DE102005049537B4

DE102005049537B4 - Verfahren zur Herstellung zyklischer Peptide und Verwendung der derart hergestellten zyklischen Peptide

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Publication number: DE102005049537B4
Application number: DE200510049537
Authority: DE
Inventors: Parvesh Wadhwani; Anne Prof. Dr. Ulrich; Sergij Afonin
Original assignee: Forschungszentrum Karlsruhe GmbH
Current assignee: Karlsruher Institut fuer Technologie KIT
Priority date: 2005-10-17
Filing date: 2005-10-17
Publication date: 2010-04-22
Anticipated expiration: 2025-10-18
Also published as: DE102005049537A1

Abstract

Verfahren zur Herstellung zyklischer Peptide mit der allgemeinen Formel cyclo-(X–Y) wobei Y die C-terminale Startaminosäure ist und X eine Aminosäuresequenz umfassend mindestens 2 bis 21 Aminosäuren umfassend folgende Schritte,
A – Peptidsynthese von linearen Peptiden, enthaltend die Sequenz des zyklischen Peptids, beginnend mit der Staaminosäure (Y) L- oder D-Phe am Harz für den weiteren Kettenaufbau,
und
B – Vorlegen der linearen Peptide in Lösung
und
C – Zyklisierung einer Anzahl von linearen Peptiden in Lösung jeweils in sich.

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung zyklischer Peptide mit der allgemeinen Formel cyclo-(X-Y) wobei Y die C-terminale Startaminosäure ist und X eine Aminosäuresequenz umfassend mindestens 2 bis 21 Aminosäuren umfassend folgende Schritte, A – Peptidsynthese von linearen Peptiden, enthaltend die Sequenz des zyklischen Peptids, beginnend mit einer der Startaminosäuren (Y) L- oder D-Phe am Harz für den weiteren Kettenaufbau und B – Vorlegen der linearen Peptide in Lösung und C – Zyklisierung einer Anzahl von linearen Peptiden in Lösung jeweils in sich, und die Verwendung der derart hergestellten zyklischen Peptide gemäß den Patentansprüchen.
Viele unterschiedliche Organismen nutzen kationische, amphiphile antimikrobielle Peptide als primäre Verteidigungslinie, um gegen eine bakterielle Infektion anzukämpfen. Viele andere Peptide und Peptidantibiotika mit zyklischem Aufbau, wie z. B. Tyrocidine, Streptocidine und Loloatine besitzen auch eine Haarnadel-Struktur mit zwei gegenüberliegende β-Schleifen (beta-Schleifen), welche aus Prolin und einer D-Aminosäure bestehen. Ein gut untersuchter Repräsentant solcher Peptide ist das Dekapeptid Gramicidin S (GS), welches nicht-ribosomal durch Bacillus brevis hergestellt wird. Es hat ein zyklisches Peptidgrundgerüst mit zwei kurzen, antiparallelen β-Strängen, welche durch zwei aus ^DPhe-Pro gebildete β-Schleifen verbunden sind [cyclo-(^DPhe-Pro-Val-Orn-Leu)₂]. Die Struktur wird durch 4 zwischen den Strängen ausgebildete Wasserstoffbrückenbindungen stabilisiert. Selbst 60 Jahre nach seiner Entdeckung weckt GS immer noch das Interesse von Chemikern und Biologen im Bestreben seine Wirkungsweise auf Membranen zu verstehen. Obwohl sich mehrere NMR-, CD-, sowie spektroskopische und biophysikalische Untersuchungen mit der Struktur des Peptids in Lösung oder in Lipidmembranen befasst haben, herrscht immer noch keine Klarheit darüber, wie GS mit biologischen Membranen interagiert. NMR-Experimente erforderten kostengünstig große Mengen mehrerer GS-Analoga, welche mit verschiedenen NMR-Isotopen (¹³C, ¹⁵N, ²H) markiert werden. Die kommerzielle Produktion von GS ist seit einigen Jahren aus Kostengründen eingestellt worden. GS wirkt nicht nur gegen Bakterien und Pilze, sondern verursacht auch eine Lyse von eukaryotischen Zellmembranen, wie z. B. bei Erythrozyten und diese hämolytische Nebenwirkung hat bisher seine pharmazeutische/topische Anwendung limitiert. Im Bestreben eine GS-Variante mit einem verbesserten therapeutischen Index kostengünstig zu erhalten, wurden viele unterschiedliche GS-Analoga synthetisiert. Durch Variation der Ringgröße (6–14 Aminosäurereste) und die Substitution einiger Aminosäuren durch ihre D-Formen besteht die Aussicht ein GS-Analogon mit weniger hämolytischen Eigenschaften zu erhalten. Solch ein therapeutisches GS-Analogon mit deutlich geringerer Membran zerstörender Aktivität und höherer Membran-Translokation, könnte Anwendung als ein Zell penetrierendes Transporter Molekül für Aufnahme von pharmazeutischen Wirkstoffen finden. Berichte über die Synthese von GS und seiner Analoga, zeigen, dass die Gesamtausbeute aber im Gegensatz zu den Erwartungen sehr gering ausfällt. In vielen Fällen ist die Zyklisierung des linearen Vorläuferpeptids der am wenigsten effektive Schritt. Beispielsweise wurden auf biomimetische Art in einem von Tamaki et al. beschriebenen Protokoll, Pentapeptid-aktivierte Ester dimerisiert und zyklisiert, wobei sich eine Gesamtausbeute von 38% ergab¹. Die meisten GS-Synthesen wurden in der Vergangenheit entweder in Lösung oder in Festphase mittels t-Boc-Schutzgruppen-Protokollen durchgeführt. Nur wenige neuere Arbeiten (Bu et al.² und Wu et al.³) nutzen Fmoc-Protokolle, jedoch liegen die Ausbeuten nicht über 25%. Beide Methoden beginnen die Synthese mit einem Syntheseharz, welches mit Fmoc-Leu vorbeladen ist und beinhalten einen zusätzlichen Schritt, entweder Cyanomethylierung oder enzymatische Zyklisierung, wobei aber keine Verbesserung der Ausbeute an GS erreicht wird. Kürzlich vorgestellte auf Fmoc-Schutzgruppen basierende Protokolle, welche die Synthese auch mit Fmoc-Leu starten, bieten einen attraktiven Weg höhere Ausbeuten an GS und seiner zuckerhaltigen Analoga zu erzielen^4,5. Aus den Druckschriften WO 98/04584 (SEATEK MARINE BIOTECHNOLOGY, INC. [CA7CA] und UNIVERSITY OF BRITISH COLUMBIA [CA/CA]) und WO 98/16459 (PENCE, INC. [CA/CAS]) sind zyklische Peptide und deren Verwendung als Pharmazeutika bekannt, ein Verfahren zur Herstellung unter Auswahl spezifischer Startaminosäuren am Träger für den weiteren Kettenaufbau, um eine anschließende Zyklisierung mit hoher Zyklisierungsausbeute zu erhalten, wird nicht offenbart. Die kostengünstige chemische Synthese mit hoher Ausbeute ist daher der einzig gangbare Weg eine solch große Vielfalt von zyklischen Peptid-Analoga zu produzieren, speziell wenn gewisse D-Aminosäuren, Zuckerderivate oder andere Modifikationen in das Molekül inkorporiert werden müssen.
Die vorliegende Erfindung stellt eine Lösung der oben aufgeführten Probleme da.
Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zur Herstellung zyklischer Peptide, vorzugsweise mit zwei gegenüberliegende beta-Schleifen ([3-Schleifen), oder zyklische Peptidantibiotika oder deren Derivate oder Analoga, mittels einer kostengünstigen und chemisch-präparativ ausgerichteten Synthese, mit hoher Ausbeute, zur Verfügung. Die Erfindung beschreibt eine einfache und in hohem Grade leistungsfähige Peptidsynthese zur Herstellung eines zyklischen Peptids und seiner verschiedenen Analoga oder Derivate, mittels Kupplungsreagenzien und einer minimalen Anzahl an Reinigungsschritten. Die vorliegende Erfindung umfasst ein Verfahren zur Herstellung zyklischer Peptide oder deren Derivate oder Analoga mit der allgemeinen Formel cyclo-(X-Y) wobei Y die C-terminale Startaminosäure ist und X eine beliebige Aminosäuresequenz umfassend mindestens 2 bis 21 Aminosäuren. Peptidsynthese ausgehend von linearen Peptiden, enthaltend die Sequenz des zyklischen Peptids, beginnend mit der Startaminosäuren (Y) L- oder D-Phe am Harz für den weiteren Kettenaufbau.
Fmoc-Festphasenpeptidsynthese: Fmoc (9-Fluorenylmethoxycarbonyl) wird in der Festphasen-Peptidsynthese besonders als temporäre N-Terminus-Schutzgruppe verwendet. Die Synthese des linearen Peptids wird nach der von Merrifield 1963 entwickelten Festphasensynthese an einem unlöslichen, polymeren Harz durchgeführt. Als Linker dient Tritylchlorid. Der Trityl-Linker ermöglicht es, das lineare Peptid vom Harz abzuspalten, ohne dass dabei die permanenten Schutzgruppen beeinträchtigt werden. Die Peptid-Synthese erfolgt nach der Fmoc-Strategie. Nach dem Abspalten der linearen Vorläuferpeptide vom Harz folgt Zyklisierung, am Ende der Synthese erfolgt Abspaltung der permanenten Schutzgruppen z. B. Dde.
Ablauf der Peptid-Festphasensynthese:

1. Anhängen der Aminosäure an das Harz. Synthese von linearen Peptiden, enthaltend die Sequenz des zyklischen Peptids, beginnend mit einer der folgenden Startaminosäuren (Y) L- oder D-Phe, oder deren Derivate oder Analoga, beginnend mit der Aminosäure als Startaminosäure (Y) die am weitesten von den Aminosäuren, welche die erste β-Schleife in der Sequenz des zyklischen Peptids bilden, entfernt ist
2. Entfernen der Aminoschutzgruppe (Fmoc-Entschützung)
3. Kupplung durch Aktivierung z. B. mit HCTU/CI-HOBt
4. Wiederholung der Schritte 2 und 3
5. Ablösen des geschützten Peptids von der Festphase, z. B. Harz.
6. Isolieren, z. B. herstellen eines Präzipitats, und optional ein Trocknungsschritt der linearen Peptide.
7. Vorlegen der linearen Peptide in Lösung.
8. Zyklisierung einer Anzahl von linearen Vorläuferpeptiden in Lösung jeweils in sich
9. Abspaltung der Dde-Gruppen

Anhängen der ersten Aminosäure (Fmoc-D-Phe) ans Harz:
Die Reaktion erfolgt in wasserfreiem DCM unter Zugabe eines tertiären Amins (DIPEA) als Base unter Ausbildung eines Tritylesters. Der N-terminale Fmoc-Schutz bleibt unter diesen Reaktionsbedingungen erhalten.
Fmoc-Entschützung:
Diese Reaktion erfolgt mit der Base Piperidin (20–25% Piperidin in NMP)
Kupplung:
Kupplungsmethode in der Fmoc-SPPS ist die Aktivester-Methode, welche entweder über eine Voraktivierung der Carbonsäuregruppe oder eine in-situ-Aktivierung abläuft. Die Kupplung der N-Fmoc-Aminosäure erfolgt nach der HCTU/CI-HOBt-Methode mit der Base DIPEA in N-Methylpyrrolidon (NMP). Durch die Zugabe von DIPEA wird die Aminosäure und das HOBt neutralisiert bzw. deren Nukleophilie erhöht. Unter diesen Reaktionsbedingungen wird intermediär der Aktivester von CI-HOBt der NFmoc-Aminosäure erhalten, der von der am Harz befindlichen freien Aminofunktion nukleophil angegriffen wird somit entsteht die Amidbindung.
Wiederholung der Schritte 2 und 3:
Wiederholung der Fmoc-Entschützung und der Kupplung bis das lineare Vorläuferpeptide vollständig synthetisiert ist.
Ablösen des geschützten Peptids von der Festphase:
Die Bindung des linearen Vorläuferpeptids an den Trityl-Linker wird bereits mit einer schwachen Säure (Essigsäure oder TFA) gebrochen. Die Abspaltung vom Harz gelingt somit ohne die ebenfalls säurelabilen, permanenten Schutzgruppen des Dde.
Zyklisierung des linearen Vorläuferpeptids:
Die Zyklisierung des linearen Vorläuferpeptids erfolgt nach der PyBOP/HOBt-Methode mit der Base DIPEA in DCM.
Abspaltung der Dde-Gruppen:
Die Dde-Gruppe wird mit 2% Hydrazin in THF entfernt.
Bei der Herstellung der linearen Vorläuferpeptide ergaben sich bei einer systematischen Permutation der Startaminosäure innerhalb der zyklischen Peptidsequenz verschiedene Produktausbeuten zwischen 51% und 93%. Auch der nachfolgende Zyklisierungsschritt ergab wiederum abhängig von der Startaminosäure stark variierende Ausbeuten zwischen 26% und 74%. Die Neigung zur Zyklisierung des jeweiligen Vorläuferpeptids lässt sich mit seiner Tendenz eine vororganisierte Konformation einzunehmen, korrelieren. Dies konnte an Hand von Zirkulardichroismus-Untersuchungen bestätigt werden. Die Gesamtausbeute, konnte durch ^DPhe als Startaminosäure von 20% bis auf 69% gesteigert werden. Die Wahl des Kupplungsreagenzes und des Gegenions spielt hierbei nur eine marginale Rolle. Mit dem optimierten Synthese, welches nur einfache Kupplungsreaktionen beinhaltet und keine Zwischenaufreinigungsstufen erfordert, wurden zyklische Peptide oder zyklische Peptid-Analoga, welche ¹⁹F-markierte Phenylglycin-Derivate und/oder ¹⁵N-markierte Aminosäuren enthielten, synthetisiert werden. Solche Phenylglycin-Derivate haben eine starre Verbindung zum Peptid-Rückgrat und dienen somit zur Analyse der räumlichen Orientierung eines Peptids in biologischen Systemen. Diese werden zur Strukturaufklärung der Peptide und ihrer Orientierung in Lipidmembranen mittels Festkörper-NMR verwendet.
Beispiel:
Gramicidin S (3) wurde mittels FPPS (Schritte i und ii (1)) synthetisiert. Reagenzien und experimentelle Bedingungen: (i) Harzbeladung: Startaminosäure (hier Fmoc-DPhe-OH), DiPEA, CH₂Cl₂, 2 h; (ii) Standard Fmoc-Festphasen-Peptidsynthese: 9 Zyklen; Entfernung der Schutzgruppe: 22% Piperidin in DMF, 30 min.; Kupplung: Fmoc-Aminosäure (4 Äquivalente (äq.), HCTU (3.9 Äquivalente), CI-HOBt (4 Äquivalente), DiPEA (8 Äquivalente), 2 h; (iii) Spaltung des Produkts vom Harz: TFA/i-Pr₃SiH/H₂O (92.5/5/2.5 v/v), 3.5 h; (iv) Zyklisierung: 1 mg/ml in DCM, PyBOP (3 equiv), HOBt (3 equiv), DiPEA (6 equiv), CH₂Cl₂, 20 h; (v) N₂H₄4 (2% in THF), 16 h.

Zunächst, wurde eine Serie verschiedener linearer Vorläuferpeptide 1a–e
1a = H-[Pro-Val-Orn(dde)-Leu-^DPhe-]₂-OH
1b = H-[^DPhe-Pro-Val-Orn(dde)-Leu-]₂-OH [nicht erfindungsgemäß]
1c = H-[Leu-^DPhe-Pro-Val-Orn(dde)-]₂-OH [nicht erfindungsgemäß]
1d = H-[Orn(dde)-Leu-^DPhe-Pro-Val-]₂-OH [nicht erfindungsgemäß]
1e = H-[Val-Orn(dde)-Leu-^DPhe-Pro-]₂-OH [nicht erfindungsgemäß]
individuell aufgebaut und nachfolgend vom Harz abgespalten. Die Hauptmenge jedes Rohprodukts wurde direkt ohne eine Zwischenreinigung zyklisiert und die Schutzgruppen vom Ornithin-Rest entfernt (Schritte iv und v (2)), um das gewünschte Endprodukt GS zu erhalten. Das nach der Zyklisierung erhaltene Produkt zeigt alle schon früher in der Literatur beschriebenen, charakteristischen analytischen und spektroskopischen Eigenschaften^3,4,6. In früheren Arbeiten wurde berichtet, dass die linearen Vorläuferpeptide nur nach Entfernung der Schutzgruppen an den δ-NH₂-Gruppen biologisch aktiv sind. Daher wurde auch in der vorliegenden Arbeit die orthogonale 1-(4,4-di-Methyl-2,6-dioxocyclohex-1-yliden)ethyl (Dde)-Schutzgruppe von 1a–e entfernt, um die Schutzgruppenfreien linearen Vorläuferpeptide 2a–e
2a = H-[Pro-Val-Orn-Leu-^DPhe-]₂-OH
2b = H-[^DPhe-Pro-Val-Orn-Leu-]₂-OH [nicht erfindungsgemäß]
2c = H-[Leu-^DPhe-Pro-Val-Orn-]₂-OH [nicht erfindungsgemäß]
2d -= H-[Orn-Leu-^DPhe-Pro-Val-]₂-OH [nicht erfindungsgemäß]
2e = H-[Val-Orn-Leu-^DPhe-Pro-]₂-OH [nicht erfindungsgemäß]
für biologische Aktivitätstests und CD-Messungen zur Verfügung zu haben. Neben dem Wildtyp-Peptid wurden auch die Analoga 3–8 synthetisiert,
3 = Leu → 4F-Phg; Val → ¹⁵N-Val
4 = Val → 4F-Phg; Leu → ¹⁵N-Leu
5 = Leu → 4CF₃-Phg
6 = Val → 4CF₃Phg
7 = Leu → 4CF₃-Phg; Orn → Lys
8 = Val → 4CF₃-Phg; Orn → Lys
bei denen spezifische hydrophobe Aminosäurereste durch 4F-Phg, 4CF₃-Phg und/oder ¹⁵N-markiertes Leu oder Val ersetzt wurde (1). Bei einigen GS-Analoga wurde der hydrophile Orn-Rest durch Lys ersetzt, hierdurch ändern sich die antimikrobiellen Eigenschaften von GS nicht. Die jeweiligen Ausbeuten an linearen und zyklischen Peptiden, sowie der zugehörige Reinheitsgrad wurden quantitativ mit analytischer HPLC bestimmt. Diese sind Tabelle 1 zu entnehmen. Tabelle 1: Charakterisierung der stufenweisen Ausbeuten bei der Synthese von 1a–e

Vorläufer Peptid	Startaminosäure	Retentionszeit t_R ^a (min)	Reinheit ^b (%)	Ausbeute an linearem Peptid^c (%)	Zyklisierungsausbeute ^d(%)	Gesamt ausbeute ^e(%)
1a	^DPhe	18.1	95	93	74	69
1b*	Leu	15.8	68	67	46	31
1c*	Orn(dde)	15.8	70	64	26	17
1d*	Val	15.4	89	88	55	48
1e*	Pro	17.6	64	51	41	21

^aHPLC Retentionszeit des Peaks mit der korrekten Masse. ^bVerhältnis der Peakfläche mit der korrekten Masse im Verhältnis zur Gesamtfläche zwischen 5–20 min. Retentionszeit im HPLC-Chromatogramm, ^ckorrigierte Ausbeute des linearen Vorläuferpeptids (berechnet relativ zur jeweiligen Harzbeladung) ^dAusbeute beim Zyklisierungsschritt per se, d. h. die Menge an zyklischem Gramicidin S (Reinheit > 95%) relativ zu der Menge an linearem Peptid. ^eAusbeute an GS für die gesamten Syntheseschritte relativ zur Harzbeladung (berechnet durch Multiplikation der jeweiligen Ausbeute an linearem Peptid mit der Aubeute an zyklischem Peptid). *nicht erfindungsgemäße Beispiele

Hierbei ist anzumerken, dass die jeweiligen Spalten separat die Ausbeute an linearem Produkt und die Ausbeute des Zyklisierungsschrittes per se wiedergeben. Die Gesamtausbeute des Endproduktes (letzte Spalte) wird dann erhalten, indem man die zwei gerade erwähnten Prozentausbeuten miteinander multipliziert. Diese Spalte gibt also die Ausbeute an zyklischem GS im Verhältnis zur Beladung des Harzes an.
In der vorliegenden Erfindung wird die Abhängigkeit der Ausbeuten von der ersten Aminosäure mit der die Synthese beginnt (Startaminosäure), systematisch für zwei unterschiedliche Harztypen aufgezeigt. Dies ist nach unserem Wissensstand bisher nicht verglichen worden. Die meisten der bisher entwickelten GS-Synthesen benutzten allgemein zugängliche Harze, welche mit Fmoc-geschütztem Leu, Val oder in einigen Fällen Pro beaufschlagt waren. In unserem Ansatz wurde das Harz mit allen fünf möglichen Fmocgeschützten Aminosäuren aus der GS-Sequenz (Pro, Val, Orn, Leu und ^DPhe) beladen, um die jeweiligen Ausbeuten der linearen Vorläuferpeptide 1a–e zu vergleichen. Nachdem die linearen Sequenzen zunächst auf einem Wang-Harz und später auf einem 2-Chlortritylchlorid-Harz synthetisiert worden waren, zeigte sich, dass die Wahl des Harzes keinen signifikanten Unterschied in den Ausbeuten ergibt. Das 2-Chlortritylchlorid-Harz wurde ursprünglich gewählt, um die Bildung von Diketopiperazin zu vermeiden, falls Pro als Startaminosäure benutzt wird, die nachfolgenden Synthesen (3–8) wurden aber dann auch mit diesem Harz durchgeführt. Bei allen der fünf untersuchten Startaminosäuren wurde die Effizienz zweier unterschiedlicher Kupplungsreagenzien systematisch getestet. Die hierbei eingesetzten Reagenzien waren 2-(1H-6-Chlorbenzotriazol-1yl)-1,1,3,3-tetramethyluroniumhexafluorphosphat (HCTU) und 2-(7-Azabenzotriazol-1yl)-1,1,3,3-tetramethyluroniumtetrafluorborat (TATU). HCTU wurde verwendet, da es eines der kostengünstigsten Kupplungsreagenzien ist, während TATU in vielen Fällen als eines der effizientesten Reagenzien angesehen wird. Die Ausbeuten an 1a–e waren bei Einsatz von HCTU durchweg höher (51%–93%,) als bei Verwendung von TATU (41%–86%). Daher ist vorzugsweise HCTU zu verwenden.
Betrachtet man die in Tabelle 1 angeführten Ausbeuten so fällt auf, dass die Ausbeuten an 1a–e in Abhängigkeit von der Startaminosäure systematisch voneinander abweichen. Unabhängig vom eingesetzten Kupplungsreagenz ergeben sich höhere Ausbeuten, wenn die Aminosäuresequenz mit ^DPhe oder Val begonnen wird, als bei Pro, Orn oder Leu. Diese Beobachtungen liefern einen ersten Anhaltspunkt für eine Optimierung der GS-Synthese. Die speziell im Falle von ^DPhe erhaltene hohe Ausbeute spiegelt eine günstige Konstellation wieder, bei der das terminale Ende der wachsenden Sequenz während aller hintereinander folgenden Kupplungsschritte frei zugänglich ist.
Nachdem das jeweilige lineare Peptid vom Harz abgespalten war, wurde die Zyklisierung des lyophilisierten Rohpeptides in flüssiger Phase durchgeführt, ohne eine dazwischen geschaltete Aufreinigung. Abhängig von der ersten Aminosäure, die nach der Abspaltung nun das freie C-terminale Ende des linearen Vorläuferpeptids bildet, wurde auch eine deutliche Variation in den Zyklisierungsausbeuten beobachtet, welche bei Werten zwischen 26% und 74% lagen. Die entsprechenden Daten in Tabelle 1 zeigen, dass dieser Faktor wohl einen der wichtigsten Schritte bei der GS-Synthese darstellt, wobei ^DPhe die beste und Orn die ungünstigste Startposition ist.
Nachdem ^DPhe sich als beste Startaminosäure herausgestellt hatte, wurden die Kupplungsreagenzien variiert und der Effekt des jeweiligen Gegenions untersucht. Unter den drei Hauptklassen an Kupplungsreagenzien (symmetrischen Anhydriden, OBt-Estern und Säurefluoriden) wurden nur OBt-Ester verwendet. Symmetrische Anhydride erfordern zwei Äquivalente an geschützter Aminosäure, wodurch die Synthese beim Einbau von teuren Isotopenmarkierungen nicht mehr ökonomisch durchzuführen ist. Der Einsatz von Säurefluoriden wurde vermieden, da die meisten nicht nur für ihre Bildung sondern auch beim nachfolgenden Kupplungsschritt niedrige Temperaturen benötigen. Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist eine möglichst einfache und effiziente Synthese aufzuzeigen, wurden die aktiven OBt-Ester von HCTU, 2-(1H-6-Chlorbenzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluronium-Tetrafluorborat (TCTU), 2-(1H-Benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluronium-Hexafluorphosphat (HBTU), und 2-(1H-Benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluronium-Tetrafluorborat (TBTU), zusammen mit Benzotriazol-1-yl-oxytripyrrolidinophosphonium-Hexafluorphosphat (PyBOP) bezüglich ihrer Eignung als Kupplungsreagenz verglichen. Der Vorteil von OBt-Estern liegt darin, dass sie wenig zur Razemisierung neigen, effizient und stabil sind und sich für die automatische Peptidsynthese eignen. Auf den Einsatz von 2-(7-Aza-1H-Benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluronium-Hexafluorphosphat (HATU), welches als hocheffizientes Kupplungsreagenz bekannt ist, wurde aus Kostengründen und aufgrund der Tatsache, dass die Ausbeuten an 1a–e bei Verwendung von TATU nicht besser lagen als beim Einsatz von HCTU, verzichtet. Tabelle 2: Ausbeute an 1a mit verschiedenen Kupplungsreagenzien

Peptid Kupplungsreagenz Reinheit ^a (%) Ausbeute ^b (%)

1a HCTU 95 93

1a TCTU 88 86

1a HBTU 88 86

1a TBTU 93 83

1a PyBOP 86 63

^aVerhältnis der Peakfläche mit der korrekten Masse im Verhältnis zur Gesamtfläche zwischen 5–20 min. Retentionszeit im HPLC-Chromatogramm, ^bkorrigierte Ausbeute

Verbindung 1a wurde daher unter Verwendung von HCTU, TCTU, HBTU, TBTU und PyBOP synthetisiert. Die hierbei erzielten Ausbeuten sind in Tabelle 2 aufgelistet. Die Ausbeute an 1a, welches mittels HCTU hergestellt wurde, war im Vergleich zu dem mit dem nicht chlorierten Analogon HBTU synthetisierten Produkt höher. Bei Verwendung von HCTU war die Ausbeute auch höher als bei TCTU. Beide Reagenzien unterscheiden sich nur in ihren PF₆ ^– und BF₄ ^–-Gegenionen. In gleicher Weise lag die Ausbeute an 1a mit HBTU leicht höher als bei TBTU. Das PF₆ ^–-Gegenion scheint daher bezüglich des linearen Vorläuferpeptids etwas bessere Ausbeuten als BF₄ ^– zu geben. Jedoch ist dieser Effekt nicht sehr stark ausgeprägt, verglichen mit dem deutlich höheren Einfluss der Startaminosäure.
Da die verschiedenen linearen Peptidsequenzen somit einen deutlichen Einfluss auf die Zyklisierungsausbeuten hatten, wurde ihre Konformation mittels Zirkulardichroismus-(CD)-Spektroskopie näher untersucht. CD-Spektren der entschützten und gereinigten Vorläuferpeptide 2a–e wurden in verschiedenen Lösungsmitteln (wässrigem Phosphatpuffer sowie in 50% und 100% Trifluorethanol (TFE)) gemessen. Das CD-Spektrum von zyklischem GS in wässrigem Puffer weist in Übereinstimmung mit Literaturdaten stark negative Elliptizitätswerte im Bereich von 206 und 223 nm auf. Die CD-Spektren der linearen Vorläuferpeptide 2a–e in wässrigem Puffer ähneln sich zwar untereinander in starkem Maß, unterscheiden sich aber dagegen deutlich vom zyklischen GS-Spektrum. Diese Peptide zeigen ein Minimum bei 198 nm und substanziell kleinere Elliptizitätswerte im Wellenlängenbereich zwischen 205 und 225 nm, was auf eine weitgehend ungeordnete Struktur hinweist. Ein interessanterer konformativer Trend ergibt sich jedoch bei Betrachtung der in 4 dargestellten Spektren, welche in 50%igem TFE aufgenommen wurden. GS zeigt verglichen mit der wässrigen Pufferlösung einen generellen Anstieg der Elliptizitätswerte verbunden mit einem deutlich ausgeprägteren Minimum bei 206 nm. Währen die CD-Spektren von 2b, 2c und 2d auf eine im wesentlichen ungeordnete Struktur hinweisen, deuten 2a und 2e auf eine deutlich geordnete Struktur hin. Speziell das CD-Spektrum des linearen Vorläuferpeptids 2a mit ^DPhe als (C-terminaler) Startaminosäure ähnelt stark dem Spektrum des zyklischen GS. Beide Spektren zeigen negative Banden bei 206 nm und 220 nm und durchlaufen den Nullwert bei 192 nm. Der Verlauf des CD-Spektrums von 2e hingegen, deutet zwar schon auf eine gewisse geordnete Sekundärstruktur hin, weicht aber von dem des zyklischen GS deutlicher ab. In 100% TFE ähnelt das Spektrum von zyklischem GS mit den beiden negativen Banden bei ca. 206 nm und 220 nm dem von 2a, 2d und 2e, während sich gegenüber 2b und 2c speziell bei kleineren Wellenlängen leichte Unterschiede bemerkbar machen. Diese Serie von CD-Experimenten zeigt, dass unter allen linearen Vorläuferpeptiden, das mit ^DPhe als Startaminosäure die ausgeprägte Tendenz hat, in Lösung (insbesondere in 50% TFE) eine Konformation anzunehmen, welche der Struktur von zyklischem GS sehr ähnlich ist.
Diese auffallende, vororganisierte Konformation, welche sich für das Vorläuferpeptid 2a beobachten lässt, korreliert sehr gut mit seiner hohen Ausbeute beim Zyklisierungsschritt (vgl. Tabelle 1). Mit diesem konformativen Aspekt, welcher kritisch in bezug auf die Synthese zyklischer Peptide ist, hat man sich experimentell bisher nicht befasst. In bisherigen Synthesen wurden üblicherweise zumeist mit Fmoc-Pro-OH; Fmoc-Leu-OH oder Fmoc-Val-OH vorbeladene Harze für die GS-Synthese benutzt, da diese leicht kommerziell erhältlich und preiswert sind (z. B. Faktor 5 billiger als das Fmoc ^DPhe-Harz, während Fmoc-Orn(Dde)-Harz überhaupt nicht kommerziell erhältlich ist). Beim Start einer Synthese ausgehend von einem Harz, welches mit einer dieser drei Aminosäuren vorbeladen ist, erhält man gewöhnlich akzeptable Ausbeuten des jeweiligen linearen Vorläuferpeptids. Falls dieses Peptid jedoch nicht in geeigneter Weise vororganisiert ist, in der Weise, dass sich das C- und N-terminale Ende der Peptidkette in enger räumlicher Nähe befinden, wie in 5 illustriert ist, dann stellt die Zyklisierung den wesentlichen Ausbeute-limitierenden Schritt dar. Der allein gangbare Weg für einen effektiven Zyklisierungsschritt ist die GS-Synthese mit ^DPhe zu beginnen. Wie sich aus Tabelle 1 ersehen lässt, ist ein weiterer Vorteil von ^DPhe, dass auch die Syntheseausbeute an linearem Peptid 1a in diesem Fall am höchsten ist. Dieser synergistische Effekt im Falle von ^DPhe als Startaminosäure, welches sich sowohl auf die linearen Kupplungsreaktionen als auch auf die Zyklisierung positiv auswirkt, führt zu einer drastischen Verbesserung in der Gesamtausbeute an GS auf etwa 70%.
Das Konzept einer vororganisierten Konformation wirft die Frage auf, ob die linearen Peptide irgendeine funktionale Aktivität aufweisen. Die in der Literatur beschriebenen Beobachtungen hinsichtlich solcher linearer GS-Analoga sind widersprüchlich. Daher wurden die antimikrobiellen und hämolytischen Eigenschaften der entschützten linearen Vorläuferpeptide 2a–e systematisch bestimmt. Die antimikrobielle Aktivität wurde an Hand der minimalen Hemmkonzentration (minimal inhibitory concentration (MIC)) gegenüber einem Gram-positiven (Bacillus subtilis ATCC 6633) und einem Gram-negativen Bakterienstamm (Escherichia coli DH5α) beurteilt. Gram-positive Bakterien sind üblicherweise empfindlicher gegenüber GS als Gram-negative, wobei MICs von 0.7 μM bzw. 11 μM erhalten werden. Für die linearen Vorläuferpeptide 2a–e ergab sich unabhängig vom Typ des Bakterienstammes bis zu einer Konzentration von 80 μM fortgesetztes Bakterienwachstum. In ähnlicher Weise verursacht GS 50% Hämolyse menschlicher Erythrozyten bei einer Konzentration von 12 μM, aber keines der linearen Vorläuferpeptide zeigt bis hinauf zu Konzentrationen von 36 μM irgendwelche Aktivität. Dies macht deutlich, dass GS zyklisch sein muss, um biologische Aktivität zu besitzen. Dieses Ergebnis erinnert an das antimikrobielle Peptid Protegrin-1 mit einer β–Haarnadel-Struktur, welches durch zwei intramolekulare Disulfidbrücken in einer zyklischen Struktur stabilisiert wird. Diese beiden Verbindungsglieder sind für die biologische Aktivität erforderlich, da aufgezeigt wurde, dass die linearen Analoga ebenfalls inaktiv sind. In gleicher Weise werden die antiparallelen β-Stränge von Tachyplesin durch zwei Disulfidbrücken zusammen gehalten und die linearen Derivate sind inaktiv. Nur wenn eine Vororganisation der linearen Tachyplesin-Analoga durch Aufeinanderstapelung aromatischer Reste über nicht-kovalente Bindungen induziert wird, konnte bei einigen Derivaten biologische Aktivität hergestellt werden.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass bei der Synthese von Peptiden mit zyklischer Struktur der Peptidkette, wie z. B. bei GS, die Wahl der Startaminosäure von herausragender Bedeutung ist und die Gesamtausbeute entscheidend beeinflussen kann. Dies ergibt sich aus dem Zusammenspiel zweier unabhängiger Faktoren: 1.) aus der Ausbeute bei den Kupplungsreaktionen der linearen Vorläuferpeptide und 2.) aus der Effizienz des Zyklisierungsschrittes. Im Falle von GS, potenzieren sich beide Faktoren gegenseitig und führen zu einer optimalen Ausbeute bei beiden Schritten, falls ^DPhe als Startaminosäure eingesetzt wird. Der erste Faktor scheint ein Schritt zu sein, welcher mit der Zugänglichkeit des freien N-terminalen Endes der wachsenden Peptidkette während der aufeinander folgenden Kupplungsschritte zusammenhängt. Der zweite Faktor, welcher sich auf die Zyklisierungsreaktion bezieht, korreliert mit einer vororganisierten Konformation des linearen Vorläuferpeptids, dies ergibt sich aus den CD-Studien. Die optimale Wahl von ^DPhe als Startaminosäure lässt sich durch die Bildung einer Haarnadelstruktur des linearen Vorläuferpeptids 1a verstehen. Bei dieser Sequenz ist das für die Bildung einer β-Schleife charakteristische Motiv ^DPhe-Pro zentral angeordnet, wodurch es als Kern für die Bildung einer vororganisierten Haarnadel-Struktur dient. Wie in 5 illustriert, kann bei gegenüberliegender und räumlich naher Anordnung des N- und C-terminalen Endes von 1a die maximale Zahl von 4 intramolekularen Wasserstoffbrückenbindungen gebildet werden. Für jedes lineare Vorläuferpeptid, dessen Synthese mit einer anderen Aminosäure begonnen wird, ist der entropische Aufwand für die Bildung zweier β-Schleifen und die Verknüpfung der zwei losen Enden während der Zyklisierung vermutlich weitaus höher. Die relative Position dieser β-Schleife innerhalb der linearen Sequenz ist ein relevanter Faktor, der auch die Zyklisierungsausbeute bei zyklischen Peptiden bestimmt.
Bezüglich der Effizienz der chemischen Kupplungsreaktion, kann zusammenfassend festgestellt werden, dass auf Uronium basierende Reagenzien akzeptable Ausbeuten ergeben, jedoch HCTU als das am besten geeignete Kupplungsreagenz erscheint. Die Wahl des Gegenions oder des Harzes war nicht so von Bedeutung als die Wahl der Startaminosäure. Die Gesamtausbeute an zyklischem Peptid konnte von ungefähr 20% auf 70% gesteigert werden, was gegenüber früher veröffentlichten GS-Syntheseprotokollen eine signifikante Verbesserung bedeutet. Die optimierte Methode verwendet kostengünstige Reagenzien (HCTU), die in den meisten Peptidlaboratorien üblicherweise verfügbar sind. Der Einsatz eines Fmoc-Standardprotokolls sollte die Synthese von GS, seiner Analoga und auch von anderen zyklischen Peptiden deutlich erleichtern und effizienter gestalten. Das gesamte Protokoll erfordert nur einen Reinigungsschritt, z. B. HPLC, ganz am Schluss, wodurch Verluste an Zwischenprodukten vermieden werden können.
Im Hinblick auf Festkörper-NMR-Anwendungen, wurde das optimierte Protokoll eingesetzt, um einige selektiv markierte GS-Analoga 3–8 aufzubauen, welche eine ¹⁵N-markierte Aminosäure (Leu oder Val) und eine in geeigneter Weise substituierte Fluorphenyl-Seitenkette (4F-Phg oder 4CF₃-Phg) oder nicht natürliche isotopenmarkierte Aminosäuren. enthielten. Unter nicht natürlichen Aminosäuren versteht man alle Aminosäuren außer den 22 essentiellen in Organismen vorkommenden Aminosäuren.
Die detaillierte Struktur und Dynamik von GS im biologisch relevanten, Membrangebundenen Zustand kann bestimmt werden, indem eine ¹⁵N-markierte Aminosäure in die Peptidbindung eingebaut wird oder ein mit hoher Sensitivität messbares ¹⁹F-Reportermolekül starr an das GS-Peptidgerüst angebunden wird. Die hierbei gewonnenen Informationen können dann dazu verwendet werden, ein Analogon zu entwickeln, das mit deutlich erhöhter Selektivität auf Bakterienmembranen wirkt. Mittels ¹⁹F- und ¹⁵N-NMR-Spektroskopie wurde gezeigt, dass GS bei kleinen Konzentrationen flach auf der Lipiddoppelschicht liegt, während es sich bei hohen Konzentrationen in eine vertikale Position zur Membranoberfläche drehen kann und vermutlich in einem selbst organisierenden Prozess eine oligomere Pore bildet.
Therapeutisch wirksame GS-Analoga mit deutlich geringerer Membran zerstörender oder hämolytischer Aktivität und höherer Membran-Translokation, könnte Anwendung als ein Zell penetrierendes Transporter Molekül für Aufnahme von pharmazeutischen Wirkstoffen finden. Damit sind solche Stoffe sowohl, als pharmazeutisch aktive Wirkstoffe für Arzneimittel, als auch als Kosmetika geeignet. Auch ist eine Verwendung als biotechnologisch verwendbares Molekül möglich, wie zum Beispiel als transzellulärer Transporter zum Transport von gelösten Stoffen, zum Beispiel Wirkstoffe, durch eine Membran.
Verzeichnis der Abkürzungen:

Boc

Tert-Butyloxycarbonyl

CD

Circulardichroismus

DCM

Dichlormethan

Dde

1-(4,4-Dimethyl-2,6-dioxocyclohex-1-yliden)ethyl

DIEPA

Diisopropylethylamin

DMAP

Dimethylaminopyridin

DMF

Dimethylformamid

DMSO

Dimethylsulfoxid

Fmoc

Fluorenylmethyloxycarbonyl

FPPS

Fmoc-Festphasenpeptidsynthese

GS

Gramicidin S

HATU

O-(7-Azabenzotriazol-1-yl)-N,N,N',N'-tetramethyluronium hexafluorophosphat

HBTU

2-(1H-Benzotriazol-1yl)-1,1,3,3-tetramethyluroniumhexafluorophosphat

HCTU

2-(1H-6-Chlorbenzotriazol-1yl)-1,1,3,3-tetramethyluronium-hexafluorphosphat

HOBT

1H-1-Hydroxy-1,2,3-benzotriazol

HPLC

High performance liquid chromatography (Hochdruckflüssigkeits-Chromatographie)

Leu

Leucin

MALDI-MS

Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionisation-MS (Massenspektrometrie)

MIC

Minimal inhibitory concentration (minimale Hemmkonzentration)

NMR

Kernresonanzspektroskopie

Orn

Ornithin

Phe

Phenylalanin

Phg

Phenylglycin

Pro

Prolin

PyBOP

Benzotriazol-1-yl-oxytripyrrolidinophosphonium Hexafluorphosphat

SPPS

Solid-Phase-Peptide-Synthesis (Festphasenpeptidsynthese)

TATU

2-(7-Azabenzotriazol-1yl)-1,1,3,3-tetramethyluronium-tetrafluorborat

TBTU

O-(Benzotriazol-1-yl)-N,N,N',N'-tetramethyluronium tetrafluoroborat

TCTU

2-(1H-6-Chlorbenzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluronium Tetrafluorborat

TFA

Trifluoressigsäure

TFE

1,1,1-Trifluormethanol

THF

Tetrahydrofuran

Trt

Trityl

Val

Valin

Literatur:

(1) Tamaki, M.; Akabori, S.; Muramatsu, I. J. Am. Chem. Soc. 1993, 115, 10492-10496.
(2) Bu, X.; Wu, X.; Ng, N. L.; Mak, C. K.; Qin, C.; Guo, Z. J. Org. Chem. 2004, 69, 2681-2685.
(3) Wu, X. M.; Bu, X. Z.; Wong, K. M.; Van, W. L.; Guo, Z. H. Org. Lett. 2003, 5, 1749-1752.
(4) Grotenbreg, G. M.; Kronemeijer, M.; Timmer, M. S. M.; El Oualid, F.; van Well, R. M.; Verdoes, M.; Spalburg, E.; van Hooft, P. A. V.; de Neeling, A. J.; Noort, D.; van Boom, J. H.; van der Marel, G. A.; Overkleeft, H. S.; Overhand, M. J. Org. Chem. 2004, 69, 7851-7859.
(5) Grotenbreg, G. M.; Christina, A. E.; Buizert, A. E. M.; van der Marel, G. A.; Overkleeft, H. S.; Overhand, M. J. Org. Chem. 2004, 69, 8331-8339.
(6) Wishart, D. S.; Kondejewski, L. H.; Semchuk, P. D.; Sykes, B. D.; Hodges, R. S. Lett. Pept. Sci. 1996, 3, 53–60.

Claims

Verfahren zur Herstellung zyklischer Peptide mit der allgemeinen Formel cyclo-(X–Y) wobei Y die C-terminale Startaminosäure ist und X eine Aminosäuresequenz umfassend mindestens 2 bis 21 Aminosäuren umfassend folgende Schritte, A – Peptidsynthese von linearen Peptiden, enthaltend die Sequenz des zyklischen Peptids, beginnend mit der Staaminosäure (Y) L- oder D-Phe am Harz für den weiteren Kettenaufbau, und B – Vorlegen der linearen Peptide in Lösung und C – Zyklisierung einer Anzahl von linearen Peptiden in Lösung jeweils in sich.
Verfahren nach Anspruch 1 dadurch gekennzeichnet, dass das zyklische Peptid ein Peptidantibiotikum, vorzugsweise ein Gramicidin S, Tyrocidin, Streptocidin und Loloatin ist.
Verfahren nach Anspruch 1 und 2 dadurch gekennzeichnet, dass das zyklische Peptid mindestens ein Phenylglycin und/oder mindestens ein Phenylglycin-Derivat und/oder mindestens ein ¹⁹F-markiertes Phenylglycin-Derivat und/oder eine ¹⁵N-markierte Aminosäure enthält.
Verwendung der mit dem Verfahren gemäß Anspruch 1 bis 4 hergestellten zyklischen Peptide zur Aufklärung der räumlichen Orientierung derselben zyklischen Peptide in Lipidmembranen mittels Festkörper-NMR.