen auf innervierte Kontrollmuskeln: a = p < 0,005, b = p < 0,05 und bezogen auf denervierte Kontrollmuskell c = p < 0,005.
***p < 0,005 vergleichen mit innervierter Kontrolle p < 0,05 verglichen mit denervierter Kontrolle.

Experiment 2 (Tabelle 2)

Die innervierten Muskeln zeigten die erwartete Clenbuterol-induzierte Wachstumsreaktion und die Denervation führte zu einem signifikant niedrigeren Gewicht und Proteingehalt. Es schien, daß der Effekt der Denervation progressiv verlief, da die denervierten Soleus-Muskeln von den Tieren in diesem Experiment (d.h. nach 7 Tagen der Denervation) leichter waren und weniger Protein enthielten als die Soleus-Muskeln nach 4 Tagen der Denervation in Experiment 1.
Die Verabreichung von Clenbuterol an diese chronisch denervierten Muskeln verursacht einen signifikanten Rückgang der Atrophie. Dies folgt aus Messungen des Muskelproteingehalts und der Faserquerschnittsflächen. So zeigten die denervierten Muskeln von Clenbuterol-behandelten Tieren eine statistisch signifikante (p (0,005) Zunahme im Proteingehalt gegenüber den unbehandelten denervierten Muskeln. Die Zunahme an Protein spiegelte sich ebenfalls wider in einer Zunahme an Faserfläche. Wie in Experiment 1 schienen jedoch SO-Fasern eine größere Empfindlichkeit gegen Clenbuterol aufzuweisen als FOG-Fasern. So hatten die SO-Fasern von denervierten Soleus-Muskeln von Clenbuterol-behandelten Tieren eine mittlere Querschnittsfläche, die signifikant (p < 0,005) größer war als die von SO-Fasern von denervierten Muskeln der Kontrolle. In der Tat war die Zunahme in der SO- Faserfläche in den denervierten Muskeln von Clenbuterol-behandelten Tieren derart, daß die Faserfläche fast gänzlich die Werte von innervierten Muskeln der Kontrollen erreichte. Die FOG-Fasern von denervierten Muskeln von Clenbuterol-behandelten Tieren waren signifikant kleiner in der Fläche (p < 0,005) als FOG-Fasern von innervierten Kontrollen, aber sie waren signifikant in der Fläche vergrößert (p < 0,05) im Vergleich zu FOG-Fasern von denervierten Kontrollmuskeln.
Nimmt man an, daß in diesem Experiment die innervierten und denervierten Muskeln anfänglich ähnliche Proteingehalte wie die Kontrolltiere in Experiment 1 aufwiesen, dann verloren die denervierten Kontrollmuskeln zwischen 3 und 7 Tagen nach der Denervation etwa 1 mg Protein, und die Clenbuterol-behandelten denervierten Muskeln legten 1,5 mg zu. Tabelle 2 (Abschnitt 2): Tabelle 2. Experiment 2. Der Effekt von Clenbuterol auf chronisch denervierte Muskeln. Mittelwerte zusammen mit 1 Standardabweichung in Klammern angegeben
FOG = Schnell kontrahierend oxidativ glykolytisch; FG = schnell kontrahierend glykolytisch; SO = langsam kontrahierend oxidativ.
Innerhalb eines Fasertyps, bezogen auf innervierte Kontrollmuskeln: a = p < 0,005, b = p < 0,05 und bezogen auf denervierte Kontrollmuskell c = p < 0,005.
***p < 0,005 vergleichen mit innervierter Kontrolle p < 0,05 verglichen mit denervierter Kontrolle.

Experimente 1 und 2

In beiden Experimenten beobachtete man, daß die Querschnittsfläche der FOG-Fasern von den innervierten Kontrollmuskeln größer waren, als in vorherigen Experimenten bemerkt wurde. Der Grund für diesen Unterschied ist nicht klar; es ist jedoch möglich, daß die Denervation zu einigen Haltungseinschränkungen in den Muskeln des Hinterbeins führte, die zu diesem Unterschied in der Fasergröße führte.

DISKUSSION

Die Ergebnisse beider Experimente zeigen, daß der β-adrenerge Agonist Clenbuterol nicht nur die denervationsinduzierte Atrophie von Ratten Soleus-Muskeln inhibiert, sondern auch partiell ruckgangig macht. Die Veränderungen im Muskelproteingehalt nach der Denervation legen den Schluß nahe, daß in Abwesenheit von Clenbuterol die Denervation zu einem anfänglichen Stop des Muskelwachstums führt, daß dieser Vorgang dann jedoch zu einer echten und nicht einer relativen Atrophie fortschreitet.
In Experiment 1 wurde das Muskelwachstum durch Denervation blockiert oder schwer verzögert Es war nicht klar, ob Clenbuterol eine Reduktion des Wachstums inhibiert hatte oder ob es die denervationsinduzierte Neigung in Richtung Atrophie mit einem Wachstumsstimulus überlagerte. In Experiment 2 hatte sich die atrophische Reaktion gut konsolidiert, bevor die Tiere das Medikament erhielten, und hier führte Clenbuterol zu einer Nettoproteinablagerung, begleitet von einer Zunalme an Fasergröße in Muskeln, die sich unter anderen Umständen bereits im Zustand der Atrophie befünden hätten.
Die Denervation wird begleitet von einer Zunahme in der Rate des Proteinabbaus, von dem man glaubt, daß er größtenteils für die Reduktion der Muskelproteinmasse verantwortlich ist. Es ist möglich, daß Clenbuterol Effekte auf Muskel vermittelt durch Reduktion des Proteinabbaus. Der Effekt von Clenbuterol auf die Wachstumsantwort in chronisch denerviertem Muskel steht im Einklang mit solch einem Mechanismus.
Beiden Experimenten war die augenscheinlich größere Empfindlichkeit von SO-Fasern gegenüber der Clenbuterol-Behandlung in den denervierten Muskeln gemeinsam. Die Ursache für diesen Unterschied in der Empfindlichkeit ist unbekannt. Muskeln, in denen SO-Fasern vorherrschen, haben eine höhere anteilige Rate von Protein-Turnover als Muskeln, die hauptsächlich schnell kontrahierende Fasern umfassen. Man kann spekulieren, daß dies ebenfalls für SO-Fasern im Vergleich zu anderen Fasertypen innerhalb eines einzigen Muskels gilt. Wenn dies so ist, dann könnte die Inhibierung des Proteinabbaus in einer Faser mit einer inhärent schnelleren Rate des Proteinabbaus zu einer erhöhten Reaktionsantwort führen. Dieses Konzept kann auf die Effekte von Clenbuterol auf denervierte Muskeln mit ihren erhöhten Abbauraten ausgedehnt werden, in denen die verhaltnismäßigen Effekte von Clenbuterol auf Proteinmasse und SO-Faserfläche ebenfalls beträchtlich größer waren. So erhöhte das Medikament in Experiment 2 den Proteingehalt von innervierten Muskeln um 12 % und von denervierten Muskeln um 50 %. Der verhaltnismaßige Effekt auf SO-Faserflächen war ebenfalls meßbar unterschiedlich in innervierten und denervierten Muskeln, wobei die Erhöhung der SO-Faserfläche in den ersteren 17 %, aber 94 % in den letzteren betrug.
Es scheint daher, daß der Prozeß, der in normalem Muskel auf Clenbuterol reagiert, möglicherweise im denervierten Muskel empfindlicher auf das Medikament wird, wobei ähnliche kontrollierende Faktoren in beiden Zuständen vorliegen. Ein Verständnis der Reaktionsmechanismen von Clenbuterol könnte ein besseres Verständnis der Steuerungen von Protein-Turnover und Wachstum zur Folge haben.

Abschnitt 3:

Propranolol differenziert anscheinend die physikalischen und zusammensetzungsbedingten Charakteristika von Clenbuterol-induziertem Muskelwachstum

Zusammenfassung:

Der Effekt von Propranolol auf Clenbuterol-induzierte Veränderungen in Muskelfasergröße und Proteingehalt wurde untersucht.
Propranolol inhibierte nicht die Fähigkeit von Clenbuterol, Proteinzunahme zu stimulieren, reduzierte jedoch die Zunahme an Muskelfasergröße. Die zusammensetzungsbedingten und physikalischen Charakteristika des Clenbuterol-induzierten Muskelwachstums schienen daher durch Propranolol voneinander differenziert werden zu können.

EINLEITUNG

Es konnte gezeigt werden, daß der β-adrenerge Agonist Clenbuterol spezifisch die Körperproteinzunahme fördert und Körperfett zusammen mit intramuskulärem Fett reduziert. Untersuchungen an jungen männlichen Ratten haben gezeigt, daß die Zunahme an Körperprotein augenscheinlich auf Herz- und Skelettmuskel beschränkt ist. Bei Schafen hatte das Medikament einen gleich schnellen Effekt sowohl auf die Stickstoffretention, Herzrate, und Körpertemperatur. Die längere Dauer und größere Medikamentenempfindlichkeit der Stickstoffretention legte jedoch den Schluß nahe, daß die beiden Reaktionen unterschiedliche mechanistische Grundlagen aulweisen könnten. Durch Verwendung verschiedener adrenerger Antagonisten bei Ratten wurde gefünden, daß die Effekte von Clenbuterol auf Lipolyse, Herzmasse und Energiehaushalt von den Effekten auf das Skelettmuskelwachstum getrennt werden konnten. Der β-Antagonist Propranolol blockierte den Anstieg in Herzmuskelmasse und verringerte in signifikanter Weise die Veränderung im Körperfett, hatte jedoch keinen Effekt auf die allgemeine Skelettmuskelwachstumsantwort.
Wir haben in Abschnitt 1 weiter oben gezeigt, daß die Clenbuterol-induzierte Zunahme an Muskelproteingehalt sich in einer Muskelfaserhypertrophie ausprägt. In diesem Abschnitt berichten wir über den Effekt von Propranolol auf die zwei Aspekte der Clenbuterol-induzierten Wachstumsreaktion, nämlich Muskelfasergröße und Gesamtmuskelproteingehalt.

MATERIAL UND METHODEN

Männliche Rooded-Lister Ratten (Rowett Stamm) wurden im Alter von 19 Tagen entwöhnt und in vier Gruppen von je 6 Tieren mit gleichem mittlerem Gewicht eingeteilt. Die Tiere bekamen ein standardisiertes Labor-Rattentrockenfutter (Labsure CRM nuts, K & K Greff, Sussex, England) und Wasser zur freien Verfügung angeboten. Nach vier Tagen wurden die Tiere erneut gewogen und falls notwendig, neu gruppiert, so daß die Gruppen ein gleiches mittleres Körpergewicht aufwiesen. Die Ratten wurden einzeln in Plastikkäfigen mit Drahtbeden gehalten und weitere vier Tage lang mit dem halbsynthetischen, pulverisierten Futter PW3 zur freien Verfügung gefüttert. Zu diesem Zeitpunkt wurde eine Gruppe weiter mit PW3 gehalten, während die anderen Gruppen entweder PW3 mit 2 mg/kg Futter Clenbuterol oder PW3 mit 200 mg/kg Futter Propranolol oder PW3 mit sowohl Clenbuterol als auch Propranolol in den oben angegebenen Dosierungen erhielten. Alle Gruppen bekamen ihr entsprechendes Futter für einen Zeitraum von 7 Tagen. Ihr Gewicht und die aufgenommene Nahrungsmenge wurden täglich gewogen.
Nach Ende des Versuchszeitraums wurden die Tiere durch zervikale Dislokation getötet und die Soleus-Muskeln entnommen und gewogen. Eine kleine Probe aus der Mitte jedes Muskels wurde entnommen und für die histochemische Untersuchung wie in Abschnitt 1 beschrieben vorbereitet. Die Bestimmung der Fasertypzusammensetzung basierte auf der Bewertung der Färbereaktion für Ca²&spplus;- aktivierte myofibrilläre ATPase bei pH 9,4 nach methanolfreier Formalinfixierung. Diejenigen Fasern, die das ausgeprägteste Reaktionsprodukt lieferten, wurden als schnell kontrahierende, oxidativ und glykolytisch aktive (FOG)-Fasern bezeichnet. Diejenigen, die kein Reaktionsprodukt lieferten wurden als langsam kontrahierende, oxidativ aktive (SO)-Fasern bezeichnet, und solche, die ein mittleres Reaktionsprodukt zeigten, wurden als schnell kontrahierende, glykolytisch aktive (FG)-Fasern bezeichnet. Die quantitative Auswertung der für ATPase angefarbten Muskelquerschnitte erfolgte mit Hilfe von Photographien auf einem Hipad Digitalisiertablett (Bausch und Lomb, Austin, Texas), das an einen Prime 550 Computer (Prime Computer Inc., Framingham, Massachussetts) angeschlossen und so programmiert worden war, daß er die benötigten Parameter aus den auf dem Tablett umfahrenen Flächen berechnen konnte.
Der übrige Muskel wurde eingefroren und bei -20ºC bis zur Verwendung zur Messung von RNA und Protein aufbewahrt. Die verwendeten Methoden waren die gleichen, wie in Abschnitt 1 vorstehend ausgeführt.

ERGEBNISSE

Alle Tiere entwickelten sich unter der angebotenen Diät gut und es gab am Ende des Experiments kaum Unterschiede zwischen den mittleren Körpergewichten in jeder Gruppe (Kontrolle 91,4 ± 2,8 g; Clenbuterol-Gruppe 94,6 ± 4,6 g; Propranolol-Gruppe 89,6 ± 3,5 g; Clenbuterol + Propranolol- Gruppe 95,7 ± 3,6 g; Mittelwerte ± SEM n=6 für jede Gruppe). Abgesehen von einer sehr leichten Abnahme der Nahrungsaufnahme am ersten Tag der Bereitstellung der experimentellen Diät waren die mittleren täglichen Aufnahmen für jede Gruppe nicht signifikant unterschiedlich Kontrolle 10,1 ± 0,2 g; Clenbuterol 9,4 ± 0,8 g; Propranolol 9,8 ± 0,3 g; Clenbuterol + Propranolol 10,1 ± 0,2 g: Mittelwerte ± SEM n= 6 für jede Gruppe). Folglich war die ungefähre täglich aufgenommene Menge des Medikaments für jede Gruppe entweder 0,02 mg Clenbuterol oder 2 mg Propranolol für die Einzelmedikament- Diät oder die Summe dieser beiden für eine Kombinationsdiät.

Muskelprotein- und RNA-Gehalt (Tabelle 1)

Die über die Nahrung eifolgte Verabreichung von Clenbuterol erzeugte eine Erhöhung des Muskelgewichts, die mit einer statistisch signifikanten Erhöhung von Gesamtprotein und RNA einherging. Der Futterzusatz von Propranolol allein verursachte keine Veränderungen im Muskelgewicht, Gesamtprotein oder RNA-Gehalt. Wenn Clenbuterol und Propranolol als Kombination dem Futter beigegeben wurden, wurde eine signifikante Zunahme des Gesamtproteingehalts des Muskels beobachtet. Obwohl der Gesamt-RNA-Gehalt sich ebenfalls vergrößerte, war die Standardabweichung des Mittelwerts (SEM) jedoch derart, daß eine statistische Signifikanz nicht erreicht wurde. Folglich veränderte die Zugabe des β-Antagonisten Propranolol zum Futter nicht qualitativ die Clenbuterol-induzierte Wachstumsreaktion im Ratten-Soleus-Muskel. Tatsächlich zeigten die Ergebnisse, daß Clenbuterol + Propranolol eine Zunahme der Muskelproteinkonzentration hervorrief. Tabelle 1 (Abschnitt 3): Tabelle 1. Der Effekt von Propanolol auf die Clenbuterol-induzierten Veränderung in Protein und RNA in Ratten Soleus-Muskeln
Werte sind angegeben als Mittelwerte mit ihren Satndardabweichungen.
Signifikanzniveaus wurden nach dem zweiteiligen Stundent t Test ermittelt unter Verwendung der mittleren Intragruppen-Standardabweichung berechnet durch Analyse der Varianz nach einem einzigen Merkmal. ***p < 0,005, **p < 0,01, *p < 0,05 verglichen mit Kontrolle

Muskelfaserfläche und Häufigkeit (Tabelle 2)

Charakteristischerweise erzeugte die Zugabe von Clenbuterol zum Futter bei jungen mannlichen Ratten eine Skelettmuskelwachstumsreaktion, so daß nach 7 Tagen das Medikament eine Faserhypertrophie in den untersuchten Soleus-Muskeln hervorrief. Typischerweise zeigten sowohl FOG- als auch SO-Fasertypen eine signifikante Zunahme der Faserfläche. Zusammen mit einem Trend zu Veränderungen in der prozentualen Häufigkeit dieser beiden Fasertypen resultierte dies in einer signifikanten Zunahme der prozentualen FOG-Fläche und einer signifikanten Abnahme der prozentualen SO-Fläche.
Die Muskeln von Ratten, die mit einer Diät gefüttert wurden, die Propranolol enthielt, waren denen von Ratten, die Kontrollfutter erhalten hatten, sehr ähnlich. Die Zugabe von Propranolol zur Clenbuterol-enthaltenden Diät resultierte jedoch in einer Verringerung der erwarteten Clenbuterolinduzierten Wachstumsantwort. Faserflächen und Häufigkeiten, die an Muskeln von Tieren gemessen wurden, welche mit der Kombinationsdiät gefüttert worden waren, wichen nicht signifikant von denen der Kontrollmuskeln ab. Tabelle 2 (Abschnitt 3): Tabelle 2. Der Effekt von Propanolol auf die Clenbuterol-induzierte Veränderung der Faserfläche und -Häufigkeit in Ratten Soleus-Muskeln
Werte sind angegeben als Mittelwerte mit ihren Standardabweichungen.
Fasertyp-Nomenklatur
FOG = Schnell kontrahierend oxidativ glykolytisch:
FG = schnell kontrahierend glykolitisch;
SO = langsam kontrahierend oxidativ
Signifikanzniveaus wurden nach dem zweiteiligen Student t Test ermittelt unter Verwendung der mittleren Intragruppen-Standardabweichung berechnet durch Analyse der Varianz nach einem einzigen Merkmal.
* = p < 0,05 verglichen mit Kontrolle

DISKUSSION

Die Effekte der wachstumsfördernden β-Agonisten, beispielhaft gezeigt an Clenbuterol, haben sich in einer Reihe von Aspekten als interessant erwiesen. Clenbuterol scheint in der Lage zu sein, eine muskeispezifische Zunahme der Proteinablagerung zu stimulieren, selbst bei schnell wachsenden jungen männlichen Ratten, die eine energie- und proteinreiche Diät erhalten. Ähnliche Veränderungen treten auf in denervierten Muskeln, wie weiter oben in Abschnitt 2 gezeigt, bei denen andere Wirkstoffe sich als wirkungslos erwiesen haben. Diese Medikamente scheinen daher eine physiologische Einschränkung des Muskelwachstums zu umgehen. Diese Argumentation kann ausgedehnt werden auf Veränderungen im Proteinmetabolismus, dahingehend daß Clenbuterol selektiv den Proteinabban unterdrückt, wohingegen die meisten physiologischen Stimuli für Muskelwachstum gleichzeitig Muskelproteinsynthese und -abbau verstärken.
Die vorliegenden Ergebnisse legen den Schluß nahe, daß es zumindest auf kurze Sicht möglich ist, die Zunahme an Muskelprotein von der normalerweise begleitenden Zunahme der Abmessungen der Muskelfasern zu trennen. Folglich und in Bestätigung früherer Resultate führte die Anwesenheit des gemischten β-Antagonisten Propranolol nicht zu einer Hemmung der Fähigkeit von Clenbuterol, Muskelproteinzunahme zu stimulieren, sondern reduzierte die Zunahme an Muskelfaserfläche, von der in früheren Experimenten gezeigt wurde, daß sie mit diesem Effekt von Clenbuterol-Behandlung einhergeht (siehe Abschnitt 1 oben).
Es sollte betont werden, daß dies Kurzzeitexperimente sind und daß die Ergebnisse nicht so interpretiert werden sollten, daß sie die letztendliche Korrelation von Muskelwachstum hinsichtlich seines Ausmaßes und dem Gewinn an Muskelprotein widerlegen. Nichtsdestotrotz zeigen sie, daß irgendwelche unterschiedlichen Faktoren wahrscheinlich in die Kontrolle dieser zwei Aspekte des Wachstums involviert sind.
Die Trennung zwischen Veränderungen im Volumen (unter der Aunahme, daß die Muskelfaserlänge in Clenbuterol und Clenbuterol+Propranolol-behandelten Tieren gleich war) und den Veränderungen im Proteingehalt ist am einfachsten dadurch erklärt, daß man Veränderungen im Wassergehalt des Muskels annimmt. Clenbuterol allein erhöht nicht die Konzentration an Muskelprotein, aber die Kombination von Clenbuterol mit dem β-Blocker führte zu einer 10 %igen Zunahme der Muskelproteinkonzentration. Die Ergebnisse eines kürzlich durchgeführten Experimentes unterstützen diesen Vorschlag, indem sie zeigen, daß in den Muskeln von Ratten, die mit Clenbuterol + Propranolol behandelt worden waren, die Wasserkonzentration signifikant (p < 0,025) niedriger war als in denen von Ratten, die jedes Medikament einzeln erhalten hatten (Clenbuterol 73,8 ± 0,3 %; Propranolol 73,3 ± 0,3 %; Clenbuterol + Propranolol 71,6 ± 0,2 % Mittelwerte ± SEM n=6 für jede Gruppe).
Der Skelettmuskel ist sowohl ein hochgeordnetes als auch ein heterogenes Gewebe in dem Sinne, daß es intrazelluläre Strukturen enthält wie komplexe sarkoplasmatische und transverse Tubularmembransysteme und Mitochondrien, die ihrerseits eine hochorganisierte Myofilament-Anordnung umgeben.
Es gibt Hinweise dafür, daß "intrazelluläres" Wasser im allgemeinen und Muskelwasser im besonderen sich nicht als frei bewegliche und austauschbare Population von Molekülen verhalt, sowie speziell daß komplexe Wechselwirkungen zwischen F-Aktin und Wasser auftreten. Darüberhinaus ist der extrazelluläre Raum des Skelettmuskels sowohl durch die fibrilläre Natur des Gewebes als auch durch die Anwesenheit der extrafilamentären Kollagenscheide begrenzt. Folglich kann die Beziehung zwischen der Zunahme und den beiden Hauptkomponenten der Muskelmasse, Protein und Wasser, nicht so einfach wie die in weniger gleichmäßig strukturierten Geweben sein.
Ein weiterer Faktor sollte in Betracht gezogen werden, falls Veränderungen in der Beziehung zwischen Protein- und Wasserzunahme den vorliegenden Ergebnissen zugrunde liegen. In unseren früheren Untersuchungen zu den Effekten von Propranolol auf das Clenbuterol-induzierte Wachstum wurde bemerkt, daß der β-Antagonist nicht das Vermögen von Clenbuterol zur Stimulierung des Muskelwachstums beeinträchtigte, während es den Einlluß des β-Agonisten auf Körperfett und, vielleicht viel wichtiger, auf die Gesamtenergiebilanz, signifikant reduzierte. Ein Faktor, der zu dieser Zunahme des Energieverbrauchs beiträgt, könnte eine β-vermittelte Aktivierung der Na/K-ATPase sein. Da die Aktivität dieses Enzyms kritisch für die Kontrolle des zellulären Kaliums und Natriums ist, ist es wahrscheinlich an der Kontrolle der Wasserbewegung durch die Zellmembran hindurch beteiligt. Als Resultat könnte die Clenbuterol-induzierte Zunahme der Ionenpumpenaktivität blockiert und die freie Bewegung von Wasser inhibiert werden, während Clenbuterol weiter die Ablagerung von Protein in Gegenwart von Propranolol fördert. Was auch immer der zugrundeliegende Mechanismus sein mag: die Veränderungen, die wir beobachtet haben, könnten ein weiteres Anzeichen dafür sein, daß die besonderen Effekte des Medikaments Clenbuterol auf Muskelproteinzunahme wenig, wenn überhaupt irgendwelche Verbindung zu seiner Wirkung als β-Agonist haben, obwohl einige der durch Clenbuterol vermittelten Effekte eindeutig β-vermittelt sind.

Abschnitt 4

Der Effekt des anabol wirksamen Mittels Clenbuterol auf überbeanspruchte Ratten-Skelettmuskel

Zusammenfassung:

Die über die Nahrung erfolgende Verabreichung von Clenbuterol an junge mannliche Ratten bewirkt, wie gezeigt wurde, eine muskelspezifische hypertrophe Wachstumsantwort. Dieser Abschnitt zeigt, daß der kombinierte Effekt der Medikamentenbehandlung und eines hypertrophen Stimulus, der durch Tenotomie induziert wurde, einen additiven Effekt auf das Muskelwachstum hervorruft. Dieser Effekt wurde sowohl an der Muskelzusaannensetzung (Protein und RNA) als auch an der Fasergröße gezeigt.

EINLEITUNG

Die proteinanabolen Effekte des β-adrenergen Agonisten Clenbuterol haben über die letzten Jahre hinweg beträchtliches Interesse geweckt. Bemerkenswerterweise scheint das Medikament eine muskelspezifische Wirkung zu haben, ausgedrückt als Muskelfaserhypertrophie in Abgrenzung zur Hyperplasie (siehe Abschnitt 1 oben).
In jungen Ratten scheint der anabole Effekt von Clenbuterol für ungefähr eine Woche anzuhalten. Es ist möglich, daß dies so ist, weil die Muskelgrößenzunahme in diesem Stadium ein kritisches Maximum erreicht hat. Es war von dnher von Interesse herauszufinden, ob das Medikament in einem Muskel eine weitere Wachstumsantwort hervorrufen könnte, der bereits einem getrennten hypertrophen Stimulus ausgesetzt worden war. Die Tenotomie der Gastrocnemius-Muskeln bei Ratten erzeugt eine Überbeanspruchung der verbleibenden fünktionellen Synergisten, d.h. der Soleus- und Plantaris-Muskein, die daraufhin eine kompensatorische Hypertrophie durchmachen.
Die Antagonisten halten die funktionell überbeanspruchten Muskeln in einem gestreckten Zustand, aus dem die Hypertrophie resultiert.
Dieser Abschnitt beschreibt die Wirksamkeit des wachstumsfördernden Medikamentes Clenbuterol bei der Überlagerung eines weiteren Wachstums eines Muskels, der bereits einem durch Tenotomie induzierten hypertrophen Stimulus ausgesetzt wurde.

MATERIALIEN UND METHODEN

Männliche saugende Hooded Lister Ratten (Rowett Stamm) wurden, wie bereits weiter oben beschrieben (Abschnitt 1 oben), verwendet, gehalten, gruppiert und gefüttert. Kurz zusammengefaßt wurden die Tiere in zwei Gruppen von 18 Tieren gleichen mittleren Körpergewichts eingeteilt. Die Tiere wurden zuerst an Standardrattentrockenfutter für 4 Tage gewöhnt und dann für weitere vier Tage mit der halbsynthetischen pulverisierten Trockenfutterdiät PW3 gefüttert.
Die Tenotomieprozedur wurde unter Ethernarkose und aseptischen Bedingungen durchgeführt. Ein kleiner Einschnitt wurde in der Haut an der Ferse gesetzt, und die Sehnen des Gastrocnemius wurden identifiziert und inzisiert. Unmittelbar nach der Erholung von dem chirurgischen Eingriff wurde einer Gruppe die Kontrolldiät PW3 angeboten, während die übrige Gruppe PW3 mit Clenbuterol (2 mg/kg Futter) erhielt. Aus jeder Gruppe (Kontroll- und Clenbuterol-Gruppe) wurden 6 Tiere nach 3, 7 oder 11 Tagen getötet und die Soleus-Muskeln aus den Kontroll- und tenotomisierten Gliedmaßen entfernt. Die Muskeln wurden gewogen und eine kleine Probe wurde aus dem Mittelteil des Muskels entfernt und für die histochemische Untersuchung gemaß Abschnitt 2 oben vorbereitet. Die Bestimmung der Fasertypensssammensetzung basierte auf der Antarbung für Ca²&spplus;-ATPase und erlaubte die Differenzierung von langsam kontrahierenden (SO), schnell kontrahierenden, oxidativ und glykolytisch aktiven (FOG) und schnell kontrahierenden, glykolytisch aktiven (FG) Fasern. Die quantitative Auswertung der Faserflächen erfolgte wie im Abschnitt 2 oben beschrieben von Photographien der für ATPase-Aktivität angefarbten Querschnitte.
Der übrige Muskel wurde schnell eingefroren und bei - 20 ºC aufbewahrt bis zur Verwendung für Bestimmungen von Muskelprotein und RNA-Gehalt nach bekannten Methoden.
Die Muskeln der vier verschiedenen Behandlungsarten wurden wie folgt bezeichnet:
C Soleus der untenotomisierten Extremität von Ratten mit Kontrollfutter.
CT Soleus der tenotomisierten Extremität von Ratten mit Kontrollfutter.
A Soleus der untenotomisierten Extremität von Ratten mit Clenbuterol (Agonist).
AT Soleus der tenotomisierten Extremität von Ratten mit Clenbuterol (Agonist).

ERGEBNISSE

Muskelprotein und RNA-Gehalt (Tabelle 1)

Bei den kontrollgefütterten Tiere ging die Tenotomie einher mit der typischen hypertrophen Reaktion in dem intakten synergistischen Muskel, dem Soleus. Das Muskelgewicht zeigte eine statistische signifikante Zunahme innerhalb von drei Tagen nach dem chirurgischen Eingriff, und dies war begleitet von Zunahmen an Muskelprotein- und RNA-Gehalt (Tabelle 1). Über 11 Tage hinweg erhöhte die durch den Gebrauch hervorgerufene Hypertrophie den RNA-Gehalt der Gruppe CT auf einen signifikant höheren Wert (P < 0,005) als in Muskeln der Gruppe A. Die Tenotomie führte auch zu einer signifikanten Erhöhung (P < 0,005) des RNA/Protein-Quotienten in den Soleus-Muskeln, die der kompensatorischen Hypertrophie unterlagen (Tabelle 1).
Die Muskeln der Gruppe AT zeigten, daß die Wirkungen des Medikaments und die Effekte bei Arbeitsüberlastung des Muskels additiv waren. Die Werte für Protein- und RNA-Gehalte in Muskeln der Gruppe AT waren signifikant größer als in Gruppe A sowohl an Tag 7 als auch an Tag 11 (Tabelle 1).
Alle Muskeln zeigten eine Zunahme im RNA-Gehalt als Ergebnis entweder der Tenotomie, Clenbuterol-Behandlung, oder von beidem und diese ging der Erhöhung an Proteinzunahme voraus. Der Effekt war jedoch besonders ausgeprägt in Muskeln, die der kombinierten Behandlung ausgesetzt worden waren (Gruppe AT). Ein Teil der Clenbuterol-Reaktion (Gruppe A) involvierte eine Zunahme an RNA, wänrend eine noch weitere Zunahme in additiver Weise durch den Effekt der Tenotomie (Gruppe AT) erreicht wurde. Interessanterweise zeigten Muskeln der Gruppe CT die kleinste Zunahme in Gesamtproteingehalt und RNA-Gehalt zwischen Tag 3 und Tag 7, wohingegen, im Gegensatz hierzu die Clenbuterol-behandelten Gruppen große Zunahmen in diesen Parametern über diesen Zeitraum aufwiesen.
Wie bei den Muskeln der Gruppe CT beobachtet, gab es eine statistisch signifikante Zunahme des RNA/Protein-Quotienten in Muskeln der AT-Gruppe von Tag 3 an. Es gab keine signifikanten Unterschiede zwischen den RNA/Protein-Quotienten in Muskeln aus tenotomisierten Extremitäten aus beiden Fütterungsgruppen nach der anfänglichen 3-Tage-Periode, obwohl sowohl die Kontroll- als auch die Clenbuterol-behandelte Gruppe signifikant höhere Translationskapazitäten aufwiesen (P < 0,0005) als jede der nicht-operierten Gruppen. Tabelle 1 (Abschnitt 4): Tabelle 1. Effekt der nach Tenotomie auftretenden kompensatorischen Hypertrophie und der Clenbuterol- Behandlung auf Protein- und RNA-Gehalt in Ratten Soleus-Muskel. Werte sind angegeben als Mittelwerte mit ihren Standardabweichungen.
Signifikanzwerte wurden nach dem zweiteiligen Student t Test geschätzt unter Verwendung der mittleren Intragruppen-Standardabweichung berechnet durch Analyse der Varianz nach einem einzigen Merkmal.
***p < 0,005; **p < 0,01; *p < 0,05 verglichen mit Werten von Muskeln aus nichtoperiereten Extremitäten von kontrollgefütterten Tieren
p < 0,005; p < 0,01; p < 0,05 verglichen mit Werten von Muskeln aus tenotomisierten Extremitäten von kontrollgefütterten Tieren
ap < 0,005; bp < 0,001; cp < 0,05 verglichen mit Werten von Muskeln aus nichtoperierten Extremitäten von Clenbuterol- gefütterten Tieren

Muskelfaserflächen (Tabelle 2)

Die kompensatorische Muskelfaserhypertrophie als Reaktion auf Tenotomie war deutlich sichtbar in allen Fasertypen der Soleus-Muskeln aus kontrollgefütterten Tieren ab Tag 7, war jedoch erst ab Tag 11 statistisch signifikant. Die kompensatorische Hypertrophie in Muskeln der Gruppe CT war nicht signifikant unterschiedlich von der in Clenbuterol-behandelten Kontrollmuskeln (Gruppe A, Tabelle 2). Die Abwesenheit einer statistisch signifikanten Hypertrophie in Muskeln der Gruppe CT und Gruppe A am Tag 3 bleibt unerklärt und unerwartet in Hinblick auf die signifikante Hypertrophie in Muskeln der Gruppe AT.
Die Effekte von Clenbuterol und Tenotomie waren (in allen Fällen außer an Tag 3) additiv, so daß die FOG- und SO-Faserllächen in Muskeln der Gruppe AT signifikant größer waren als in jeder anderen Gruppe (p (0,05; Tag 7 und Tag 11; Tabelle 2). Eine statistisch signifikante Hypertrophie war deutlich in den Muskeln der Gruppe AT vor dem Zeitpunkt bemerkbar, an dem vergleichbare Muskeln aus kontrollgefütterten Tieren den Effekt zeigten. Diese Reaktion trat zu einem Zeitpunkt auf, als die kontralateralen Muskeln aus diesen Clenbuterol-gefütterten Tieren eine kleinere Stimulierung der Gewichts- und Proteinzunahme zeigten (Tabelle 2). Ausgedrückt als prozentuale Veränderung gegenüber den entsprechenden, nicht operierten Kontrollen zeigten die Muskeln der Gruppe CT jedoch an Tag II die größere prozentuale Zunahme an Faserfläche in Übereinstimmung mit den Veränderungen an Gewicht und Protein. Tabelle 2 (Abschnitt 4): Tabelle 2. Effekt der nach Tenotomie auftretenden kompensatorischen Hypertrophie und der Clenbuterol- Behandlung auf Faserfläche in Ratten Soleus-Muskel. Werte sind angegeben als Mittelwerte mit ihren Standardabweichungen. (n = 6)
Signifikanzwerte wurden nach dem zweiteiligen Student t Test geschätzt unter Verwendung der mittleren Intragruppen-Standardabweichung berechnet durch Analyse der Varianz nach einem einzigen Merkmal.
***p < 0,005; **p < 0,01; *p < 0,05 verglichen mit Werten von Muskeln aus nichtoperiereten Extremitäten von kontrollgefütterten Tieren
p < 0,005; p < 0,01; p < 0,05 verglichen mit Werten von Muskeln aus tenotomisierten Extremitäten von kontrollgefütterten Tieren
ap < 0,005; bp < 0,001; cp < 0,05 verglichen mit Werten von Muskeln aus nichtoperierten Extremitäten von Clenbuterol- gefütterten Tieren

DISKUSSION

Frühere Untersuchungen haben gezeigt, daß die muskelspezifischen, anabolen Effekte von Clenbuterol sich als Muskelfaserhypertrophie ausprägten (Abschnitt 1 oben). Die Ergebnisse der vorliegenden Experimente zeigen, daß Clenbuterol-Behandlung zwar Muskelwachstum potenziert, daß das Medikament aber nicht das gesamte latente Wachstum hervorruft, dessen ein Gewebe fähig ist.
Muskeln, die man entweder Clenbuterol oder Tenotomie ihrer synergistischen Muskeln ausgesetzt hat, zeigten Hypertrophie. Die Reaktion solcher Muskeln war charakterisiert durch eine Zunahme an Gesamtmuskelprotein- und RNA-Gehalt in Verbindung mit einer Zunahme der Faserquerschnittsfläche. Nach 11 Tagen erzeugten beide experimentelle Manipulationen ein vergleichbares Ausmaß einer Reaktion in Hinblick auf Gesamtproteingehalt und Fasergröße. Die Tenotomie-induzierte kompensatorische Hypertrophie führte jedoch zu einer sehr viel markanteren Zunahme des RNA/Protein-Quotienten, als an Muskeln aus der Clenbuterol-behandelten Gruppe erkennbar war (Tabelle 1). Diese Ergebnisse passen zu der Beobachtung, daß kompensatorische Hypertrophie einhergeht mit erhöhten Proteinsyntheseraten, während von Clenbuterol gezeigt werden konnte, daß es die Proteindegradation reduziert und wenig Einfluß auf die anteilige Syntheserate autweist. Dies deutet an, daß, obwohl das Nettoergebnis beider Behandlungsarten ähnlich war, nämlich Hypertrophie, der Mechanismus, nach dem dies erreicht wurde, bei beiden Behandlungsarten unterschiedlich sein könnte.
Folglich war es nicht überraschend, daß die Kombination von Clenbuterol-Behandlung mit der Tenotomie-induzierten hypertrophen Tendenz in Hinblick auf Gesamtmuskelprotein und RNA im Endeffekt (nach 11 Tagen) eine signifikant größere Reaktion hervorruft (P < 0,005) als jede Behandlungsart für sich genommen. Diese Reaktion auf die kombinierten Behandlungen war auch stark sichtbar an den Fasergrößen. Die Tatsache, daß die SO-Fasern in den Muskeln der tenotomisierten Extremitat sich nicht signifikant innerhalb der beiden Behandlungsgruppen unterschieden, könnte wichtig sein. Aus dieser Beobachtung kann geschlossen werden, daß diese oxidativen Fasern eine maximale Größe erreicht hatten, oberhalb derer die Diffiision von Sauerstoff in der für den besonderen Metabolismus dieser oxidativen Muskeln ausreichenden Menge limitierend werden könnte. Die FOG- und FG-Fasertypen, die zum anaeroben Metabolismus befähigt sind, wären nicht im gleichen Ausmaß hierdurch betroffen. Wenn dies so ist, ist es möglich, daß mit der Kombination der beiden Behandlungen das maximale Wachstumspotential unter diesen besonderen Umständen erreicht worden ist.

Abschnitt 5:

Der Effekt von β-Agonisten und β-Antagonisten auf Muskelwachstum und Körperzusammensetzung von jungen Ratten (Rattus sp.)

Zusammenfassung:

1. Der Zusatz des β-selektiven adrenergen Agonisten Clenbuterol zum Futter ging einher mit einer Zunahme an Protein und RNA im Skelettmuskel und Herzmuskel, einer Abnahme an Fettablagerung und einer Zunahme des Energieverbrauchs.
2. Weder Propranolol noch Atenolol blockierten den Effekt von Clenbuterol auf Muskeimasse, aber beide reduzierten dessen Effekte auf Herzmasse und Fettmasse und Energieverbrauch.
3. Fünf andere β-Agonisten wurden getestet. Alle erhöhten die interskapuläre Masse braunen Fettgewebes und erniedrigten Körperfett, aber nur zwei erhöhten Skelettmuskelprotein.
4) Es wird geschlossen, daß die anabolen und antilipogenen Wirkungen gewisser β-Agonisten mechanistisch unterschiedlich sind.

EINLEITUNG

Einige, aber nicht alle β-selektiven adrenergen Agonisten stimulieren die Ablagerung von Körperprotein und inhibieren die von Körperfett. Ihre Effekte wurden bereits in einer Reihe von Spezies beobachtet, sie treten auf in unkastrierten männlichen Tieren und, was am bemerkenswertesten ist, ihre anabolen Eigenschaften scheinen auf die Skelettmuskulatur und Herzmuskulatur beschränkt zu sein. Einige Resultate legten den Schluß nahe, daß die Zunahme an Muskelproteinansammlung zurückzuführen ist auf eine markant niedrigere Rate des Muskelproteinabbaus.
In Schafen wurde gefunden, daß eines dieser Medikamente, Clenbuterol, verabreicht als abornasale Imusion, die Stickstoffretention innerhalb drei Stunden erhöhte und daß die Zunahme der Stickstoffretention zusammenfiel mit einer Erhöhung von Herzrate und Körpertemperatur. Allerdings war die kardiovaskuläre Antwort von kurzer Dauer (circa 30 Stunden), während die Stickstoffretention für 6 Wochen erhöht blieb. Die Unterschiede in den zeiflichen Verläufen der Stickstoffretention und der kardiovaskulären Reaktionen und auch die Unterschiede ihrer Dosisabhängigkeiten legen den Schluß nahe, daß beiden ein unterschiedlicher Mechanismus zugrunde liegt. Im Besonderen könnte man sich fragen, ob die Wirkung von Clenbuterol, falls es direkt das Muskelwachstum fördert, in dieser Hinsicht etwas mit β-Stimulation zu tun hat.
In diesem Abschnitt berichten wir über Untersuchungen zur Sensitivitat von β-Antagonisten auf die Stimulation des Muskelwachstums und die Inhibition der Fettablagerung durch Clenbuterol und über den Effekt einiger anderer β-Agonisten auf Gewebewachstum und Fettablagerung.

MATERIALIEN UND METHODEN

Materialien

Mit Ausnahme von Clenbuterol, das ein Geschenk von Boehringer-Ingelheim war, wurden die unterschiedlichen Medikamente aus kommerziellen Quellen bezogen. Materialien für die Assays wurden entweder von Sigma Chemical Co (Poole, Dorset, England) oder von BDH PLC (Poole, Dorset, England) erhalten.

Tiere und Fütterung

Die Tiere waren Hooded Lister Ratten vom ingezüchteten Rowett-Stamm. Die Tiere waren in einer spezifisch pathogenfreien Umgebung gezüchtet worden. Nach Entwöhnung am 19. Tag nach der Geburt wurden die Tiere bei 23ºC mit einem 12-Stunden-Tag/Nacht-Zyklus (Tagbeginn 7.00 Uhr) in einem "minimal disease"-Tierhaus gehalten. Männliche Ratten wurden in Experiment 1 und weibliche Ratten in Experiment 2 verwendet. Frühere Arbeiten haben gezeigt, daß die beiden Geschlechter hinsichflich ihrer Reaktionen auf Clenbuterol sich nicht unterscheiden.
Nach Abgewöhnen der Tiere wurden sie in Gruppen von 6 Tieren mit gleichem mittlerem Körpergewicht gehalten. Für die nächsten 4 Tage wurde ihnen ad libitum eine Standard-Labor-Diät (Labsure, K & K Greef, Croydon, Surrey, England) angeboten. Die Tiere wurden dann erneut gewogen und, falls notwendig, umgruppiert, so daß jede Gruppe zu Beginn der Experimentierperiode das gleiche mittlere Körpergewicht und somit während der Zeit davor den gleichen Gewichtszuwachs aufwies. Zu diesem Zeitpunkt wurde jedes Tier, das vom Mittelwert um mehr als 2 Standardabweichungen abwich (± 3 g) vom Experiment ausgeschlossen. Im Ganzen wurden von den 168 Tieren zu Beginn 12 Tiere aus diesen Gründen ausgeschlossen.
Die Tiere wurden dann für weitere 4 Tage einzeln in klaren Plastikkäfigen untergebracht, die als Boden einen Lattenrost aufwiesen und den freien Zugang zu einem Futtermittel in Pulverform (PW3) zuließen. Nach dieser Zeit erhielten sie entweder weiterhin das gleiche Futtermittel oder PW3 mit einem Zusatz unterschiedlicher Medikamente. Diese Medikamente waren Clenbuterol, Isoetharin, Orciprenalin, Reproterol, Salbutamol und Terbutalin. Die gepulverten Medikamente wurden in eine kleine Menge PW3 gemischt und entsprechende Mengen der Hauptmenge der Diätformulierung zugefügt. Diese Diät wurde dann wenigstens für 30 Minuten bei 200 Umdrehungen pro Minute in einem Haushaltsmischgerät mit Schlagrühwerk gemischt.
Von diesem Zeitpunkt an wurden die Körpergewichte (gemessen zwischen 9.30 und 10.30) und die aufgenommenen Mengen Nahrung (korrigiert auf Verluste durch Verschütten) täglich erfaßt. Gruppen von Tieren wurden zu Beginn des Experiments und nach 7 und 21 Tagen in Experiment 1 getötet. In Experiment 2 wurden die Tiere nach 15 Tagen getötet.

Tötung und Sektion

Die Tiere wurden um 9.00 Uhr aus dem Tierhaus herausgebracht. Sie wurden durch zervikale Dislokation nicht später als 3 Stunden nach dem Transfer getötet und wurden unmittelbar nach dem Tod gewogen. Der gesamte gastrointestinale Trakt, die Leber, beide Nieren, und das Herz wurden entfernt. Die Organe wurden vor dem Wiegevorgang gründlich durch Abtupfen getrocknet; das Herz wurde vorher ausgeblutet. Die Hinterbeine wurden vorn Körper abgetrennt, enthautet und mit dem Fuß auf der Laborbank fixiert. Die Achillessehne wurde durchtrennt und die Gastrocnemius/Plantaris/Soleus- Muskelgruppe proximal abgepellt. Die Muskeln wurden abgetrennt. Jedes Paar wurde vereinigt, in eine gewogene Polythentüte getan, gewogen und in flüssigem Stickstoff eingefroren. Die Gewebe wurden in verschlossenen Tüten bei - 20ºC aufbewahrt, bis ihr Inhalt innerhalb eines Monats nach der Sektion analysiert wurde. Der Restkörper wurde gewogen und bei - 20ºC eingefroren aufbewahrt.

Muskelzusammensetzung

Die Muskelproben wurden in flüssigem Stickstoff eingefroren und zwischen zwei Aluminiumblöcken pulverisiert, die vorher mit Trockenels vorgekühlt worden waren. Aliquots (ca. 100 mg) des Pulvers wurden akkurat gewogen und in 3 ml 0,5 M Perchlorsäure (PCA) homogenisiert. Das Homgenisat wurde bei 6000 g für 15 Minuten zentrifügiert und der Niederschlag wurde in 2 ml 0,5 M PCA resuspendiert. Nach der Zentrifügation wurden die beiden Überstande vereinigt und eingefroren für die spätere Messung des Muskel-Creatin-Gehaltes aufbewahrt. Der Niederschlag wurde in 10 ml 0,3 M NaOH für eine Stunde bei 37ºC inkubiert, und ein 1 ml Aliquot der Lösung wurde für die Proteinmessung verwendet. Der Rest wurde mit 1 ml 3 M PCA vermischt, auf 4ºC abgekühlt für 30 Minuten und zentrifügiert. Der Überstand wurde zur Bestimmung des RNA-Gehalts aus dem Quotienten der optischen Dichten (OD) bei 260 nm und 232 nm verwendet. RNA wurde nach der Formel berechnet:
RNA (µg/ml) = 10,34 x (3,17 x OD260 -0,75 x OD 232).
In einigen Experimenten wurde der Niederschlag dann resuspendiert in 10 ml 0,5 M PCA, für 30 Minuten auf 90ºC erhitzt, zentrifugiert und der DNA-Gehalt des Überstandes durch ein bekanntes Verfahren bestimmt. Alle Muskeln zeigten ähnliche Reaktionen und daher werden aus Gründen der Einfachheit nur die Ergebnisse gezeigt, die mit den Gastrocnemius-Muskeln erhalten wurden.

Malkroskopische Körperzusammensetzung

Die gefrorenen Kadaver wurden in etwa 3 cm große Würfel geschnitten, lyophilisiert für 4 Tage, davon die letzten zwei Tage bei 40ºC. Die getrockneten Proben wurden in einer Braun Multimix Küchenmaschine pulverisiert, und je drei Proben wurden für die Analyse von Stickstoff und Fett verwendet. Körperprotein wurde berechnet als N x 6,25, und der Gesamtenergieinhalt wurde berechnet als:
Energie (kJ) = (Körperstickstoff (N) (g) x 148,1) + (Körperfett (g) x 39,6).

Schätzung der Muskelmasse

Die Messung der Gesamtmuskelmasse basierte auf der Annahme, daß der Körperpool von Creatin fast ausschließlich aus dem Creatin des Skelettmuskels besteht. Durch Messung des Körpergehaltes an Creatin und dem Vergleich dieses Wertes mit dem Quotienten aus Creatin:Protein in Muskelproben des gleichen Tieres kann eine Abschatzung des Gesamtmuskelproteinpools erhalten werden.
Doppelproben des getrockneten Kadaverpulvers (ca. 300 mg) wurden in 3 ml 0,5 M PCA homogenisiert und anschließend bei 6000 g für 20 Minuten zentrriugiert. Der Niederschlag wurde mit weiteren 2 ml PCA gewaschen. Die Uberstande wurden vereinigt und mit einem bektannten Volumen an 4 M KOH neutralisiert (pH 4-6). Nach der Zentrigation wurde der Überstand erneut mit 0,25 ml 5,4 M HCl angesauert und die Lösung wurde 30 Minuten bei 15 Pfünd/Quadratinch (15 lbs/in²) autoklaviert, um das Creatin in Creatinin zu verwandeln. Die Creatinin-Konzentration wurde gegen Standards aus Creatin gemessen, das der gleichen Prozedur unterzogen worden war. Der Creatin-Gehalt der PCA- Überstände der Gastrocnemius-Muskel-Homogenisate wurden ebeufalls geschätzt. Frühere Arbeiten an Kaninchen hatten gezeigt, daß die Methode Resultate ergibt, die von denen nicht zu unterscheiden sind, die nach Totalsektion erhalten werden.

Statistik

Die Signifikanz der Unterschiede zwischen Mittelwerten wurde mit Hilfe zweiteiliger t-Tests erfaßt. In Experiment 2 wurden die Veränderungen in Körperfett, Leber-, Herz- und Gesamtmuskelmasse gegeneinander mit Hilfe des Spearmann Rank Korrelationstests korreliert. Ein Wert von P (zweiteilig) von weniger als 0,05 wurde als statistisch signifikant angesehen.

ERGEBNISSE

Experiment 1. Die Effekte von β-Antagonisten auf die Clenbuterol-Wirkung

Obwohl die Anwesenheit von Clenbuterol in der Diät keinen Einfluß auf die Nahrungsaufnahme hatte, war sie mit einer Steigerung der Protein- und RNA- (aber nicht DNA-) Gehalte des Gastrocnemius-Muskels (Tabelle 2) und einer Erhöhung der Gesamtmuskelproteinmasse (Tabelle 3) verbunden. Beide Antagonisten führten zu einer weiteren, kleinen, aber statistisch signifikanten Erhöhung des Gastrocnemius-Proteingehalts und nicht etwa zu einer Verringerung des Clenbuterol-Effekts. Protein-, RNA- und DNA-Gehalt des Herzens waren auch höher in Tieren, die Clenbuterol allein erhalten hatten. Sowohl Propranolol als auch Atenolol reduzierten jedoch signifikant den Effekt von Clenbuterol auf den Protein- und RNA-Gehalt im Herzen.

Körperprotein. Fett und berechneter Energieverbrauch

Vier Beobachtungen waren bemerkenswert (Tabelle 3). Erstens war der Effekt von Clenbuterol auf Gesamikörperprotein und Gesamtmuskelprotein der mit der Clenbuterol-Behandlung verbunden war, mehr oder weniger an Tag 7 der Behandlung abgeschlossen. Zweitens konnte die Zunahme an Gesamtkörperprotein vollständig durch eine Zunahme der Muskelproteinmasse erklärt werden. Drittens beeinflußten keiner der beiden Antagonisten in negativer Weise den Effekt von Clenbuterol auf die Gesamtmuskel- und Gesamtkörperproteinablagerung, und wiederum gab es eine Tendenz (obwohl nicht signifikant), daß das Gesamtmuskelprotein in den Gruppen CP, CPII und CA höher war. Viertens wurde die niedrigere Rate der Fettablagerung, die mit der anhaltenden Ingestion von Clenbuterol verbunden war, teilweise durch sowohl Propranolol als auch Atenolol rückgängig gemacht. Es sei darauf hingewiesen, daß dieser Effekt nicht vollständig rückgängig gemacht wurde und daß die Körperfettmasse in den Gruppen CP, CPII und CA immer noch signifikant niedriger war als die der Kontrolltiere.
Unter Bezugnahme auf die Unterschiede zwischen der Aufnahme metabolisierbarer Energie und Zunahme an Körperenergie schien es, daß Clenbuterol den Gesamtenergieverbrauch um etwa 8 % (P < 0,001) erhöhte und daß beide Antagonisten diesen Effekt des β-Agonisten vollständig rückgängig machten.

Experiment 2. Der Einfluß von β(2)-Agonisten auf Wachstum und Körperzusammensetzung.

Von den untersuchten Agonisten steigerte nur Clenbuterol in markanter Weise die Masse der Beinmuskeln (Tabelle 4). Obwohl sowohl Orciprenalin als auch Isoetharin einen Effekt hervorriefen, war dieser geringer als der, der mit der Clenbuterol-Behandlung verbunden war. Isoetharin und Salbutamol erhöhten in signifikanter Weise die Herzmasse, und Terbutalin und Reproterol reduzierten die Lebermasse. Mit Ausnahme von Orciprenalin erhöhten alle diese Medikamente die Masse der interskapulären Polster braunen Fettgewebes.
Orciprenalin und Isoetharin erhöhten die Körperproteinmasse (+5 % P < 0,05), allerdings nicht so wirkungsvoll wie Clenbuterol (+11 % P < 0,001). Terbutalin und Orciprenalin reduzierten ebenfalls die Körperfettmasse (-14 %) hatten aber wiederum keinen so ausgeprägten Effekt wie Clenbuterol (-26 %). Der Spearmann Rank Korrelationstest ergab eine signifikante Beziehung zwischen den Abnahmen an Körperfett und Lebermasse (R = 0,421: P < 0,05). Die Veränderung in der Beinmuskelmasse korrelierte signifikant mit der Zunahme an Körperprotein, jedoch nicht mit anderen Messungen.

DISKUSSION

Obwohl eine niedrigere Rate der Fettablagerung ein Befünd ist, der allgemein bei Tieren beobachtet wird, die mit einer Vielzahl von sowohl α- als auch β-selektiven adrenergen Agonisten behandelt wurden, erhöhen nur wenige β-Agonisten das Körperprotein. Es könnte daher die Frage auftauchen, ob den augenscheinlich verwandten Effekten von Clenbuterol, Fenoterol und Cimaterol auf Körperprotein und -fett ein gemeinsamer, β-vermittelter Mechanismus zugrunde liegt.
Die vorliegenden Ergebnisse in Clenbuterol-behandelten Tieren bestätigten unsere früheren Befünde, daß Wachstumsförderung auf Skelett- und Herzmuskel beschränkt zu sein scheint. Die höheren Gehalte an Skelettmuskelprotein und RNA waren nicht begleitet von Steigerungen in DNA, und dies läßt den Schluß zu, daß die Wachstumsantwort von ihrer Natur her eher hypertroph als hyperplastisch war. Dies wurde bestätigt durch Messungen der Faseranzahl und -durchmesser, wie oben in Abschnitt 1 gezeigt. Im Herzen gab es jedoch eine Erhöhung des DNA-Gehalts.
Die vorübergehende Natur des Effekts von Clenbuterol auf Muskelwachstum könnte dahingehend interpretiert werden, daß er eine Tachyphylaxie anzeigt. Das Medikament zeigt jedoch einen progressiv verlaufenden Effekt auf Herzprotein (um 14 mg an Tag 7 erhöht und um 35 mg an Tag 21) und Fettmasse (um 2,5 g an Tag 7 erniedrigt und um 8,7 g an Tag 21). Dies legt den Schluß nahe, daß Tachyphylaxie nicht die Erklärung ist. Es ist möglich, daß die Einstellung des beschleunigten Muskelwachstums aus einer letztendlich vollständigen Limitierung, die von einer unveränderten Skelettwachstumsrate bedingt wird, resultiert. Schafe und Rinder, in denen der Effekt von Clenbuterol auf die Zunahme des Körperstickstoffs sehr viel andauernder ist, zeigen eine viel niedrigere gewichtsspezifische Wachstumsrate.
Weder der gemischt-β-Antagonist Propranolol noch der β(1)-selektive Antagonist Atenolol blockierten den Effekt von Clenbuterol auf Muskelwachstum. Darüber hinaus zeigen vorläufige Arbeiten mit einem β(2)-Antagonisten - der Hoffman La Roche-Verbindung Ro 22-4574-, daß wir nicht in der Lage waren, eine inhibitorische Wirkung auf Clenbuterol-stimuliertes Muskelwachstum zu finden. Tatsachlich zeigten die β-Antagonisten eine Tendenz, eine weitere kleine Erhöhung der Muskelproteinablagerung hervorzurufen. Es ist möglich, daß die Effekte von Clenbuterol auf Körperfett, intramuskuläres Fett und Muskelglycogen gewisse Limitierungen für das Muskelwachstum setzen. Durch Begrenzung dieser "nachteiligen" Effekte von Clenbuterol könnten die β-Antagonisten hierdurch ihre inhibitorischen Effekte auf Muskelwachstum verringert haben.
Diese Ergebnisse stehen im Gegensatz zu der substantiellen Hemmung des Effekts von Clenbuterol auf den Energieverbrauch, Hernvachstum, und deren teilweise Blockierung des Effektes von Clenbuterol auf die Körperfettablagerung durch beide Antagonisten. Bei Schafen haben wir einen ausgeprägten Effekt von Clenbuterol auf Herzrate beobachtet, einen Effekt, der einhergeht mit einer Reduktion der Stickstoffausscheidung. Allerdings wiesen diese beiden Effekte unterschiedliche Dosisempfindlichkeiten (wobei die Stickstoffretention empfindlicher war) und zeitliche Verläufe (die Erhöhung der Herzrate war ein vorübergehendes Phänomen) auf. Diese Beobachtungen legten den Schluß nahe, daß sie vom Mechanismus her nicht direkt miteinander verwandt sind. Da sowohl die mit der Clenbuterol- Behandlung verbundene Erhöhung des Herzwachstums und der Gesamtenergieverbrauch durch den β(1)-selektiven Antagonisten Atenolol blockiert wurden ist es möglich, daß die Zunahme des Herzwachstums eine β(1)-vermittelte Antwort ist und daß sie mehr von einer kardialen Überbeanspruchung herrührt, als von der direkten Wirkung von Clenbuterol als anabol wirksames Mittel.
Eine gewisse Vorsicht sei empfohlen. Es bleibt möglich, daß die differenziellen Antworten des Muskelwachstums auf der einen Seite und der Fettablagerung sowie des Herzwachstums auf der anderen Seite nur aus Unterschieden in der Affinitat der entsprechenden β-Rezeptoren gegenüber Clenbuterol und Propranolol herrühren. Um diese Möglichkeit zu untersuchen, expenierten wir Ratten für 4 Tage gegenüber hohen Dosen von Propranolol, bevor sie Clenbuterol + Propranolol erhielten. Wiederum blockierte der Antagonist den Effekt von Clenbuterol auf Muskelwachstum nicht (Gastrocnemius- Proteingehalt (mg); Kontrolle: 288 ± 9 Clenbuterol + Propranolol 392 ± 12).
Die mit den anderen β-Agonisten erhaltenen Ergebnisse zeigen ebenfalls die komplexe Pharmakologie der Wachstumsantwort. Ursprünglich waren die Medikamente wegen ihrer Unterschiede bezüglich ihrer absoluten Wirksamkeiten und β(2)-Selektivitäten ausgewählt worden. Obwohl sie in einer Dosis gegeben wurden, die doppelt so hoch war, wie die von Clenbuterol, war kein Medikament so wirkungsvoll bei der Förderung des Muskelwachstums wie Clenbuterol. Salbutamol und Orciprenalin verringerten in signifikanter Weise das Körperfett; 4 der 5 Medikamente erhöhten die Masse der Polster braunen Fettgewebes, und alle zeigten eine Tendenz zur Reduktion der Lebermasse, ein Effekt, den sie mit Clenbuterol teilten. Signifikante Rank-Korrelationen zwischen den Effekten der Medikamente auf Herz-, Leber- und Fettmasse wurden gefünden, aber, mit Ausnahme der Körperproteinmasse, korrelierte die Veränderung in der Beinmuskelmasse nicht signifikant mit irgendeiner der anderen Messungen. Wieder einmal waren daher die Effekte der Medikamente auf Muskelwachstum und ihre Effekte auf Körperfett und Herzmasse voneinander getrennt.
Obwohl diese Ergebnisse eine enge Beziehung zwischen der β-Aktivitat und der Stimulation des Muskelwachstums anzweifeln lassen, bieten sie keine Erklärung hinsichtlich der Mechanismen der anabolischen Wirkung. Unsere früheren Ergebnisse legen den Schluß nahe, daß Clenbuterol durch Erniedrigung der Muskelproteinabbaurate die Ablagerung von Muskelprotein erhöht. Dieser Mechanismus unterscheidet sich von dem, der der Förderung des Muskelwachstums, hervorgerufen durch Tensionsveränderungen, Arbeitsbelastung und Insulin, unterliegt. Darüber hinaus ist es nicht sicher, ob der Effekt von Clenbuterol auf die Muskelproteinablagerung direkt ist, oder ob er mit irgendeiner anderen hormonellen Veränderung zu tun hat. Es ist von Interesse, daß der nicht-selektive β-Agonist Isoproteronol in isolierten Muskeln und in der Halbkörperpräparation den Proteinabbau reduziert. Jedoch waren wir nicht in der Lage, einen ähnlichen Effekt von Clenbuterol in isolierten Muskeln in Konzentrationen von 10&supmin;¹¹ M bis 10&supmin;&sup8; M zu zeigen. Nichtsdestotrotz reduzierte Clenbuterol in Konzentrationen über 10&supmin;¹&sup0; M Muskelglycogen in vitro. Es ist möglich, daß ein bislang unidentifizierter Metabolit von Clenbuterol für die Stimulation des Muskelwachstums verantwortlich ist, während Veränderungen der Fettablagerung, Glycogenolyse und des Energieverbrauchs direkte, β-vermittelte Antworten auf das Medikament selbst sind. Tabelle 1 (Abschnitt 5): Bezeichnung der den Tieren angebotenen Futter Tabelle 2 (Abschnitt 5): Tabelle 2. Die Protein-, RNA- und DNA-Gehalte der Gastrocnemius-Muskeln und des Herzens von männlichen Ratten am Ende einer 21 Tage-Periode während der sie ein Kontrollfutter oder eine der in Tabelle 1 aufgeführten Futtervarianten + Zusatz erheiten. Mittelwerte zusammen für einem mittleren Fehler der Mittelwerte für die angegebenen Zahlen.
Die statistische Signifikanz der Unterschiede ist angegeben:
Signifikant höher als Gruppe C * P< 0,05; *** P< 0,001.
Signifikant niedriger als Gruppe CL P< 0,05; P< 0,01.
Signifikant höher als Gruppe CL @ P< 0,05; @@ P< 0,01. Tabelle 3 (Abschnitt 5): Tabelle 3. Gesamtkörper- und Muskelprotein, Körpertett und berechneter Energieverbrauch von jungen mannlichen Ratten, die ad libitum für 7 oder 21 Tage mit einem Kontrollfutter oder eine der in Tabelle 1 aufgeführten Futtervarianten + Zusatz erhielten. Mittelwerte zusammen für einem mittleren Fehler der Mittelwerte für die angegebenen Zahlen.
a Tiene am Tag der ersten Exposition gegenüber deu experimentellen Futtervarianten geschlachtet.
b Energieverbrauch von Tag 0-7;
c Energieverbrauch von Tag 7-21;
Die statistische Signifikanz der Unterschiede ist angegeben:
Signifikant höher als Gruppe C *** P< 0,001.
Signifikant niedriger als Gruppe CL P< 0,01; P< 0,001.
Signifikant höher als Gruppe CL @ P< 0,05; @@ P< 0,01. Tabelle 4 (Abschnitt 5): Gewebegewichte (mg), Körperprotein (g) und Körperfett (g) von Gruppen zu je 6 weiblichen Ratten, denen ad libitum für 15 Tage Kontrollefutter oder eine der in Tabelle 1 aufgeführten Futtervarianten + Zusatz angeboten wurde. Mittelwerte zusammen mit einer gemeinsamen Schätzung der Varianz-gepoolten Standardabweichung PSD

Abschnitt 6:

Clenbuterol, ein β-Agonist, induziert Wachstum im innervierten und denervierten Ratten Soleus- Muskel über anscheinend unterschiedliche Mechanismen.

Zusammeufassung:

Die mit der Nahrung erfolgende Verabreichung des anabol wirksamen Mittels Clenbuterol hat bereits gezeigt, daß Clenbuterol in der Lage ist, die durch Denervation induzierte Atrophie in Ratten- Soleus-Muskeln zu inhibieren oder rückgängig zu machen. Wir zeigen hier, daß die verbessernden Effekte von Clenbuterol in denervierten Rattenmuskeln im Prinzip auf einer großen Zunahme der Proteinsynthese beruhen. Diese beruht wiederum auf einer Erhöhung der Proteinsynthesekapazität und einer normalisierten Translationseffizienz. Die Reaktionen von innervierten und denervierten Muskeln unterscheiden sich daher in fundamentaler Weise voneinander. Die Veränderungen in denervierten Muskeln erinnern an die klassischen pleiotypischen Antworten von Zellen auf Wachstumsfaktoren.

EINLEITUNG

Es ist vorgeschlagen worden, daß β-adrenerge Agonisten als thermogen wirksame Mittel zur Reduktion von Körperfett eingesetzt werden können. Nur einige wenige dieser Medikamente zeigen jedoch zusätzliche anabolische Aktivität. Medikamente wie Clenbuterol, Fenoterol und Cimaterol, die in dieser Hinsicht wirksam sind, sind bemerkenswert hinsichtlich ihrer muskelspezifischen Wirkung in einer großen Anzahl von Spezies. Die anabole Wirkung von Clenbuterol in innervierten Rattenmuskeln zeigt sich in einer Faserhypertrophie (siehe Abschnitt 1 oben) und ist primär das Ergebnis einer Reduzierung des Proteinabbaus. Wir haben in Abschnitt 2 oben nachgewiesen, daß in denervierten atrophierenden Ratten-Soleus-Muskeln primär wegen einer Erhöhung des Proteinabbaus Clenbuterol hoch wirksam ist bei der Blockierung oder Rückgängigmachung der atrophischen Reaktion. Da der Effekt von Clenbuterol durch eine Verminderung des Abbaus vermittelt zu sein schien, legte diese Beobachtung den Schluß nahe, daß die Wirkung dieses Medikaments auf das Wachstum der denervierten Muskeln mit einem solchen Mechanismus in Einklang zu bringen ist. Das vorliegende Experiment wurde so angelegt, daß es ermöglichen sollte, diese Möglichkeit zu untersuchen, indem Veränderungen im Protein-Turnover in denervierten Ratten Soleus-Muskeln untersucht wurden, die Clenbuterol ausgesetzt waren.

MATERIAL UND METHODEN

Tiere und experimentelles Protokoll

Zwei identische Experimente wurden durchgeführt, eines zur Bestimmung des Protein-Turnovers und das andere für die histochemische Analyse. Für jedes Experiment wurden männliche Hooded Lister- Ratten des Rowett-Stamms am 19. Tag nach der Geburt entwöhnt und in 11 Gruppen zu je 6 Tieren mit gleichem mittlerem Gewicht eingeteilt. Das anlänglich verwendete Fütterungsschema war genau das gleiche, wie oben in Abschnitt 1 beschrieben wurde. Ratten (60 ± 2 g Körpergewicht), die drei Tage lang an die Kontrolldiät PW3 gewöhnt worden waren, wurden 6 Tage nach der Abgewöhnung (19. Tag) unilateral 0,7-1,2 cm des Ischiasnervs unter Ether-Narkose und aseptischen Bedingungen entfernt. Die Tiere wurden einzeln in flachhödigen Käfigen untergebracht, und ihre Körpergewichte wurden täglich gemessen. Um 10 Uhr morgens am vierten Tag nach der Denervation wurde den Ratten ad libitum eine Kontrolldiät angeboten (5 Gruppen) oder eine Diät, die den β-adrenergen Agonisten Clenbuterol enthielt (2 mg/kg; 5 Gruppen). Eine Gruppe von Ratten wurde als Kontrollgruppe zum Zeitpunkt Null analysiert; anschließend wurde jeweils eine Gruppe aus den Kontroll- und Clenbuterol-Gruppen nach 12, 24, 36, 72 und 168 Stunden untersucht.
Die Tiere wurden getötet und die Soleus-Muskeln aus den innervierten und denervierten Gliedmaßen entfernt und in geeigneter Weise für die nachfolgende Analyse eingefroren (siehe unten).

Bestimmung der anteiligen Proteinsyntheserate und Muskelprotein- und RNA-Gehalte

Die anteilige Proteinsyntheserate (Ks) wurde sowohl in beiden innervierten und denervierten Soleus-Muskeln von Kontroll- und Clenbuterol-behandelten Ratten bestimmt unter Verwendung einer Bolusdosis von 150 mM Tritium-markiertem 2,6-³H-Phenylalanin (75 µCi/ml; 1 ml pro Ratte). Nicht anasthetisierte Ratten wurden immobilisiert durch Einwickeln in ein J-Tuch (J-cloth), und eine große Dosis von 2,6-³H-Phenylalanin wurde in die laterale Schwanzvene injiziert. Nach genau 10 Minuten wurden die Tiere getötet und die Hinterbeine entfernt. Die Deine wurden schnell enthäutet und in Eiswasser gekühlt, bevor die Soleus-Muskeln seziert, eingefroren und in flüssigem Stickstoff aufbewahrt wurden. Die Muskeln wurden homogenisiert und für die Messung der spezifischen Radioaktivität von freiem und proteingebundenem Phenylalanin vorbereitet. Die Gesamtproteinsynthese wurde berechnet nach K&sub5; x Proteingehalt.
Muskelprotein- und RNA-Gehalte wurden nach bekannten Methoden ermittelt.
Die anteilige Rate des Abbaus wurde geschätzt als die Differenz zwischen Ks und der anteiligen Rate an Proteingewinn (Kg). Letzterer wurde geschätzt aus der Veränderung des Proteingehalts während aufeinanderfolgender Zeitpunkte, wobei angenommen wird, daß die Rate linear verlief.

Histochemie

Die histochemische Analyse der Muskelschnitte wurde genau so ausgeführt, wie in Abschnitt 2 oben beschrieben.

Statistik

Die Daten wurden bewertet durch eine Analyse von Varianzverfahren unter Verwendung einer sput plot-Anordnung. Soweit zutreffend wurden Vergleiche zwischen den Effekten mit Hilfe der t- Statistik gemacht, die sich aus dem Standardfehler der Abweichung (S.E.D; 36 Freiheitsgrade) ableitet.

ERGEBNISSE

Die Denervation des Ischiasnervs führte zu einer nahezu vollstandigen Aufhebung des Soleus- Wachstums, wobei die Muskelproteinmasse (Tabelle 1) und die Faserflächen sich über den verfolgten Zeitraum kaum veränderten. Die Anwesenheit von Clenbuterol in der Diät stimulierte das Wachstum sowohl der innervierten als auch der denervierten Muskel (Tabelle 1). Wie wir in Abschnitt 2 oben gezeigt hatten, zeigten denervierte Muskeln aber eine relativ größere proportionale Verbesserung der Proteinmasse, 71 % für denervierte gegenüber 25 % für innervierte im Vergleich zu geeigneten Kontrollen (P < 0,001). Die Art der die Zusammensetzung betreffenden Veränderungen, die durch Clenbuterol induziert wurden, wurden vom Nervenzustand beeinflußt. In innervierten Muskeln erhöhten sich proportional sowohl Protein- als auch RNA-Masse (Tabelle 1), wohingegen in denervierten Muskeln der RNA/Protein-Quotient am Tag 1 signifikant erhöht war und auch so blieb bis Tag 3 der Behandlung mit Clenbuterol.
An Tag 4 der Denervation zeigten sich die klassischen Veränderungen im Proteinmetabolismus, wobei sowohl die Gesamtrate als auch die anteilige Rate der Proteinsynthese (Ks) erniedrigt waren (um 60 % bzw. 29%) und die anteilige Rate des Abbaus (Kd) vergrößert war (Tabelle 2). Die Fasern in diesen denervierten Muskeln waren charakteristischerweise klein (siehe Abschnitt 2 oben). Die Verabreichung des Medikamentes führte zu dieser Zeit zu bemerkenswerten Unterschieden in den Effekten auf den Proteinmetabolismus zwischen innervierten und denervierten Muskeln (Tabelle 2). In beiden Fällen erzeugte Clenbuterol eine schnelle Abnahme von Kd um ungefähr 50 % über die ersten 24 Stunden (Tabelle 2), und dieser Abnahme folgte eine geringere Abnahme (15 %) für die verbleibenden 6 Tage (Tabelle 2). In innervierten Muskeln beeinflußte das Medikament Ks nicht (Tabelle 2), und die Zunahme in Fasergröße konnte durch eine Abnahme des Proteinkatabolismus erklärt werden. Im Gegensatz hierzu zeigten mit Clenbuterol behandelte denervierte Muskeln eine Stimulation in Ks und eine Verbesserung in der Translationseffizienz (g Protein synthetisiert pro g RNA) im Vergleich zu unbehandelten denervierten Muskeln (Tabelle 2). Daher war die Zunahme der Fasergröße teilweise erklärbar durch die Stimulierung der Synthese und teilweise durch die Reduktion des Abbaus. Nach 7 Tagen der Clenbuterol-Verabreichung zeigten die denervierten Muskeln Eigenschaften bezüglich ihrer Zusammensetznng und kinetischen Eigenschalten, die denen von normalen innervierten Muskeln dieser Größe ähnlich waren.

DISKUSSION

Der charakteristische Anabolismus als Reaktion auf Clenbuterol wurde wieder einmal an den innervierten Muskeln beobachtet. In diesen Muskeln konnte die mit der Medikmentenbehandlung verbundene Erhöhung der Fasergröße und Proteinzunahme (Tabelle 1) durch eine Abnahme des Proteinkatabolismus (Tabelle 2) erklärt werden. Im Fall der denervierten Muskeln (Tabellen 1, 2) wurde nur die Hälfte des Proteinanabolismus durch reduzierten Abbau erreicht, wobei der Rest das Ergebnis einer Stimulation sowohl des anteiligen (Tabelle 2) als auch der Gesamtrate der Proteinsynthese war. Dies ergab sich aus Veränderungen in zwei Prozessen, die zeitlich unterschiedliche Verläufe zeigten. Erstens war die Translationseffizienz, die als Ergebnis der Denervation um 25 % reduziert war, innerhalb von 12-24 Stunden nach Beginn der Clenbuterol-Behmdlung auf einen den Kontrollwerten gleichenden Wert wiederhergestellt (Tabelle 2). Zweitens war die RNA-Zunahme, und daher die gesamte potentielle Translationskapazitat, über eine Periode von 24-72 Stunden erhöht.
Als Konsequenz dieser beiden Effekte wurde eine Zunahme der anteiligen Proteinsyntheserate von 58 % zwischen 24-36 Stunden im Vergleich zu nichtbehandelten denervierten Muskeln beobachtet, wobei diese Zunahme noch nach 72 Stunden signifikant war (22 %; P < 0,05).
Interessanterweise fanden frühere Experimente eine signifikante (34 %) Erhöhung von Ks in normalen innervierten Gastrocnemius-Muskeln erwachsener Ratten, denen Clenbuterol injiziert worden war. Keine derartige Veränderung in Ks wurde in der vorliegenden Studie beobachtet. Die früheren Untersuchungen unterschieden sich von der vorliegenden Studie in verschiedener Hinsicht wie das Alter der Tiere, die Art der Verabreichung, die Dosierung von Clenbuterol und vor allen Dingen dem Zeitpunkt nach der Arzneimittel-Gabe, zu dem Ks bestimmt wurde. Es ist vorgeschlagen worden, daß es dieser letztere Unterschied ist, d.h. die zum gleichen Zeitpunkt wie der Gipfel der thermogenen Reaktion erfolgende Messung von Ks innerhalb einer Stunde nach der täglichen Injektion, die den Unterschied in den Ergebnissen erklärt.
Es könnte eingewendet werden, daß der Unterschied in der Reaktion von innerviertem und denerviertem Muskel gegenüber Clenbuterol mit erhöhten Mengen von β-adrenergen Rezeptoren in den denervierten Muskelmembranen verbunden sein könnte. Dies scheint jedoch nicht der Fall zu sein. Selbst in Anwesenheit des gemischt-β-Antagonisten Propranolol (2 mg/Tag, äquivalent zu 100-fachem Überschuß von Clenbuterol, einer Dosis, von der gezeigt werden konnte, daß sie Herzhypertrophie und die Reduktion des Körperfetts blockiert) bleibt Clenbuterol wirksam in der Rückgängigmachung des nach Denervation auftretenden Muskelproteinverlustes.
Ein Faktor aus Ischiasnerven ist identifiziert worden, der nach intramuskulärer Injektion das Wachstum denervierter Muskeln stimuliert. Obwohl die Versuchung groß ist anzunehmen, daß die Effekte von Clenbuterol auf denervierten Muskel in irgendeiner Weise durch diesen myotrophen Faktor vermittelt sein könnten, ist dies sicher eine inadäquate Erklärung für die Wirkung des Medikamentes auf den Proteinanabolismus. Beispielsweise war der früher isolierte myotrophe Faktor ohne Einfluß auf innervierte Muskeln, wohingegen Clenbuterol in fünktionell innervierten Muskeln über Veränderungen des Proteinabbaus ausgeprägte anabole Wirkungen hat. Die Veränderungen in der Translationseffizienz und -kapazität im Clenbuterol-behandelten denervierten Muskel sind jedoch ähulich wie die Reaktionen von anderen Zelltypen auf spezifische Peptidwachstumsfaktoren. Die Wiederherstellung der Translationseffizienz wurde beobachtet als Reaktion auf viele Stimuli, unter anderem die erneute Futtergabe nach Hungern, und es mögen daher einige oder tatsächlich viele Signale existieren, die erkannt werden könnten. In normalen Muskeln könnte eines dieser Signale vom fünktionellen Nerv erzeugt werden, der das System vollständig aktiviert. Weitere entweder direkt oder indirekt durch Clenbuterol induzierte Stimuli könnten selektiv die Proteolyse verändern.
Zusammenfassend haben wir gezeigt, daß die neuartige Reaktion des denervierten Muskels auf den β-Agonisten Clenbuterol mindestens zwei Mechanismen umfaßt. Der erste umfaßt im herunterregulierten denervierten Zustand Veränderungen der Translationseffizienz und -kapazität, welche an die klassischen pleiotypischen Reaktionen von Zellen auf Wachstumsfaktoren erinnern. Der zweite ist eine spezifische Reduktion des Proteinabbaus. Im innervierten Zustand wird der erste Effekt nicht beobachtet, weil die Muskeln bereits auf andere Stimuli reagiert haben, wohingegen der zweite Effekt sich zeigt. Viele andere physiologische Stimuli erhöhen die Proteinznnahme über Mechanismen, die primär Proteinsynthese, aber auch Degradierung stimulieren. Die speziellen charakteristischen Eigenschalten von Clenbuterol und seinen Analoga scheinen aufregende Fortschritte zu bieten für die Manipulation von Muskelzusammensetzung und -wachstum sowie als potentiell wertvolle Hilfsmittel für die Untersuchung und die Behandlung myogener Erkrankungen. Tabelle 1 (Abschnitt 6): Tabelle 1. Effekt von Clenbuterol auf Zusammensetzung innervierter und denervierter Ratten Soleus-Muskeln
(Protein- und RNA-Gehalte und der RNA/Protein-Quotient in den innervierten und denervierten Soleus-Muskeln der Ratte. die einer unilateralen Denervation des Ischiasnervs unterworfen wurde) Tabelle 2 (Abschnitt 6): Tabelle 2. Metabolische Effekte von Clenbuterol aut innerviette und denerviette Ratten Soleus- Muskeln.
(Die anteilige Rate der Proteinsynthese (Ks) sowohl in innervierten als auch denervierten Soleus- Muskeln der gleichen Ratten wie in Tabelle 1 beschrieben. Die anteilige Rate der Proteinablagerung (Kg) basierte auf der Veränderung von Muskelprotein zwischen den angegebenen Zeitperioden. Die anteilige Rate des Proteinabbaus (Kd) wurde geschätzt als die Differenz zwischen den Mittelwerten von Kg und Ks. Es wurde angenommen, daß die kleine Menge an Wachstum in den denervierten Gliedmaßen der kontrollgefütterten Tiere nicht signifikant unterschiedlich ist von Null. Der resultierende Wert wird als Hinweis für die Rate des Proteinabbaus in diesen Muskeln über den angegebenen Zeitraum gewertet).

Abschnitt 7:

Der Effekt von Clenbuterol auf klinischen Verlauf und Stickstoffbalance in Patienten mit Krebs- Kachexie

HINTERGRUND

Clenbuterol ist ein β(2)-sympathomimetisches Medikament, das in der Behandlung von Bronchospasmen in Tieren und Menschen angewendet wurde. Klinische Versuche haben eine ähnliche Wirksamkeit und ein ähnliches Nebenwirkungsprofil wie Salbutamol und Terbutalin ergeben, den beiden in England gebräuchlichsten β(2)-Agonisten, wo Clenbuterol zur Zeit für klinische Studien nicht zur Verfügung steht.
Neuere Arbeiten haben gezeigt, daß Clenbuterol drei zusätzliche Effekte auf Muskelprotein aufweist, die mit Salbutamol und Terbutalin nicht beobachtet werden. Erstens kann Clenbuterol spezifisch die Rate von Skelett- und Herzmuskelwachstum in jungen Tieren erhöhen; es gibt eine leichte Reduktion in der Wachstumsrate der Eingeweide bei medikamentenbehandelten Tieren im Vergleich zu Kontrolltieren. Zweitens limitiert Clenbuterol die Atrophie von Skelettmuskulatur in denervierten Extremitäten von Ratten. Drittens werden in Clenbuterol-behandelten Tieren nach Entwicklung der Denervationsatrophie die atrophischen Veränderungen unter gleichzeitiger Zunahme der kontraktilen Stärke rückgängig gemacht.
Die Notwendigkeit für ein Medikament, das selektiv Wachstum fördern kann oder auf andere Art und Weise Substanzverlust limitieren karin, gibt es in vielen pathologischen Situationen, von denen eine enorm große Zahl von Patienten betroffen ist. Es ist daher wichtig, die möglichen klinischen Anwendungen der Effekte von Clenbuterol auf den Proteinanabolismus zum frühesten Zeitpuukt zu gewahrleisten, an dem eine Wirksamkeit sichergestellt ist. Von besonderer Wichtigkeit in Bezug auf die Aufrechterhaltung der Muskelmasse ist die Beobachtung, daß Verlust von magerem Körpergewebe auf etwa 80-85 % des Idealwertes fast immer eine infauste Prognose nach sich zieht. Dieser Situation sieht man sich häufig gegenüber bei Patienten mit neoplastischen Erkrankungen und einer assoziierten Kachexie mit der sie begleitenden Muskelschwäche. In diesem Zustand hat eine Behandlung außer Schmerzlinderung wenig zu bieten, jedoch könnten Patienten in einer derartigen Lage in Hinblick auf subjektives Wohlbefinden und längere Überlebenszeit profitieren, falls der reine Gewebeverlust durch ein Medikament, wie Clenbuterol, verlangsamt oder angehalten werden könnte. In Hinblick auf die geringfügige Begrenzung des Wachstums der Eingeweide gibt es keine Hinweise dafür, daß das Tumorwachstum durch das Medikament verstärkt werden würde. In der Tat existiert die Möglichkeit, daß sich dieses Wachstum wegen der präferentiellen anabolen Effekte auf Skelettmuskeln reduziert.

ÜBERSICHT ÜBER DEN PROJEKTIERTEN BEWEIS DER KLINISCHEN WIRKSAMKEIT VON CLENBUTEROL:

Hiermit schlagen wir eine vorläufige Studie des Effekts von Clenbuterol bei Krebskachexie vor. Zunächst mußte eine derartige Studie einfach in Hinblick auf Ausführung und Zielen angelegt sein, da es unethisch wäre moribunde Patienten einer anstrengenden Untersuchung zu unterziehen ohne positive Hinweise auf einen wahrscheinlichen therapeutischen Vorteil. Nichtsdestotrotz ist es wichtig, daß eine derartige Studie durchgeführt wird, und es sollte für die Hersteller von Clenbuterol nicht schwierig sein, das notwendige Ausnahmezertifikat für klinische Studien (Clinical Trial Exemption Certificate) vom Komitee für die Sicherheit in der Medizin (Committee for the Safety of Medicines) zu erhalten, um die Verwendung von Clenbuterol in einer Patientengruppe zu erlauben, die wenig zu verlieren und möglicherweise viel zu gewinnen haben. Mit einem derartigen Zertifikat könnte man an die entsprechenden Ethik-Kommissionen herangehen, die wahrscheinlich das vorgeschlagene Protokoll genehmigen würden. Wegen der unterschiedlichen klinischen Formen, Manifestationen und Krankheitsverläufe bei Patienten mit etablierten Malignomen wäre es notwendig, eine brauchbare Anzahl von Patienten (beispielsweise 30-40) zu untersuchen, um eine brauchbare Abschatzung der Verwendung von Clenbuterol in der Praxis zu erhalten. Patienten mit soliden Tumoren, einem dokumentierten Gewichtsverlust von mehr als 10 %, die nur noch palliativ behandelt werden, könnten untersucht werden. Die Anlage der Studie wäre zweizügig, mit einer anfänglichen parallelen placebokontrollierten Phase, der eine zweite Crossover-Phase folgt bei denjenigen, die willens und fahig sind, weiter in der Studie zu verbleiben. Diejenigen, die in die Studie aufgenommen wurden, wurden nach einer anfänglichen Einphasierungsperiode von drei Tagen randomisiert werden und dann entweder 200 µg Clenbuterol drei Mal täglich oder Placebo für 7 Tage erhalten, gefolgt von einer Absetzphase von 7 Tagen. Diejenigen, die dann in der Studie weitermachen, wurden dann Placebo oder Clenbuterol für weitere 7 Tage erhalten, gefolgt von einer Ausphasierungsperiode von 3 Tagen. Proteinverlust würde während der Studie einfach durch Messung der täglichen Stickstoffverluste mit dem Urin gemessen werden. Klinische Bewertung, diagnostische Klassifikation, vorhergehende und aktuelle Therapiemodalitäten wurden erfaßt werden. Diätetische Tagebücher wurden herangezogen werden, um irgendwelche Veränderungen in der Nahrungsmittelaufnahme während der Studie zu kontrollieren. Die subjektive Einschatzung der Befindlichkeit und Debilität wurde mit Hilfe einer visuellen Analogskala erfaßt werden. Jedwede Nebenwirkungen der Versuchsmedikation wurden erfaßt werden. Zusätzlich wurden zu verschiedenen Zeitpunkten der Studie, einfache Tests der aktiven Muskelfünktion gemacht werden können, falls dies die Befindlichkeit jedes einzelnen Patienten erlauben wurde. Grundlegende anthropemetrische Messungen (Größe, Gewicht, Hautfaltendicke) wurden ebenfalls zu unterschiedlichen Zeitpunkten erfaßt werden.
Die derzeitige Häufigkeit der Krebskachexie in der zur Verfügung stehenden Population wurde eine Beendigung der Studie innerhalb eines Zeitraums von etwa 12 Monaten erlauben.

Abschnitt 8

Der Effekt von Clenbuterol auf Skelettmuskelentwicklung in Rowett Hooded Lister-Ratten

HINTERGRUND

Frühere Untersuchungen an Ratten haben gezeigt, daß die Effekte von Clenbuterol beeinflußt oder bestimmt werden durch den physiologischen Zustand des Muskels oder seines Fasertyps. In verschiedener Hinsicht (beispielsweise Membraneigenschaften, Isoenzymmuster, Proteintumoverraten) zeigt ein denervierter Muskel Ähnlichkeiten mit dem des Fötus oder Neonaten. Unsere Untersuchungen haben gezeigt, daß Clenbuterol besonders effektiv als anabolisches Mittel im denervierten Muskel ist. Die Reaktion war größenordnungsmaßig besser und schneller als im innervierten, wachsenden, voll differenzierten Muskel. Darüberhinaus war der Mechanismus, nach dem diese Antwort ausgelöst wurde, auch unterschiedlich von dem im innervierten Muskel. Während Clenbuterol geringe oder keine Veränderungen in der anteiligen Rate der Proteinsynthese in normalem innerviertem Muskel zeigte, bestand seine Wirkung auf deneivierte Muskeln in einer Normalisierung der Translationseffizienz (g Protein synthetisiert/ g RNA) und einer signifikanten Erhöhung der anteiligen Rate der Proteinsynthese. Diese Daten legen den Schluß nahe, daß der undifferenzierte oder unreife Muskel besonders reaktionsfahig für β(2)-Agonisten ist, oder. spezieller ausgedrückt, für Clenbuterol und seine Analoga. Es ist gut dokumentiert, daß der Fötus empfindlich für spezifische Signale zu besonderen Zeitpunkten seiner Entwicklung ist. So kann beispielsweise eine Einzeldosis oder eine Kurzzeitverabreichung von Gonadotrophinen an neonatale Ratten ausgeprägte Veränderungen der Körperzusammensetzung nach sich ziehen, die über das adulte Leben hinweg persistieren. Falls Clenbuterol seine muskelspezifischen Effekte dadurch ausübt, daß es grundsätzliche Eigenschalten des Muskels verändert, (beispielsweise an der Plasmamembran) dann sollten Veränderungen, die frühzeitig während der Entwicklung gesetzt werden, möglicherweise persistieren. Eine Untersuchung einer solchen Möglichkeit erfordert, daß das Medikament (oder aktive Faktoren, die mit der Medikamentenverabreichung verbunden sind) die Plazentaschranke durchdringt und fötales Imprinting auslöst, oder zur Verabreichung an den Neonaten in der Milch sezerniert wird.
Ziel der Mbeit war, den Effekt von Clenbuterol auf Skelettmuskelentwicklung zu untersuchen und die Möglichkeit zu studieren, daß eine Interaktion mit dem frühen Muster der Entwicklung möglicherweise in einer permanenten Veränderung des Wachstumsmusters resultiert.
Die Untersuchung konzentrierte sich auf zwei Bereiche:
a) vorgeburtliche Muskelentwicklung
b) Muskelentwicklung von der Geburt bis zur Periode nach der Abmilchung.

a) Vorgeburtliche Entwicklung in Soleus- und EDL-Muskeln der Ratte:

Es ist eine gut bekannte Tatsache, daß die zeitliche Abfolge von Ereignissen während der Myogenese von außerordentlicher Bedeutung für die Etablierung der genetischen Expression von individuellen Muskelzellen ist und damit auch des Muskels als Ganzem. Myotubuli beginnen sich im Fötus etwa am 15. Tag der Trächtigkeit zu bilden, einem Zeitpunkt, zu dem noch wenig neurale Kontakte ausgebildet sind. Das erste Experiment wurde deshalb so angelegt, daß der Fötus vom 12. Tag der Trächtigkeit Clenbuterol ausgesetzt war und Muskeln am 19. Tag der Trächtigkeit gewonnen werden konnten. Zu diesem Zeitpunkt können neuromuskuläre Kontaktpunkte nachgewiesen werden und der Muskel beginnt zu reifen.
Trächtige Muttertiere wurden mit vom 12. Tag der Trächtigkeit mit einer Kontrolldiät + Clenbuterol (2 mg/kg) gefüttert. Ganze einzelne Soleus- und EDL-Muskeln wurden aus 19 Tage alten Feten isoliert und sowohl licht- als auch elektronenmikroskopisch begutachtet. Muskeln aus Clenbuterol-behandelten Feten besaßen primitive, differenzierte motorische Endplatten in primären und sekundären Myotubuli. In Kontrollmuskeln wurden jedoch Endplatten der zweiten Generation selten gefünden Darüberhinaus war es augenscheinlich, daß in den Clenbuterol-behandelten Myotubuli Fusionen in einem größeren Ausmaß als in den Kontrollen aufgetreten waren. Die myofibrillären Proteine zeigten ein größeres Ausmaß an räumlicher Organisation, und die tubulären Systeme schienen extensiver organisiert zu sein als in den Kontrollen.
Generell zeigten die mikroskopischen Befünde, daß Clenbuterol-Behandlung von fötalen Rattenmuskeln in utero zu einer fortgeschrittenen Muskelfaserfüsion geführt hatte. Diese Behauptung wurde durch biochemische Analysen unterstützt. Da einzelne Muskeln zu klein für eine akkurate Bewertung sind, wurden die Bestimmungen an der ganzen posterior-distalen Muskelgruppe durchgeführt.
Die hauptsächlichen Ergebnisse waren:
i) Das Medikament erhöhte das Gewicht (P < 0,05) und den Proteingehalt (P < 0,01) des fötalen Herzens.
ii) Feuchtgewichte der Skelettmuskeln und Proteingehalt und Proteinkonzentrationen waren signifikant (P < 0,005) erniedrigt in Clenbuterol-behandelten Feten im Vergleich zu den Kontrollen.
iii) DNA-Konzentrationen waren signifikant (P < 0,005) erhöht in Clenbuterol-behandelten Gruppen, aber RNA-Konzentrationen waren nicht signifikant unterschiedlich von den Kontrollwerten.
iv) Sowohl Gesamt-RNA- als auch DNA-Inhalte waren signifikant verringert (P < 0,005).
Diese Ergebnisse müssen mit Vorsicht interpretiert werden, obwohl sie die Annähme unterstützen, daß Clenbuterol-Behandlung die Fusion von Myoblasten vorantreibt.
Unerwarteterweise wurde in den trächtigen Muttertieren ein beträchtlicher anaboler Effekt von Clenbuterol beobachtet. Es ist daher möglich, daß ein Teil dieses Negativeffektes auf die Föten weitergegeben wurde. Dies gilt besonders für den fötalen Skelettmuskel, da der agonistische Effekt auf Herzgewicht sich auspragt wie in entwöhnten Tieren.
In den Muttertieren wurde gefünden daß:
i) es im Vergleich zu den Kontrollen eine 15-30 %ige Zunahiine im Gewicht einzelner Muskeln (ausgedrückt als Bruchteil des Körpergewichts) in den mit Clenbuterol behandelten Muttertieren gab.
ii) die Herzgewichte in den behandelten Tieren um 10-20 % erhöht waren.
Es gab jedoch keine signifikanten Unterschiede in Hinblick auf mittlere Fetenanzahl oder mittleres fötales Gewicht zwischen Kontrollen und Clenbuterol-gefütterten Tieren.
Diese Ergebnisse legen den Schluß nahe, daß Clenbuterol die Ausbildung der Myotubuli auf Kosten der Zellteilung beschleunigt. Es war daher wichtig, den Effekt von Clenbuterol auf die Anzahl der Muskelfasern herauszulinden. Folglich wurde ein weiterer Satz von Experimenten durchgeführt, um den Einfluß einer anhaltenden Gabe des Medikamentes vom 12. Tag der Trächtigkeit bis zur Geburt und Entwöhnung zu untersuchen. Wir beobachteten, daß der Beginn des Geburtsvorganges im Vergleich zu Kontrollmuttertieren um ungefahr 12 Stunden verzögert eintrat, wänrend die Anwesenheit von Clenbuterol im Futter jedoch nicht das Ergebnis oder den Erfolg der Geburt behinderte.
Wie bei den Muttertieren, die vor der Geburt getötet worden waren, zeigten auch Muttertiere, die bis zur Entwöhnung mit Clenbuterol gefüttert worden waren, eine Erhöhung des Herzgewichtes um ungefahr 7 % und des Muskelgewichtes um 20-30 %.
Wie bereits beschrieben, wurden trächtige Muttertiere mit einem Futter ernährt, das Clenbuterol enthielt (2 mg/kg). Nach der Geburt wurde die Zahl der Nachkommen auf 8 Tiere (4 von jedem Geschlecht) eingestellt, und die Jungtiere wurden zusammen mit ihren Müttern bis zur Entwöhnung gehalten. Die Ergebnisse der entwöhnten Ratten, die kontinuierlich vom 12. Tag der Trächtigkeit mit Clenbuterol behandelt worden waren, waren besonders interessant. Wie bei der Untersuchung des fötalen Muskels beobachtet, führte die Behandlung mit Clenbuterol zu einer signifikanten Reduktion des Muskelgewichts. Die histologische Begutachtung ergab jedoch eine signifikante (P< 0,05) Reduktion der Gesamtanzahl an Fasern sowohl in Soleus- als auch EDL-Muskeln der behandelten Tiere. Darüberhinaus waren die Querschnittflächen dieser Fasern beträchtlich größer als die von Kontrolltieren. Diese Ergebnisse standen im Gegensatz zu denen, die mit entwöhnten Tieren erhalten wurden, die nur 4 Tage lang Clenbuterol ausgesetzt worden waren: die Faserhypertrophie war nicht begleitet von einer Reduktion der Faseranzhl.
Daher zeigen diese Daten zusammen mit denen der Feten, daß:
i) Clenbuterol die Myotubuli/Myofbrillen-Ausbildung auf Kosten der Zellteilung beschleunigt;
ii) aufgrund dieses Ergebnisses eine permanente Veränderung in der Anzahl der Fasern und ihrer Größe aufgetreten zu sein schien;
iii) mit anderen Worten Clenbuterol zwei Wirkungen hat: (1) im fötalen Muskel verändert es die Faseranzahl, wahrscheinlich unter genotypischer Kontrolle, und (2) im adulten Muskel verändert es die Fasergröße, wahrscheinlich unter phänotypischer Kontrolle.

b) Wirkungen der neonatalen Exposition

Die Beobachtungen, die an Tieren gemacht worden waren, die zuerst in utero mit Clenbuterol behandelt worden waren, zeigen das gemeinsame Muster der erhöhten Fusion und reduzierter Faseranzahl. In der Folge gleichen sich diese beiden Effekte gegenseitig aus, so daß die Jungtiere keine Reaktion bezuglich Muskelgewicht oder Proteinanabolismus zeigten, wie dies für Tiere nach der Entwöhnungsphase beobachtet wird.
Eine sich hieraus ergebende Hypothese ist, daß Clenbuterol über ein einziges System wirkt, das mit Entwicklung zu tun hat, und daß Muskelzunahme mit Reife zu tun hat: entweder des Muskels oder assoziierter Rezeptorpopulationen oder der Nervenversorgung. Eine zweite Hypothese ist die, daß die fötalen/neonatalen und der Entwöhnung nachfolgenden Reaktionen tatsächlich Interaktionen von Clenbuterol mit wenigstens zwei unterschiedlichen Mechanismen widerspiegeln.
Es war daher angebracht, das Stadium zu untersuchen, an dem die Ratte für Clenbuterol in Hinblick auf den Muskelproteinanabolismus empfänglich wird. In der ersten unternommenen Studie wurden Jungtiere von Muttertieren genommen, die mit einer Kontrolldiät ernährt worden waren. Die Wurfgröße wurde auf 8 Jungtiere (vier von jedem Geschlecht) eingestellt, und die Hälfte der Muttertiere auf eine Kontrolldiät mit Clenbuterol (2 mg/kg) gesetzt. Im Alter von 18 Tagen wurden die Jungtiere analysiert. Jungtiere von Muttertieren, denen Clenbuterol gegeben worden war, waren 9 % leichter als Kontrollen, während absolute Muskelgewichte um 11-13 % verringert waren. Bezogen auf das Körpergewicht war die Herzmasse um 7 % erhöht, während Lebermasse um 7 % verringert war. In Plantaris-Muskeln von Clenbuterol-behandelten Tieren war die Gesamtproteinmenge um 7 % niedriger, RNA war unverändert, während DNA um 10 % verringert war. Praktisch ähnliche Daten wurden von Soleus-Muskeln erhalten.
Dieser experimentellen Anordnung liegt die Annahme zugrunde, daß erstens Clenbuterol den Jungtieren durch die Milch des Muttertieres in genügenden Mengen zur Verfügung gestellt wird und daß, zweitens, das Medikament die Milchmengen nicht beeinflußt. In der Praxis zeigen die leichten Effekte auf die relative Herzmasse an, daß wenigstens ein bißchen Clenbuterol über die Milchdrüse zur Verfügung gestellt wurde. Aus den Tagesgewichten der Jungtiere war jedoch klar, daß es zu einem ausgeprägten Wachstumsstop während der ersten 48 Stunden nach Verfütterung des Medikaments an die Muttertiere kam. Dies liegt wahrscheinlich an einer reduzierten Milchsezernierung (die Futteraufnahme durch die Muttertiere sank während dieser kurzen Periode ab). Darüberhinaus zeigte die Analyse der Körperzusammensetzung der Muttertiere am Ende der Studie, daß das Muskelwachstum, wie auch beim trächtigen Zustand, um 4-12 % in Clenbuterol-behandelten Tieren gefördert worden war. Herzmassen blieben unverändert. Clenbuterol schien daher zumindest partiell die Versorgung der Milchdrüse mit Nährstoffen außer Kraft gesetzt zu haben. Da der Blutfluß, und damit wahrscheinlich auch die Herzgröße, während der Laktation bereits erhöht ist, könnte eine mögliche Umverteilung an andere Gewebe ohne Erhöhung der Gesamtherzleistung und ohne Notwendigkeit zur Erhöhung der Herzmasse erreicht werden.
Diese Befünde zeigten, daß ein anderer experimenteller Ansatz notwendig war. Folglich wurde das Medikament nicht dem Futter der Muttertiere beigegeben, sondern die Jungtiere wurden mit entsprechenden Mengen von Clenbuterol zweimal täglich oral behandelt (festgesetzt auf 200 µg/kg Körpergewicht; das ist die gleiche Menge, wie sie für die in einem vorhergehenden Abschnitt beschriebenen Wachstumsuntersuchungen verwendet wurde). In übriger Hinsicht war das Experiment so ausgelegt wie das oben beschriebene Antenatalexperiment, d.h., die Wurfgröße wurde auf 8 (vier von jedem Geschlecht) eingestellt, und anschließend erhielt die Hälfte des Wurfes (zwei von jedem Geschlecht) in versetzten Intervallen von Tag 4 an jeweils Clenbuterol, während die andere Hällte Wasser erhielt. Diese Anordnung wurde getroffen, um Streuungen durch Variation innerhalb des Wurfes zu verringern. Zwei Würfe wurden für jede Behandlung verwendet, in der Clenbuterol entweder von Tag 4, Tag 8, Tag 12, Tag 16 oder Tag 19 (Entwöhnung) an gegeben wurde. Alle Jungtiere wurden an Tag 25 untersucht.
Unterschiede in den Körpergewichten wurden nicht gefünden Alle Clenbuterol-behandelten Tiere zeigten Zunahmen im Herzgewicht (9-15 %). Nur in Tieren, denen das Medikament von Tag 19 an gegeben wurde, wurden Unterschiede im Muskelgewicht (+10%) beobachtet. Vorhergegangene Behandlungen, d.h. Medikation zu Zeiten zwischen dem 4. und dem 25. Tag und dem 16. bis 25. Tag hatten keinen Einfluß auf das Muskelgewicht. Der Muskelproteingehalt war jedoch bei allen Behandlungen von Tag 8 an gleichermaßen erhöht (größenordnungsmäßig um 11-13 %). Der Gesamt-RNA- Gehalt blieb durch Clenbuterol unbeeinflußt, aber es gab, wie auch schon bei den Fötalstudien, wieder signifikante Verringerungen (P < 0,01) im DNA-Gehalt. Für Tiere, die das Medikament im Alter von 16 Tagen oder früher erhalten hatten, betrug die Abnahme 9-13%, wohingegen bei Behandlung an den Tagen 19-25 die Abnahme nur 5 % betrug.
Der Einfluß auf den Proteingewinn war daher am größten während der unmittelbar nach der Entwöhnung liegenden Periode (Tag 19-25). Frühere Exposition hatte keinen signifikanten Einfluß. Zwei Erklärungen könnten für diese Beobachtungen herangezogen werden.
1) Die frühere Exposition war zu einem Zeitpunkt erfolgt, an dem der Mechanismus, der zum Muskelproteingewinn führt, inaktiv war. Alternativ könnte es sein, daß das System vorhanden, aber inaktiv war und entweder desensibilisiert oder durch frühe Exposition gegenüber dem Medikament herunterreguliert war.
2) Die für embryonale Muskeln beobachtete Förderung der frühen Faserfüsion hielt während der frühen bis späten Säugungsperiode an mit dem Ergebnis von größeren Fasern aber geringeren Anzahlen, so daß das Potential für zusätzliches Muskelwachstum limitiert war.
Dieses Experiment ist mit dem Ziel wiederholt worden, die zeitliche Abfolge der Ereignisse genauer zu studieren. Die experimentelle Anordnung glich im Prinzip der oben geschilderten. Nun jedoch wurden die Zeitintervalle der Exposition während der Tage 14-24 in 2 Tages-Inkremente vergrößert, wobei alle Tiere am 28. Tag untersucht wurden. Wieder wurden maximale Reaktionen von Tieren beobachtet, die entweder von Tag 20 oder Tag 22 an behandelt worden waren; sie waren verringert bei Tieren mit Behandlung zwischen den Tagen 24-28. Die Reaktionen von Tieren, die von Tag 14 bis Tag 18 behandelt wurden, waren 50-100 % niedriger als das optimale Wachstum der Muskelproteinmasse. Die Erhöhung der Herzgewichte (16-24 %) war für alle Gruppen ähnlich.
Dieses Experiment bestätigt wieder, daß die Entwöhnungsperiode eine Periode großer Empfindlichkeit für die anabole Wirkung des Medikamentes ist. Zu diesem Zeitpunkt der Entwicklung treten beträchtliche Veränderungen in Darmmorphologie und Metabolismus auf. Darüber hinaus wird das Muskelgewebe besonders empfindlich für spezifische Hormone, die an der Regulation des Proteinmetabolismus beteiligt sind, zum Beispiel die Glucocorticosteroide. Die mögliche Interaktion von Clenbuterol entweder mit systemischen oder darmständigen Hormonen muß weiter untersucht werden.
Obwohl die oben genannten experimentellen Informationen sich besonders auf Ratten beziehen, wird es als möglich angesehen, daß die gleichen oder ähnliche Effekte auch in anderen Säugern und in Menschen beobachtet werden könnten und möglicherweise in gewissem Ausmaß auch in Nicht-Säugern.

Claims

1. Verwendung des β-adrenergen Agonisten Clenbuterol oder eines Analogs desselben zur Herstellung eines Arzneimittels, das den Funktionsverlust von gestreiften Muskeln rückgängig macht, der zurückzuführen ist auf:

a) einen humoral vermittelten katabolischen Zustand und/oder

b) eine zeitweilige Nichtverwendung dieser Muskeln.

2. Verwendung nach Anspruch 1, wobei der Funktionsverlust von gestreiften Muskeln zurückzuführen ist auf:

a) einen humoral vermittelten katabolischen Zustand.

3. Verwendung nach Anspruch 1 oder 2, wobei das Arzneimittel an Menschen verabreicht werden soll.

4. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei eine Atrophie der Muskeln zumindest teilweise auf einen kachektischen Zustand zurückzuführen ist.

5. Verwendung nach Anspruch 4, wobei der kachektische Zustand ein erworbenes Immundefizienzsyndrom (AIDS) ist.

6. Verwendung nach Anspruch 4, wobei der kachektische Zustand Krebs ist.

7. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei der β-adrenerge Agonist in einer Mischung mit einem β-adrenergen Antagonisten verabreicht wird.

8. Verwendung nach Anspruch 7, wobei der β-adrenerge Antagonist Propranolol, Atenolol, die Hoffman La Roche-Verbindung Ro 22-4574 oder eine Mischung dieser Verbindungen umfaßt.