DE3320189A1

DE3320189A1 - Analoga von neurohypophysaeren hormonen mit inhibierungswirkungen, ihre herstellung und pharmazeutische zusammensetzungen

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Publication number: DE3320189A1
Application number: DE3320189A
Authority: DE
Inventors: Petr Praha &Scaron;imek; Tomislav Roztoky Barth; Franti&scaron;ek Dipl.-Ing. Brtník; Karel Jo&scaron;t; Alena Machová; Linda Servítová; Ji&rcaron;ina Praha Slaninová
Original assignee: Czech Academy of Sciences CAS
Current assignee: Czech Academy of Sciences CAS
Priority date: 1982-06-03
Filing date: 1983-06-03
Publication date: 1983-12-08
Also published as: DK233183A; GB2122622A; DK233183D0; SE8303091L; FR2528036A1; US4508645A; NL8301965A; SE8303091D0; CH658061A5; GB2122622B; IT8321431A0; GB8315273D0; BE896943A; IT1164260B

Description

Ceskoslovenskä akademie ved Narodni 3, Prag (CSSR)

Analoga von neurohypophysären Hormonen mit Inhibierungswirkungen, ihre Herstellung und pharmazeutische Zusammensetzungen

Die Erfindung betrifft Analoga von neurohypophysären Hormonen, die gegenüber einigen biologischen Aktivitäten der neurohypophysären Hormone Inhibierungswirkungen aufweisen und Verfahren zu ihrer Herstellung sowie ferner ihre pharmazeutische Verwendung. Diese Analoga können sowohl zum Nachweis der neurohypophysärf Hormone in Körperflüssigkeiten als auch zur pharmakologischen Verwendung dienen beispielsweise bei pathologischer Überproduktion endogener Hormone.

Bisher waren im wesentlichen zwei Strukturabweichungen bekannt, die beim Oxytocin Inhibierungswirkungen hervorrufen. Der Austausch der Hydroxylgruppe des Tyrosins in 2-Stellung gegen eine Methoxygruppe (Berankovä Z., Rychlik I., Jost K., Rudinger J., Sorm F., Coil. Czechoslov. Chem. Commun. 26 (1961) 2673), wobei die Inhibierungswirkung durch gleichzeitige Acetylierung der Oi-Aminogruppe des Cysteins in 1-Stellung gesteigert werden kann (Oost K., ^orm F., Coil. Czechoslov. Chem. Commun, 36_ (1971) 297). Durch Einführung

233-S10244-SF-Bk BAD ORIGINAL

ORIGINAL INSPECTED _ΟΟργ

von zwei Methylgruppen (Schulz H., du Vigneaud V., J. Med. Chem. 9_ (1966) 647) oder von zwei Ethylgruppen (Vavrek R.J., Ferger M. F., Allen G. A., Rich D. H., Blomquist A. T., du Vigneaud V., 3. Med. ehem. 13 (1972) 124) oder einer Polymethylenkette (Nestor J. j., Ferger M. F., du Vigneaud V., J. Med. Chem. 18_ (1975) 284) in ß-Stellung der ß-Mercaptopropionsäure in Kombination mit der Alkylierung des Tyrosins (Sawyer W. H., Grzonka Z., Manning M.: Mol. Cell. Endocrinol. (1981) 117) lassen sich aus diesen Substanzen weitere wirksame Inhibitoren herstellen.

Im Rahmen der Erfindung wurde nun festgestellt, daß auch die Kombination struktureller Variationen wie Alkylierung des Tyrosins und Einführung von zwei Methylgruppen in ß-Stellung des Cysteins in 1-Stellung der Peptidkette und gegebenenfalls Acetylierung der primären Aminogruppe des Cysteins zu Verbindungen mit ausgeprägten Inhibierungswirkungen gegenüber der Wirkung von Oxytocin oder Vasopressin führt.

Ähnlich starke Inhibierungseigenschaften weisen auch Analoga des Vasopressins auf, bei denen sich der Penicillaminrest in 6-Stellung bzw in 1- und 6-Stellung befindet.

Die Erfindung betrifft entsprechend neue Analoga von neurohypophysären Hormonen mit Inhibierungswirkungen der allgemeinen Formel I

A-V-Tyr(B)-X-Gln-Asn-Y-Pro-Z-GlyNH₂ (I), I _: I

in der bedeuten:

A CH₃CO oder H,

V den Penicillaminrest oder Cys,

BAD ORIGINAL

B CH₃ oder H,

X lie oder Phe,

Y Cys oder den Penieillaminrest und

Z Leu oder Lys,

wobei alle chiralen Aminosäuren der L-Reihe angehören.

Es handelt sich erfindungsgemäß insbesondere um folgende

Analoga:

l-N-Acetylpenicillamin-oxytocin ((Verbindung 1) l-Penicillamin-2-O-methyltyrosin-oxytocin (Verbindung 2) l-N-Acetylpenicillamin^-O-methyltyrosin-oxytocin (Verb. 3) l-Penicillamin-e-lysin-vasopressin (Verbindung 4) l-N-Acetylpenicillamin-S-lysin-vasopressin (Verbindung 5) l-Penicillamin^-O-methyltyrosin-S-lysin-vasopressin (Verb.6) l-N-Acetylpenicillamin^-O-methyltyrosin-S-lysin-

vasopressin (Verbindung 7)

o-Penicillamin-S-lysin-vasopressin (Verbindung 8) l-Penicillamin-o-penicillamin-S-lysin-vasopressin (Verb. 9).

Die zu den einzelnen oben angeführten Verbindungen 1 bis 9 gehörenden Strukturkombinationen und einige Angaben zur biologischen Wirksamkeit sind in der nachstehenden Tabelle zusammengefaßt.

Die Inhibierungswirkungen der Substanzen im Test in vivo sind als pA₂~Werte angegeben, die dem negativen Logarithmus derjenigen molaren Konzentration des Inhibitors entsprechen, die die Antwort auf 2X Einheiten des Agonisten so erniedrigt, daß sie gleich der Antwort auf IX Einheiten in Abwesenheit des Inhibitors ist (Schild H.O., Brit. 3. Pharmacol. 2_ (1947) 189 , Dyckes D.F., Nestor J.J., Ferger M.F., du Vigneaud, J. Med. Chem. Γ7 (1974) 260). Im Test in vitro (Gebärmutter in vitro) entspricht der pA₂~Wert dem negativen Logarithmus

der Inhibierungskonstante nach der Beziehung pA^ = -log ) wobei B die Konzentration des Inhibitors (M), A₅₀ die Agonistenkonzentration, die zu 50 % der maximalen Wirkung führt, und A^„ die Agonistenkonzentration, die zu 50 % der maximalen Wirkung in Gegenwart des Inhibitors B führt, bedeuten (Eggene P., Schwartz I.L., Walter R., J. Gen. Physiol. 52 (1968) 465).

BAD ORIGINAL

	A	V	B	X	Y	Z	Inhibierungswirkung pA_?	in situ	antipressori-	antigalaktogo-
ver bin							antiuterotonische Wirkung	_a	sche Wirkung	gische Wirkung
dung	CH₃CO	Pen	H	He	Cys	Leu	in vitro	6,9	unwirksam	0,04^b
1	H	Pen	CH₃	He	Cys	Leu	4,4	_a	7,2	6,8
2	CH₃CO	Pen	CH₃	He	Cys	Leu	8,0	6,3	6,4	0,45^b
3	H	Pen	H	Phe	Cys	Lys	5,4	6,3	6,9	_a
4	CH₃CO	Pen	H	Phe	Cys	Lys	5,6	6,9	unwirksam	unwirksam
5	H	Pen	CH₃	Phe	Cys	Lys	5,5	_a	7,4	6,8
6	CH₃CO	Pen	CH₃	Phe	Cys	Lys	8,1	6,16	6,7	unwirksam
7	H	Cys	H	Phe	Pen	Lys	_a	6,8	6,73	_a
8	H	Pen	H	Phe	Pen	Lys	6,0	7,18	_a
9							6,8

a) nicht bestimmt

b) eigene Aktivität in I.U./mg

N.
1

CO Ca) K) CD

v» ί. U IUJ

Das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung der Analoga des Oxytocins und Vasopressins der Formel I beruht darauf, daß ein lineares Peptid der Formel II

A-V-Tyr(B)-X-GIn-ASn-Y-PrO-Z-GIyNH₂ (II) mit A, B, V, X, Y und Z wie in Formel I unter Erzeugung der Disulfidbindung oxidiert wird.

Die Erfindung wird im folgenden anhand von Ausführungsbeispielen näher erläutert.

Der Penicillaminrest ist nachfolgend mit Pen abgekürzt.

Die Aminosäureanalysen wurden auf einem automatischen Aminosäureanalysator durchgeführt. Die Peptidproben wurden dabei mit 6M HCl in einem Vakuum von 150 Pa bei einer Temperatur von 105 ⁰C 20 h hydrolysiert. Die Oxidation wurde mit Perameisensäure durchgeführt. Die Dünnschichtchromatographie wurde auf Silicagelfolien (Silufol, Kavalier) in folgenden Systemen durchgeführt: 2-Butanol - 98 %ige Ameisensäure Wasser (75:13,5:11,5; Sl), 2-Butanol - 25 %ige wässerige Ammoniaklösung - Wasser (85:7,57,5, S2).l-Butanol - Essigsäure - Wasser (4:1:1, S3), 1-Butanol - Pyridin - Essigsäure - Wasser (15:10:3:6, SA) und Methanol - Chloroform Essigsäure - Wasser (10:15:3:2, S6). Die analytische Elektrophorese wurde auf den Papieren Whatman 3MM in feuchter Kammer bei einem Potentialgefälle von 20V/cm 1 h in IM Essigsäure (pH 2,4) und in Pyridin-Acetat-Puffer (pH 5,7) durchgeführt. Die Substanzen wurden mit Ninhydrin oder mit dem Chlorierungsverfahren nachgewiesen. Zur Gegenstromverteilung wurde eine Ganzglas-Apparatur mit verschiebbarer Ober- und Unterphase verwendet. Die präparative trägerfreie Elektrophorese wurde auf einer früher beschriebenen Apparatur durchgeführt

BAD ORIGINAL

WACHeEREIOHT |

233-34 991P-SF-Bk 12.9.1983

P 33 20 189.7 ^Neue Seiten 9, Ll, 18, 19, 20, 24, 25- und

-S-

(Prusik Z., Sedläkova E., Barth T., Hoppe-Seyler's Z. Physiol. Chem. 353 (172) 1837). Für die hochwirksame Flüssigchromatographie wurden eine aus handelsüblichen Teilen aufgebaute Apparatur und mit Separone SI-C-18 (Laboratorni pristroje, Praha) gefüllte Säulen verwendet..

Beispiel 1

o-Nitrobenzolsulfenyl-O-t-butyltyrosyl-isoleucyl-glutaminylasparaginyl-S-benzylcysteinyl-prolyl-leucyl-glycinamid

Zu einer Lösung des Amids von Isoleucyl-glutaminylasparaginyl-S-benzylcysteinyl-prolyl-leucyl-glycin (1,27 g; Jost K., Rudinger J., Sorm F., Coil. Czechoslov. Chem. Commun. 26 (1961) 2496) in Dimethylformamid (25 ml) wurde N-Hydroxysuccinimidester von o-Nitrobenzolsulfehyl-O-tbutyltyrosin (0,56 g) zugegeben. Nach zweitägigem Rühren wurde ein weiterer Teil des aktiven Esters (0,05 g) zugefügt und weitere 24 h gerührt. Dann wurde das Dimethylformamid abgedampft und der Trockenrest mit Petrolether und Ether verrieben, abfiltriert und mit Wasser, 0,1 M H-SO., Wasser, 0,25 M NaHCO, und Wasser gewaschen. Es wurden 1,2 g (65 %) Produkt erhalten; F. 225 - 229 ⁰C; [^Ä] _Q 0° (c = 0,2; Dimethylformamid); Rj- 0,51 (Sl), 0,36 (S2), 0,65 (S3), 0,74 (S4).

Aminosäureanalyse: Tyr 0,94, He 0,94, GIu 1,03, Asp 1,06,

Cys (BzI) 0,95, Pro 0,95, Leu 1,08, GIy 1,04.

Elementaranalyse für ^c ₅7^H80^Ni2⁰13^S2*^H2⁰

% C % H % N

berechnet: 55,96 6,76 13,74 gefunden : 55,97 6,57 13,70.

Benzyloxycarbonyl-S-benzylpenicillaminyl-tyrosyl-isoleucylglutaminyl-asparaginyl-S-benzylcysteinyl-prolyl-leucylglycinamid; .... . . . -

Zu einer Lösung des oben hergestellten Octapeptids (1,1 g) in Dimethylformamid (15 ml) wurde 2,05M HCl in Ether (1 ml) zugegeben. Nach 7 min Stehenlassen wurde das Hydrochlorid mit Ether ausgefällt (E^ 0,59, E^ 0,33; Fy 0,25 (Sl), 0,17 (S2), 0,24 (S3), 0,64 (S4)). Das Hydrochlorid wurde in Dimethylformamid (10 ml) gelöst; der pH-Wert der Lösung wurde mit N-Ethylpiperidin auf 7,5 - 8,0 (angefeuchtetes pH-Papier) eingestellt; zu der Lösung wurde p-Nitrophenylester von Benzyloxycarbonyl-S-benzy!penicillamin (0,4 g) in Dimethylformamid (3 ml) zugegeben. Nach zweitägigem Rühren wurde eine weitere Menge des aktiven Esters (0,04 g) zugefügt und das Rühren weitere zwei Tage fortgesetzt. Dann wurde das Dimethylformamid abgedampft und der Trockenrest mit Petrolether und Ether verrieben, abfiltriert und mit Wasser, IM HCl, Wasser, 0,25 M NaHCO₃ und Wasser gewaschen. Die gewonnene Substanz (0,77 g) wurde in Trifluoressigsäure (77 ml) gelöst. Nach 1 h Stehen bei Raumtemperatur wurde zu dem Reaktionsgemisch Toluol (77 ml) zugegeben, worauf die Lösung zur Trockne eingedampft wurde. Der Trockenrest wurde mit Ether verrieben, abfiltriert und im Exsikkator über P₉O₅ und KOH getrocknet. Es wurden 0,7 g (57 %) Produkt gewonnen. 0,5 g dieser Substanz wurden in zwei Teilmengen von je 0,25 g durch Gelfiltration weiter gereinigt. Das Produkt wurde durch Abdampfen des Dimethyiformamids und Verreiben des Trockenrests mit Ether isoliert. Es wurden 0,27 g (54 %) Produkt erhalten; F. 228 - 231 ⁰C, [ocj _Q = -42,1° (c = 0,2; Dimethylformamid); Rp 0,54 (Sl), 0,33 (S2), 0,66 (S3), 0,77 (S4),

Aminosäureanalyse: Pen(Bzl) 0,96, Tyr 0,93, He 0,95,

GIu 0,99, Asp 1,02, Cys(BzI) 0,89, Pro 1,04, Leu 1,02, GIy 0,97.

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- 11 -

Elementaranalyse für ^C67^H9o^Ni2°i4^S

% C % H % H

berechnet: 58,75 6,77 12,27

gefunden : 58,70 6,53 12,33.

Acetyl-S-benzylpenicillaminyl-tyrosyl-isoleucyl-glutaminylasparaginyl-S-benzylcysteinyl-prolyl-leucyl-glycinamid

Zu einer Lösung des oben hergestellten Nonapeptids (245 mg) in Essigsäure (2 ml) wurde 35 SSige Bromwasserstofflösung in Essigsäure (2 ml) zugegeben. Nach 15 min Stehen bei Raumtemperatur wurde das Hydrobromid mit Ether ausgefällt (.E₂ λ 0,51; Rp 0,42 (Sl), 0,09 (S2), 0,43 (S3), 0,62 (S4)). Das Hydrobromid wurde in Dimethylformamid (2,5 ml) gelöst; der pH-Wert der Lösung wurde mit N-Ethy!piperidin auf den Wert 7,7 - 8,0 (angefeuchtetes pH-Papier) eingestellt. Zu der Lösung wurde S-Chlor-e-hydroxychinolinylacetat (106 mg) zugegeben. Nach zweitägigem Rühren wurde ein weiterer Teil des aktiven Esters (20 mg) zugefügt und das Rühren noch 24 h fortgesetzt. Dann wurde das Dimethylformamid abgedampft, der Trockenrest ***" mit Petrolether und Ether verrieben, ab filtriert und mit

Wasser, IM HCl, Wasser, 0,25 M NaHCO, und mit Wasser gewaschen. Es wurden 185 mg (70 %) Produkt gewonnen, das durch Gelfiltration weiter gereinigt wurde. Es wurden 151 mg (82 %, Gesamtausbeute 57 Si) Substanz erhalten; F. 226 - 231 ⁰C,[⁰^₀ -39,7° (c = 0,1; Dimethylformamid); Rp 0,49 (Sl), 0,24 (S2), 0,58 (S3), 0,73 (S4).

Elementaranalyse für ^C6i^H86^Hi2⁰i3^S2"^{0>5 H}2°

% C % H % N

berechnet: 57,76 6,91 13,25 gefunden : 57,73 6,89 13,57.

N -Acetyl-l-penicillamin-oxytocin (Verbindung 1)

Das oben beschriebene geschützte Nonapeptid (138 mg) wurde in siedendem flüssigen Ammoniak (150 ml) gelöst und mit Natrium bis zum Auftreten einer blauen, während 10 s beständigen Färbung des Reaktionsgemischs reduziert. Die Lösung wurde dann mit Ammoniumchlorid entfärbt und das Ammoniak absublimiert. Der Trockenrest wurde in 0,01 M HCl (100 ml) aufgelöst und mit Wasser auf ein Gesamtvolumen von 300 ml verdünnt; der pH-Wert der Lösung wurde mit Ο,ΟΙΜ NaOH auf 7,0 eingestellt. Die Oxidation wurde mit 3,3-10"²M K₃[Fe(CN)₆] durchgeführt, das bis zum Auftreten einer gelben, während 1 h beständigen Färbung des Reaktionsgemischs zugegeben wurde. Während der Oxidation wurde der pH-Wert des Reaktionsgemischs zwischen 6,9 und 7,0 gehalten. Das Reaktionsgemisch wurde anschlieOend mit IM HCl auf pH 4,1 angesäuert und auf eine mit einem schwach basischen Anionenaustauscher in Chloridform (50 ml) gefüllte Säule aufgegeben. Die Säule wurde mit Wasser (50 ml) gewaschen; die vereinigten Eluate wurden auf einer mit Separon SI-C-18 gefüllten Säule entsalzt. Nach Durchwaschen der Säule mit Wasser wurde das Produkt mit 90 %igem Methanol ausgewaschen. Das Eluat wurde mit Essigsäure auf pH 4,5 angesäuert und das Methanol abgedampft. Nach der Lyophilisierung wurden 72 mg Produkt gewonnen. 35 mg dieses Produkts wurden durch Hochdruck-Flüssigchromatographie (Methanol - Wasser 4:6) gereinigt. Es wurden 11 mg Produkt gewonnen.[ötj -47,0 ° (c = 0,18; 3M Essigsäure); Rp 0,64 (S4), 0,76 (S6).

Aminosäureanalyse: Pen(Q H) + CyS(O₃H) (2,00), Tyr 0,97 (0,66),

lie 1,00 (1,00), GIu 0,97 (1,00), Asp 0,97 (1,00), Pro 1,03 (0,77), Leu 1,06 (1,00), GIy 1,00 (1,00). Die in Klammern angegebenen Werte beziehen sich auf die mit Perameisensäure oxidierte Probe.

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Elementaranalyse für C₄₇H₇₂N₁₂O₁₃S₂^CH₃COOH-OH₂O (1305):

% C % H % N

berechnet: 46,92 7,10 12,87 gefunden : 46,87 6,72 12,81.

Beispiel 2

t-Butyloxycarbonyl-O-methyltyrosyl-isoleucyl-glutaminylasparaginyl-S-benzylcysteinyl-prolyl-leucyl-glycinamid

Das oben beschriebene Heptapeptid (2,1 g) wurde in Dimethylformamid (50 ml) gelöst; zu der Lösung wurde 2,4,5-Trichlorphenylester von t-Butyloxycarbonyl-O-methyltyrosin (1,1 g) zugegeben. Nach zweitägigem Rühren wurde ein weiterer Teil des aktiven Esters zugefügt (0,2 g) und das Rühren bis zum nächsten Tag fortgesetzt. Dann wurde das Dimethylformamid abgedampft, der Trockenrest mit Petrolether und Ether verrieben, abfiltriert und mit Wasser, 5 %iger Citronensäure, Wasser, 0,25M NaHCO₃ und Wasser gewaschen. Es wurden 1,9 g (67 %) Produkt erhalten. F. 225 - 228 ⁰C; [<*3_D -35,2° (c = 0,2; Dimethylformamid); R_F 0,50 (Sl), 0,32 (S2), 0,59 (S3), 0,72 (S4).

Aminosäureanalyse: Tyr(Me) + Tyr 0,93, He 0,96, Glu 0,99,

Asp 1,01, Cys(Bzl) 1,03, Pro 1,02, Leu 1,04, GIy 1,00.

Elementaranalyse für C₅₃H₇₉N₁₁O₁₃S'⁰'^{5 H}2° (^lli9>·

% C % H % N

berechnet: 56,87 7,20 13,76 gefunden : 56,62 7,10 13,73.

Benzyloxycarbonyl-S-benzylpenicillaminyl-O-methyltyrosyl-iso-

leucyl-glutaminyl-asparaginyl-S-benzylcysteinyl-prolyl-leucyl-

glycinamid

Zu einer Lösung des oben hergestellten Octapeptids (1,5 g) in Essigsäure (15 ml) wurde 35 %ige Bromwasserstofflösung in Essigsäure (15 ml) zugegeben. Nach 5 min bei Raumtemperatur wurde das Hydrobromid mit Ether ausgefällt (E^¹I 0,57, Ες¹:! 0,27; R_F 0,23 (Sl), 0,20 (S2),

0,34 (S3), 0,59 (S4)). Das Hydrobromid wurde in Dimethylformamid

der Lösung
(15 ml) gelöst; der pH-Wert/wurde mit N-Ethylpiperidin auf

7,5 - 8,0 (angefeuchtetes pH-Papier) eingestellt; zu der Lösung wurde p-Nitrophenylester von Benzyloxycarbonyl-S-benzy!penicillamin (0,7 g) in Dimethylformamid (4 ml) zugegeben. Nach 4 Tagen Rühren wurde das Dimethylformamid abgedampft und der Trockenrest mit Petrolether und Ether verrieben, abfiltriert und mit Wasser, IM HCl, Wasser, 0,25M NaHCO₃ und Wasser gewaschen. Es wurde 1,0 g (54 %) Produkt gewonnen, das in vier Teilmengen von je 0,25 g durch Gelfiltration weiter gereinigt wurde. Es wurden 0,59 g (59 %, Gesamtausbeute 32 %) Produkt erhalten; F. 233 - 239 ⁰C; [⁰O₀ -40,2° (c = 0,2, Dimethylformamid); R_f 0,54 (Sl), 0,33 (S2), 0,66 (S3), 0,76 (S4).

Aminosäureanalyse: Pen(Bzl) 0,87, Tyr(Me) + Tyr 0,87,

He 0,94, GIu 0,99, Asp 1,04, Cys(Bzl) 0,88, Pro 1,04, Leu 1,04, GIy 0,99.

Elementaranalyse für C,J-L₀N₁₀O ,,S₀-H₀O (1384):

OO 7£. i.e. 14 Z. *■

% C % H % N

berechnet: 59,03 6,85 12,15 gefunden : 59,05 6,79 12,26.

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l-Penicillamin-2-O-methyltyrosin-oxytocin (Verbindung 2)

Das oben beschriebene geschützte Octapeptid (238 mg) wurde in siedendem flüssigen Ammoniak (250 ml) gelöst und mit Natrium bis zum Auftreten einer blauen, 30 s beständigen Färbung des Reaktionsgemischs reduziert. Die Lösung wurde mit Ammoniumchlorid entfärbt; das Ammoniak wurde absublimiert und der Trockenrest in 0,01 M HCl (100 ml) gelöst. Die Lösung wurde mit Wasser auf ein Gesamtvolumen von 500 ml verdünnt; der pH-Wert der Lösung wurde mit O,1M NaOH auf 7,0 eingestellt. Die Oxidation wurde mit 3,3·10"²M K₃LFe(CN)₆] durchgeführt, das bis zum Auftreten einer gelben, 1 h beständigen Färbung des Reaktionsgemischs zugegeben wurde. Während der Oxidation wurde der pH-Wert des Reaktionsgemischs zwischen 6,9 und 7,0 gehalten. Die Lösung wurde dann mit IM HCl auf 4,5 angesäuert und auf eine mit einem schwach basischen Anionenaustauscher in Chloridform gefüllte Säule aufgegeben. Die Kolonne wurde mit Wasser (50 ml) gewaschen; die Eluate wurden lyophilisiert. Das Produkt wurde durch kontinuierliche trägerfreie Elektrophorese gereinigt. Es wurden 23,1 mg Produkt gewonnen;

[öc] _D o° (c = 0,14; 3M Essigsäure), E^ 0,62, E^ 0,23; R_F 0,62 (S4), 0,56 (56).

Aminosäureanalyse: Pen(0₃H) + CyS(O₃H) 2,09, Tyr(Me) + Tyr 0,95 (0,82), He 0,96 (0,93), GIu 1,02 (1,02), Asp 1,00 (1,02), Pro 0,98 (1,02), Leu 1,02 (1,00), GIy 1,00 (1,00). Die Werte in Klammern beziehen sich auf die mit Perameisensäure oxidierten Probe.

Elementaranalyse für ^C4₆ ^H ₇2^Ni2⁰i2^S2'⁰'^{5 CH}3^C00H'²»^{5 H} ₂°

% C % H % N

berechnet: 50,21 7,08 14,95 gefunden : 50,30 6,72 14,94.

Beispiel 3

Acetyl-S-benzylpenicillaminyl-O-methyltyrosyl-isoleucyl-glutaminylasparaginyl-S-benzylcysteinyl-pröiyl-leucyl-glycinamid

Zu einer Lösung des Nonapeptids (190 mg) in Essigsäure (2 ml) wurde 35 %ige Bromwasserstofflösung in Essigsäure (2 ml) zugegeben. Nach 10 min Stehen bei Raumtemperatur wurde das Hydrobromid mit Ether ausgefällt (E^ ^ 0,50; Rp. 0,47 (Sl), 0,28 (S2), 0,44 (S3), 0,63 (S4)). Das'Hydrobromid wurde dann in Dimethylformamid (5 ml) gelöst; der pH-Wert der Lösung wurde mit N-Ethylpiperidin auf 7,5 - 8,0 (angefeuchtetes pH-Papier) eingestellt, worauf die Lösung mit 5-Chlor-8-hydroxychinolinylacetat (39 mg) versetzt wurde. Nach zweitägigem Rühren wurde eine weitere Teilmenge des aktiven Esters zugefügt und das Rühren weitere zwei Tage fortgesetzt. Dann wurde das Dimethylformamid abgedampft und der Trockenrest mit Petrolether und Ether verrieben, abfiltriert und mit Wasser, IM HCl, Wasser, 0,25M NaHCCL und Wasser gewaschen. Es wurden 140 mg (79 %) Produkt erhalten, das durch Gelfiltration weiter gereinigt würde. Es wurden 97 mg Produkt gewonnen; F. 234 - 238 ⁰C, B*!^ -47,2° (c = 0,1; Dimethylformamid); R_R 0,49 (Sl), 0,27 (S2), 0,55 (S3), 0,73 (S4). :

Elementaranalyse für ^C ₆₂ ^H88^H12°13⁵2'^{2 H}2° ^¹³¹⁰)^:

% C % H ■' % N

berechnet: 56,86 7,08 12,83 gefunden : 56,61 6,84 j 12,76.

N -Acetyl-l-penicillamin^-O-methyltyrosin-oxytocin (Verbindung 3)

Das oben beschriebene geschützte Nonapeptid (87 mg) wurde in siedendem flüssigen Ammoniak (100 ml) gelöst und mit

BAD ORIGINAL

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Natrium bis zum Auftreten einer blauen, 10 s beständigen Färbung des Reaktionsgemischs reduziert. Die Lösung wurde mit Ammoniumchlorid entfärbt und das Ammoniak absublimiert. Der Trockenrest wurde in Ο,ΟΙΜ HCl (100 ml) aufgelöst. Die Lösung wurde auf ein Gesamtvolumen von AOO ml verdünnt. Die Oxidation wurde mit 3,3-10" M K₃[Fe(CN)₆] durchgeführt, das bis zum Auftreten einer gelben, 1 h beständigen Färbung des Reaktionsgemischs zugegeben wurde. Die Lösung wurde dann mit IM HCl auf pH 4,5 angesäuert und auf eine mit einem schwach basischen Anionenaustauscher in Chloridform (50 ml) gefüllte Säule aufgegeben. Die Säule wurde mit Wasser (50 ml) gespült. Die Eluate wurden lyophilisiert. Die erhaltene Substanz wurde durch Gegenstromverteilung im System s-Butanol-0,05 % wässerige Essigsäure (1:1) weiter gereinigt. Nach 100 Verschiebungen der oberen, und 100 Verschiebungen der unteren Phase wurde die Verbindung aus den Röhrchen 44-56 isoliert und durch Gelfiltration weiter gereinigt. Es wurden 7,1 mg Produkt erhalten; PiL -67,0° (c = 0,10; 3M Essigsäure); R_p 0,64 (S4), 0,83 (S6).

Aminosäureanalyse: Pen(0₃H) + CyS(O₃H) (2,05),

Tyr(Me) + Tyr 0,98 (o,35), He 0,98 (1,00), GIu 1,05 (1,03), Asp 1,00 (1,01), Pro 0,96 (0,95), Leu 1,00 (1,00), GIy 1,00 (1,00). Die in Klammern angegebenen Werte beziehen sich auf die mit Perameisensäure oxidierten Probe.

Elementaranalyse für ^C4₈ ^H _7A ^N ₁₂ ⁰13^S2'^{6 H}2° ^(1199):

% C % H % N

berechnet: 48,07 7,23 14,01 gefunden : 48,09 7,34 14,23.

[ NAOHQEREK.»·» ι

Beispiel A

0-Nitrobenzolsulfe,nylasparaginyl-S-ben2ylcysteinyl-prolyl-N^£ p-toluolsulfonyllysyl-glycinamid

Das Amid des S-Benzylcysteinyl-prolyl-N^e -p-toluolsulfonyllysyl-glycins (14,0 g) wur.de in Dimethylformamid (70 ml) gelöst; der pH-Wert der Lösung wurde mit N-Ethy!piperidin, auf 7,5 - 8,0 (angefeuchtetes pH-Papier) eingestellt. Zu der Lösung wurde 2,4,5-Trichlorphenylester des o-Nitrobenzolsulfehylasparagins (11,0 g) zugegeben; das Gemisch wurde bei Raumtemperatur gerührt. Nach 24 h wurde eine weitere Teilmenge des aktiven Esters (1,0 g) zugegeben und das Rühren weitere 24 h fortgesetzt. Dann wurde das Dimethylformamid abgedampft und der Trockenrest mit Petrolether und Ether verrieben, abfiltriert und mit Wasser, O,1M HJ30., Wasser, 0,25M NaHCO, und Wasser gewaschen. Es wurden 15,1 g (76 %) Produkt erhalten; F. 175-179 ⁰C; [^al₀ -62,1° (c = 0,2; Dimethylformamid); Rp 0,55 (Sl), 0,39 (S2), 0,60 (S3), 0,69 (S4).

Aminosäureanalyse: Asp 0,97, Cys(Bzl) 0,98, Pro 1,03, GIy 1,01,

Elementaranalyse für ^c _4u ^H51^N9^u10^S3

% C % H % N

berechnet: 52,56 5,62 13,79 gefunden : 52,23 5,54 13,70.

o-Nitrobenzolsulfenylglutaminyl-asparaginyl-S-benzylcysteinylprolyl-N -p-toluolsulfonyllysyl-glycinamid

Zu einer Lösung der oben hergestellten Verbindung (14,0 g) in Dimethylformamid (50 ml) wurde 2.26M HCl in Ether (14,2 ml) zugegeben. Nach 7 min Stehen wurde das Hydrochlorid mit Ether ausgefällt und mit Ether aus Dimethylformamidlösung umgefällt.

-BAD ORIGINAL

- 19 -

Es wurden 12,3 g Hydrochlorid gewonnen (Eg¹JJ 0,76, E^ 0,42; Rp 0,23 (Sl), 0,21 (S2), 0,21 (S3), 0,64 (S4)). Das Hydrochlorid wurde in Dimethylformamid (50 ml) gelöst; der pH-Wert der Lösung wurde mit N-Ethylpiperidin auf 7,5 - 8,0 eingestellt (angefeuchtetes pH Papier); die Lösung wurde mit 2,4,5-Trichlorphenylester von o-Nitrobenzolsulfenylglutamin (7,9 g) versetzt. Nach 24 h Rühren wurde eine weitere Teilmenge des aktiven Esters (o,8 g) zugegeben. Nach weiteren 24 h wurde das Dimethylformamid abgedampft und der Trockenrest mit Petrolether und Ether verrieben, abfiltriert und mit Wasser, 0,1M H₂SO., Wasser, 0,25M NaHCO und Wasser gewaschen. Es wurden 10,5 g (65 %) Produkt erhalten; F-. 187 - 192 ⁰C; H_n -43,0° (c = 0,2; Dimethylformamid); R_p 0,38 (S₁), 0,24 (S2), 0,49 (S3), 0,69 (S4).

Aminosäureanalyse: GIu 1,08, Asp 1,07, Cys(Bzl) 0,72, Pro 1,01,

GIy 1,06.

Elementaranalyse für

	%	C	%	H	%	N
berechnet:	50	,98	5,	80	14	,53
.gefunden :	50	,79	5,	74	14	,61.

o-Nitrobenzolsulfenylphenylalanyl-glutaminyl-asparaginyl-S-benzylcysteinyl-prolyl-N -p-toluolsulfonyllysyl-giycinamid

Zu einer Lösung der oben hergestellten Verbindung (10 g) in Dimethylformamid (50 ml) wurde 2,26M HCl in Ether (8,9 ml) zugegeben. Nach 7 min Stehen wurde das Hydrochlorid mit Ether ausgefällt und einigemale mit Ether verrieben. Es wurden 7,9 g Hydrochlorid gewonnen (E^ 0,70, E^ 0,40; fy 0,09 (Sl), 0,10 (S2), 0,09 (S3), 0,55 (S4)). Das'Hydrochlorid wurde in Dimethylformamid (40 ml) gelöst; der pH-Wert der Lösung wurde mit N-Ethylpiperidin auf 7,5 - 8,0 (angefeuchtetes pH-Papier)

eingestellt; die Lösung wurde mit 2,4,5-Trichlorphenylester von o-Nitrobenzolsulfenylphenylalanin (4,6 g) versetzt. Nach 24 h Rühren wurde eine weitere Teilmenge (1,0 g) des aktiven Esters zugefügt, worauf das Rühren weitere 24 h fortgesetzt wurde. Dann wurde das Dimethylformamid abgedampft und der Trockenrest mit Ether und Petrolether verrieben, abfiltriert und mit Wasser, O,IM H₂SO^, Wasser, 0,25M NaHCO, und Wasser gewaschen. Es wurden 8,5 g (74 %) Produkt erhalten; F. 206 - 209 ⁰C; IKI₀ -24,0° (c = 0,2; Dimethylformamid); Rp 0,53 (Sl), 0,29 (S2), 0,58 (S3), 0,72 (S4).

Aminosäureanalyse: Phe 1,05, GIu 1,05, Asp 1,03, Cys(Bzl) 0,83,

Pro 1,03, GIy 1,01.

Elementaranalyse für C^₁FU₃N₁₀O₁,S,-0,5 H„0 (1198):

24 OO JLZ iJ J Δ

% C Si H % N

berechnet: 54,12 5,80 14,02 gefunden : 54,02 · 5/64 14,32.

o-Nitrobenzolsulfenyl-O-t-butyltyrosyl-phenylalanyl-glutaminyl- · .asparaginyl-S-benzylcysteinyl-prolyl-N ^f-p-toluolsulfonyllysylglycinamid .-

Zu einer Lösung des oben beschriebenen Heptapeptids (2,4 g) in Dimethylformamid (100 ml) wurde 2,05M HCl in Ether (5,1 ml) zugegeben. Nach 7 min Stehen wurde das Hydrochlorid mit Ether ausgefällt (E^ 0,63, E^ 0,37; R_p 0,18 (Sl), 0,18 (S2), 0,17 (S3), 0,63 (S4)). Das Hydrochlorid wurde in Dimethylformamid (50 ml) gelöst; der pH-Wert der Lösung wurde mit N-Ethylpiperidin auf 7,5 - 8,0 eingestellt (angefeuchtetes pH-Papier); die Lösung wurde mit N-Hydroxysuccinimidester von o-Nitrobenzolsulfenyl-O-t-butyltyrosin (1,1 g) versetzt. Nach 24 h Rühren wurde eine weitere Teilmenge des aktiven Esters (0,2 g) zugefügt und das Rühren bis zum nächsten Tag

♦ «4

!•••„-J· ·..·-..· 3320183

- 21 -

fortgesetzt. Dann wurde das Dimethylformamid abgedampft und der Trockenrest mit Petrolether und Ether verrieben, abfiltriert und mit Wasser, O,1M H₂SO₄, Wasser, 0,25M NaHCO₃ und Wasser gewaschen. Es wurden 2,5 g (88 %) Produkt erhalten; F. 193 - 197 ⁰C; G*]_n -21,1° (c = 0,2; Dimethylformamid); Rp 0,58 (Sl), 0,34 (S2), 0,63 (S3), 0,77 (S4)).

Aminosäureanalyse: Tyr 0,95, Phe 1,02, GIu 1,05, Asp 0,97,

Cys(Bzl) 0,85, Pro 1,06, GIy 1,01.

Elementaranalyse für

	% C	% H	% N
berechnet:	56,41	6,18	12,76
gefunden :	56,24	6,03	12,94.

Benzyloxycarbonyl-S-benzylpenicillaminyl-tyrosyl-phenylalanyl-

glutaminyl-asparaginyl-S-sulfonyllysyl-glycinamid

glutaminyl-asparaginyl-S-benzylcysteinyl-prolyl-N -p-toluol-

Aus dem Octapeptid (1,5 g) wurde auf die oben beschriebene Weise das Hydrochlorid hergestellt, wobei 1,1 ml 2,05M HCl in Ehter verwendet wurde. Das Hydrochlorid wurde in Dimethylformamid (10 ml) gelöst und der pH-Wert der Lösung mit N-Ethylpiperidin auf 7,5 - 8,0 eingestellt (angefeuchtetes pH-Papier); die Lösung wurde mit p-Nitrophenylester von Benzyloxycarbonyl-S-benzylpenicillamin (0,5 g) in Dimethylformamid (4 ml) versetzt. Nach zweitägigem Rühren wurde eine weitere Teilmenge des aktiven Esters (0,05 g) in Dimethylformamid (1 ml) zugegeben und das Rühren weitere zwei Tage fortgesetzt. Dann wurde das Dimethylformamid abgedampft und der Trockenrest mit Petrolether und Ether verrieben, abfiltriert und mit Wasser, IM HCl, Wasser, 0,25M NaHCO₃ und Wasser gewaschen. Das gewonnene Produkt (1,2 g) wurde in Trifluoressigsäure (120 ml) gelöst und 1 h bei Raumtemperatur stehengelassen. Zu der Lösung wurde Toluol (120 ml) zugefügt und

das Gemisch im Vakuum eingedampft. Nach Verreiben des Trockenrests mit Ether wurden 1,1 g (.66 %) Produkt gewonnen; 1,0 g dieses Produkts wurden in vier Teilmengen von je 0,25 g durch Gelfiltration weiter gereinigt. Es wurden 438 mg (58 %) Produkt erhalten; F. 136 - 141 °C;[<*]_D -31,2° (c = 0,2; Dimethylformamid); R_F 0,56 (Sl), 0,30 (S2), 0,68 (S3), 0,71 (S4).

Aminosäureanalyse: Pen(Bzl) 0,88, Tyr 0,87, Phe 1,05, GIu

1,01, Asp. 0,99, Cys(Bzl) 0,88, Pro 0,99, GIy 1,01.

Elementaranalyse	für C	77^H95	N₁₃	O₁₆S₃-	¹H₂O	(1573):
	%	C		Λ> Π	%	N
berechnet:	58	,80	6	,22	11	,58
gefunden :	58	,83	6	,10	11	,76.

l-Penicillamin-8-lysin-vasopressin (Verbindung 4)

Das geschützte Peptid (144 mg) wurde in siedendem flüssigen Ammoniak (150 ml) gelöst und mit Natrium bis zum Auftreten einer blauen, 20 s beständigen Färbung des Reaktionsgemischs reduziert. Das Reaktionsgemisch wurde dann.mit Ammoniumchlorid entfärbt und das Ammoniakisublimiert. Der Rückstand wurde in Ο,ΟΙΜ HCl (50 ml) gelöst; die Lösung wurde mit Wasser auf ein Volumen von 400 ml verdünnt und mit Ether ausgeschüttelt. Reste des Ethers wurden aus der Lösung im Vakuum beseitigt. Die Oxidation wurde mit 3,3·10"²M K₃[Fe(CN)₅] durchgeführt, das bis zum Auftreten einer gelben, 1 h beständigen Färbung zugegeben wurde, wobei der pH-Wert des Reaktionsgemischs mit O,1M NaOH zwischen 6,9 und 7,0 gehalten wurde. Nach der Oxidation wurde das Reaktionsgemisch mit Essigsäure auf pH 3,6 angesäuert und die Lösung an einer mit einem Kationenaustauscher in Carboxylatform (30 ml, 0,07 - 0,15 mm) gefüllten Säule chromatographiert. Nach Waschen der Säule mit 0,25 % Essigsäure wurde das Produkt mit 50 %iger Essigsäure

BAD ORIGINAL

* «a

tr 4 » · * ·

- 23 ~

eluiert und lyophilisiert. Das gewonnene Lyophylisat (71 mg) wurde durch trägerfreie Elektrophorese weiter gereinigt. Es wurden 13,5 mg Produkt erhalten; K_D -12,1° (c = 0,14; 3M Essigsäure); E^f 0,63, E^ 0,61; R_r 0,32 (S4), 0,03 (S6).

Aminosäureanalyse: Pen(0₃H) + CyS(O₃H) (1,94), Tyr 0,97

(0,58), Phe 1,01 (0,96), GIu 1,05 (1,03), Asp 1,04 (1,03), Pro 0,99 (0,93), GIy 1,03 (1,00). Die Werte in Klammern beziehen sich auf die mit Perameisensäure oxidierte Probe.

(1412)

Elementaranalyse	fur C	481 69	N₁₃O₁₂S₂.	3,5 CH₃COC
	%	C	% H	% N
berechnet:	46	,80	6,85	12,90
gefunden :	46	,61	6,06	12,82.
Beispiel 8

Acetyl-S-benzylpenicillaminyl-tyrosyl-phenylalanyl-glutaminyl-

asparaginyl glycir.amid

asparaginyl-S-benzylcysteinyl-prolyl-N -p-toluolsulfonyllysyl-

Das oben beschriebene geschützte Nonapeptid (200 mg) wurde in Essigsäure (2 ml) gelöst; die Lösung wurde mit 35 %iger Bromwasserstoff lösung in Essigsäure (2 ml) versetzt. Nach 10 min Stehen bei Raumtemperatur wurde das Hydrobromid mit Ether ausgefällt (E^ 0,53, R_f 0,55 (Sl), 0,16 (S2), 0,54 (S3), 0,62 (S4). Das Hydrobromid wurde in Dimethylformamid (5 ml) gelöst; der pH-Wert der Lösung wurde mit N-Ethylpiperidin auf 7,5 - 8,0 (angefeuchtetes pH-Papier) eingestellt; zu der Lösung wurde S-Chlor-e-hydroxychinolylacetat (56 mg) zugegeben. Nach zweitägigem Rühren wurde eine weitere Teilmenge des aktiven Esters zugefügt und das Rühren weitere zwei Tage fortgesetzt. Dann wurde das Dimethylformamid abgedampft

und der Trockenrest mit Ether und Petrolether verrieben, ab filtriert und mit Wasser, IM HCl, Wasser, 0,25M NaHCO₃ und Wasser gewaschen; es wurden 126 mg (67 %) Produkt erhalten; F. 136 - IAO ⁰C; E⁵O₀ -7,9° (c = 0,1; Dimethylformamid), R,- 0,54 (Sl), 0,24 (S2), 0,60 (S3), 0,72 (S4).

Elementaranalyse	für C₇	1^H91^N	13⁰I	5^S3'	■ 4	H₂O (1535):
	%	C	%	H		% N
berechnet:	55,	56	6	,50		11,86
gefunden :	55,	38	6	,02		11,83.

N^Acetyl-l-penicillamin-S-lysin-vasopressin (Verbindung 5)

Das geschützte Nonapeptid (105 mg) wurde in siedendem flüssigen Ammoniak (100 ml) gelöst und mit Natrium bis zum Auftreten einer blauen, 10 s beständigen Färbung des Reaktionsgemischs reduziert. Die Lösung wurde mit Ammoniumchlorid entfärbt und das Ammonial^sublimiert. Das Lyophilisat wurde in Ο,ΟΙΜ HCl (100 ml) gelöst, mit Wasser auf ein Volumen von 400 ml verdünnt und mit Ether ausgeschüttelt. Die Oxidation wurde mit 3,3-10~²M K₃[Fe(CN)₆] durchgeführt, das bis zum Auftreten einer gelben, 1 h beständigen Färbung der Lösung zugegeben wurde; der pH-Wert wurde mit O,1M NaOH zwischen 6,9 und 7,0 gehalten. Nach der Oxidation wurde das Reaktionsgemisch mit Essigsäure auf pH 3,5 angesäuert und an einer mit einem Kationenaustauscher in Carboxylatform (20 ml, 0,07 - 0,15 mm) gefüllten Säule chrornatographiert. Die Säule wurde mit 0,25 % Essigsäure gewaschen und das Produkt mit 50 % Essigsäure eluiert. Nach der Lyophilisierung wurden 59 mg Produkt gewonnen, das durch trägerfreie Elektrophorese weiter gereinigt wurde. Es wurden 14,8 mg Produkt erhalten; [°3₀ -51,0° (c = 0,14; 3M Essigsäure); E^ 0,51, e"¹^ 0,38; R_f 0,40 (S4), 0,26 (S6).

BAD ORIGINAL

- 25 -

Aminosäureanalyse: Pen (0,H) + CyS(O₃H), (1,88), Tyr 0,94

(0,61), Phe 0,96 (1,02), GIu 1,05 (1,00), Asp 1,12 (1,00), Pro 1,21 (1,00), Lys 0,96 (0,98), GIy 1,02 (Q95), Die Werte in Klammern beziehen sich auf die mit Perameisensäure oxidierte Probe.

Elernentaranalyse für ^c _5u ^H7i^Ni3^Oi3^S2'² CH₃COOH^,5 H₅O (13S):

% C % H % N berechnet: 48,86 6,68 13,72 gefunden : 48,80 5,94 13,76.

Beispiel 6

t-Butyloxycarbonyl-O-methyltyrosyl-phenylalanylglutaminylasparaginyl-S-benzylcysteinyl-prolyl-N ^ -p-toluolsulfonyllysyl-glycinamid

Aus dem Heptapeptid (2,4 g) wurde auf die oben erläuterte Weise das Hydrochlorid hergestellt, wobei 5,1 ml 2,05M HCl *·■"■■ in Ether verwendet wurden. Das Hydrochlorid wurde in Dimethylformamid (50 ml) gelöst; der pH-Wert der Lösung wurde mit N-Ethylpiperidin auf 7,5 - 8,0 eingestellt (angefeuchtetes pH-Papier) und die Lösung mit 2,4,5-Trichlorphenylester von t-Butyloxycarbonyl-O-methyltyrosin (1,0 g) versetzt. Nach 24 h Rühren wurde eine weitere Teilmenge des aktiven Esters (0,2 g) zugegeben und das Rühren weitere 24 h fortgesetzt. Dann wurde das Dimethylformamid abgedampft und der Trockenrest mit Petrolether und Ether verrieben, abfiltriert und mit Wasser, 10 fciger Citronensäure, Wasser, 0,25M NaHCO₃ und Wasser gewaschen. Es wurden 2,2 g (8430 Produkt erhalten; F. 196-200 ⁰C; H₀ -21,6° (c = 0,2; Dimethylformamid); R_F 0,55 (Sl), 0,25 (S2), 0,46 (S3), 0,66 (S4).

Aminosäureanalyse: Tyr + Tyr(Me) 0,92, Phe 0,98, GIu 1,00,

Asp 1,00, Cys(Bzl) 0,82, Pro 1,05, GIy 1,00.

Elementaranalyse für ^cg3^H84^Ni2⁰i5^S2'²'^{5 H}2° ^³⁵⁹ ^

% C % H % N

berechnet: 55,70 6,60 12,37 gefunden : 55,54 6,22 12,43.

Benzyloxycarbonyl-S-benzylpenicillaminyl-O-methyltyrosylphenylalanyl-glutaminyl-asparaginyl-S-benzylcysteinylprolyl-N ^-p-toluolsulfonyllysyl-glycinamid

Aus dem oben beschriebenen Octapeptid (1,35 g), das in Essigsäure (10 ml) gelöst wurde, wurde in üblicher Weise das Hydrobromid hergestellt, wobei 5 ml 35 %iger Bromwasserstoff in Essigsäure verwendet wurden. Das Hydrobromid wurde in Dimethylformamid (10 ml) gelöst und der pH-Wert der Lösung mit N-Ethylpiperidin auf 7,5 - 8,0 eingestellt (angefeuchtetes pH-Papier); die Lösung wurde mit p-Nitrophenylester von Benzyloxycarbonyl-S-benzylpenicillamin (0,51 g) in Dimethylformamid (2 ml) versetzt. Nach zweitägigem Rühren wurde eine weitere Teilmenge des aktiven Esters (o,25 g) in Dimethylformamid (2 ml) zugefügt und das Rühren weitere zwei Tage fortgesetzt. Dann wurde das Dimethylformamid abgedampft und der Trockenrest mit Petrolether und Ether verrieben, abfiltriert und mit Wasser, IM HCl, Wasser, 0,25M NaHCO, und Wasser gewaschen. Es wurden 1,2 g (74 %) Produkt gewonnen; 0,75 g dieser Substanz wurden in drei Teilmengen von je 0,25 g durch Gelfiltration weiter gereinigt. Es wurden 361 mg (49 %) Produkt erhalten; F. 202 - 205 ⁰C;i*3_D -34,6° (c = 0,1; Dimethylformamid); Rp 0,60 (Sl), 0,31 (S2), 0,68 (S3), 0,76 (S4).

Aminosäureanalyse: Pen(Bzl) 1,04, Tyr + Tyr(Me) 0,94, Phe 1,03,

GIu 1,00, Asp 0,99, Cys(Bzl) 0,92, Pro 1,00, GIy 1,00.

BAD ORIGINAL

- 27 -

Elementaranalyse für ^C78^H97^Ni3°i6^S3'¹'^{5 H}2°

3SC % H % N

berechnet: 58,70 6,31 11,41 gefunden : ' 58,65 6,25 11,57.

l-Penicillamin^-O-methyltyrosin-S-lysin-vasopressin (Verbindung 6)

Das oben beschriebene Nonapeptid (145 mg) wurde in siedendern flüssigen Ammoniak (150 ml) gelöst und mit Natrium bis zum Auftreten einer blauen, 10 s beständigen Färbung reduziert. Die Lösung wurde dann mit Ammoniumchlorid entfärbt und das Ammoniak absublimiert. Der Rückstand wurde in Ο,ΟΙΜ HCl (100 ml) gelöst, mit Wasser auf ein Gesamtvolumen von 450 ml verdünnt und die Lösung mit Ether ausgeschüttelt. Reste des Ethers wurden durch Verdampfen im Vakuum beseitigt. Die Oxidation wurde mit 3,3-10"²M K₃[Fe(CN)^j durchgeführt,

das bis zum Auftreten einer gelben, 1 h beständigen Färbung zugegeben wurde. Der pH-Wert des Reaktionsgemischs wurde während der Oxidation mit O,1M NaOH auf 6,9 - 7,0 gehalten. Nach der Oxidation wurde die Lösung mit Essigsäure auf pH 4,0 angesäuert und an einer mit einem Kationenaustauscher in Carboxylatform gefüllten Säule (20 ml, 0,07 - 0,15 mm) chromatographiert. Die

ioer
Säule wurde mit 0,25 %> essigsäure.gewaschen. Das Produkt wurde mit 50 %iger Essigsäure eluiert und lyophilisiert. Es wurden 86 mg Lyophilisat gewonnen, das'durch trägerfreie Elektrophorese weiter gereinigt wurde. Es wurden 10,3 mg Produkt erhalten; (α] oo (_c _ o_}i5; 3M Essigsäure); rf¹^ 0,64, Eg 7 0,60; R_F 0,34 (S4), 0,05 (S6).

Aminosäureanalyse: Pen(0₃H) + CyS(O₃H) (1^94), Tyr + Tyr(Me)

0,94 (0,82), Phe 1,06 (1,04), GIu 0,96 (1,00), Asp 1,06 (1,00), Pro 1,00 (0,99), Lys 0,97 (1,04), GIy 1,00 (0,99). Die Werte in Klammern beziehen sich auf die mit Perameisensäure oxidierte Probe.

-^ 28 -

Elementaranalyse	fur C^	9^H71^f	^s\|13°12^S2"	3 CH₃COOH-5
	%	C	% H	% N
berechnet:	48,	27	6,85	13,30
gefunden :	48,	30	6,27	13,42.
Beispiel 7

(1369)

Acetyl-S-benzylpenicillaminyl-O-methyltyrosyl-phenylalanylglutaminyl-asparaginyl-S-benzylcysteinyl-prolyl-N^€ -ptoluolsulfonyllysyl-glycinamid

Das oben beschriebene Nonapeptid (200 mg) wurde in Essigsäure (2 ml) gelöst; die Lösung wurde mit 35 %iger Bromwasserstofflösung in Essigsäure (2 ml) versetzt. Nach 10 min Stehen bei Raumtemperatur wurde das Hydrobromid mit Ether ausgefällt (E^ 0,49; R_p 0,07 (S2), 0,63 (SA)). Das Hydrobromid wurde in Dimethylformamid (2 ml) gelöst; der pH-Wert der Lösung wurde mit N-Ethylpiperidin auf 7,5 - 8,0 (angefeuchtetes pH-Papier) eingestellt; zu der Lösung wurde S-Chlor-S-hydroxychinolinylacetat (43 mg) zugegeben. Nach zweitägigem Rühren wurde eine weitere Teilmenge des aktiven Esters (15 mg) zugefügt und das Rühren weitere zwei Tage fortgesetzt. Dann wurde das Dimethylformamid abgedampft und der Trockenrest mit Petrolether und Ether verrieben, abfiltriert und mit Wasser, IM HCl, Wasser, 0,25M NaHCO₃ und Wasser gewaschen. Es wurden 142 mg (74 %) Produkt gewonnen, das durch Gelfiltration weiter gereinigt wurde. Es wurden 109 mg Produkt erhalten; F. 190 - 195 ⁰C; [öj _Q -31,2° (c = 0,1; Dimethylformamid); R_f 0,56 (Sl), 0,26 (S2), 0,59 (S3), 0,74 (S4).

Elementaranalyse	für C₇	2^H93	^H13	°15^S3*	2,5 H	₂0(
	%	C		% H	%	N
berechnet:	56,	83	6	,49	11	,96
gefunden :	56,	50	6	,30	11	,99.

BAD ORIGINAL

s » » ι

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N^-Acetyl-l-penicillamin-^-O-methyltyrosin-S-lysin-vasopressin (Verbindung 7)

Das oben beschriebene geschützte Nonapeptid (92 mg) wurde in siedendem flüssigen Ammoniak (150 ml) gelöst und mit Natrium bis zum Auftreten einer blauen, 10 s beständigen Färbung des Reaktionsgemischs reduziert. Die Lösung wurde dann mit Ammoniumchlorid entfärbt und das Ammoniak absublimiert. Der Rückstand wurde in Ο,ΟΙΜ HCl (100 ml) gelöst, mit Wasser auf ein Volumen von 450 ml verdünnt und mit Ether ausgeschüttelt. Reste des Ethers wurden aus der Lösung durch Abdampfen im Vakuum entfernt. Die Oxidation wurde mit 3,3-10"²M K₃[Fe(CN)₆] durchgeführt, das bis zum Auftreten einer gelben, 1 h beständigen Färbung des Reaktionsgemischs zugegeben wurde. Während der Oxidation wurde der pH-Wert des Reaktionsgemischs mit O,1M NaOH zwischen 6,9 und 7,0 gehalten. Nach der Oxidation wurde die Lösung mit Essigsäure auf pH 4,0 angesäuert und an einer mit einem Kationenaustauscher in Carboxylatform gefüllten Säule (25 ml, 0,07 - 0,15 mm) chromatographiert. Die Säule wurde mit 0,25 %iger Essigsäure gewaschen; das Produkt wurde mit 50 %iger Essigsäure eluiert und die Lösung lyophilisiert. Es wurden 60 mg Lyophilisat gewonnen. Nach Reinigung durch trägerfreie Elektrophorese wurden 2,4 mg Produkt erhalten; UK)_n -32,8° (c = 0,13; 3M Essigsäure), E^ 0,51, E^ 0,35; R_f 0,43 (S4), 0,39 (S6).

Aminosäureanalyse: PentO^H) +CyS(O₃H) (1,96), Tyr + Tyr(Me)

0,96 (0,69), Phe 1,04 (0,99), GIu 1,01 (1,00), Asp 1,03 (1,00), Pro 1,03 (0,97), Lys 0,95 (0,98), GIy 1,03 (1,01).

O (1628):

Elementaranalyse	für	^C51^H	73 ^Nl	3 °13^S:	_?-6 CH	₃C00H-7
	%	C		% H	%	N
berechnet:	46,	51	6	,88	11,	,91
gefunden :	46,	40	6	,43	11,	.08.

Beispiel 8

ö-Penicillamin-e-lysin-vasopressin (Verbindung 8)

Das geschützte Nonapeptid, das Amid des Benzyloxycarbonyl-S-benzylcysteinyl-tyrosyl-phenylalanyl-glutaminyl-asparaginyl-S-benzylpenicillaminyl-prolyl-N-p-toluolsulfonyllysyl-glycins, (90 mg), das durch stufenweisen Aufbau der Peptidkette in Lösung hergestellt worden war, wurde in flüssigem Ammoniak (100 ml) bis zum Auftreten einer blauen, 20 s beständigen Färbung reduziert. Die Lösung wurde mit Ammoniumchlorid entfärbt und das Ammoniak absublimiert. Der Trockenrest wurde in Ο,ΟΙΜ HCl (100 ml) gelöst; die Lösung wurde mit Wasser (50 ml) verdünnt und mit Ether ausgeschüttelt. Nach Verdünnen auf ein Volumen von 300 ml wurde der pH-Wert der Lösung auf 7,0 eingestellt und die Oxidation durch Zugabe von 3,3-10 M K₃CFe(CN),] bis zum Auftreten einer gelben, 1 h beständigen Färbung durchgeführt. Der pH-Wert wurde während der Oxidation zwischen 6,9 und 7,0 gehalten. Nach Beendigung der Oxidation wurde das Reaktionsgemisch mit Essigsäure auf pH 4,5 angesäuert und auf eine mit einem Kationenaustauscher in Carboxylatform gefüllte Säule aufgegeben. Die Säule wurde mit 0,25 %iger Essigsäure gewaschen und das Produkt mit 50 %iger Essigsäure eluiert. Nach Lyophilisierung wurde das Produkt durch kontinuierliche trägerfreie Elektrophorese gereinigt. Es wurden 10,2 mg Lyophilisat gewonnen; M_n +13,6° (c =0,13; 3M Essigsäure); E^l¹J 0,66, ET_n 0,61; R_r 0,33 (S4)> 0,03 (56).

Aminosäureanalyse: CyS(O₃H) + Pen(0₃H) (1,94), Tyr 0,92

(0,56), Phe 1,00 (0,96), GIu 0,92 (0,91), Asp 1,00 (1,01), Pro 1,00 (1,03), Lys 1,07 (o,98), GIy 0,96 (1,07). Die Werte in Klammern beziehen sich auf die mit Perameisensäure oxidierte Probe.

BAD ORIGINAL

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Elementaranalyse für ^C4₈ ^H ₆9^Ni3°i2^S2'^{5 CH}3^C00H'^{8 K}2° (¹⁵²9)

% C % H % N berechnet: 41,81 6,35 10,93 gefunden (auf 9 %' _5Q , _{44 1£J 92} Asche korrigiert): ^{i>PU 6}'^{44 iU}'^y/'

Beispiel 9
Disulfid-l-penicillamin-o-penicillamin-e-lysin-vasopressin

Das geschützte Nonapeptid, das Amid des Benzylo ycarbonyl-S-benzylpenicillaminyl-tyrosyl-phenylalanyl-glutaminyl-asparaginyl-S-benzylpenicillaminyl-prolyl-N ^£ -p-toluolsulfonyllysyl-glycins (120 mg), das durch stufenweisen Aufbau der Peptidkette in Lösung hergestellt worden war, wurde in flüssigem Ammoniak reduziert, mit K-.[Ve(CN) J oxidiert und

J O

wie in Beispiel 1 gereinigt. Es wurden 10,5 mg Produkt erhalten ;(*] -11,0° (c = 0,13; 3M Essigsäure); E^ 0,61, E^ 7 0,60; Rp 0,36 (S4), 0,04 (S6).

Aminosäureanalyse: Pen(0,H) (1,80), Tyr 0,86 (0,82),

Phe 1,00 (1,06), GIu 0,92 (0,98), Asp 1,00 (0,91), Pro 1,00 (1,13), Lys 1,00 (0,98), GIy 1,00 (0,99). Die Werte in Klammern beziehen sich auf die mit Perameisensäure oxidierte Probe.

Elementaranalyse für ^c ₅o^H73^Ni3°i2^S2*³'^{5 CH} ₃ ^Cu0H'^{5 H} ₂°

% C % H % N

berechnet: 48,57 6,92 12,89 gefunden : 48,54 6,80 12,86.

Claims

BEETZ & PARTNER Steinsdorfstr. 10 ■ D-8000 München 22 Telefon (089) 227201 - 227244 - 295910 Telex 5 22 048 - Telegramm Allpat'· München

233-34.991P

Patentanwälte European Patent Attorneys

Dipl.-Ing. R. BEETZ sen.

Dr.-Ing. R. BEETZ jun.

Dr.-lng. W. TlMPE Dipl.-Ing. J. SIEGFRIED Priv.-Doz. Dipl.-Chem. Dr. rer. nat. W. SCHMITT-FUMiAN

Dipl.-Ing. K. LAMPRECHT 11981 3. Juni 1983

Ansprüche

I 1. Analoga von neurohypophysären Hormonen mit Inhibierungswirkungen der Formel I

A-V-Tyr(B)-X-GIn-ASn-Y-PrO-Z-GIyNH₂ (I),

in der bedeuten:

A CH₃CO oder H,

V den Penicillaminrest oder Cys, B CH₃ oder H,

X He oder Phe,

Y den Penicillaminrest oder Cys und Z Leu oder Lys,

wobei alle chiralen Aminosäuren L-Konfiguration besitzen.
2. l-N-Acetylpenicillamin-oxytocin als Verbindung der Formel I nach Anspruch 1.
3. l-Penicillamin^-O-methyltyrosin-oxytocin als Verbindung der Formel I nach Anspruch 1.
4. l-N-Acetylpenicillamin-2-O-methyltyrosin-oxytocin als Verbindung der Formel I nach Anspruch 1.

233-S10244-SF-Bk

BAD ORIGINAL
5. l-Penicillamin-S-lysin-vasopressin als Verbindung der Formel I nach Anspruch 1. j
6. l-N-Acetylpenicillamin-e-lysin-vasopressin als Verbindung der Formel I nach Anspruch 1.
7. l-Penicillamin^-O-methyltyrosin-S-lysin-rvasopressin als Verbindung der Formel I nach Anspruch 1.
8. l-N-Acetylpenicillamin-^-O-methyltyrosin-e-lysin-vasopressin als Verbindung der Formel I nach Anspruch 1.
9. o-Penicillamin-S-lysin-vasopressin als Verbindung der Formel I nach Anspruch 1.
10. l-Penicillamin-ö-penicillamin-e-lysin-vasopressin als Verbindung der Formel I nach Anspruch 1.
11. Verfahren zur Herstellung der Analoga nach einem der Ansprüche

■ "I Tdis 10, gekennzeichnet durch Oxidation eines linearen Peptids der Formel II

H H

ι I

A-V-Tyr(B)-X-GIn-ASn-Y-PrO-Z-GIyNH₂ (II)

mit A, B, V, X, Y und Z wie in Anspruch 1 unter Erzeugung einer Disulfidbindung.
12. Pharmazeutische Mittel, gekennzeichnet durch mindestens eines der Analoga nach einem der Ansprüche 1 bis 10 als Wirkstoff.

BAD ORIGINAL _οοργ