AT398767B - Verfahren zur reinigung eines rohpeptids mittels präparativer mitteldruckflüssigkeitschromatographie - Google Patents

Description

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Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Reinigung eines Rohpeptids mittels präparativer Mitteldruckflüssigkeitschromatographie, wobei man das zu reinigende Peptid auf eine Chromatographie-Säule aufträgt, die Umkehrphasen-Silica-Material d.h. alkylierte hochkondensierte Polykieselsäure mit einer Korngröße von 20 bis 90 Mikrometer und mit einer Porengröße von 6 bis 30 Nanometen als stationäre 5 Phase enthält, bei einem Druck von 0 bis 40 bar mit einer mobilen Phase entweder isokratisch oder mit einem Gradienten eluiert, so das Gemisch auftrennt und das auf diese Weise erhaltene Eluat fraktioniert, und wobei das zu reinigende Peptid in möglichst konzentrierter Form auf die Säule aufgetragen wird und die mobile Phase aus (a) einem Gemisch aus wenigstens einem organischen Lösungsmittel und Wasser, oder 10 (b) einem Gemisch aus wenigstens einem organischen Lösungsmittel und einer Pufferlösung mit einem pH-Wert von 2 bis 10, oder (c) einer rein wässerigen Pufferlösung mit einem pH-Bereich von 2 bis 10, besteht.

Das Prinzip der Festphasensynthese von Peptiden ist von R.B.Merrifieid zum Beispiel in "Angewandte Chemie", Band 97, (1985), Seiten 801 bis 812, beschrieben. Im "International Journal of Peptide and 75 Protein Research", Band 25, (1985), Seiten 449 bis 474 beschreibt M.Bodanszky das Prinzip der Peptidsynthese in Flüssigphase.

Die EP-A 37 516 beschreibt eine Festphasensynthese eines Vasopressinderivates nach Merrifield mittels Reinigung auf Molekularsieben (Trennung nach Molekulargewicht). Eine ähnliche Reinigung wird auch in der US-PS 4 148 787 und in "Collection Czechoslov.Chem.Comm.", Vol.31, (1966), Seiten 4581 bis 20 4591, beschrieben.

In der US-PS 4 093 610 wird im Zusammenhang mit einer Flüssigphasensynthese eine Reinigung auf Ionenaustauschern oder auf Molekularsieben beschrieben.

Weitere Reinigungsmethoden werden in der DE-OS 27 23 453 und der DE-PS 1 643 273 beschrieben, wobei die letztere Methode nur für Mengen im mg-Bereich durchführbar ist. 25 Auf die Problematik der Peptid-Reinigung ist auch von G.FIouret et al. in ”lnt.J.Peptide Protein Res.",13, (1979), Seiten 137 bis 141, hingewiesen worden. im übrigen sei auch auf folgende, zum Stand der Technik gehörende Literatursteilen verwiesen: K.Noda in "Int.J.Peptide Protein Res.",19,(1982), Seiten 413-419; "Collection of Czechoslov.Chem.Comm.",Vol.32,(1967),Seiten 1250-1257; 30 EP-A 112 809, worin die nicht ökonomische HPLC zur Anwendung kommt; US-PS 4 495 097; V.du Vigneaud et al.,(1960),J.Biol.Chem. Vol.235,Nr.12,Seiten 64-66.

Ausführlicher werden bestimmte Reinigungsmethoden beschrieben in J.Chromatog., 38, (1968), Seiten 396-398,und 35 M.Zaoral et al.,Collection Czechoslov.Chem.Comm.,Vol.43,(1978), Seiten 511-522.

Mit allen diesen bekannten Reinigungsverfahren können im allgemeinen ökonomisch vertretbare Reinheitsgrade von 92 bis 94 % erreicht werden. Das hat zur Folge, daß bei einer medizinischen Verwendung einer Peptidverbindung stets nachgewiesen werden mußte, daß die sie begleitenden Nebenprodukte keine nachteiligen Folgen, Auswirkungen und Nachteile haben, was nicht leicht war, da man oft nicht wußte, aus 40 was für Verbindungen die Nebenprodukte bestanden. Dieser Zustand ist unbefriedigend, zumal in der Medizin immer mehr Peptidverbindungen eingesetzt werden.

Ferner ist es aus der DE-OS 31 24 818 bekannt, die Reinigung einer Peptidverbindung durch Chromatographie in einer Säule mit umgekehrter Phase in einem Methanoltriflourazetat-Puffer-Gemisch durchzuführen. Dies ergibt nur geringe Ausbeuten. Ähnliche Nachteile bestehen für ein Verfahren nach der 45 DE-OS 33 17 092, bei welchem eine Peptidverbindung in einem Gemisch aus Methanol und Wasser gelöst und auf eine Säule von mit Octadecylketten modifiziertem Silicagel aufgegeben wird und die Elution mit einem Gemisch aus Methanol und wässeriger Triflouressigsäure durchgeführt wird.

Schließlich ist es bekannt (US-PS 4,623,716), zur Reinigung einer Peptidverbindung ein Hochdruckflüssigkeitschromatographieverfahren einzusetzen, bei welchem mit einem Gradient von 10-40 % Äthanol in so zwei Mol wässeriger Essigsäure mit einem Zusatz von Ammoniumhydroxidlösung eluiert wird. Auch hier ergeben sich geringe Ausbeuten.

Die Erfindung setzt sich zur Aufgabe, ein ökonomisches Reinigungsverfahren für Peptidverbindungen zu schaffen, mit welchem Reinheiten von über 99 % erreicht werden können, wobei ein solches Reinigungsverfahren mit hohen Ausbeuten im industriellen Maßstab, d.h. mit einer Möglichkeit zum Arbeiten im 55 Gramm-Bereich, durchführbar sein soll. An Hand der bekannten Literatur mußte man annehmen, daß es nicht möglich ist, ein solches Verfahren zu finden, welches die angestrebte Reinheit auf ökonomische Art erreicht. Völlig überraschend wurde nun doch ein solches Verfahren gefunden. 2

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Das erfindungsgemäße Verfahren besteht hiebei darin, daß, ausgehend von dem eingangs beschriebenen Verfahren, bei welchem die mobile Phase aus einem Gemisch bzw. einer Pufferlösung gemäß einer der Vatianten (a), (b) oder (c) besteht, die mobile Phase in allen diesen drei Fällen (a) bis (c) zusätzlich noch 5 1. als Chelierungsmittel wenigstens eine Aminocarbonsäure oder Nitrilocärbonsäure in einer Menge von 0,01 bis 0,1 Vol.-%, insbesondere 0,05 Vol.-%, bezogen auf das Gesamtvolumen der mobilen Phase, und 2. wenigstens eine stark polare organische Verbindung, nämlich Hexamethylenphosphortriamid, Dimethylsulfoxid (DMSO), Dimethylformamid (DMF) und N-Methylpyrrolidon (NMP) in einer Menge von 0,05 10 bis 1 Vol.-%, insbesondere 0,5 Vol.-%, bezogen auf das Gesamvolumen der mobilen Phase in Kombination enthält.

Das erfindungsgemäße Verfahren hat den Vorteil, daß es äußerst ökonomisch ist. Es ist weiters sehr vorteilhaft, daß das erfindungsgemäße Verfahren in einem niedrigen Druckbereich durchgeführt werden kann. Ebenso ist das Säulenfüllmaterial relativ billig, weil im erfindungsgemäßen Verfahren irreguläre statt 75 sphärische Partikel verwendbar sind. Im Vergleich zu entsprechendem HPLC-Material ist das erfindungsgemäß eingesetzte Säulenfüllmaterial gegenwärtig etwa 20 mal billiger. Während der Reinigung werden die Peptidverbindungen weder denaturiert noch weisen sie einen Aktivitätsverlust auf; das erfindungsgemäße Verfahren ist also für die Peptidverbindungen äußerst schonend. Durch geeignete Wahl des Fließmittels können die Peptidverbindungen rasch und selektiv getrennt werden. Die erfindungsgemäß aufgetrennten, 20 gereinigten Peptidverbindungen weisen erstaunlicherweise eine Reinheit von über 99% auf, was auf den kombinierten Zusatz des erwähnten Chelierungsmittels und der erwähnten, stark polaren, organischen Verbindungen zurückzuführen ist. Weiters können mit dem erfindungsgemäßen Verfahren große Mengen an Lösungsmitteln eingespart werden. Völlig überraschend ist, daß sich bei hohen Beladungen der Säulen signifikante Verbesserungen in der 25 Ausbeute ergeben, und zwar nicht nur im Vergleich zu einer Verfahrensführung ohne Chelator und ohne stark polare organische Verbindung, sondern auch im Vergleich zu einer Verfahrensführung, bei welcher entweder nur die stark polare organische Verbindung als Zusatz eingesetzt wird oder nur das Chelierungsmittel allein.

Aus der Literaturstelle "Chemical Abstracts" 99, 64410k (1983) ist zwar die Verwendung von EDTA und 30 von DMF im Zusammenhang mit einem Flüssigkeitschromatographieverfahren bekannt, jedoch werden diese beiden Substanzen nicht der mobilen Phase zugesetzt, sondern für die Waschung der Säule verwendet, also für die stationäre Phase, und auch nicht in Kombination, sondern alternativ. Es handelt sich also bei diesem Stand der Technik um eine Vorbehandlung der Säule mit DMF oder EDTA, bevor Leukotrien mittels eines konventionellen Fließmittels gereinigt wird. 35 Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens enthält die mobile Phase als Chelierungsmittel Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) oder Nitrilotriessigsäure (NTA). Dadurch ergeben sich besonders günstige Ergebnisse:

Der Nachweis der Peptidverbindungen in den Fraktionen erfolgt z.B. im UV-Licht bei einer Wellenlänge von 232 nm oder 275 nm. 40 Zur Kontrolle der Reinheit und der Struktur des Peptides in den Fraktionen können die bekannten Methoden angewendet werden: beispielsweise HPLC, DC, Aminosäurenanalyse, Sequenzanalyse.

Falls ein Puffer im Fließmittel verwendet wird, so werden die entsprechenden Fraktionen vorteilhaft noch vor der Lyophilisation entsalzt, z.B. an Ionenaustauschern oder mittels Molekularsieben.

Um das fraktionierte, erfindungsgemäß gereinigte Peptid als Festkörper zu erhalten, wird die entspre-45 chende Fraktion beispielsweise lyophilisiert.

Mit dem erfindungsgemäßen Reinigungsverfahren ist es möglich, beispielsweise 20-50 g Rohpeptid innerhalb von 3 Stunden zu reinigen. Für das erfindungsgemäße Reinigungsverfahren können Peptidverbindungen verwendet werden, die entweder mittels Festphasensynthese nach Merrifield ("Angewandte Chemie", Band 97, (1985), Seiten 810 50 bis 812) oder in der Flüssigphasensynthese ("IntJ.Peptide Protein Res.,",25, (1985), Seiten 449 bis 474) synthetisiert werden.

Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren können insbesondere folgende Peptide gereinigt werden: Disulfid-Verbindungen, welche gemäß einem neuen Verfahren hergestellt worden sind, das im wesentlichen dadurch gekennzeichnet ist, daß man wenigstens ein Oxidationsmittel, welches kovalent oder elektrostatisch 55 an eine feste Phase gebunden ist und welches - SH-Gruppen zu Disulfidbrücken zu oxidieren vermag, in Wasser unter Rühren vorlegt, dann eine wässerige Lösung der zu oxidierenden Peptidverbindung langsam dosiert derart zugibt, daß die Konzentration des zu oxidierenden Peptids so gering ist, daß die Wahrscheinlichkeit einer intermolekularen Reaktion der Peptidmoleküle vernachlässigbar klein ist, und die Reaktionsteil- 3

AT 398 767 B nehmer miteinander unter intensivem Rühren reagieren läßt, und anschließend die rohe, eine Disuifidbrücke aufweisende Peptidverbindung aufarbeitet. Es können aber auch mit dem erfindungsgemäßen Verfahren Peptide gereinigt werden wie Terlipressin der Formel 5 Gly-Gly-Gly-Cys-Tyr-Phe-Gln-Asn-Cys-Pro-Lys-Gly-NHg, CIS-Pressin der Formel 10

Gly-Gly-Gly-Cys-Tyr-Phe-Asn-Cys-Pro-Lys-Gly-HNp,

Hamburger-Peptid der Formel Asp-Ser-Asp-Pro-Arg, Vasopressin und deren Derivate, Calcitonin, Somatostatin und Insulin. Es ist bevorzugt, mit dem erfindungsgemäßen Verfahren Terlipressin zu reinigen; das mit 15 dem erfindungsgemäßen Verfahren gereinigte Terlipressin ist extrem sauber und hat andere Charakteristiken als ein im Handel erhältliches, herkömmliches Terlipressin, was auf das Fehlen von Verunreinigungen zurückzuführen ist.

Entsprechende Strukturformeln sind beschrieben in: "Handbook of Biochemistry" C-164 bis 0-188 - Amino Acid Sequences of Proteins, C-265 (Handbook 20 of Biochemistry selected date for Molecular Biology, 2nd edition (1970), Editor: Herbert A.SOBER, PhD, veröffentlicht von (The Chemical Rubber Co., Cieveland, Ohio, 44 128), und "Int.J.Peptide Protein Res.”, 15, (1980), Seiten 342 bis 354.

Die nachfolgenden Beispiele sollen die vorliegende Erfindung erläutern. 25 Beispiel 1: Terlipressin 10 g Terlipressin (Rohpeptid) der Formel 30

Gly-Gly-Gly-Cys-Tyr-Phe-Gln-Asn-Cys-Pro-Lys-Gly-NH2, gelöst in 750 ml destilliertem Wasser, wurde mittels einer MPLC-Anlage der Firma Labomatic AG auf eine 45 x 880 mm Säule unter einem Druck von 15 bar aufgetragen. Packung: Umkehrphasenmaterial (Cts-60) 35 Das Peptid wurde dann mit einem Fließmittelgemisch von 26 % Methanol und 74% 0,1 M Triethylammoni-umphosphat (TEAP) pH 2,45, 0,4% DMSO und 0,05% EDTA mit einem Durchfluß von 60 ml/Min. eluiert und fraktioniert. Die Detektion des Peptides erfolgte bei 210 nm im Durchfluß. Das Peptid wurde dann mittels HPLC-Analyse in den Fraktionen nachgewiesen und die entsprechenden Fraktionen nach Zusammenschütten nach bekannten Methoden auf einem Ionenaustauscher entsalzt und lyophilisiert. 40 Die Reinheit des somit erhaltenen Peptides wurde mittels HPLC-, Aminosäuren- und Sequenzanalyse bestimmt. Ausbeute: 83%, Reinheit 99,8%. Die analytische HPLC wurde wie folgt durchgeführt: Säuiengröße: 4,6 mm x 250 mm Stationäre Phase: (alkalische hochkondensierte Poly-Kieselsäure) Mobile Phase: 74% 0,1 molares Triethylammoniumphosphat, pH 2,25, 26% Methanol Temperatur: 20'C Druck: 148 bar Fluß: 1,5 ml/Minute Detektion: 210 nm

In Fig.1 ist das entsprechende Chromatogramm abgebildet. Die Ordinate entspricht der optischen Dichte bei 210 nm, und die Abszisse entspricht der Retentionszeit in Minuten. 55

Claims (2)

1. AT 398 767 B Beispiel 2: CIS-Pressin Es wird im wesentlichen wie in Beispiel 1 vorgegangen, jedoch mit folgenden Abweichungen: Säule: 52 x 480 mm Packung: Umkehrphasenmaterial (Ci8 200-100) Fließmittel: 18% Acetonitril / 82% 0,12 Μ TEAP pH 2,9 0,52% DMF, 0,05% NTA Durchfluß: 18 ml/min. Druck: 20 bar Detektion: 232 nm Probemenge: 5 g gelöst in 200 ml dest.Wasser Ausbeute: 78% Reinheit: 99,5% Beispiel 3: Asp-Ser-Asp-Pro-Arg Hamburger Peptid Es wird im wesentlichen wie in Beispiel 1 vorgegangen, jedoch ist keine Entsalzung nötig, sondern eine direkte Lyophilisation der gesammelten Fraktionen. Weitere Abweichungen waren: Säule: 37 x 1083 mm Packung: Umkehrphasenmaterial (Ci s 30-60) Fließmittel: 10% Methanol / 0,1% Trifluoressigsäure (TFA) in dest.Wasser, 0,3% NMP, 0,045% EDTA Druck: 17 bar Durchfluß: 25 ml/Min. Detektion: 210 nm, Probemenge: 3 g gelöst in 70 ml dest.Wasser Ausbeute: 85% Reinheit: 99,7% Patentansprüche 1. Verfahren zur Reinigung eines Rohpeptids mittels präparativer Mitteldruckflüssigkeitschromatographie, wobei man das zu reinigende Pentid auf eine Chromatographie-Säule aufträgt, die Umkehrphasenmate-rial-Silica-Material, d.h. alkylierte hochkondensierte Polykieselsäure mit einer Korngröße von 20 bis 90 Mikrometer und mit einer Porengröße von 6 bis 30 Nanometer, als stationäre Phase enthält, bei einem Druck von C bis 40 bar mit einer mobilen Phase entweder isokratisch oder mit einem Gradienten eluiert, so das Gemisch auftrennt und das auf diese Weise erhaltene Eluat fraktioniert, und wobei das zu reinigende Peptid in möglichst konzentrierter Form auf die Säule aufgetragen wird und die mobile Phase aus (a) einem Gemisch aus wenigstens einem organischen Lösungsmittel und Wasser, oder (b) einem Gemisch aus wenigstens einem organischen Lösungsmittel und einer Pufferlösung mit einem pH-Wert von 2 bis 10, oder (c) einer rein wässerigen Pufferlösung mit einem pH-Bereich von 2 bis 10, besteht, dadurch gekennzeichnet, daß die mobile Phase in allen drei obigen Fällen (a) bis (c) zusätzlich noch 1. als Chelierungsmittel wenigstens eine Aminocarbonsäure oder eine Nitrilocarbonsäure in einer Menge von 0,01 bis 0,1 Vol.-%, insbesondere 0,05 Vol.-%, bezogen auf das Gesamtvolumen der mobilen Phase, und 2. wenigstens eine stark polare organische Verbindung, nämlich Hexamethylenphosphortriamid, Dimethylsulfoxid (DMSO), Dimethylformamid (DMF) und M-Methylpyrrolidon (NMP) in einer Menge von 0,05 bis 1 Vol.-%, insbesondere 0,5 Vol,-%, bezogen auf das Gesamtvolumen der mobilen Phase, in Kombination enthält.
2. 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die mobile Phase als Chelierungsmittel Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) oder Nitrilotriessigsäure (NTA) enthält. 5 AT 398 767 B Hiezu 1 Blatt Zeichnungen 6