DE69210797T2

DE69210797T2 - Prolyl Endopeptidase Inhibitor

Info

Publication number: DE69210797T2
Application number: DE69210797T
Authority: DE
Inventors: Fumiko Kanou; Kenichi Kimura; Junji Nakamura; Makoto Yoshihama
Original assignee: Snow Brand Milk Products Co Ltd
Current assignee: Snow Brand Milk Products Co Ltd
Priority date: 1991-12-24
Filing date: 1992-12-22
Publication date: 1996-09-26
Anticipated expiration: 2012-12-23
Also published as: EP0556482A3; DE69210797D1; JPH05301826A; CA2086142A1; EP0556482A2; EP0556482B1

Description

Hintergrund der Erfindung

Gebiet der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft einen Prolylendopeptidase-Inhibitor. Der Prolylendopeptidase-Inhibitor der vorliegenden Erfindung ist zur Heilung von Amnesie wirksam, weil er eine hemmende Aktivität auf Prolylendopeptidase aufweist.

Beschreibung des Standes der Technik

Mit einer verlängerten Lebensspanne, die durch die Entwicklung der medizinischen Technologien in den letzten Jahren herbeigeführt wurde, wurde senile Demenz ein ernsthaftes Problem nicht nur für die Patienten selbst, sondern auch für die Familie und die Gesellschaft. Arzneimittel, die bisher zur Heilbehandlung von Demenz vorgeschlagen und angewendet wurden, waren solche, welche ihre Wirkungen auf die Randfaktoren von Demenz zeigen. Ein Arzneimittel, das seine Wirkung auf das Wesentliche der Demenz an sich ausübt, wurde gewünscht.
Prolylendopeptidase (EC 3.4.21.26) ist ein Enzym, das spezifisch die Carboxylseite von Prolin in prolinhaltigen Peptiden sowohl in vitro als auch in vivo abschneiden kann. Das Enzym hat eine Wirksamkeit zur Zersetzung oder Inaktivierung von Nervenpeptid- Vasopressin, von dem man annimmt, daß es mit dem Gedächtnis assoziiert ist[Nippon Norgeikagaku kaishi,58 1147 bis 1154 (1984)]. Von Prolylendopeptidase-Inhibitoren wurde demgemäß erwartet, daß sie eine Aktivität gegen Amnesie aufweisen. Tatsächlich wurde von einer Anzahl von synthetischen Inhibitoren berichtet, daß sie eine Aktivität gegen Amnesie in Experimenten aufweisen, bei welchen man Ratten und Mäuse verwendete [J. Pharmacobio-Dyn, 10, 730 bis 735 (1987)].
Ferner wurden in jüngster Zeit mehrere Berichte veröffentlicht, die die Beziehung zwischen Demenz vom Alzheimer-Typ und Prolylendopeptidase betreffen; zum Beispiel ein Bericht, der von einer signifikanten Aktivitätszunahme dieses Enzyms im Gehirn von Alzheimer-Patienten handelt,[Experientia, 46 94 bis 97 (1990)] ein Bericht über die Verwicklung des Enzyms in das Abschneiden von β-Protein-C-Endungen [FEBS LETTERS 260 131 bis 134 (1990)], und ähnliches. Von Prolylendopeptidase-Inhibitoren wurde daher enthusiastisch erwartet, daß sie als Arzneimittel gegen Amnesie verwendbar seien. Insbesondere sind die meisten der üblichen Inh ibitoren synthetische Arzneimittel mit ähnlichen chemischen Strukturen. Wechselbeziehungen von Struktur und Aktivität wurden für synthetische Inhibitoren aufgeklärt [Agric. Biol. Chem 55 37 bis 43 (1991)], und demgemäß ihre Aktivitäten, Absorption, Ausscheidung, Stabilität und ähnliches in Tierexperimenten geklärt. In dieser Hinsicht wurde von Inhibitoren, welche auf natürlichem Weg von Actinomycetes und ähnlichem erzeugt werden, erwartet, daß sie einzigartige und komplizierte Strukturen aufweisen, welche in synthetischen Inhibitoren nicht gefunden werden. Es bestehen Erwartungen, daß sie Vorteile aufweisen, die chemische Inhibitoren nicht besaßen, hinsichtlich ihrer Aktivitäten, Absorption, Ausscheidung, Stabilität und ähnlichem in vivo.
Ferner beschreiben J. Antibiot., 15 (1987)100 bis 104 und 17 (1989)107 bis 115 eine hemmende Wirkung von Enduracidin A auf Reverse Transkriptase, welche eine potentielle therapeutische Wichtigkeit zur Bekämpfung von AIDS haben könnte.

Zusammenfassung der Erfindung

Die gegenwartigen Erfinder unternahmen Untersuchungen, um Inhibitoren mit einer hemmenden Aktivität auf Prolylendopeptidase aus natürlichen Quellen zu erhalten, und stellten fest, daß Enduracidin A und seine Analoga, von denen man herkömmlicherweise wußte, daß sie Wirksamkeiten gegen Mikroben zeigen, unerwarteterweise auch eine hemmende Aktivität auf Prolylendopeptidase haben, und stellten fest, daß man diese Aktivität für die Heilbehandlung von Amnesie einsetzen kann.
Enduracidin A und seine Analoga, deren hemmende Aktivität auf Prolylendopeptidase durch die gegenwärtigen Erfinder festgestellt wurde, sind bekannte Verbindungen. Daß sie die hemmende Aktivität auf Prolylendopeptidase aufweisen, wurde zum ersten Mal durch die gegenwärtigen Erfinder festgestellt. Ferner wurde festgestellt, daß diese Verbindungen eine stärkere Wirkung auf Prolylendopeptidase aufweisen, die man vom Menschen gewonnen hat, als auf jene, die man aus Mikroorganismen gewonnen hat. Es wurde festgestellt, daß sie verschiedene und vorteilhaftere Charakteristika als Medikament im Vergleich zu bekannten Inhibitoren haben.
Insbesondere ist es eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, einen neuen Prolylendopeptidase-Inhibitor vorzusehen, der mehr vorteilhafte Charakteristika als bekannte Arzneimittel hinsichtlich seiner Aktivität, Absorption, Ausscheidung, Sicherheit und ähnlichem aufweist.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, eine Arzneimittelzusammensetzung zur Heilbehandlung von Amnesie vorzusehen, worin die prolylendopeptidaseinhibierende Aktivität eingesetzt wird.
Die genannte Aufgabe kann gemaß der vorliegenden Erfindung erfüllt werden, indem man eine Methode zur Hemmung der Prolylendopeptidase-Aktivitat vorsieht, wobei man einem Subjekt, das die Hemmung von Prolylendopeptidase benötigt, eine wirksame Menge der nachstehenden Verbindung (I) verabreicht,
worin R¹ eine Alkylgruppe, und insbesondere eine niedere Alkylgruppe darstellt, R² ein Halogenatom oder ein Wasserstoffatom ist, Ala einen Alaninrest bedeutet, Thr einen Threoninrest bedeutet, Asp einen Aspartinsäurerest bedeutet, Orn einen Ornithinrest bedeutet, Ser einen Serinrest bedeutet und Gly einen Glycinrest bedeutet, D den Typ D bezeichnet, alb ein Stereoisomeres bezeichnet und "a" allo bedeutet;
oder eines ihrer pharmazeutisch annehmbaren Salze.
In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist die genannte Verbindung der Formel I Enduracidin A.
Die genannte Aufgabe kann ferner gemäß der vorliegenden Erfindung erfüllt werden, indem man eine Methode zur Heilbehandlung von Amnesie vorsieht, bei der man einem Subjekt eine wirksame Menge der genannten Verbindung 1 oder eines ihrer pharmazeutisch annehmbaren Salze verabreicht.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Figur 1 list ein Diagramm, das die Beziehung zwischen der Dosis von Enduracidin A und der hemmenden Aktivität auf Prolylendopeptidase durch einen Dixon Plot zeigt.

Detaillierte Beschreibung der Erfindung und bevorzugter Ausführungsformen

Die niedere Alkylgruppe, die durch R¹ in Formel (I) dargestellt ist, kann eine Methyl-, Ethyl-, Propyl-, Isobutyl-, sek-Butyl-, n-Butyl- oder tert-Butyl-Gruppe oder ähnliches sein; und das Halogenatom, das durch R² dargestellt ist, kann ein Chlor-, Brom- oder Fluoratom sein.
Die wirksame Komponente der vorliegenden Erfindung kann ein pharmazeutisch annehmbares Salz bilden, wie zum Beispiel ein Hydrochlorid, Phosphat oder ähnliches. Demgemäß umfaßt die effektive Komponente der vorliegenden Erfindung derartige pharmazeutisch annehmbare Salze der Verbindung von Formel (I).
Die Verbindung, die eine Methylgruppe für R¹ und ein Chloratom für R² in Formel (I) aufweist, ist Enduracidin A, das eine bekannte Verbindung ist.
Von den Enduracidinen, die durch die genannte Formel (I) dargestellt sind und durch das Enduracidin A typisiert sind, das man durch Kultivieren eines Mikroorganismus erhalten hat, wurde berichtet, daß sie als antimikrobielles Mittel oder als Zusatzstoff für Tierfutter aufgrund ihrer antimikrobiellen Aktivität verwendbar sind [JP-OS (ko-kai) 114/1970, JP- OS (ko-kai) 17158/1970, J. Antibiot., 4, 147 (1968) und Berichte von J. Takeda Rcs. Lab. 42, 45 (1984)]. Diese Verbindungen kann man demgemäß mit bekannten Methoden erhalten. Wenn möglich, können sie mit einer vollständig oder teilweise synthetischen Methode hergestellt werden.
Das Enduracidin A und seine Analoga, die prolylendopeptidase-inhibierende Verbindungen sind, verarbeitet man zu Tabletten, Pulvern, Granalien, Kapseln, Injektionslösungen, Inhalationsmittel oder Mittel zur äußeren Anwendung gemäß üblichen Methoden. Man kann sie klinisch oral oder parenteral als Mittel gegen Amnesie, Vorbeugungs- oder Heilmittel gegen AIDS oder Anti-HIV-Mittel verabreichen. Eine Dosis variiert in Abhängigkeit von den Symptomen des Subjektes und der Art und Weise, in welcher das Arzneimittel verabreicht wird, obwohl üblicherweise eine Menge von 1 mg bis 10 mg pro Tag an einen Erwachsenen einmal täglich oder unterteilt mehrere Male pro Tag verabreicht wird.
Enduracidin A ist eine niedrig toxische Verbindung. Seine akute Toxizität LD&sub5;&sub0;, die an Mäusen durch intraperitoneale Injektion und an Ratten durch intravenöse Injektion erkannt wurde, ist, wie berichtet, größer als 400 mg/kg bzw. 300 mg/kg (JP-OS (ko-kai) 114/1970 und JP-OS (ko-kai) 17158/1970).

Beispiele

Reinigungsmethode

Enduracidine wurden hergestellt durch einen Mikroorganismus, der das Antibiotikum B- 4577-m erzeugt und zum Genus Streptomyces gehört, durch einen Mikroorganismus B-5477 (IFO-12439, ATCC-21013) der zum Streptomyces fungicidix gehört, oder durch andere Mikroorganismen, die verschiedene Charakteristika hinsichtlich des Mediums aufweisen und auf natürliche Weise oder künstlich mutativ sind. Die Herstellung, Isolierung und Reinigung wurden gemäß einer Methode durchgeführt, die in J. Antibiot., 4, 138 (1968) beschrieben ist.

Herstellung der Zusammensetzung

Hydrochloride von Enduracidinen sind leicht löslich in Wasser und Methanol. Demgemäß kann man sie als Injektionszubereitung verwenden, indem man sie in physiologischer Kochsalzlösung für Injektionszwecke löst.
Sie können auch zu Tabletten zusammen mit anderen Bestandteilen verarbeitet werden. Ein Beispiel für einen Ansatz, den man zu Tabletten verarbeiten kann, ist nachstehend gegeben. Enduracidin A Hydroxypropylmethylcellulose (HPC) Lactose Magnesiumstearat Gesamt
Eine Tablettenzubereitung, die die genannten Komponenten in den oben angegebenen Mengen enthielt, stellte man her, indem man diese Komponenten mischte und die Mischung tablettierte.
Enduracidin A, das die Verbindung mit einer Aktivität zur Hemmung von Prolylendopeptidase in der vorliegenden Erfindung ist, hat die nachstehenden physiologischen Charakteristika.

1) Hemmende Aktivität auf Prolylendopeptidase

Die hemmende Aktivität von Enduracidin A maß man unter Verwendung einer Methanollösung dieser Verbindung. Als ein Ergebnis stellte man fest, daß die Konzentration für eine 50 %-ige Reaktionshemmung von Prolylendopeptidase gewonnen aus menschlicher Plazenta 0,52 µg/ml (0,22 µMol/l) betrug, wenn man 0,04 mmol/l Z-Gly- Pro-7AMC als Substrat verwendete. In der gleichen Reaktion zeigte ein Enzym, das man aus einem Mikroorganismus Flavobacterium (0,00085 Einheiten/ml) gewonnen hatte, eine Konzentration der 50 %-igen Reaktionshemmung, nämlich 24 µg/ml (10 µMol/l). Demgemäß wurde festgestellt, daß Enduracidin A eine viel höhere Spezifität gegenüber dern Enzym zeigt, das man aus menschlicher Plazenta gewonnen hat (siehe Tabelle 1 unten). Andererseits zeigten SNA-115, das eine natürlich vorkommende Verbindung ist, und Z-Pro-Prolinol, welches ein synthetischer Inhibitor ist, wobei beide dafür bekannt sind, daß sie eine hemmende Aktivität auf Prolylendopeptidase haben, fast den gleichen Grad an Hemmungsaktivität sowohl auf das Enzym, das aus menschlicher Plazenta gewonnen wurde, als auch auf das Enzym, das aus Flavobacterium gewonnen wurde. Staurosporin, wovon bekannt ist, daß es das Enzym hemmt, welches aus Flavobacterium gewonnen wurde [Agric. Biol. Chem., 54, 3021 bis 3022 (1990)], zeigt im Gegensatz zu Enduracidin A eine sehr schwache hemmende Aktivität auf das Enzym, das man aus menschlicher Plazenta gewonnen hatte. Daher nahm man an, daß man die Spezifität der Hemmung des Enzyms, welches aus menschlicher Plazenta gewonnen wurde, ein Charakteristikum ist, das Enduracidin A innewohnt. Tabelle 1 Hemmende Aktivität verschiedener Verbindungen auf Prolylendopeptidase gewonnen aus menschlicher Placenta und Prolylendopeptidase gewonnen aus Flavobacterium Verbindung menschliche Plazenta Flavobacterium Enduracidin A Z-Pro-Prolinol Staurosporin
Reaktionen des Enzyms aus menschlicher Plazenta und Enduracidin A führte man durch, indem man die Menge des Substrates und die Konzentration von Enduracidin A veränderte. Den Modus der Hemmung untersuchte man durch den Dixon Plot, um festzustellen, daß Fnduracidin A eine nicht kompetitive Inhibition mit Ki = 0,6 µg/ml (0,25 µMol/l) zeigte (siehe Figur 1).
Die Hemmungsaktivität auf Prolylendopeptidase in der vorliegenden Erfindung maß man mit der folgenden Methode. Prolylendopeptidase aus menschlicher Plazenta stellte man gemäß der Methode zur Herstellung von Aromatase her [Chem. Pharm. Bull., 38 2834 bis 2837 (1990)], wobei man Cytosol-Fraktionen verwendete, aus denen man Microsom- Fraktionen (Aromatase-Fraktionen) entfernt hatte. Insbesondere entfernte man die menschliche Plazentamembran und wusch die zurückbleibenden Gewebe mit 1,1 %-iger KC1, um das Blut daraus zu entfernen. Die Plazentagewebe pulverisierte man und homogenisierte sie mit einer 67 mmol/l Kaliumphosphat-Pufferlösung (pH-Wert 7,5) mit einem Gehalt von 5 mmol DTT und 0,25 Mol Saccharose. Die homogenisierte Lösung zentrifugierte man bei 10.000 x g 30 min, um eine überstehende Flüssigkeit zu erhalten. Die überstehende Flüssigkeit unterwarf man einer Ultrazentrifugierung bei 104.000 x g 60 min, wodurch man eine überstehende Flüssigkeit erhielt, woraus die Microsom- Fraktionen entfernt worden waren, als eine Prolylendopeptidase-Fraktion. Dieses rohe Enzym stellte man auf eine Proteinkonzentration von 27,3 mg/ml ein, pipettierte es zu 1 ml-Portionen und lagerte es bei -20 ºC.
Um die Enzymreaktion durchzuführen, löste man 0,01 ml jeder Probe in Methanol in verschiedenen Konzentrationen, gab 0,01 ml der Plazenta-Cytosolfraktion zu 0,96 ml einer 0,1 m Tris-HCL-Pufferlösung (pH-Wert 7,0), mischte die erhaltene Lösung und inkubierte bei 37 ºC 5 min. Die Reaktion inituerte man durch Zugabe von 0,02 ml einer 2 mmol/l Lösung eines synthetisierten Substrates, Z-Gly-Pro-7-AMC (ein Produkt von Cambridge Research Biochemicals), gelöst in 40 %-igem Dioxan zur genannten Lösung, und setzte 10 min lang bei 37 ºC fort. Nach der Reaktion gab man 0,5 ml eines reaktionsbeendenden Mittels (10 g Triton X-100/95 ml, 1 m Acetat-Pufferlösung, pH-Wert 4,0) und 2 ml Wasser zu, um 7-AMC (7-Amino-4-methylcumarin), das durch die Reaktion freigesetzt wurde, bei einer Anregungswellenlänge von 380 nm und einer Emissionswellenlänge von 460 nm zu messen.
Andererseits gab man zur Ausführung der Reaktion des Enzyms, gewonnen aus Flavobacterium, 0,01 ml jeder Probe, gelöst in Methanol in verschiedenen Konzentrationen und 0,01 ml (0,085 Einheiten/ml) Prolylendopeptidase (ein Produkt von Seikagaku Kogyo Co.) gelöst in 0,1 m Tris-HCL-Pufferlösung (pH-Wert 7,0) zu 0,96 ml einer 0,1 m Tris- HCL-Pufferlösung (pH-Wert 7,0), mischte die erhaltene Lösung und inkubierte bei 37 ºC 5 min. Die Reaktion initiierte man durch Zugabe von 0,02 ml einer 2 mmol/l Lösung synthetischen Substrates, Z-Gly-Pro-7-AMC, gelöst in 40 %-igem Dioxan, zur genannten Lösung und setzte 10 min bei 37 ºC fort. Nach der Reaktion gab man 0,5 ml eines reaktionsbeendenden Mittels (10 g Triton X-100/95 ml, 1 m Acetat-Pufferlösung, pH-Wert 4,0) und 2 ml Wasser zu, um das 7-AMC, das durch die Reaktion freigesetzt wurde, bei einer Anregungswellenlänge von 380 nm und einer Emissionswellenlänge von 460 nm zu messen.
Die Hemmungsrate bestimmte man mit der Formel [(A-B)/A] x 100 (%), worin A eine Fluoreszenzkonzentration von freigesetztem 7-AMC in der Reaktion der Kontrollprobe und B eine Fluoreszenzkonzentration des freigesetzten 7-AMC in der Reaktion repräsentieren, zu welcher man die Probe zugegeben hatte.
Enduracidin A und seine Analoga zeigen eine hemmende Aktivität auf Prolylendopeptidase, gewonnen vom Menschen mit einer höheren Spezifität als übliche bekannte Prolylendopeptidase-Inhibitoren und bei einer geringeren Menge. Ferner können sie nicht-kompetitiv auf das Enzym wirken. Dadurch sind sie für die Heilbehandlung von Amnesie wirksam.

Claims

1. Verwendung der folgenden Verbindung (I)

worin R¹ eine Alkylgruppe darstellt, R² ein Halogenatom oder ein Wasserstoffatom ist, Ala einen Alanin-Rest bedeutet, Thr einen Threoninrest bedeutet, Orn einen Ornithinrest bedeutet, Ser einen Serinrest bedeutet und Gly einen Glycinrest bedeutet, D den Typ D bezeichnet und a = allo ein Stereoisomeres bezeichnet;

oder eines ihrer therapeutisch annehmbaren Salze für die Herstellung eines therapeutischen Mittels zur Inhibition einer Prolylendopeptidase-Aktivität in einem Patienten bzw. Subjekt.

2. Verwendung der Verbindung (I) gemäß Anspruch 1 oder eines ihrer therapeutisch annehmbaren Salze zur Herstellung eines therapeutischen Mittels zum Heilen oder Vorbeugen bei Amnesia.