DE3317092A1

DE3317092A1 - Analoga von neurohypophysaeren hormonen mit inhibierungseigenschaften, ihre herstellung und pharmazeutische mittel

Info

Publication number: DE3317092A1
Application number: DE19833317092
Authority: DE
Inventors: Tomislav Roztoky Barth; Karel Jo&scaron;t; Michal Dipl.-Ing. Lebl; Alena Machová; Linda Servítová; Ji&rcaron;ina Praha Slaninová
Original assignee: Czech Academy of Sciences CAS
Current assignee: Czech Academy of Sciences CAS
Priority date: 1982-05-10
Filing date: 1983-05-10
Publication date: 1983-11-10
Also published as: IT8321002A1; BE896685A; GB2121052A; GB2121052B; SE8302643D0; IT1164212B; FR2526318B1; SE8302643L; FR2526318A1; DK199983A; SE460051B; IT8321002A0; CH653346A5; NL8301663A; DK199983D0; GB8312320D0

Description

Analoga von neurohypophysären Hormonen mit Inhibierungseigenschaften, ihre Herstellung und pharmazeutische Mittel

Die Erfindung betrifft Analoga der neurohypophysären Hormone Oxytocin und Vasopressin, die gegenüber der uterotonischen und pressorischen Aktivität der Naturhormone Inhibierungswirkungen aufweisen, ein Verfahren zu ihrer Herstellung sowie entsprechende pharmazeutische Zusammensetzungen. Gemeinsames Strukturmerkmal aller dieser Analoga ist das Vorliegen einer aromatischen, hydrophoben D-Aminosäure in Stellung 2. Dieses strukturelle Merkmal ist hauptsächlich für die Inhibierungswirkungen verantwortlich, wobei weitere strukturelle Modifizierungen des Moleküls die Inhibierungswirkung unterstreichen oder qualitativ verändern.

Es ist bekannt, daß neurohypophysäre Hormone eine Reihe von biologischen Aktivitäten aufweisen (Handbook of Experimental Pharmacology, Vol. XXIII: Neurohypophysial Hormones and Similar Polypeptides (B. Berde, Ed.), Springer-Verlag, 1968, Berlin) , aufgrund deren sie in der Medizin verwendet werden. In manchen Fällen werden andererseits Stoffe gebraucht, die einige dieser Aktivitäten hemmen. Im Rahmen der Erfindung

233-S10233-SF-Bk

»♦ " * !SS»»

wurde nun festgestellt, daß solche Verbindungen durch Einführung einer aromatischen hydrophoben D-Aminosäure in das Molekül der neurohypophysaren Hormone anstatt des Tyrosinrests in der Stellung 2 gewonnen werden können. Im Vergleich zu früher publizierten Analoga (Rudinger J., Krejci I., Handbook of Experimental Pharmacology, Vol. XXIII, Neurohypophysial Hormones and Similar Polypeptides (B. Berde, Ed.), S. 748-801, Springer Verlag, Berlin 1968; Sawyer, W. H., Grzonka, Z., Manning, M., MoI. Cell. Endocrinol. 22, (1981) 117-134) weisen die erfindungsgemaßen Analoga eine stärkere Inhibierungswirkung auf, wobei zugleich die Möglichkeit einer qualitativen Änderung der biologischen Aktivitäten besteht, beispielsweise die Erzielung einer protrahierten Inhibierungswirkung.

Die erfindungsgemäßen Analoga der neurohypophysaren Hormone besitzen die allgemeine Formel

R³-CH-C0-NH-CH-C0-Xⁱ-Gln-Asn-NH-CH-C0-Pro-X²~X·⁵ ι

CH₀ ι ί

in der bedeuten;

R¹ und R² Wasserstoff oder Methyl,

R Wasserstoff, Amino oder TriglycyJami.no,

R⁴ Wasserstoff, Methyl, Ethyl oder Ethoxy,

R⁵ -S-CH₂- oder -S-S-,

X den Rest des Isoleucins oder Phenylu

X den Rest des Leucin^ oder Ly^ins

und
X Glycinamido oder Hydroxy,

wobei alle chiralen Aminosäuren der L-Reihe und die mit * bezeichnete Aminosäure der D-Reihe angehören.

Bevorzugte erfindungsgemäGe Analoga weisen folgende Kombinationen der Gruppen R bis R und X bis X auf:

Verbin dung	R¹	R²	R³	R*	R⁵	X¹	X²	X³
1	H	H	H	H	S-CH₂	He	Leu	GIyNH₂
2	H	H	H	OC₂H₅	S-CH₂	He	Leu	GIyNH₂
3	H	H	H	CH₃	S-CH₂	He	Leu	GIyNH₂
4	H	H	H	C₂H₅	S-CH₂	He	Leu	GIyNH₂
VJl	H	H	H	C₂H₅	S-S	He	Leu	GIyNH₂
6	hl	H	NH₂	C₂H₅	S-S	He	Leu	GIyNH₂
7	CH₃	CH₃	NH₂	C₂H₅	S-S	He	Leu	GIyNH₂
8	H	H	NH₂	^C2^H5	S-S	Phe	Lys	GIyNH₂
9	H	H	Gly-Gly-Gly-NH	C₂H₅	S-S	He	Leu	GIyNH₂
10	H	H	H	CH₃	S-CH₂	He	Leu	OH

Die oben angeführten Analoga meisen starke Inhibierungswirkungen auf. In der nachstehenden Tabelle sind Zahlenwerte für diese Aktivitäten angegeben, wobei pA_ den negativen dekadischen Logarithmus der Inhibierungskonstante nach der Beziehung

= -log λ-⁵—

^A50

bedeutet, in der B die Konzentration des Inhibitors (in mol/1), A_ro die zu 50 % der maximalen Wirkung führende Agonistenkon-

zentration (Oxytocin) und A₅₀₅ die zu 50 % der maximalen Wirkung führende Agonistenkonzentration in Gegenwart des Inhibitors der Konzentration B (Eggens, P., Schwartz, I.L., Walter, R., J. Gen. Physiol. 52 (1968) 465) bedeuten. Die Tests wurden an isolierten Rattengebärmuttern durchgeführt.

Verbindung	PA₂
1	8,26
2	7,54
3	8,73
4	8,73
5	8,06
6	8,15
7	8,09
8	7,05^a
9	6,14^b
10	8.8

Negativer dekadischer Logarithmus der Analogonkonzentration, die zu einer Verringerung der biologischen Wirkung des Vasopressins (dh des Blutdrucks bei der despinalisierten Ratte) auf 50 % des ursprünglichen Werts führt (Schild, H.O., Brit. J. Pharmacol. Chemother, 2. (1947) 189): Im Test irt vivo ist ein Blutvolumen der Ratte von 6,7/100 g Körpergewicht vorausgesetzt (Nestor, J.J., Ferger, M.F., du Vigneaud V., J. Med. Chem. _18(1975) 284).

Das Analogon weist eine prolongierte Inhibierungswirkung gegenüber der uterotonischen Aktivität des Oxytocins beim Test an der Rattengebärmutter in vivo im Vergleich mit der äquipotenten Dosis (2-D-p-Ethy!phenylalanin)-oxytocin auf.

Die Inhibierungswirkungen bleiben auch erhalten, wenn der Glycinamidrest aus dem Molekül beseitigt ist (Verbindung 10); von diesem Typ der Modifikation ist bekannt (Ss-Patentanmeldungen PV 2803-82, PV 2099-81) und PV 8301-82), daß er die endokrinen Aktivitäten eliminiert, was bei der Anwendung der In-

I · ο » ■>

„ C « »

hibitoren sehr günstig ist. Durch Acylierung der primären ος-Aminogruppe mit einer kurzen Peptidkette sind Inhibitoren mit verlängerter Wirkung zugänglich. Diese verlängerte Wirkung wird durch die sukzessive enzymatische Abspaltung des hinzugefügten Molekülteils und die sukzessive Produktion des eigenen Inhibitors verursacht, dh die Ausnutzung des Prinzips der Hormonogenwirkung (Jeränkovä-Ksandrovä, Z., Bisset, G.W., Jost, K., Krejci, I., Pliska, V., Rudinger, J., Rychlik, I., Sorm, F., Brit. J. Pharmacol. 26 (1966), 615-632) auf dem Gebiet der Inhibitoren.

Das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung der Analoga der neurohypophysären Hormone beruht auf der Synthese entsprechender, gegebenenfalls modifizierter Polypeptide mit einer aromatischen, hydrophoben D-Aminosäure in Stellung 2 und deren Cyclisierung zu den betreffenden Analoga, der sich

es

eine weitere Modifizierung anschließen kann; ist in den Ausführungsbeispielen näher erläutert.

Beispiel 1

2-D-Phenylalanin-desamino-6-carba-oxytocin

o-Nitrobenzolsulfonyl-D-phenylalanyl-isoleucyl-glutaminylasparaginyl-S-ß-carboxyethyl-homocystelnyl-prolyl-leucylglycinamid (150 mg) wurde in Dimethylformamid (4 ml) gelöst; nach Zugabe von Chlorwassersäure in Ether (3,2 N; 0,4 ml) wurde das entstandene Gemisch 6 min bei Raumtemperatur stehengelassen. Durch Zugabe von Ether wurde das Hydrochlorid des Octapeptids ausgefällt, das nochmals aus Dimethylformamid und Ether umgefällt, dann im Vakuum getrocknet wurde. Danach wurde es in Dimethylformamid (4 ml) gelöst; nach Zugabe von Hydroxybenzotriazol (181 mg) und Abkühlung auf 0 ⁰C wurde zu dem Gemisch Dicyclohexylcarbodiimid (200 mg) zugegeben. Die

Lösung wurde 1 h bei O ⁰C und 1,5 h bei Raumtemperatur gerührt. Die ausgeschiedenen Kristalle von Dicyclohexylharnstoff wurden abgesaugt; die Lösung wurde in auf 45 ⁰C erwärmtes Methanol (150 ml) eingegossen, worauf der pH-Wert des Gemischs durch Zugabe von N-Ethylpiperidin auf 8,5 eingestellt wurde. Das Gemisch wurde dann 2 h auf 45 ⁰C gehalten und danach auf ein kleines Volumen eingeengt. Durch Zugabe von Ether wurde das Produkt ausgefällt, das' abgesaugt und im Vakuum getrocknet wurde (140 mg). Ein Teil des Produkts (30 mg) wurde in einem Gemisch aus Methanol und Wasser (1:1, 10 ml) gelöst

von mit

und auf eine Säule (50 χ 0,9 cm)/0ctadecylketten modifiziertem Silicagel aufgegeben. Die Elution wurde mit einem Gemisch aus 55 % Methanol und 0,05 %iger wässeriger Trifluoressigsäure durchgeführt. Die die Verbindung (k = 7,3) enthaltende Fraktion wurde im Vakuum konzentriert und lyophilisiert. Es wurden 6,5 mg nach HPLC und TLC in vier Systemen reine Verbindung gewonnen.

Analyse für C	44^H6	7^N11°	11^S	I	7	-2H₂C	) (994,2):
	%	C	7	/ο π	% N
Berechnet:	53	,16	,20	15,50
gefunden :	52	,88	,39	15,29.

Aminosäureanalyse:

Asp 1,04, GIu 1,05, Pro 0,95, GIy J,04, He 0,94, Leu 1,05, Phe 0,98, HCy(C₂H₄COOH) 0,97.

Beispiel 2

2-D-ß-Ethyltyrosin-desamino-6-carba-oxytocin

o-Nitrobenzolsulfonyl-D-O-ethyltyrosyl-isoleucyl-glutaminylasparaginyl-S-ß-carboxyethyl-homocysteinyl-prolyl-leucyl-

- 12 -

glycinamid (130 mg) wurde wie in Beispiel 1 cyclisiert. Es wurden 135 mg Rohprodukt gewonnen, von dem ein Teil (30 mg) in einem Methanol-Wasser-Gemisch (4:6) gelöst und auf eine Säule (50 χ 0,9 cm) mit Silicagel, das mit Octadecylketten modifiziert war, aufgegeben wurde. Die Elution wurde mit einem Gemisch aus Methanol und 0,05 %iger Trifluoressigsäure (1:1) durchgeführt. Die die Verbindung (k = 26,3) enthaltende Fraktion wurde konzentriert und lyophilisiert. Es wurden 6,2 mg nach HPLC und TLC reine Verbindung gewonnen.

Analyse für 0,Ji₇₁N₁₁O₁₀S-A H₉O (1074):

4o /1 11 LZ *-

% C % H % H

Berechnet: 51,43 7,41 14,34

gefunden : 51,27 7,65 14,08.

Aminosäureanalyse:

Asp 1,02, Gen 1,03, Pro 1,00, GIy 1,04, lie 0,93, Leu 0,98, Tyr(Et) 0,41, Tyr 0,56, HCy(C₂H₄COOH) 0,92.

Beispiel 3

2-D-p-Methylphenylalanin-desamino-6-carba-oxytocin

o-Nitrobenzolsulfonyl-D-p-methylphenylalanyl-isoleucylglutaminyl-asparaginyl-S-ß-carboxyethyl-homocysteinyl-prolylleucyl-glycinamid (220 mg) wurde wie in Beispiel 1 cyclisiert. Ein Teil des Rohprodukts (30 mg) wurde wie in Beispiel 1 gereinigt. Die die Verbindung (k = 13,6) enthaltende Fraktion wurde im Vakuum konzentriert und lyophilisiert. Es wurden 7,3 mg nach HPLC und TLC reine Verbindung gewonnen.

Analyse für C^	%	¹H⁰:	L1^S	• 3 H₂O	(1026):
	52,	C		Y H	% N
Berechnet:	52,	67	7	,37	15,01
gefunden :	40	7	,61	14,83

Aminosäureanalyse:

Asp 1,00, GIu 1,00, Pro 1,05, GIy 1,01, He 0,91, Leu 1,04, Phe(Me) 0,99, HCy(C₂H₄COOH) 0,99.

Beispiel 4

2-D-p-Ethylphenylalanin-desamino-6-carba-oxytocin

o-Nitrobenzolsulfonyl-D-p-ethylphenylalanyl-isoleucylglutaminyl-asparaginyl-S-ß-carboxyethyl-homocysteinyl-prolyl-leucyl-glycinamid (200 mg) wurde cyclisiert und ein Teil des Produkts (30 mg) wie in Beispiel 1 gereinigt. Es wurden 5,3 mg nach HLPC und TLC reine Substanz gewonnen.

Analyse für 0.,H₇₁N₁₁O₁₁S-A H_o0 (1058):

46 /1 11 11 Z.

% C % H % N Berechnet: 52,21 7,52 14,56 gefunden : 51,90 7,54 14,41

Aminosäureanalyse:

Asp 1,01, GIu 1,03, Pro 0,94, GIy 0,99, He 0,92, Leu 1,05, Phe(Aet) 1,00, HCy(C₂H₄COOH) 0,95.

Beispiel 5

2-D-p-Ethylphenylalanin-desamino-oxytocin

S-Benzylmercaptopropionyl-D-p-ethylphenylalanyl-isoleucylglutaminyl-asparaginyl-S-benzylcysteinyl-prolyl-leucyl-glycinamid (50 mg) wurde in flüssigem Ammoniak gelöst und mit Natrium bis zur Erreichung einer 1 min anhaltenden blauen Färbung reduziert. Die blaue Färbung wurde dann durch Zugabe eines Tropfens Essigsäure beseitigt und das Gemisch lyophilisiert. Das Lyophilisat wurde in 0,1M HCl (8 ml)

- 14 -

gelöst; die Lösung wurde mit Wasser auf 100 ml verdünnt und ihr pH-Wert mit 0,1M NaOH auf 7 eingestellt. Danach wurde eine Lösung von ICfFe(CN),] (25 mg in 5 ml Wasser) innerhalb von 20 min unter ständiger Einhaltung des pH-Werts von 7 zugegeben. Das Gemisch wurde dann noch 40 min bei Raumtemperatur gerührt. Anschließend wurde der pH-Wert durch Zugabe von Essigsäure auf 4 eingestellt und die Lösung mit einer Hochdruckpumpe auf eine Säule (25 χ 0,4 cm) mit Silicagel aufgebracht, das mit Octadecylketten modifiziert war. Die Säule wurde danach mit Wasser gewaschen; die Peptide wurden mit einem Gemisch aus 80 % Methanol und 0,55 %iger wässeriger Trifluoressigsäure eluiert. Das Eluat wurde im Vakuum eingeengt und lyophilisiert. Das Lyophilisat wurde wiederum in einem Gemisch von Methanol und Wasser (1:1, 8 ml) gelöst, auf eine Säule (50 χ 0,9 cm) mit Silicagel, das mit Octadecylketten modifiziert war, aufgebracht und mit einem Gemisch aus Methanol und 0,05 %iger Trifluoressigsäure (65 : 35) eluiert. Die die Verbindung (k = 16,6) enthaltende Fraktion wurde im Vakuum eingeengt und lyophilisiert. Es wurden 8,6 mg nach HLPC und TLC reine Substanz gewonnen.

Analyse für	^C45^H	^!69^NJ	7	¹IlV	4H₂	0 (
	%	C	7	% H	%	N
Berechnet:	50,	22	,21	14	,32
gefunden :	49,	94	,24	14	,18

Aminosäureanalyse:

Asp 1,02, GIu 0,97, Pro 0,89, GIy 1,00, Cys 0,53, He 0,91, Leu 1,00, Phe(Et) 1,00.

Beispiel 6

2-D-p-Ethylphenylalanin-oxytocin

3 φΟΛ*

- 15 -

M ^-Benzyloxycarbonyl-S-benzylcysteinyl-D-p-ethylphenylalanyl-isoleucyl-glutaminyl-asparaginyl-S-benzylcysteinyl-prolyl-leucyl-glycinamid (200 mg) wurde wie im Beispiel 5 reduziert und oxidiert. Die Cyclisierungslosung wurde auf eine Säule eines Kationenaustäuschers (30 ml) in der Carboxylform aufgebracht; nach Waschen der Säule mit 0,25 %iger Essigsäure wurden die Peptide mit 50 %iger Essigsäure eluiert. Ein Drittel des durch Lyophilisierung gewonnenen Produkts wurde in einem Gemisch aus Methanol und Wasser (1 : 1, 8 ml) gelöst und auf eine Säule (50 χ 0,9 cm) mit Silicagel, das mit Octadecylketten modifiziert war, aufgebracht. Die Elution wurde mit einem Gemisch von Methanol (60 SS) und 0,1M Ammoniumacetat (40 %) vom pH-Wert 7 durchgeführt. Die die Substanz (k = 21,1) enthaltende Fraktion wurde im Vakuum eingeengt und lyophilisiert. Es wurden 16,3 mg nach HLPC und TLC reine Verbindung gewonnen.

Analyse für (	^:45^H	70^Ni:	?°1	I	7	S ·2	^H2	0-C₂H₄O₂	(1115):
	%	C	6	X H		% N
Berechnet:	50	,61	,05	15	,07
gefunden :	50	,36	,181	15	,23

Aminosäureanalyse:

Asp 0,96, GIu 0,98, Pro 1,02, GIy 0,96, Cys 1,73, He 1,06 Leu I;o3, Phe(Et) 1,02.

Beispiel 7

l-Penicillamino-2-D-p-ethylphenylalanin-oxytocin

N^Benzyloxycarbonyl-S-benzylpenicillaminyl-D-p-ethylphenylalanyl-isoleucyl-glutaminyl-asparaginyl-S-benzylcysteinylprolyl-leucyl-glycinamid (200 mg) wurde wie in Beispiel 5 reduziert und oxidiert. Das Cyclisierungsgemisch wurde wie in

£ 111 β * e. « !> Ο»*

- 16 -

Beispiel 6 verarbeitet und gereinigt mit dem Unterschied, daß für die Elution ein 65 % Methanol enthaltendes Gemisch verwendet wurde. Es wurden 8,2 mg nach HLPC und TLC reine Substanz gewonnen.

Analyse für C₄₇H₇₄N₁₂O_nS₂^ H₂O-C₂H₄O₂ (1161):

% C % H % N Berechnet: 50,67 7,29 14,47 gefunden : 50,78 7,43 14,31

Aminosäureanalyse:

Asp 0,98, GIu 1,00, Pro 0,89, GIy 1,00, He 1,03, Leu 1,02, Phe(Et) 0,97, Cys+Pen 1,48.

Beispiel 8

2-D-p-Ethylphenylalanin-8-lysin-vasopressin

N-Benzyloxycarbonyl-S-benzylcysteinyl-D-p-ethylphenylalanylphenylalanyl-glutaminyl-asparaginyl-S-benzylcysteinyl-prolyl-N -p-toluolsulfonyllysyl-glycinamid (100 mg) wurde in flüssigem Ammoniak (40 ml) mit Natrium bis zur Entstehung einer blauen, während 1 m bestehenbleibenden Färbung reduziert. Danach wurde die Farbe durch Zugabe von Essigsäure beseitigt, worauf die Lösung lyophilisiert wurde. Der Trockenrest wurde in 0,1M HCl (10 ml) gelöst, mit Wasser auf ein Volumen von 200 ml verdünnt und auf pH 7 eingestellt; nach Zugabe einer Lösung von K-XFe(CN)^J bis zu einer beständigen gelben Färbung wurde dieser pH-Wert unter Rühren 1 h aufrechterhalten. Danach wurde die Lösung auf eine Säule mit einem Kationenaustauscher in der Carboxylatform aufgebracht; die Säule wurde mit 0,05 %iger Essigsäure gewaschen und das Produkt mit 50 %iger Essigsäure eluiert. Nach Lyophilisierung wurde

- 17 -

das Produkt in Wasser (10 ml) gelöst und auf eine Säule (50 χ 0,9 cm) mit Silicagel,das mit Octadecylketten modifiziert war, aufgebracht. Die Elution wurde mit einem Gemisch aus 40 % Methanol und 60 % Trifluoressigsäure (0,1 %ige wässerige Säure) durchgeführt. Die entsprechenden Fraktionen wurden lyophilisiert. Die Reinheit des Produkts wurde durch Dünnschichtchromatographie (4 Systeme), Flüssigchromatographie und Papierelektrophorese (2 Puffer von verschiedenem pH-Wert) nachgewiesen.

Aminosäureanalyse:

Lys 1,07, Asp 1,03, GIu 0,92, Pro 0,94, GIy 1,04, Cys 1,84, Phe 1,06, Phe(Et) 0,92.

Beispiel 9

N^-Glycyl-glycyl-glycyl^-D-p-ethylphenylalanin-oxytocin

Zu einer Lösung von 2-D-p-ethylphenylalanin-oxytocin (4 mg) in 0,3 ml Wasser wurde eine Lösung des N-Hydroxysuccinimidesters von o-Nitrobenzosulfonyl-glycyl-glycylglycin (10 mg) in 0,3 ml Dimethylformamid zugefügt. Nach 2 h Rühren bei Raumtemperatur wurden noch 14 mg aktivierter Ester von Triglycin zugegeben, worauf die Lösung durch Zugabe von 11 μΐ IM NaOH auf pH 8 alkalisch gemacht wurde. Die Reaktion wurde durch Hochdruckflüssigchromatographie (Reversphasenchromatographie verfolgt). Nach Verschwinden der Ausgangssubstanz (20 h) wurde die Lösung im Ölpumpenvakuum bei Raumtemperatur eingedampft; der Trockenrest wurde in Methanol (1 ml) und nach Zugabe von 2,3M HCl in Ether (60 μΐ) gelöst; nach 5 min Stehen bei Raumtemperatur wurde die Lösung wieder eingedampft. Der Trockenrest wurde in 1 ml 3M Essigsäure suspendiert und abfiltriert; das Filtrat wurde nach Verdünnung mit 5 ml Wasser auf eine Säule (üü χ 0,9 cm)

mit Silicagel, das mit Octadecylketten modifiziert war (Kohlenstoffgehalt 15 %) aufgebracht. Die Elution wurde bei einem Durchsatz von 4 ml/min nach folgendem Programm der mobilen Phase durchgeführt: 0-40 min Methanol-0,1 %ige Trifluoressigsäure 40:60; 40 - 50 min linearer Gradient bis zu einem Gehalt von 60 % Methanol. Die entsprechenden Fraktionen wurden im Vakuum eingeengt und lyophilisiert. Es wurden 2,3 mg chromatographisch (TLC, HPLC) und elektrophoretisch reine Substanz gewonnen.

Aminosäureanalyse:

Asp 0,99, GIu 1,05, Pro 0,90, GIy 4,08, Cys 1,29, He 0,96, Leu 1,02, Phe(Et) 0,99.

Beispiel 10

2-D-p-Methylphenylalanin-9-desglycinamido-desamino-6-carba-oxytocin

2-D-p-Methylphenylalanin-desamino-6-carba-oxytocin (2,5 mg) wurde in 50 μΐ Methanol und 300 μΐ 20 mM Phosphatpuffer pH 7,7 gelöst; nach Zugabe von 2,5 mg Chymotrypsin wurde das Gemisch bei 37 ⁰C 12 h inkubiert. Die Reaktion wurde durch Flüssigchromatographie verfolgt. Nach Verschwinden des Ausgangsstoffs wurde das Reaktionsgemisch auf eine Säule (25 χ 0,4 cm) mit Silicagel, das mit Octadecylketten modifiziert war, aufgebracht. Als mobile Phase wurde ein Gemisch aus 40 % Methanol und 60 % 0,05M Ammoniumacetat pH 7,0 verwendet. Nach der Lyophilisierung wurden 1,6 mg Substanz gewonnen, die aufgrund der Dünnschichtchromatographie in 4 Systemen und der hochwirksamen Flüssigchromatographie in 2 Systemen chromatographisch rein war.

Aminosäureanalyse:

Asp 0,96, GIu 0,98, Pro 1,02, HCy(C₂H₄CO₂H) 0,93, He 1,03,

Leu 1,03, Phe(Me) 1,05.

Die erfindungsgemäßen pharmazeutischen Mittel enthalten mindestens ein anspruchsgemäßes Analogon als Wirkstoff. Sie sind aufgrund ihrer Inhibierungswirkungen gegenüber der
uterotonischen und pressorischen Wirksamkeit der natürlichen neurohypophysären Hormone sehr vorteilhaft therapeutisch anwendbar, insbesondere in der Humanmedizin.

Claims

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BEETZ & PARTNER : :_##: ' :,.·...· Patentanwälte 3317092

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Dr.-Ing. W. TIMPE

Dipl.-Ing. J. SIEGFRIED

Priv.-Doz. Dipi.-Chem. Dr. rer. nat. W.SCHMITT-FUMIAN

Dipl.-Ing. K. LAMPRECHT 11981

Ansprüche

. /Analoga von neurohypophysären Hormonen mit Inhibierungseigenschaften der allgemeinen Formel

' 5

R^ZCR³CH

ft z\

R³-CH-C0-NH-CH-C0-X¹-Gln-Asn-NH-CH-C0-Pro-X²-X³ ι

CH₀
ι ^

R⁴

in der bedeuten:

R¹ und R² Wasserstoff oder Methyl,

R Wasserstoff, Amino oder Triglycylamino,

R Wasserstoff, Methyl, Ethyl oder Ethoxy,

R⁵ -S-CH₂- oder -S-S-,

X den Rest des Isoleucins oder Phenylalanins,

2
X den Rest des Leucins oder Lysins

und
X Glycinamido oder Hydroxy,

wobei alle chiralen Aminosäuren der L-Reihe und die mit * bezeichnete Aminosäure der D-Reihe angehören.
2. Analogon der Formel nach Anspruch 1 mit R , R , R und R - H, R⁵ = -S-CH₂-, X¹ = He, X² = Leu und X³ -

233-S10233-SF-Bk

12 3
3. Analogen der Formel nach Anspruch 1 mit R , R und R = H,

R⁴ = -OC₂H₅, R⁵ = -S-CH₂-, X¹ = He, X² = Leu und X³ =

12 3
4. Analogon der Formel nach Anspruch 1 mit R , R und R = H,

R⁴ = -CH,. R⁵ = -S-CH₀-, X¹ = He, X² = Leu und X³ = GIyNH₀.

12 3
5. Analogon der Formel nach Anspruch 1 mit R , R und R = H,

R⁴ = -C₀H,., R⁵ = -S-CH₀-, X¹ = He, X² = Leu und X³ = GIyNH₀.

Z. j /L Z

12 3
6. Analogon der Formel nach Anspruch 1 mit R , R und R=H,

R⁴ = -C₀H₁,, R⁵ = -S-S-, X¹ = He, X² = Leu und X³ = GIyNH₀. ζ ο ζ

1 2
7. Analogon der Formel nach Anspruch 1 mit R und R = H,

R³ = -NH₂, R⁴ = -C₂H₅, R⁵ = -S-S-, X¹ = He, X² = Leu und X³ = GIyNH₂.

1 2
8. Analogon der Formel nach Anspruch 1 mit R und R = -CH,,

R³ =-NH₂, R⁴ = -C₂H₅, R⁵ = -S-S-, X¹ = He, X² = Leu und X³ = GIyNH₂.

12 3
9. Analogon der Formel nach Anspruch 1 mit R und R = H, R = -NH₀,

R⁴ = -C₂H₅, R⁵ = -S-S-. X¹ = Phe, X² = Lys und X³ = GIyNH₂.

12 3
10. Analogon der Formel nach Anspruch 1 mit R und R = H, R =

Gly-Gly-Gly-NH-, R⁴ = -C₃H₅, R⁵ = -S-S-, X¹ = He, X² = Leu und X³ = GIyNH₂.

12 3
11. Analogon der Formel nach Anspruch 1 mit R , R und R = H,

R⁴ = -CH,, R⁵ = -S-CH₀-, X¹ = He, X² = Leu und X³ = -OH.
12. Verfahren zur Herstellung der Analoga nach einem der Ansprüche 1 bis 11, gekennzeichnet durch Cyclisierung entsprechender, gegebenenfalls modifizierter Polypeptide mit einer aromatischen, hydrophoben Aminosäure in Stellung 2 sowie ggf an-

schließende weitere Modifizierung.
13. Verfahren nach Anspruch 12 zur Herstellung von 2-D-Phenylalanindesamino-6-carba-oxytocin, gekennzeichnet durch Cyclisierung von o-Nitrobenzolsulfonyl-D-phenylalanyl-isoleucyl-glu taminylasparaginyl-S-ß-carboxyethyl-homocysteinyl-prolyl-leucylglycinamid.
14. Verfahren nach Anspruch 12 zur Herstellung von 2-D-ß-Ethyltyrosin-desamino-6-carba-oxytocin, gekennzeichnet durch Cyclisierung von o-Nitrobenzolsulfonyl-D-O-ethyltyrosylisoleucyl-glutaminyl-asparaginyl-S-ß-carboxyethylhomocysteinyl-prolyl-leucyl-glycinamid.
15. Verfahren nach Anspruch 12 zur Herstellung von 2-D-p-Methylphenylalanin-desamino-6-carba-oxytocin, gekennzeichnet durch Cyclisierung von o-Nitrobenzolsulfonyl-D-p-methylphenylalanyl-isoleucyl-glutaminyl-asparaginyl-S-ß-carboxyethyl-homocysteinyl-prolyl-leucyl-glycinamid.
16. Verfahren nach Anspruch 12 zur Herstellung von 2-D-p-Ethylphenylalanin-desamino-6-carba-oxytocin, gekennzeichnet durch Cyclisierung von o-Nitrobenzolsulfonyl-D-p-ethylphenylalanyl-isoleucyl-glutaminyl-asparaginyl-S-ß-carboxyethyl-homocysteinyl-prolyl-leucyl-glycinamid.
17. Verfahren nach Anspruch 12 zur Herstellung von 2-Q-p-Ethylphenylalanin-desamino-oxytocin, gekennzeichnet durch Cyclisierung von S-Benzylmercaptopropionyl-D-p-ethylphenylalanylisoleucyl-glutaminyl-asparaginyl-S-benzylcysteinyl-prolylleucyl-glycinamid unter Reduktion mit Natrium in flüssigem Ammoniak und Oxidation mit K
18. Verfahren nach Anspruch 12 zur Herstellung von 2-D-p-E.thyl-

phenylalanin-oxytocin, gekennzeichnet durch Cyclisierung von N^-Benzyloxycarbonyl-S-benzylcysteinyl-D-p-ethylphenylalanylisoleucyl-glutaminyl-asparaginyl-S-benzylcysteinyl-prolylleucyl-glycinamid unter Reduktion mit Natrium in flüssigem Ammoniak und Oxidation mit K [Fe(CN)J.
19. Verfahren nach Anspruch 12 zur Herstellung von 1-Penicillamin-2-D-p-ethylphenylalanin-oxytocin_s gekennzeichnet durch Cyclisierung von N ^-Benzyloxycarbonyl-S-benzylpenicillaminyl-D-p-ethylphenylalanyl-isoleucyl-glutaminyl-asparaginyl-S-benzylcysteinyl-prolyl-leucyl-glycinamid unter Reduktion mit Natrium in flüssigem Ammoniak und Oxidation mit K₃[Fe(CN)₆].
20. Verfahren nach Anspruch 12 zur Herstellung von 2-D-p-Ethylphenylalanin-8-lysin-vasopressin, gekennzeichnet durch Cyclisierung von N-Benzyloxycarbonyl-S-benzylcysteinyl-D-p-ethylphenylalanyl-phenylalanyl-glutaminyl-asparaginyl-S-benzylcysteinyl-prolyl-N ^£-p-toluolsulfonyllysyl-glycinamid unter Reduktion mit Natrium in flüssigem Ammoniak und Oxidation mit K,[Fe(CN)J .

S> 6
21. Verfahren nach Anspruch 12 zur Herstellung von N -Glycyl-glycylglycy1-2-D-p-ethylphenylalanin-oxytocin, gekennzeichnet durch Umsetzung von 2-D-p-ethylphenylalanin-oxytocin mit dem N-Hydroxysuccinimidester von o-Nitrobenzol-sulfonylglycyl-glycyl-glycin unter Cyclisierung und Reaktion des entstandenen Produkts mit aktiviertem Triglycinester.
22. Verfahren nach Anspruch 12 zur Herstellung von 2-D-p-Methylphenylalanin-S-desglycinamido-desamino-o-carbaoxytocin, gekennzeichnet durch Cyclisierung von 2-D-p-Methylphenylalanin-desamino-6-carba-oxytocin, gekennzeichnet durch Cyclisierung von o-Nitrobenzolsulfonyl-

D-p-methylphenylalanyl-isoleucyl-glutaminyl-asparaginyl-S-ßcarboxyethyl-homocysteinyl-prolyl-leucyl-glycinamid zu 2-D-pfoethylphenylalanin-desamino-6-carba-oxytocin und enzymatische Abspaltung der Glycinamidogruppe.
23. Pharmazeutische Mittel, gekennzeichnet durch mindestens ein Analogon nach einem der Ansprüche 1 bis 11 als Wirkstoff.