KR100457113B1 - 세라마이드류 또는 그 유도체와 다이메틸스핑고신을 유효성분으로 포함하는 방사선민감도 증진제 - Google Patents

세라마이드류 또는 그 유도체와 다이메틸스핑고신을 유효성분으로 포함하는 방사선민감도 증진제 Download PDF

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Abstract

본 발명은, 세라마이드류 및 그 유도체와 스핑고신 인산화효소 억제제(sphingosine kinase inhibitor)인 다이메틸스핑고신을 함께 포함하는 방사선 민감제에 관한 것으로, 더욱 상세하게는, 본 발명은 생체 내 암을 치료하기 위하여 암세포에 방사선을 조사하기 전, 또는 조사하는 동안 투여하여 방사선 치료 증진 효과를 나타낼 수 있는 하기 화학식 1의 세라마이드 화합물 및 화학식 4의 다이메틸스핑고신을 함께 포함하는 새로운 방사선 민감도 증진제에 관한 것이다.
(상기 식에서, R1은 탄소원자 수 1 내지 20인 알킬기를 나타낸다)
상기 화합물의 병용처리는 암 조직에서 방사선 치료 효율을 증진시키므로, 정상 세포에 영향을 주지 않는 농도의 세라마이드와 방사선을 함께 처리함에 있어서, 방사선 치료의 선량을 낮추면서도 고선량 처리와 동일한 효과를 얻을 수가 있고, 고선량 방사선 치료와 고농도 세라마이드 투여시 나타나는 부작용인 정상세포의 손상을 현저히 줄일 수 있는 효과가 있으므로, 방사선 치료의 효율을 극대화할 수 있다.

Description

세라마이드류 또는 그 유도체와 다이메틸스핑고신을 유효 성분으로 포함하는 방사선민감도 증진제{Radiosensitizer containing ceramides or derivatives thereof and dimethylsphingosine as the active ingredient}
본 발명은, 세라마이드류 또는 그 유도체와 스핑고신 인산화효소 억제제(sphingosine kinase inhibitor)인 다이메틸스핑고신을 함께 포함하는 방사선 치료 증진제에 관한 것으로, 더욱 상세하게는, 본 발명은 생체 내 암을 치료하기 위하여 암세포에 방사선을 조사하기 전, 또는 조사하는 기간 동안 투여하여 방사선 치료 증진 효과를 나타낼 수 있는, 세라마이드 화합물 및 다이메틸스핑고신을 함께 포함하는 새로운 방사선 민감도 증진제에 관한 것이다.
암의 치료법은 수술, 방사선 치료법, 화학요법으로 크게 나눌 수 있는데, 현재 암 환자 중 국내의 경우 약 35%, 미국의 경우 약 50% 정도가 방사선 치료를 받고 있으며, 국내에서 방사선 치료를 받는 암환자의 수가 매년 증가하고 있는 추세여서 암치료에 있어 방사선 치료의 중요성 또한 증가하고 있다.
이와 같이 방사선 치료는 현재 다양한 종류의 암에 필수적인 치료 방법으로 알려져 있으나 암세포의 방사선 내성 획득, 고선량 방사선 치료시 정상 조직의 손상 등이 치료의 효율을 떨어뜨리는 문제점이 대두되어 왔다.
따라서 이러한 방사선 치료의 효율을 증대시키기 위한 증진제에 관한 연구들이 계속 진행되고 있는 실정이다. 현재 항암제로 알려진 탁솔(Taxol)과 시스플라틴(cisplatin)이 유방암, 자궁암, 폐암, 위암, 대장암 등 여러 고형암들에서 방사선 민감제로 연구가 되어 왔으며, 현재에는 임상적으로 이것들을 고형암 환자들을 대상으로 방사선과 함께 투여해 본 결과, 방사선 치료 효율을 증진시킨다는 것이 입증이 되었다. 그러나 이러한 항암제들은 그 부작용이 클 뿐만 아니라, 다양한 암조직에서 고르게 효과를 나타내지도 못한다는 단점이 있다.
따라서 본 발명에서는 정상세포에 부작용을 주지 않으면서 다양한 종류의 암세포에 고르게 효과를 나타내는 방사선 치료 증진제를 제공하는 것을 목적으로 한다.
도 1은 세라마이드 처리에 의한 암세포의 생존률 변화를 나타낸 그래프이고,
도 2는 다이메틸스핑고신 처리에 의한 암세포의 생존률 변화를 나타낸 그래프이고,
도 3은 세라마이드와 다이메틸스핑고신의 복합처리에 의한 방사선 민감효능 증가를 나타낸 그래프이고,
도 4는 세라마이드/다이메틸스핑고신의 복합처리 후 나타나는 방사선 조사에 의한 세포주기의 변화를 보여주는 도면이고,
도 5는 세라마이드/다이메틸스핑고신의 복합처리에 의한 방사선에 의해 유발되는 세포사멸의 증가를 보여주는 도면이고,
도 6은 세라마이드/다이메틸스핑고신의 복합처리와 방사선 조사에 의한 PARP(Poly-(ADP-ribose)-polymerase) 절단 증가를 나타내는 도면이고,
도 7은 세라마이드/다이메틸스핑고신의 복합처리와 방사선 조사에 의한 캐스페이즈류의 증가를 나타내는 도면이고,
도 8는 세라마이드/다이메틸스핑고신의 복합처리와 방사선 조사에 의한 Bcl-2 계 유전자 발현 증가를 보여주는 도면이고,
도 9는 세라마이드/다이메틸스핑고신의 복합처리와 방사선 조사에 의한 세포사멸 관련 단백질들의 증가를 보여주는 도면이고,
도 10a 및 도 10b은 세라마이드/다이메틸스핑고신 복합처리에 의한 방사선저항세포주의 민감효과를 보여주는 그래프이고,
도 11은 암세포이식 마우스에 방사선 조사시 세라마이드/다이메틸스핑고신의 복합처리에 의한 종양축소 및 생존율 증가를 보여주는 그래프이다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은,
하기 화학식 1로 표시되는 세라마이드류 또는 그 유도체 또는 약학적으로 허용가능한 그의 염과 하기 화학식 4로 표시되는 다이메틸스핑고신 또는 하기 화학식 5 내지 8로 구성된 그룹에서 선택된 스핑고신 인산화효소 억제제를 유효성분으로서 포함하는 방사선 치료 증진제를 제공한다.
[화학식 1]
(상기 식에서, R1은 탄소수 1 내지 20인 알킬을 나타낸다)
[화학식 4]
이 때, 상기 세라마이드류는 하기 화학식 2의 구조를 갖는 것이 바람직하다.
(상기 식에서, R2은 치환된 또는 비치환된 메틸, 펜틸 또는 헵틸을 나타낸다)
더욱 바람직하게는 상기 세라마이드류는 하기 화학식 3의 구조를 갖는 세라마이드이다.
(상기 식에서, R3은 메틸 또는 펜틸을 나타낸다)
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기한 화학식 1 내지 3 중 어느 하나의 구조를 갖는 세라마이드류 또는 그 유도체, 또는 약학적으로 허용가능한 그 염과 화학식 4의 다이메틸스핑고신을 유효성분으로서 포함하는 암 치료제를 제공한다.
이하, 본 발명을 더욱 상세히 설명한다.
본 발명자들은, 암세포의 방사선 치료시, 상기한 바와 같은 세라마이드류 화합물과 스핑고신 인산화효소 억제제인 다이메틸스핑고신을 병용처리하여 본 결과, 방사선만을 투여한 경우에 비하여, 방사선에 의한 암세포 살상능이 증진됨으로써 방사선 치료 효율을 극대화할 수 있다는 것을 밝혀내었다.
본 발명의 방사선 민감도 증진제로서 사용한 화합물인 세라마이드 혹은 세라마이드 유도체들은 동물, 식물, 효모 등 고등세포의 막 구조를 형성하는 주요지질로서 단순히 구조적인 기능 이외에, 최근에는 세포의 분화, 신호전달체계의 중간전달 물질로서의 역할 등의 생리활성 기능이 밝혀지면서 많은 연구가 진행되고 있다.
즉, 세라마이드는 신호전달 경로에서 2차 전달자로 기능을 하기 때문에 다양한 세포의 성장, 분화 등의 과정에 포함되는 신호전달 경로의 중요한 요소인데, 본 발명자들은 이러한 세라마이드를 암세포의 방사선 처리시 함께 투여했을 때, 방사선에 의해 유도되는 세포사멸에 대한 민감성을 증가시킨다는 사실을 발견하였다. 그러나, 암세포의 방사선에 대한 민감성을 증가시키기 위해 세라마이드를 암세포에 처리하더라도, 암세포내의 활발한 세라마이드 대사 작용에 의해, 처리된 세라마이드가 다른 물질로 전환되어 버려, 세라마이드의 효과가 감소되는 문제점이 있었다. 또한, 이러한 문제점을 해결하기 위하여 세라마이드를 고농도로 투여하고자 하여도, 세라마이드는 인체에 투여시 그 독성이 매우 강하여 고농도에서는 정상세포에 치명적인 영향을 주게 된다.
따라서, 세라마이드가 다른 물질로 전환되는 대사과정을 가능한 한 차단하기 위해, 세포 내에서 세라마이드의 대사에 작용하는 다양한 효소 중 하나인 스핑고신카이네이즈의 억제제를 처리하여, 세포 내 세라마이드 축적을 유도함으로써, 암세포의 방사선 민감 효능을 극대화시킬 수 있었다.
즉, 복잡한 대사 조절의 대상이 되는 세포내 세라마이드는 하기와 같은 몇몇의 경로에 의하여 축적되는 것으로 알려져 있다. 그 경로로는 첫 번째로, 스핑고미엘리나아제의 활성화에 의한 스핑고미엘린의 가수분해, 둘째로 세린과 팔미톨-CoA를 축합하는 세라마이드 합성 효소에 의한 생합성, 세째로 세레브로사이드 합성 효소에 의한 세레브로사이드로부터의 대사적 합성, 네째로 스핑고신으로부터 아실트랜스퍼라아제가 매개된 전환 등이 있는데, 상기 경로 중 스핑고미엘리나아제에의한 스핑고미엘린의 분해와 세라마이드 합성효소에 의한 생합성이 신호전달의 범주에 속하는 세라마이드 합성 경로이며, 전자의 과정이 세포내 세라마이드 축적에서 후자보다 더 흔한 경로인 것으로 알려져 있다.
여기서, 세라마이드는 각각 세라마이드에 세라미다아제가, 스핑고신에 스핑고신 카이네이즈가 작용하여 생성되는 스핑고신 및 스핑고신-1-포스페이트의 전구체인데, 이중 스핑고신 카이네이즈는 세포 내 세라마이드가 축적될 때 활성화되어 축적된 세라마이드의 대사를 유도하는 것으로 알려져 있는 대표적인 효소이다. 이 효소는 하기 화학식 4와 같은 다이메틸스핑고신(N,N-dimethyl-D-erythro-sphingosine, DMS)에 의해 저해되는 것으로 알려져 있다.
[화학식 4]
따라서 본 발명에서는 세라마이드류 화합물과 상기의 다이메틸스핑고신 또는 다른 스핑고신 인산화효소 억제제를 함께 처리함으로써, 세라마이드 축적 효과를 극대화하고, 이를 통하여 정상세포에 영향을 주지 않는 양의 세라마이드로써 방사선 치료 효과를 증진시킬 수 있었다.
본 발명에서는 방사선 치료의 주된 대상이 되는 폐암의 마우스 폐암세포주인 LLC(Lewis lung carcinoma) 세포를 대상으로 방사선조사시 유발되는 생존률 감소가 세라마이드 또는 다이메틸스핑고신 각각의 단독 처리군보다 세라마이드/다이메틸스핑고신의 동시 처리에 의해 증가된다는 사실과, 이것이 방사선에 의해 유도되는 세포사멸에 대한 민감성의 증가로 나타나는 결과임을 확인하였다.
또한 세라마이드/다이메틸스핑고신의 사전처리와 방사선 조사에 의해 증가되는 세포사멸 과정 중에, PARP(poly(ADP-ribose)polymerase) 절단이 증가되어 DNA 재생을 방해하게 되는데, 이 증가된 PARP 절단에 마이토콘드리아 의존형 캐스패이지(caspase)인 캐스패이지-9과 캐스패이지-3가 관여한다는 것을 확인했을 뿐 아니라, 다양한 Bcl-2계 단백질들의 유전자 발현이 변화하여, 다양한 세포사멸 유도 자극에 대한 암세포의 민감성을 상대적으로 증가시켜주는 Bcl-2:Bax 비율이 유도된다는 사실을 확인함으로써, 세라마이드/다이메틸스핀고신의 처리시 증가되는 암세포의 방사선 민감 효과가 마이토콘드리아상의 많은 변화들이 관여하여 진행되는 마이토콘드리아 의존형의 세포사멸의 전체적인 증가에 의한 것임을 보여주었다.
또한 방사선에 저항성이 있는 LLC(Lewis lung carcinoma) 세포에서도 세라마이드/다이메틸스핑고신의 처리시 암세포의 방사선에 대한 민감도가 증가됨으로써 방사선 내성 암종에 대한 치료 효과를 나타내었다.
본 발명의 방사선 치료 증진제로서 사용가능한 세라마이드류는 상기 화학식 1의 기본 구조를 포함하는 화합물이라면 특별히 한정되지는 않으나, 하기 화학식 2와 같은 구조를 갖는 세라마이드인 것이 바람직하며, 특히 바람직한 것은 화학식 3의 구조를 갖는 세라마이드 즉, N-아세틸-D-에리트로-스핑고신(N-Acetyl-D-erythro-sphingosine)(이하, C2-ceramide라 한다), N-헥사노일-D-에리트로-스핑고신(N-Hexanoyl-D-erythro-sphingosine)(이하, C6-ceramide라 한다)가 특히 바람직하다.
[화학식 1]
(상기 식에서, R1은 탄소수 1 내지 20인 알킬을 나타낸다)
[화학식 2]
(상기 식에서, R2은 치환된 또는 비치환된 메틸, 펜틸 또는 헵틸을 나타낸다)
[화학식 3]
(상기 식에서, R3은 메틸 또는 펜틸을 나타낸다)
본 발명의 방사선 치료 증진제로서 사용할 수 있는 세라마이드류 화합물 및 다이메틸스핑고신은 일반적으로 시판되고 있는 것을 사용할 수 있다.
특히 상기 화학식 1의 세라마이드 화합물은, 시판되는 스핑고신의 아미노기를 아실화함으로써 용이하게 얻을 수 있는데, 이 때 아실화는 산, 무수물, 에스테르, 아미드 등을 사용하는 상법에 따라 실시할 수 있으며, 또는 ALEXIS 사 등에서 시판되는 것을 구입하여 사용할 수도 있다.
또한 본 발명의 세라마이드/다이메틸스핑고신 복합체는 저농도로 투여할 때는 생리학적으로 굉장히 안전하고, 다른 부작용을 거의 나타내지 않는 물질임이 확인되었다.
이러한 결과로부터, 세라마이드류/다이메틸스핑고신 복합체가 부작용 없이 인체 폐암세포 자궁암 세포, 유방암 세포, 및 혈액암 세포에서 방사선 효율을 현저하게 증진시키는 효과가 있다는 것을 알 수 있었으며, 방사선 치료 증진제의 활성 성분으로 유효하게 이용할 수 있다는 것을 확인하였다.
본 발명의 세라마이드류/다이메틸스핑고신 복합체는 그대로 또는 약학적으로 허용가능한 염의 형태로 의약에 사용할 수 있다. 상기 염으로는 약학적으로 허용되는 것이면 특별히 한정되지 않으며, 예를 들어 염산, 황산, 질산, 인산, 불화수소산, 브롬화수소산, 포름산 아세트산, 타르타르산, 젖산, 시트르산, 푸마르산, 말레산, 숙신산, 메탄술폰산, 벤젠술폰산, 톨루엔술폰산, 나프탈렌술폰산 등을 사용할 수 있다.
본 발명의 세라마이드류/다이메틸스핑고신 복합체를 의약으로 사용할 경우 약제학적 제제 및 그 투여 방법에 있어서는 각종 공지의 방법을 적용할 수 있다.
즉, 본 발명의 세라마이드류/다이메틸스핑고신 복합체를 비경구, 경구 등으로 투여할 수 있으며, 주사제, 산제, 과립제, 정제 등을 비롯하여 약제학적 제제에 적합한 어떠한 제형으로도 할 수 있다. 피토스핑고신 유도체를 방사선 치료 증진제의 약제학적 조성물로 제제화할 경우, 유효 성분에 악영향을 미치지 않는 한, 필요에 따라 의약에 사용되는 각종 보조제, 예컨대 담체나 기타 첨가제, 예컨대 안정제, 완화제, 유화제 등을 사용할 수 있다.
본 발명의 세라마이드류/다이메틸스핑고신 복합체의 두 성분의 병용투여시 함량비는, 환자의 상태에 따라 조절할 수 있으나, 세라마이드와 다이메틸스핑고신을 대략 1:1의 비로 하는 것이 가장 바람직하며, 약제학적 제형에 있어서 상기 복합체의 함유량은 제형에 따라 광범위하게 변할 수 있으며, 통상적인 방법에 따른다.
또한 세라마이드류/다이메틸스핑고신 복합체의 투여량 및 투여 방법은, 환자의 상태와 암세포의 양에 따라서 다양화될 수 있지만 방사선 치료전 또는 치료 중 하루 최대 0.5 mg/kg이 적당하다.
이하, 세라마이드류/다이메틸스핑고신 복합체의 제조 및 약리학적 작용에 대하여 실시예 및 시험예를 통하여 더욱 상세히 설명한다.
실시예
본 발명의 방사선 민감도 증진 효과를 시험하기 위하여 ALEXIS 사로부터 입수한 N-Acetyl-D-erythro-sphingosine (C2-세라마이드)를 사용하였고, 다이메틸스핑고신도 ALEXIS 사로부터 입수한 것을 사용하였다.
1. 세라마이드 농도의 결정
본 발명자들은 암세포의 방사선 민감 효과에 대한 실험을 하기 위한 세라마이드의 농도를 결정하기 위해, C2-세라마이드를 다양한 농도 (10, 20, 30, 40uM)로 LLC(Lewis lung carcinoma) 세포(2 x105개)에 처리한 후, 24시간과 48시간 후에 각각의 암세포 생존률을 트립판 블루 염색법으로 측정하였다. 그 결과 도 1에서와 같이, LLC 세포는 그 생존률이 세라마이드에 의해 농도 의존적으로 감소하는 경향을 보였다.
C2-세라마이드의 농도가 증가할 수록 LLC 세포의 생존률은 감소하였으나, 세라마이드의 방사선 민감 효능 증가에 대한 본 실험에서는 세포에 거의 영향을 미치지 않은 농도, 즉, 90%정도의 생존 정도를 보인 농도인 5uM의 C2-세라마이드를 이용하여 실험하였다.
2. 다이메틸스핑고신 농도의 결정
본 발명자들은 암세포의 방사선 민감 효과에 대한 실험을 하기 위한 다이메틸스핑고신의 농도를 결정하기 위해, 다이메틸스핑고신을 다양한 농도 (10, 20, 30, 40uM)로 LLC(Lewis lung carcinoma) 세포(2 x105개)에 처리한 후, 24시간 후에 각각의 암세포 생존률을 트립판 블루 염색법으로 측정하였다. 그 결과 도 2에서와같이, LLC 세포는 그 생존률이 다이메틸스핑고신에 의해 농도 의존적으로 감소하는 경향을 보였다.
다이메틸스핑고신의 농도가 증가할 수록 LLC 세포의 생존률은 감소하였으나, 세라마이드/다이메틸스핑고신 복합체의 방사선 민감 효능 증가에 대한 본 실험에서는 세포에 거의 영향을 미치지 않은 농도, 즉, 90% 이상의 생존 정도를 보인 농도인 5uM의 다이메틸스핑고신을 이용하여 방사선 치료 증진 작용을 실험하였다.
시험예
상기 실시예에서 결정된 농도의 세라마이드와 다이메틸스핑고신이 유도하는 암세포의 방사선 민감도의 변화를 다음과 같이 측정하였다.
1. 세라마이드와 다이메틸스핑고신의 처리에 의한 암세포의 방사선 민감작용
세라마이드와 다이메틸스핑고신 처리시 암세포의 방사선 민감성 작용을 측정하기 위하여, LLC세포에 방사선(0, 2, 4, 6, 8Gy)만 조사한 경우와 방사선(0, 2, 4, 6, 8Gy)과 함께 C2-세라마이드(5uM), 다이메틸스핑고신(5uM), 또는 그 둘(각각 5uM)을 함께 처리했을 경우의 생존률을 클론형성 능력을 통해 비교하여 도 3에 그 결과를 나타내었다.
도 3으로부터 알 수 있는 바와 같이, 방사선만 조사한 경우, 0Gy에서 100%, 2Gy에서 76%, 4Gy에서 23%, 6Gy에서 5.4%, 8Gy에서 0.19%의 클론생성능을 보였다. 방사선과 함께 C2-세라마이드 또는 다이메틸스핑고신를 단독 처리한 경우에는 방사선량이 증가될수록 방사선 단독조사군보다 생존율이 약간 감소하는 경향이 나타나긴 했으나, 유의적이진 않았으며, 거의 비슷한 형태의 그래프로 나타났다. 그러나도 3에서와 같이, 방사선 조사와 함께 C2-세라마이드와 다이메틸스핑고신을 복합처리했을 경우에는, 암세포의 생존률이 현저하게 감소하여, 2Gy에서 25%, 4Gy에서 3.8%, 6Gy에서 0.5%, 8Gy에서 0.01%로 방사선 민감작용이 나타났다.
2. 방사선 조사 후 암세포의 세포주기의 변화
상기 1.에서와 같이 방사선 단독조사군에 비해, 세라마이드와 다이메틸스핑고신을 함께 사전처리했을 때, 암세포생존률이 현저히 감소하는 것으로 나타났는데, 이러한 결과가, 암세포의 세포 주기 상에 어떠한 변화로부터 초래되는 결과인지를 알아보기 위하여, LLC 세포(4 x 105개)에 방사선만 조사한 경우(5Gy)와 방사선(5Gy) 조사 24시간 전에 C2-세라마이드 (5uM), 다이메틸스핑고신(5uM), 또는 그 둘(각각 5uM)을 함께 사전 처리했을 경우의 세포 주기 상의 변화를 유세포 분석 (FACS) 분석을 통해 관찰해 보았다. 분석은 방사선 조사 6시간 후에 진행하였으며, 결과는 도 4에 나타내었다.
도 4에서 알 수 있는 바와 같이, 대조군 세포의 경우, 대부분의 세포들이 G1기에 집중되어 있었으며, C2-세라마이드 또는 다이메틸스핑고신(각각 5uM)만을 처리했을 경우, 대조군 세포와 거의 비슷한 그래프 양상이 관찰되었다. 방사선 단독조사군과 방사선 조사 24시간 전 C2-세라마이드 또는 다이메틸스핑고신을 처리한 경우에는 대부분의 세포가 G2기로 완전히 치우쳐 분포되어 있는 결과가 관찰되었으며, 이것은 방사선조사에 의해 암세포의 성장이 지연됨을 알수 있었다. 반면, C2-세라마이드와 다이메틸스핑고신을 함께 24시간 전 처리하고, 방사선 조사한 경우엔 sub-G1기에 많은 세포들이 집중되었으며, 이는 암세포의 세포사멸 증가를 나타내는것으로 볼 수 있다.
3. 방사선 조사 후 세포사멸 증가 작용
LLC 세포에, 방사선만 조사했을 때, 또는 C2-세라마이드/다이메틸스핑고신만을 처리했을 때, C2-세라미이드/다이메틸스핑고신을 함께 사전 처리하고(24시간 전), 방사선을 조사했을 때의 세포사멸의 양적인 분석을 위하여, FACS 분석을 행하였다. 방사선만 조사(5Gy)한 경우, C2-세라마이드/다이메틸스핑고신(각각 5uM)만을 함께 처리한 경우, 방사선 조사(5Gy) 24시간 전에 C2-세라마이드/다이메틸스핑고신(각각 5uM)을 함께 처리한 경우에 있어서, 암세포(1x105개)에서 진행된 세포 사멸 정도를 TUNEL분석을 통하여 비교해 보았다. 각 조건하의 세포들을 방사선 조사 24시간 후에 원심분리하여 세척한 후, 사이토스핀을 이용하여 슬라이드에 세포들을 부착시켜 고정시켰다. 고정된 세포를 TdT (Terminal deoxynucleotidyl 전이효소)와 반응시키고, HRP(horse-radish peroxidase)와 반응시켜 DAB으로 발색하여 현미경으로 관찰하였다. 이 때 세포사멸을 일으킨 세포는 갈색으로 염색되는 것에 비해, 그 이외의 세포들은 파란색으로 염색되므로, 이 수를 세어 백분율로 환산 후, 세포 사멸 정도를 비교하였다.
도 5에 나타낸 바와 같이, 방사선만 조사한 암세포에서는 약 8%의 세포사멸이, C2-세라마이드와 다이메틸스핑고신를 함께 사전 처리한 경우에는 약 79%의 세포사멸이 진행된 것이 관찰되었고, 방사선 조사 없이 C2-세라미이드와 다이메틸스핑고신만을 동시 처리한 암세포는 약 13% 정도의 세포사멸정도가 나타났다.
4. 방사선 민감 작용에 의한 여러 유전자 발현정도와 단백질들의 활성변화
1) 세라마이드/다이메틸스핑고신 사전 처리 후, 방사선 조사에 의한 PARP 절단정도
암세포에 세라마이드/다이메틸스핑고신의 사전 처리 후, 방사선 조사한 경우, 세포 사멸 과정의 다양한 단계에서 다양한 특이성을 가지고 세포 사멸 정도를 조절하는 것으로 알려져 있는 캐스패이지들이 어떻게 관여하는지 확인하기 위하여, 방사선(0, 2, 4, 6, 8, 10, 15Gy)만 조사한 경우와 C2-세라미드(5uM)와 다이메틸스핑고신(5uM)를 24시간 사전 처리한 후 방사선(0, 2, 4, 6, 8, 10, 15Gy)을 조사한 경우의 캐스패이지에 의한 캐스패이지들의 대표적 최종 기질인 PARP의 절단정도를 웨스턴 블롯(western blot analysis)을 통해 비교해 보았다.
도 6에 나타낸 바와 같이, 방사선단독 조사군에서는 10Gy 이상의 방사선량에서만 86kD의 절단된 PARP가 관찰된 반면, C2-세라마이드와 다이메틸스핑고신을 24시간 사전 처리한 후 방사선을 조사한 경우에는 4Gy용량에서 86kD의 절단된 PARP가 관찰되었는 바, 이로부터 방사선만 조사한 암세포와는 다르게, 세라마이드와 다이메틸스핑고신을 사전 처리한 후 방사선을 조사한 세포에서 캐스패이즈들의 역할이 확연히 증가됨을 알 수 있었다.
2) 세라마이드/다이메틸스핑고신의 사전처리와 방사선 조사에 의해 증가되는 세포사멸과정에서 캐스페이즈들의 활성 변화
상기한 바와 같이, 방사선만 조사한 LLC 세포에 비해 C2-세라마이드와 다이메틸스핑고신의 사전처리를 병행했을 때 증가된 PARP 절단에 어떤 종류의 캐스패이지가 관여하는지 알아보기 위하여, 다양한 종류의 캐스패이지들의 항체를 이용하여, 웨스턴 블롯(western blot analysis)을 실시하여, 대표적으로 캐스패이지-3, 8, 9의 활성 변화를 관찰하였다.
도 7에 나타낸 바와 같이, C2-세라미이드(5uM)와 다이메틸스핑고신(5uM)의 24시간 사전 처리 하에서, 마이토콘드리아 의존형인 캐스패이지-9과 캐스패이지-3의 활성정도가 방사선-용량 의존형(2, 5, 8Gy)으로 증가되는 것에 비해, 캐스패이지-8의 활성상의 변화는 관찰되지 않았다. 이러한 차이는 방사선만 단독 조사한 경우엔 거의 나타나지 않았다. 이로써, C2-세라마이드와 다이메틸스핑고신 처리에 의해 증가된 방사선유발 세포사멸이 마이토콘드리아를 경유하는 과정에 의해 진행됨을 확인할 수 있었다.
3) 세라마이드/다이메틸스핑고신의 사전처리와 방사선 조사에 의해 증가되는 세포사멸과정에서 나타나는 Bcl-2 단백질군의 유전자 발현상의 변화
세라마이드/다이메틸스핑고신의 사전처리와 방사선 조사에 의해 증가되는 세포사멸과정에서, 다양한 세포사멸과정, 특히 마이토콘드리아를 경유하여 진행되는 세포사멸 과정의 조절에 있어 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있는 Bcl-2 단백질들의 세포 내 RNA 양을 다음과 같이 RT-PCR을 통해 확인하였다.
즉, 감마 방사선 5Gy를 조사한 후, 3시간과 6시간 후에 세포를 모아 원심 분리하여 세포를 세척하고, 총 RNA를 분리하여 정량하였다. 이중 1ug을 취하여 역전사시켜, 상보 DNA를 합성하고, 발현정도를 보고자 하는 여러 유전자들의 시발체(primer)와 함께 DNA 합성 효소(polymerase) 처리하여, PCR(polymerase chain reaction)을 수행하였다. 그 산물을 에티디움 브로마이드가 처리된, 1% 아가로즈 젤상에서 전기 영동하여, 여러 유전자의 전사 RNA 발현정도를 세포 내에서 일정하게 존재하는 베타-액틴을 표준으로 하여 확인하였다.
도 8에 나타낸 바와 같이, C2-세라마이드/다이메틸스핑고신(각각 5uM)를 24시간 사전 처리한 LLC 세포에서, 대표적인 세포사멸유도단백질인 Bax의 경우 유전자 발현 정도가 현저하게 증가되는 것에 비해, 세포사멸억제단백질인 Bcl-2와 Bcl-xL의 경우 감소되는 것으로 확인되었다. 이러한 결과는 방사선만(5Gy)을 단독 조사한 세포에서는 관찰되지 않았으며, 이것으로 방사선조사와 함께 C2-세라마이드/다이메틸스핑고신의 처리는 LLC 세포의 다양한 세포사멸유도자극에 대한 민감 정도를 증가시키는 Bcl-2:Bax의 세포 내 비율을 유도하여, 전체적으로 마이토콘드리아를 경유하여 진행되는 세포사멸과정이 증가되어 나타나는 결과라는 것을 확실히 할 수 있었다.
상기의 실험으로부터, 세라마이드와 다이메틸스핑고신의 사전처리가 방사선조사시에 나타날 수 있는 암세포 생존률의 감소, 세포사멸 유도인자의 발현을 증가시킴으로써, 암세포의 마이토콘드리아 경유 세포사멸에 대한 민감성을 증강시킨다는 것을 알 수 있었다.
4) 세포사멸에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있는 다른 단백질들의 세라마이드/다이메틸스핑고신의 사전처리와 방사선 조사에 의해 증가되는 세포사멸에의 관여 여부
다양한 세포사멸과정에 관여하는 하는 것으로 알려져 있는, p53, p21, Fas등의 유전자 발현상의 변화를 RT-PCR로 확인해 보았다. 도 9에 나타난 바와 같이,FAS의 경우, 방사선만 단독 조사된 세포에 비해, C2-세라마이드와 다이메틸스핑고신를 사전 처리 시, 유전자 발현이 현저하게 증가되는 경향이 관찰되었다. 이는 C2-세라마이드/다이메틸스핑고신 가 증가시키는 방사선유도 세포사멸의 적어도 일부는 C2-세라마이드/다이메틸스핑고신에 의해 유도되는 수용체를 경유하는 세포사멸과정이 포함되어 있음을 보여주는 결과였다. p53과 p21의 경우 유전자 발현상에 거의 변화가 관찰되지 않았다.
5. 세라마이드/다이메틸스핑고신의 사전처리가 방사선저항성 암세포의 방사선 민감성에 미치는 영향
LLC 세포의 방사선에 대한 민감성을 증가시켜주는 세라마이드/다이메틸스핑고신이 또한 방사선저항성 LLC 세포의 방사선 민감 정도에도 변화를 줄 수 있는지를 알아보기 위하여, 방사선(0, 2, 5, 7, 10, 15Gy)만 단독 조사된 경우와, 방사선(0, 2, 5, 7, 10, 15Gy)과 C2-세라마이드/다이메틸스핑고신(각각 5uM)을 함께 처리 했을 경우의 세포 생존률 변화를 트리판 블루 염색법을 통해 확인하였다.
그 결과, 도 10a 및 도 10b에 나타난 바와 같이, 방사선저항 LLC세포(2 x 105개)에 C2-세라마이드/다이메틸스핑고신을 복합처리 후, 2-5Gy 조사시, 30%이상, 8Gy에서 20%의 생존률의 감소효과를 나타냈다. 이는 방사선 저항 암세포주도 C2-세라미이드/다이메틸스핑고신의 복합처리가 방사선에 의한 암세포 살상효과를 증가 시킬 수 있음을 보여주는 결과였다.
6. 동물실험에서의 항암작용 및 방사선 민감작용
C57BL/6 마우스의 왼쪽 다리에 LLC 세포(1 x 106/마우스)를 이식시킨 후, 총 4개의 그룹, 즉, 대조군, 방사선단독조사군, C2-세라마이드/다이메틸스핑고신 처리군, C2-세라마이드/다이메틸스핑고신 및 방사선 조사군으로 구분하였다. 14일 경과 후 그 종양의 크기가 대략 1000mm3정도 되었을 때, C2-세라마이드/다이메틸스핑고신 처리군과 C2-세라마이드/다이메틸스핑고신 및 방사선 조사군에 2.5 mg의 C2-세라마이드와 같은 양의 다이메틸스핑고신을 함께 복강내 투여하였으며, 24시간 후엔 방사선단독조사군과 C2-세라마이드/다이메틸스핑고신 및 방사선 조사군에60Co 방사선 20Gy를 종양에 조사시켜 종양의 성장속도와 마우스의 생존율을 비교 관찰하였다. 이때 종양의 성장속도는 종양의 크기를 측정하여 (가로 x 세로2)/2로 계산하였다.
그 결과 방사선 단독 조사군과 C2-세라마이드/다이메틸스핑고신 단독 처리군도 대조군에 비해 생존기간이 약간 연장되기는 하였으나, C2-세라마이드/다이메틸스핑고신 및 방사선 조사군의 경우 확연히 증가된 40% 정도의 생존율이 관찰되었다.
이상과 같은 시험예로부터, C2-세라마이드/다이메틸스핑고신 복합체를 인체에 무해한 투여량으로 투여했을 때, 다양한 암종에서 방사선과 병용 처리 시 방사선 치료의 선량을 낮추면서도 치료 효율적인 측면에서는 고선량 처리 효과를 얻을 수가 있어, 고선량 방사선 치료시 나타나는 부작용인 정상세포의 손상을 현저히 줄일 수 있는 효과가 있으며, 따라서 방사선 치료의 효율을 극대화할 수 있음을 알 수 있다.
이상에서 살펴본 바와 같이, 세라마이드/다이메틸스핑고신 복합체는 방사선 치료 효율이 매우 낮은 방사선 내성을 가진 암 조직에서도 방사선 치료 효율을 증진시킬 수 있으며, 부작용이 없어 안전하고 효율 높은 방사선 치료 증진제로의 이용이 가능하므로 인체 방사선의 의학적 이용 확대를 유도할 수 있다.

Claims (4)

  1. 하기 화학식 1로 표시되는 세라마이드류 또는 그 유도체 또는 약학적으로 허용가능한 그의 염과 하기 화학식 4로 표시되는 다이메틸스핑고신 또는 하기 화학식 5 내지 8로 구성된 그룹에서 선택된 스핑고신 인산화 효소 억제제를 유효성분으로서 포함하는 방사선 치료 민감제.
    [화학식 1]
    (상기 식에서, R1은 탄소수 1 내지 20인 알킬을 나타낸다)
    [화학식 4]
    [화학식 5]
    [화학식 6]
    [화학식 7]
    [화학식 8]
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 세라마이드류는 하기 화학식 2의 구조를 갖는 것을 특징으로 하는 방사선 치료 민감제.
    [화학식 2]
    (상기 식에서, R2은 치환된 또는 비치환된 메틸, 펜틸 또는 헵틸을 나타낸다)
  3. 제 2 항에 있어서, 상기 세라마이드류는 하기 화학식 3의 구조를 갖는 것을 특징으로 하는 방사선 치료 민감제.
    [화학식 3]
    (상기 식에서, R3은 메틸 또는 펜틸을 나타낸다)
  4. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항의 세라마이드류 또는 그 유도체, 또는 약학적으로 허용가능한 그 염과 화학식 4의 다이메틸스핑고신을 유효성분으로서 포함하는 암 치료제.
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