DE102010001983A1 - Verfahren zur Erzeugung eines Peptidreinigungsmaterials auf Graphitbasis und Verfahren zur Peptidaufreinigung - Google Patents

Verfahren zur Erzeugung eines Peptidreinigungsmaterials auf Graphitbasis und Verfahren zur Peptidaufreinigung Download PDF

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Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Erzeugung eines Peptidreinigungsmaterials auf Graphitbasis, welches dadurch gekennzeichnet ist, dass Graphit durch mindestens einmalige Inkubation in mindestens einer organischen oder anorganischen Säure für mindestens eine Minute auf einen pH-Wert < 7 (sauer) eingestellt wird. Umfasst ist weiterhin ein Verfahren zur Peptidaufreinigung, wobei das Peptid eine endständige planare aromatische Schutzgruppe aufweist, unter Verwendung von Graphit in gepackter Form als Aufreinigungsmaterial, wobei das Verfahren dadurch gekennzeichnet ist, dass sauer voreingestellter Graphit (pH < 7) als Aufreinigungsmaterial verwendet wird.

Description

  • Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Erzeugung eines Peptidreinigungsmaterials auf Graphitbasis, sowie ein Verfahren zur Peptidaufreinigung, in welchem das Peptidaufreinigungsmaterial auf Graphitbasis eingesetzt wird.
  • Bei der Peptid-Synthese werden die Aminosäuren in der Reihenfolge der Sequenz des Peptides aneinander gefügt. Die bei jedem Syntheseschritt um eine Aminosäure wachsende Peptidkette ist bei der Festphasensynthese auf einem festen Träger gebunden. Das eine Ende jeder Aminosäure, der C-Terminus, wird mit dem anderen Ende der vorhergehenden Aminosäure verbunden, dem N-Terminus. Beide Termini sind reaktiv, so dass bei der Peptidsynthese sichergestellt werden muss, dass die Aminosäure nicht mit sich selbst reagiert bzw. bei mehreren Aminosäuren diese sich nicht in der falschen Reihenfolge verbinden. Um die Selektivität herzustellen, werden daher die Carboxyl- und Aminogruppen, die nicht verknüpft werden sollen, mit einer Schutzgruppe versehen.
  • Bei der Festphasensynthese wird zuerst eine am N-Terminus geschützte Aminosäure mit ihrem C-Terminus an die Oberfläche der festen Phase gebunden. Zu diesem Zweck wird der N-Terminus der anzufügenden Aminosäure mit einer temporären Schutzgruppe blockiert. Diese Schutzgruppe muss vor jedem neuen Syntheseschritt entfernt werden. Die funktionellen Gruppen der Seitenketten der Aminosäuren werden während der gesamten Synthese mit so genannten permanenten Schutzgruppen blockiert. Am Ende einer Synthese wird die als erstes eingeführte Aminosäure vom Substrat entfernt und protoniert, wodurch man das fertige Peptid erhält. Letztendlich liegt dann ein freies Peptid in einer Abspalt-Lösung vor.
  • Die Ablösung des fertigen Peptids vom Träger erfolgt mit einer starken Säure, vorzugsweise Trifluoressigsäure (TFA). Bei diesem Vorgang werden gleichzeitig die permanenten Schutzgruppen der Seitenketten der Peptide abgespalten. Die temporäre Schutzgruppe am N-Terminus wird normalerweise mit einer Base abgespalten. Das freie Peptid, sowie die abgespaltenen Schutzgruppen der Seitenketten liegen dann in der TFA-Lösung vor.
  • Gebräuchlich für die Abtrennung des Peptids aus der Lösung ist eine Etherfällung. Durch die Zugabe von Ether wird das Peptid ausgefällt, während die Seitenketten-Schutzgruppen in der Lösung verbleiben.
  • Die Reinheit von Peptiden aus einer Festphasensynthese ist sehr unterschiedlich. Nicht jede Aminosäure lässt sich vollständig anknüpfen. Weiterhin entstehen neben der gewünschten Zielsequenz eine Reihe von Fehlsequenzen. Diese Fehlsequenzen werden bei der Fällung mit Ether nicht abgetrennt.
  • Dies hat zur Folge, dass für den Erhalt des reinen Peptids ein oder mehrere zusätzliche Aufreinigungsschritte erforderlich sind. Abhängig von der Länge des Peptids und dessen physiko-chemischen Eigenschaften sowie denen der Nebenprodukte kann diese Abtrennung sich äußerst schwierig gestalten. Beispielsweise können unerwünschte Nebenprodukte, die in ihrer Länge nur marginal vom gewünschten Peptid abweichen, nahezu gleiche physiko-chemische Charakteristika aufweisen. Erschwerend kommt weiterhin hinzu, dass zwar die Synthese an der Festphase mit hohem Durchsatz möglich ist, die Aufreinigung aber bisher bei weitem nicht so effizient ist. Üblicherweise wird das Peptid mittels Hochleistungs-Flüssigkeits-Chromatographie (HPLC) in einer präparativen HPLC-Anlage gereinigt.
  • Eine solche HPLC-Anlage ist kostenintensiv und ermöglicht in etwa die Reinigung eines einzelnen Peptids pro Stunde. Hinzu kommen weitere Kosten für die Anschaffung und Entsorgung der Lösemittel der Flüssigkeits-Chromatographie.
  • Ein weiterer Nachteil ist die eingeschränkte Parallelisierbarkeit der Methode, denn es kann immer nur ein Peptid auf einer HPLC-Anlage gereinigt werden. Für eine Parallelisierung der Reinigung müssen weitere HPLC-Anlagen mit den entsprechenden Kosten eingesetzt werden.
  • Jacob et al. beschreiben in der internationalen Anmeldung WO 2005/118617 A2 ein Aufreinigungsverfahren, bei welchem die Schutzgruppe des N-Terminus nicht abgespalten, sondern für die Aufreinung genutzt wird. Dabei wird das Peptid-mit-Schutzgruppe auf eine lipophile Oberfläche übertragen, an welche die Schutzgruppe bindet. Anschließend werden nicht gebundene Verunreinigungen heruntergewaschen. Danach erfolgt ein Waschschritt, in welchem die Bindung zwischen dem Peptid und der Schutzgruppe aufgebrochen wird. Dadurch verbleibt die Schutzgruppe auf dem lipophilen Material und das freie Peptid wird heruntergewaschen. Als lipophile Materialien werden verschiedene Stoffe, beispielsweise Reverse-Phase-Materialien eingesetzt.
  • Diese Reinigungsvariante hat den Nachteil, dass eine Abspaltung des Peptids von der Schutzgruppe direkt während der Aufreinigung geschieht, was zu Nebenreaktionen führen kann. Außerdem kann es teilweise von Vorteil sein, die Schutzgruppe vorerst beizubehalten. Weiterhin verwenden Jacob et al. verschiedene, teilweise sehr kostenintensive lipophile Materialen.
  • Ein kostengünstigeres und leicht zugängliches Aufreinigungsmaterial wäre Graphit. Dies wurde bereits von Ramage und Raphy untersucht, wobei verschiedene planare aromatische Systeme als Schutzgruppe eingesetzt wurden (Tetrahedron Letters, 33, 3, 385–388, 1992). Dabei zeigte sich allerdings eine große Diversität im Verhalten der einzelnen Schutzgruppen. Insbesondere die Fluorenylmethoxycarbonyl-Gruppe (Fmoc-Gruppe), von welcher ein guter Rückhalt auf dem Graphit erwartet wurde, erwies sich als ungeeignet. Allein die Tetrabenzofluorenylmethoxycarbonyl-Gruppe (Tbfmoc-Gruppe) ergab bei Ramage und Raphy eine ausreichende Bindung zum Graphit.
  • Aufgabe der Erfindung war es, ein Graphit-Material bereitzustellen, welches die oben genannten Nachteile überwindet. Ebenso sollte ein Verfahren bereitgestellt werden, welches auf Basis dieses Materials die Aufreinigung von Peptiden mit endständiger planarer aromatischer Schutzgruppe ermöglicht.
  • Diese Aufgabe wird gelöst durch ein Verfahren zur Erzeugung eines Peptidreinigungsmaterials auf Graphitbasis gemäß Anspruch 1 sowie durch ein Verfahren zur Peptidaufreinigung gemäß Anspruch 6. Weitere bevorzugte Ausführungsformen ergeben sich aus den abhängigen Ansprüchen.
  • In anderen Worten wird die Aufgabe gelöst durch ein Verfahren zur Erzeugung eines Peptidreinigungsmaterials auf Graphitbasis, welches dadurch gekennzeichnet ist, dass Graphit durch mindestens einmalige Inkubation in mindestens einer organischen oder anorganischen Säure für mindestens eine Minute auf einen pH-Wert < 7 (sauer) eingestellt wird. Weiterhin wird die Aufgabe durch ein Verfahren zur Peptidaufreinigung gelöst, wobei das Peptid eine endständige planare aromatische Schutzgruppe aufweist, wobei unter Verwendung von Graphit in gepackter Form als Aufreinigungsmaterial dieses Verfahren dadurch gekennzeichnet ist, dass sauer voreingestellter Graphit (pH < 7) als Aufreinigungsmaterial verwendet wird.
  • Unter einem Peptid bzw. Peptiden werden Polypeptide mit 2 bis 100 Aminosäuren, vorzugsweise mit 2 bis 40 Aminosäuren, höchst bevorzugt mit 2 bis 20 Aminosäuren verstanden.
  • Planare aromatische Schutzgruppen umfassen alle entsprechenden Schutzgruppen, welche bei der Peptidsynthese eingesetzt werden. Umfasst sind insbesondere Fluorenylmethoxycarbonyl-Gruppen (Fmoc-Gruppen), Tetrabenzofluorenylmethoxycarbonyl-Gruppen (Tbfmoc-Gruppen) und Benzyloxycarbonyl-Gruppen (Z-Gruppen), sowie deren Derivate mit annelierten Benzolringen. Besonders bevorzugt findet eine Fmoc-Gruppe Anwendung.
  • Diese temporären Schutzgruppen, insbesondere die Fmoc-Schutzgruppe, werden in der Festphasensynthese verwendet.
  • Nach jedem Kopplungsschritt werden alle Fehlsequenzen, die nicht mit der nächsten Aminosäure reagiert haben, acetyliert und damit blockiert. Einzig das vollständig synthetisierte Zielpeptid trägt am Ende der Synthese noch die temporäre Schutzgruppe.
  • Anschließend wird eine Festphasenextraktion mit einem speziell auf die Schutzgruppe abgestimmten Säulenmaterial durchgeführt, wodurch das geschützte Zielpeptid ohne Etherfällung aus der TFA-Lösung erhalten wird. Dabei werden gleichzeitig die Fehlsequenzen abgetrennt. Die Schutzgruppe am N-Terminus bleibt erhalten.
  • Das erforderliche Säulenmaterial wird vorzugsweise mittels eines Verfahrens zur Erzeugung eines Peptidreinigungsmaterials auf Graphitbasis hergestellt, in welchem der Graphit durch aufeinander folgende Inkubationen in mindestens zwei Säuren für jeweils mindestens zwei Minuten sauer eingestellt wird, wobei nach den jeweiligen Inkubationsschritten zur Entfernung von freien Säureresten mit mindestens einem organischen Lösungsmittel behandelt wird und nach dem ersten Inkubationsschritt zur Entfernung von Proteaseresten zuerst mit kochendem Wasser behandelt wird.
  • Dabei hat es sich als vorteilhaft erwiesen, einen ersten Inkubationsschritt in einer ersten Säure für mindestens zwei Minuten und einen zweiten Inkubationsschritt in einer zweiten Säure für mindestens zehn Minuten durchzuführen.
  • Verwendung finden sowohl anorganische als auch organische Säuren. Die anorganischen Säuren sind vorzugsweise Salzsäure, Salpetersäure und Schwefelsäure. Die organischen Säuren sind ausgewählt aus den unsubstituierten oder substituierten C1-C6-Carbonsäuren, wobei die substituierten C1-C6-Carbonsäuren vorzugsweise ausgewählt sind aus den einfach oder mehrfach substituierten C1-C6-Carbonsäuren, besonders bevorzugt aus den einfach oder mehrfach halogenierten C1-C6-Carbonsäuren. Höchst bevorzugt werden von den unsubstituierten C1-C6-Carbonsäuren Essigsäure, von den mehrfach halogenierten C1-C6-Carbonsäuren TFA eingesetzt.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform werden beide Inkubationsschritte in organischen Säuren ausgeführt, wobei es besonders bevorzugt ist, den ersten Inkubationsschritt in einer ersten organischen Säure und den zweiten Inkubationsschritt in einer zweiten organischen Säure erfolgen zu lassen.
  • Eine sehr bevorzugte Ausführungsform des Verfahrens zur Erzeugung eines Peptidreinigungsmaterials ist dadurch gekennzeichnet, das der erste Inkubationsschritt in einer halogenierten C1-C6-Carbonsäure und der zweite Inkubationsschritt in einer unsubstituierten C1-C6-Carbonsäure erfolgt.
  • Zur Entfernung von freien Säureresten wird sowohl nach dem ersten als auch nach dem zweiten Inkubationsschritt mit mindestens einem organischen Lösungsmittel behandelt. Davon umfasst sind organische polare aprotische Lösungsmittel, welche allein oder in Mischung miteinander oder in Mischung mit Wasser eingesetzt werden. Falls Mischungen eingesetzt werden, weisen diese Volumenverhältnisse von 1:9 bis 9:1 auf. Insbesondere Mischungen mit Wasser weisen Volumenverhältnisse von 1:9 bis 9:1, vorzugsweise 1:5 bis 5:1, besonders bevorzugt 1:1 auf. Ein bevorzugtes Lösungsmittel ist Acetonitril (ACN).
  • Nach abgeschlossener Behandlung des Graphits wird dieser getrocknet. Der auf diesem Weg sauer eingestellte Graphit (pH < 7) ist als Material zur Peptidaufreinigung einsetzbar. Er wird für die Aufreinigung in gepackter Form verwendet. Unter „gepackter Form” ist zu verstehen, dass das Material in einer Vorrichtung, vorzugsweise in einer Säule, eingefüllt und komprimiert vorliegt, d. h. Aufschlämmungen sind hiervon nicht umfasst.
  • Das Verfahren zur Peptidaufreinigung zeichnet sich durch die folgenden Schritte aus:
    • a) mindestens einmaliges Aufbringen einer sauren wässrigen Lösung eines Peptids mit endständiger planarer aromatischer Schutzgruppe auf sauer voreingestellten Graphit in gepackter Form, so dass die Schutzgruppe zwischen die Ebenen des Graphits interkalieren kann,
    • b) Waschen des Peptid-mit-Schutzgruppe haltigen Graphits in sukkzessiven Waschschritten mit Wasser, Mischungen aus Wasser und mindestens einem organischen Lösungsmittel, sowie mit wasserfreiem organischem Lösungsmittel,
    • c) Waschen des Peptid-mit-Schutzgruppe haltigen Graphits mit einer wässrigen Base,
    • d) Waschen des Peptid-mit-Schutzgruppe haltigen Graphits mit einer Mischung aus mindestens einem organischen Lösungsmittel und Wasser zur Eluation des Peptids mit daran gebundener Schutzgruppe vom Graphit.
  • Die „saure wässrige Lösung des Peptids mit endständiger planarer aromatischer Schutzgruppe” bedingt das Lösen des geschützten Peptids in einer Mischung aus Wasser und einer Säure, vorzugsweise TFA. Die Mischung kann ein Volumenverhältnis von 1:9 bis 9:1, vorzugsweise 1:5 bis 5:1, besonders bevorzugt 1:3 (TFA:Wasser) haben. Aus wasserfreier Säure, beispielsweise reiner TFA oder der Abspaltlösung, in welcher das geschützte Peptid nach der Synthese an der Festhphase vorliegt, erfolgt keine Anlagerung an den Graphit.
  • Der Begriff „organisches Lösungsmittel” bezeichnet hier wieder die oben bereits beschriebenen organischen polaren aprotischen Lösungsmittel. Diese können allein oder in Mischung miteinander zur Anwendung kommen. Ein bevorzugtes Lösungsmittel ist auch hier wieder Acetonitril.
  • „Wässrige Basen” sind ausgewählt aus der Gruppe der anorganischen und organischen Basen, vorzugsweise der organischen Basen, besonders bevorzugt wird Ammoniak (NH3)(aq) verwendet. Die wässrige Base wird vorzugsweise in einer Konzentration zwischen 5 und 50% (V/V), besonders bevorzugt zwischen 20 und 40% (V/V), eingesetzt.
  • Die Behandlung mit der wässrigen Base dient dazu, das Milieu auf dem Graphit „umzupuffern”. Auf diesem Weg wird die Eluation des Peptids-mit-Schutzgruppe vorbereitet. Das geschützte Peptid wird nur vom Graphit eluiert, wenn dieses zuvor mit einer wässrigen Base gewaschen wurde. Dabei erfolgt noch keine Abspaltung der N-terminalen Schutzgruppe. Eine Eluation des Peptids-mit-Schutzgruppe erfolgt in diesem Schritt nicht oder nur in sehr geringen Mengen (< 5%).
  • Die Eluation des Peptids-mit-Schutzgruppe geschieht durch Waschen mit einer Mischung aus mindestens einem organischen Lösungsmittel und Wasser. Nach Eluation vom Graphit wird das Peptid mit daran gebundener Schutzgruppe in einer Reinheit zwischen 70% und 99%, vorzugsweise mindestens 80%, höchst bevorzugt mindestens 95% erhalten. Auf diesem Weg wird das geschützte Peptid ohne Etherfällung aus der TFA-Lösung gereinigt.
  • Mit Hilfe der Reinigung an Gaphit ist es möglich eine Parallelisierung der Reinigung von Peptiden durchzuführen, was bei der HPLC nicht möglich ist. Bei der HPLC-Reinigung muss für jedes Peptid ein individueller Gradient (z. B. ACN:H2O oder MeOH:H2O) etabliert werden. Auf einer prärarativen HPLC-Analage kann auch immer nur ein einziges Peptid gleichzeitig gereinigt werden. Durch die Parallelisierung können sehr viel mehr Peptide im gleichen Zeitraum gereinigt werden.
  • Zur Anwendung des Verfahrens betrifft die Erfindung entsprechend ein Peptidaufreinigungskit, welcher eine Vorrichtung umfasst, die sauer voreingestellten Graphit (pH < 7) in gepackter Form enthält. Die „Vorrichtung” umfasst dabei insbesondere jede Art von Säule, d. h. normale Säulen oder Spritzen mit einer geeigneten Rückhalteeinrichtung (beispielsweise einer Fritte). Schematisch ist eine passende Vorrichtung in gezeigt.
  • Beschreibung der Abbildungen
  • Schematische Darstellung einer Vorrichtung zur Durchführung des Peptidaufreinigungsverfahrens.
  • Dargestellt ist eine Kontrollmessung (HPLC-MS) für ein Fmoc-geschütztes Peptid (Fmoc-LSETKPAV-COOH auch bezeichnet als Fmoc-LSETKPAV-OH) nach der Festphasensynthese. Das geschützte Peptid ist gelöst in einer TFA-Wasser-Mischung.
  • Gezeigt ist das HPLC-MS-Chromatogramm des Eluats nach Aufbringung des Fmoc-geschützten Peptids auf den sauer eingestellten Graphit. Das Chromatogramm zeigt, dass die Probe vollständig angelagert wurde, d. h. es ist kein Peptid detektierbar.
  • Gezeigt ist das HPLC-MS-Chromatogramm des Eluats nach dem ersten Waschschritt mit Wasser. Das Chromatogramm zeigt, dass die Probe vollständig angelagert bleibt, d. h. das Eluat weist keinen Peptid-Peak auf.
  • Gezeigt ist das HPLC-MS-Chromatogramm des Eluats nach einem Waschschritt mit reinem Acetonitril. Das Chromatogramm zeigt, dass die Probe vollständig angelagert bleibt, d. h. das Eluat weist keinen Peptid-Peak auf.
  • Abgebildet ist das HPLC-MS-Chromatogramm des Eluats nach Waschen mit 30%iger Ammoniaklösung (Volumenverhältnis NH3:H2O = 3:7). Freies Peptid sowie Fmoc-geschütztes Peptid sind nur in sehr geringen Mengen detektierbar (< 5%).
  • Das Eluat, welches nach der finalen Behandlung mit 50%igem ACN (Volumenverhältnis ACN:H2O = 1:1) erhalten wird, weist im Chromatogramm das Peptid mit Fmoc-Gruppe auf, neben gerinen Mengen des freien Peptids (ohne Schutzgruppe).
  • Gezeigt ist das HPLC-MS-Chromatogramm nach einer klassischen Etherfällung für das gleiche Peptid allerdings ohne Fmoc-Gruppe, d. h. LSETKPAV-OH.
  • Bezugszeichenliste
    • 1
    erste Fritte
    2
    zweite Fritte
    3
    dritte Fritte
    4
    Filter
    5
    Graphit
  • Nachfolgend wird die Erfindung anhand von Beispielen erläutert.
  • Beispiele
  • Beispiel 1 – Vorbehandlung des Graphits
  • Ca. 5 g Graphit (technische Qualität) werden in eine 20 ml Spritze mit Fritte und Filter eingewogen. Der Graphit wird manuell komprimiert durch Stempeldruck im oberen Bereich der Spritze.
  • Es wird mit ca. 10 ml einer TFA-Wasser-Mischung (Volumenverhältnis 1:3; 2,5 ml TFA und 7,5 ml H2O) gewaschen und dabei 2 Minuten inkubieren gelassen. Anschließend wird 1× mit ca. 10 ml kochendem Wasser gewaschen, wodurch eventuelle Proteasen auf dem Graphit abgetötet werden, dabei wird für 2 Minuten inkubiert.
  • Es folgen Waschschritte:
    • – 1× mit ca. 10 ml ACN:H2O 1:1, 2 Minuten Inkubation,
    • – 1× mit ca. 10 ml ACN, 2 Minuten Inkubation,
    • – 2× mit ca. 10 ml 10%iger Essigsäure waschen, jeweils 10 Minuten Inkubation und
    • – 1× mit ca. 10 ml Acetonitril; 5 Minuten Inkubation.
  • Anschließend wird der Graphit getrocknet.
  • Beispiel 2 – Auftragen des Peptids mit Fmoc-Gruppe
  • Zu Kontrollzwecken werden vor Versuchsbeginn 1,8 mg des Peptids mit Fmoc-Gruppe (Fmoc-LSETKPAV-COOH) in 300 μl TFA und 900 μl Wasser (1:3‚ r/v) gelöst und zur Kontrolle HPLC-MS analysiert (siehe ). Es ist zu erkennen, dass in der Lösung Fmoc-Peptid (Sequenz Fmoc-LSETKPAV-COOH) enthalten ist. Die Ergebnisse zu sind in Tabelle 1 wiedergegeben. Tabelle 1
    Nr. Zeit Fläche Höhe Rel. Fläche
    UV_VIS_1 UV_VIS_1 min UV_VIS_1 mAU·min UV_VIS_1 mAU UV_VIS_1 %
    1 8.90 1.557 17.028 2.98
    2 16.09 0.861 7.996 1.65
    3 17.70 1.179 14.441 2.26
    4 17.84 39.512 364.054 75.70 Fmoc-Peptid
    5 17.99 4.231 54.785 8.11
    6 18.12 2.768 27.060 5.30
    7 24.02 2.090 19.808 4.00
  • Für die Aufreinigung wird das Peptid, hier Fmoc-LSETKPAV-COOH (= Fmoc-LSETKPAV-OH) mit Fmoc-Gruppe am N-Terminus, ebenfalls in einer Mischung aus TFA und Wasser (Volumenverhältnis 1:3) gelöst und 3-mal durch den trockenen, sauer voreingestellten Graphit gedrückt.
  • Das Eluat nach Auftragen der Probe weist bei HPLC-MS-Analyse keinen Peptid-Peak auf, d. h. das Peptid-mit-Schutzgruppe wurde vollständig an den Graphit angelagert. Die Ergebnisse sind graphisch in und in Tabelle 2 dargestellt. Tabelle 2
    Nr. Zeit Fläche Höhe Rel. Fläche
    UV_VIS_1 UV_VIS_1 min UV_VIS_1 mAU·min UV_VIS_1 mAU UV_VIS_1 %
    1 8.59 18.056 144.630 100.00
  • Beispiel 3 – Waschen des Peptids mit Fmoc-Gruppe auf dem Graphit
  • Das am Graphit gebundene Fmoc-Peptid aus Beispiel 2 wird wie folgt gewaschen:
    • 1. 1× mit 1,5 ml Wasser (siehe ),
    • 2. 1× mit 1,5 ml einer Mischung aus ACN:H2O im Volumenverhältnis 1:1,
    • 3. 1× mit 1,5 ml ACN (siehe );
    • 4. 1× mit 1,5 ml 30% NH3 in Wasser; Volumenverhältnis NH3:H2O 3:7 (siehe )
    • 5. 1× mit 1,5 ml einer Mischung aus ACN:H2O im Volumenverhältnis 1:1, dabei wird das Fmoc-Peptid wieder vom Graphit eluiert (siehe ).
  • Die Eluate der jeweiligen Waschschritte werden mittels HPLC-MS analysiert und sind in den – gezeigt. Das Ergebnis aus ist ebenfalls in Tabelle 3, das aus in Tabelle 4 und das aus in Tabelle 5 wiedergegeben: Tabelle 3
    Nr. Zeit Fläche Höhe Rel. Fläche
    UV_VIS_1 UV_VIS_1 min UV_VIS_1 mAU·min UV_VIS_1 mAU UV_VIS_1 %
    1 17.84 0.614 6.545 100.00
    Tabelle 4
    Nr. Zeit Fläche Höhe Rel. Fläche
    UV_VIS_1 UV_VIS_1 min UV_VIS_1 mAU·min UV_VIS_1 mAU UV_VIS_1 %
    1 8.62 1.869 16.672 2.70
    2 8.90 6.351 73.704 9.18 Freies Peptid
    3 11.35 1.128 11.530 1.63
    4 13.94 0.324 3.320 0.47
    5 15.10 0.846 8.427 1.22
    6 16.09 1.378 14.565 1.99
    7 17.84 15.026 139.837 21.71 Fmoc-Peptid
    8 18.12 0.075 2.163 0.11
    9 22.45 1.679 13.895 2.43
    10 27.04 40.524 460.444 58.56
    Tabelle 5
    Nr. Zeit Fläche Höhe Rel. Fläche
    UV_VIS_1 UV_VIS_1 min UV_VIS_1 mAU·min UV_VIS_1 mAU UV_VIS_1 %
    1 8.20 1.068 10.320 0.16
    2 8.50 2.259 14.177 0.34
    3 8.75 0.981 12.858 0.15
    4 8.89 55.472 591.596 8.31 Freies Peptid
    5 9.04 2.456 31.448 0.37
    6 9.52 0.440 5.179 0.07
    7 10.60 2.732 28.941 0.41
    8 12.00 3.049 8.097 0.46
    9 16.09 10.710 107.795 1.61
    10 16.49 1.852 22.116 0.28
    11 17.69 13.716 152.854 2.06
    12 17.90 462.506 3873.036 69.31 Fmoc-Peptid
    13 18.12 31.422 270.677 4.71
    14 19.09 3.070 30.774 0.46
    15 20.25 0.897 9.356 0.13
    16 21.22 0.441 5.166 0.07
    17 24.02 47.518 427.910 7.12
    18 24.49 8.480 53.085 1.27
    19 25.30 18.208 51.438 2.73
  • Lediglich das Eluat des letzten Schrittes, d. h. der Behandlung mit ACN-H2O, zeigt freigesetztes Fmoc-Peptid in relevanten Mengen.
  • Zu Vergleichszwecken wurde das gleiche Peptid (ohne Fmoc-Gruppe) auch nach der Etherfällungsmethode aufgereinigt. Dessen HPLC-MS-Analyse (siehe ) ergibt nahezu dasselbe Ergebnis, d. h. die Reinheit, welche mit dem erfindungsgemäßen Verfahren erzielt wird, entspricht mindestens der Reinheit des klassischen Verfahrens. Das Ergebnis aus ist ebenfalls in Tabelle 6 wiedergegeben. Tabelle 6
    Nr. Zeit Fläche Höhe Rel. Fläche
    UV_VIS_1 UV_VIS_1 min UV_VIS_1 mAU·min UV_VIS_1 mAU UV_VIS_1 %
    1 7.79 5.013 40.658 6.34
    2 8.05 0.065 1.463 0.08
    3 8.40 0.371 3.497 0.47
    4 8.64 51.929 507.273 65.66 Freies Peptid
    5 8.80 1.133 13.083 1.43
    6 9.39 0.323 3.638 0.41
    7 9.57 0.154 2.272 0.20
    8 9.72 0.045 0.921 0.06
    9 9.87 0.015 0.277 0.02
    10 10.54 10.618 98.488 13.43
    11 20.02 4.725 7.695 5.97
    12 21.65 4.697 10.718 5.94
  • Eine nachfolgende Optimierung des Verfahrens ermöglichte Reinheiten von mindestens 80%.
  • ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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  • Zitierte Patentliteratur
    • WO 2005/118617 A2 [0010]
  • Zitierte Nicht-Patentliteratur
    • Tetrahedron Letters, 33, 3, 385–388, 1992 [0012]

Claims (11)

  1. Verfahren zur Erzeugung eines Peptidreinigungsmaterials auf Graphitbasis, dadurch gekennzeichnet, dass Graphit durch mindestens einmalige Inkubation in mindestens einer organischen oder anorganischen Säure für mindestens eine Minute auf einen pH-Wert < 7 (sauer) eingestellt wird.
  2. Verfahren zur Erzeugung eines Peptidreinigungsmaterials auf Graphitbasis nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Graphit durch aufeinander folgende Inkubationen in mindestens zwei Säuren für jeweils mindestens zwei Minuten sauer eingestellt wird, wobei nach den jeweiligen Inkubationsschritten zur Entfernung von freien Säureresten mit mindestens einem organischen Lösungsmittel behandelt wird und nach dem ersten Inkubationsschritt zur Entfernung von Proteaseresten zuerst mit kochendem Wasser behandelt wird.
  3. Verfahren zur Erzeugung eines Peptidreinigungsmaterials auf Graphitbasis nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, das ein erster Inkubationsschritt in einer ersten Säure für mindestens zwei Minuten und ein zweiter Inkubationsschritt in einer zweiten Säure für mindestens zehn Minuten erfolgt.
  4. Verfahren zur Erzeugung eines Peptidreinigungsmaterials auf Graphitbasis nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, das die organischen Säuren ausgewählt sind aus den unsubstituierten oder substituierten C1-C6-Carbonsäuren, wobei die substituierten C1-C6-Carbonsäuren vorzugsweise ausgewählt sind aus den einfach oder mehrfach substituierten C1-C6-Carbonsäuren, besonders bervorzugt aus den einfach oder mehrfach halogenierten C1-C6-Carbonsäuren.
  5. Verfahren zur Erzeugung eines Peptidreinigungsmaterials auf Graphitbasis nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, das der erste Inkubationsschritt in einer halogenierten C1-C6-Carbonsäure und der zweite Inkubationsschritt in einer usubstituierten C1-C6-Carbonsäure erfolgt.
  6. Verfahren zur Peptidaufreinigung, wobei das Peptid eine endständige planare aromatische Schutzgruppe aufweist, unter Verwendung von Graphit in gepackter Form als Aufreinigungsmaterial, dadurch gekennzeichnet, dass sauer voreingestellter Graphit als Aufreinigungsmaterial verwendet wird.
  7. Verfahren zur Peptidaufreinigung nach Anspruch 6, gekennzeichnet durch die folgenden Schritte: a) mindestens einmaliges Aufbringen einer sauren wässrigen Lösung eines Peptids mit endständiger planarer aromatischer Schutzgruppe auf sauer voreingestellten Graphit in gepackter Form, so dass die Schutzgruppe zwischen die Ebenen des Graphits interkalieren kann, b) Waschen des Peptid-mit-Schutzgruppe haltigen Graphits in sukkzessiven Waschschritten mit Wasser, Mischungen aus Wasser und mindestens einem organischen Lösungsmittel und wasserfreiem organischem Lösungsmittel, c) Waschen des Peptid-mit-Schutzgruppe haltigen Graphits mit einer wässrigen Base, d) Waschen des Peptid-mit-Schutzgruppe haltigen Graphits mit einer Mischung aus mindestens einem organischen Lösungsmittel und Wasser zur Eluation des Peptids mit daran gebundener Schutzgruppe vom Graphit.
  8. Verfahren zur Peptidaufreinigung nach Anspruch 6 oder 7, dadurch gekennzeichnet, dass das organische Lösungsmittel Acetonitril ist.
  9. Verfahren zur Peptidaufreinigung nach einem der Ansprüche 6 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass die wässrige Base NH3(aq) in einer Konzentration zwischen 5 und 50% (V/V), vorzugsweise zwischen 20 und 40% (V/V), ist.
  10. Verfahren zur Peptidaufreinigung nach einem der Ansprüche 6 bis 9, wobei das Peptid als endständige planare aromatische Schutzgruppe eine Fluorenylmethoxycarbonyl-Gruppe (fmoc) aufweist.
  11. Peptidaufreinigungskit, umfassend eine Vorrichtung, welche sauer voreingestellten Graphit in gepackter Form enthält.
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