DE3320189A1 - Analoga von neurohypophysaeren hormonen mit inhibierungswirkungen, ihre herstellung und pharmazeutische zusammensetzungen - Google Patents
Analoga von neurohypophysaeren hormonen mit inhibierungswirkungen, ihre herstellung und pharmazeutische zusammensetzungenInfo
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Description
Ceskoslovenskä akademie ved
Narodni 3, Prag (CSSR)
Analoga von neurohypophysären Hormonen mit Inhibierungswirkungen,
ihre Herstellung und pharmazeutische Zusammensetzungen
Die Erfindung betrifft Analoga von neurohypophysären Hormonen, die gegenüber einigen biologischen Aktivitäten der neurohypophysären
Hormone Inhibierungswirkungen aufweisen und Verfahren zu ihrer Herstellung sowie ferner ihre pharmazeutische
Verwendung. Diese Analoga können sowohl zum Nachweis der neurohypophysärf
Hormone in Körperflüssigkeiten als auch zur pharmakologischen Verwendung dienen beispielsweise bei pathologischer Überproduktion
endogener Hormone.
Bisher waren im wesentlichen zwei Strukturabweichungen bekannt, die beim Oxytocin Inhibierungswirkungen hervorrufen. Der
Austausch der Hydroxylgruppe des Tyrosins in 2-Stellung gegen eine Methoxygruppe (Berankovä Z., Rychlik I., Jost K.,
Rudinger J., Sorm F., Coil. Czechoslov. Chem. Commun. 26
(1961) 2673), wobei die Inhibierungswirkung durch gleichzeitige Acetylierung der Oi-Aminogruppe des Cysteins in
1-Stellung gesteigert werden kann (Oost K., ^orm F., Coil.
Czechoslov. Chem. Commun, 36_ (1971) 297). Durch Einführung
233-S10244-SF-Bk BAD ORIGINAL
ORIGINAL INSPECTED ΟΟργ
von zwei Methylgruppen (Schulz H., du Vigneaud V., J. Med.
Chem. 9_ (1966) 647) oder von zwei Ethylgruppen (Vavrek R.J.,
Ferger M. F., Allen G. A., Rich D. H., Blomquist A. T., du Vigneaud V., 3. Med. ehem. 13 (1972) 124) oder einer
Polymethylenkette (Nestor J. j., Ferger M. F., du Vigneaud V.,
J. Med. Chem. 18_ (1975) 284) in ß-Stellung der ß-Mercaptopropionsäure
in Kombination mit der Alkylierung des Tyrosins (Sawyer W. H., Grzonka Z., Manning M.: Mol. Cell. Endocrinol.
(1981) 117) lassen sich aus diesen Substanzen weitere wirksame Inhibitoren herstellen.
Im Rahmen der Erfindung wurde nun festgestellt, daß auch die Kombination struktureller Variationen wie Alkylierung
des Tyrosins und Einführung von zwei Methylgruppen in ß-Stellung des Cysteins in 1-Stellung der Peptidkette und gegebenenfalls
Acetylierung der primären Aminogruppe des Cysteins zu Verbindungen mit ausgeprägten Inhibierungswirkungen gegenüber
der Wirkung von Oxytocin oder Vasopressin führt.
Ähnlich starke Inhibierungseigenschaften weisen auch Analoga des Vasopressins auf, bei denen sich der Penicillaminrest
in 6-Stellung bzw in 1- und 6-Stellung befindet.
Die Erfindung betrifft entsprechend neue Analoga von neurohypophysären Hormonen mit Inhibierungswirkungen der
allgemeinen Formel I
A-V-Tyr(B)-X-Gln-Asn-Y-Pro-Z-GlyNH2 (I), I : I
in der bedeuten:
A CH3CO oder H,
V den Penicillaminrest oder Cys,
BAD ORIGINAL
B CH3 oder H,
X lie oder Phe,
Y Cys oder den Penieillaminrest und
Z Leu oder Lys,
wobei alle chiralen Aminosäuren der L-Reihe angehören.
Es handelt sich erfindungsgemäß insbesondere um folgende
Analoga:
l-N-Acetylpenicillamin-oxytocin ((Verbindung 1)
l-Penicillamin-2-O-methyltyrosin-oxytocin (Verbindung 2)
l-N-Acetylpenicillamin^-O-methyltyrosin-oxytocin (Verb. 3)
l-Penicillamin-e-lysin-vasopressin (Verbindung 4)
l-N-Acetylpenicillamin-S-lysin-vasopressin (Verbindung 5)
l-Penicillamin^-O-methyltyrosin-S-lysin-vasopressin (Verb.6)
l-N-Acetylpenicillamin^-O-methyltyrosin-S-lysin-
vasopressin (Verbindung 7)
o-Penicillamin-S-lysin-vasopressin (Verbindung 8)
l-Penicillamin-o-penicillamin-S-lysin-vasopressin (Verb. 9).
Die zu den einzelnen oben angeführten Verbindungen 1 bis 9 gehörenden Strukturkombinationen und einige Angaben zur biologischen
Wirksamkeit sind in der nachstehenden Tabelle zusammengefaßt.
Die Inhibierungswirkungen der Substanzen im Test in vivo sind als pA2~Werte angegeben, die dem negativen Logarithmus
derjenigen molaren Konzentration des Inhibitors entsprechen, die die Antwort auf 2X Einheiten des Agonisten so erniedrigt,
daß sie gleich der Antwort auf IX Einheiten in Abwesenheit des Inhibitors ist (Schild H.O., Brit. 3. Pharmacol. 2_ (1947)
189 , Dyckes D.F., Nestor J.J., Ferger M.F., du Vigneaud,
J. Med. Chem. Γ7 (1974) 260). Im Test in vitro (Gebärmutter
in vitro) entspricht der pA2~Wert dem negativen Logarithmus
der Inhibierungskonstante nach der Beziehung pA^ = -log )
wobei B die Konzentration des Inhibitors (M), A50 die Agonistenkonzentration, die zu 50 % der maximalen
Wirkung führt, und A^„ die Agonistenkonzentration,
die zu 50 % der maximalen Wirkung in Gegenwart des Inhibitors B führt, bedeuten (Eggene P., Schwartz I.L.,
Walter R., J. Gen. Physiol. 52 (1968) 465).
BAD ORIGINAL
A | V | B | X | Y | Z | Inhibierungswirkung pA? | in situ | antipressori- | antigalaktogo- | |
ver bin |
antiuterotonische Wirkung | _a | sche Wirkung | gische Wirkung | ||||||
dung | CH3CO | Pen | H | He | Cys | Leu | in vitro | 6,9 | unwirksam | 0,04b |
1 | H | Pen | CH3 | He | Cys | Leu | 4,4 | _a | 7,2 | 6,8 |
2 | CH3CO | Pen | CH3 | He | Cys | Leu | 8,0 | 6,3 | 6,4 | 0,45b |
3 | H | Pen | H | Phe | Cys | Lys | 5,4 | 6,3 | 6,9 | _a |
4 | CH3CO | Pen | H | Phe | Cys | Lys | 5,6 | 6,9 | unwirksam | unwirksam |
5 | H | Pen | CH3 | Phe | Cys | Lys | 5,5 | _a | 7,4 | 6,8 |
6 | CH3CO | Pen | CH3 | Phe | Cys | Lys | 8,1 | 6,16 | 6,7 | unwirksam |
7 | H | Cys | H | Phe | Pen | Lys | _a | 6,8 | 6,73 | _a |
8 | H | Pen | H | Phe | Pen | Lys | 6,0 | 7,18 | _a | |
9 | 6,8 | |||||||||
a) nicht bestimmt
b) eigene Aktivität in I.U./mg
N.
1
1
CO Ca) K) CD
v» ί. U IUJ
Das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung der Analoga des Oxytocins und Vasopressins der Formel I beruht darauf, daß
ein lineares Peptid der Formel II
A-V-Tyr(B)-X-GIn-ASn-Y-PrO-Z-GIyNH2 (II)
mit A, B, V, X, Y und Z wie in Formel I unter Erzeugung der Disulfidbindung oxidiert wird.
Die Erfindung wird im folgenden anhand von Ausführungsbeispielen näher erläutert.
Der Penicillaminrest ist nachfolgend mit Pen abgekürzt.
Die Aminosäureanalysen wurden auf einem automatischen Aminosäureanalysator durchgeführt. Die Peptidproben wurden
dabei mit 6M HCl in einem Vakuum von 150 Pa bei einer Temperatur
von 105 0C 20 h hydrolysiert. Die Oxidation wurde mit Perameisensäure durchgeführt. Die Dünnschichtchromatographie
wurde auf Silicagelfolien (Silufol, Kavalier) in folgenden Systemen durchgeführt: 2-Butanol - 98 %ige Ameisensäure Wasser
(75:13,5:11,5; Sl), 2-Butanol - 25 %ige wässerige Ammoniaklösung - Wasser (85:7,57,5, S2).l-Butanol - Essigsäure
- Wasser (4:1:1, S3), 1-Butanol - Pyridin - Essigsäure
- Wasser (15:10:3:6, SA) und Methanol - Chloroform Essigsäure - Wasser (10:15:3:2, S6). Die analytische Elektrophorese
wurde auf den Papieren Whatman 3MM in feuchter Kammer bei einem Potentialgefälle von 20V/cm 1 h in IM Essigsäure
(pH 2,4) und in Pyridin-Acetat-Puffer (pH 5,7) durchgeführt.
Die Substanzen wurden mit Ninhydrin oder mit dem Chlorierungsverfahren nachgewiesen. Zur Gegenstromverteilung wurde
eine Ganzglas-Apparatur mit verschiebbarer Ober- und Unterphase verwendet. Die präparative trägerfreie Elektrophorese
wurde auf einer früher beschriebenen Apparatur durchgeführt
BAD ORIGINAL
233-34 991P-SF-Bk 12.9.1983
P 33 20 189.7 Neue Seiten 9, Ll, 18, 19, 20, 24, 25- und
-S-
(Prusik Z., Sedläkova E., Barth T., Hoppe-Seyler's Z. Physiol. Chem.
353 (172) 1837). Für die hochwirksame Flüssigchromatographie wurden eine aus handelsüblichen Teilen aufgebaute Apparatur
und mit Separone SI-C-18 (Laboratorni pristroje, Praha)
gefüllte Säulen verwendet..
o-Nitrobenzolsulfenyl-O-t-butyltyrosyl-isoleucyl-glutaminylasparaginyl-S-benzylcysteinyl-prolyl-leucyl-glycinamid
Zu einer Lösung des Amids von Isoleucyl-glutaminylasparaginyl-S-benzylcysteinyl-prolyl-leucyl-glycin
(1,27 g; Jost K., Rudinger J., Sorm F., Coil. Czechoslov. Chem.
Commun. 26 (1961) 2496) in Dimethylformamid (25 ml) wurde
N-Hydroxysuccinimidester von o-Nitrobenzolsulfehyl-O-tbutyltyrosin
(0,56 g) zugegeben. Nach zweitägigem Rühren wurde ein weiterer Teil des aktiven Esters (0,05 g) zugefügt
und weitere 24 h gerührt. Dann wurde das Dimethylformamid abgedampft und der Trockenrest mit Petrolether und Ether
verrieben, abfiltriert und mit Wasser, 0,1 M H-SO., Wasser,
0,25 M NaHCO, und Wasser gewaschen. Es wurden 1,2 g (65 %) Produkt erhalten; F. 225 - 229 0C; [Ä] Q 0° (c = 0,2; Dimethylformamid);
Rj- 0,51 (Sl), 0,36 (S2), 0,65 (S3), 0,74 (S4).
Aminosäureanalyse: Tyr 0,94, He 0,94, GIu 1,03, Asp 1,06,
Cys (BzI) 0,95, Pro 0,95, Leu 1,08, GIy 1,04.
Elementaranalyse für c 57H80Ni2013S2*H20
% C % H % N
berechnet: 55,96 6,76 13,74 gefunden : 55,97 6,57 13,70.
Benzyloxycarbonyl-S-benzylpenicillaminyl-tyrosyl-isoleucylglutaminyl-asparaginyl-S-benzylcysteinyl-prolyl-leucylglycinamid;
.... . . . -
Zu einer Lösung des oben hergestellten Octapeptids (1,1 g)
in Dimethylformamid (15 ml) wurde 2,05M HCl in Ether (1 ml)
zugegeben. Nach 7 min Stehenlassen wurde das Hydrochlorid mit Ether ausgefällt (E^ 0,59, E^ 0,33; Fy 0,25 (Sl),
0,17 (S2), 0,24 (S3), 0,64 (S4)). Das Hydrochlorid wurde in Dimethylformamid (10 ml) gelöst; der pH-Wert der Lösung
wurde mit N-Ethylpiperidin auf 7,5 - 8,0 (angefeuchtetes pH-Papier) eingestellt; zu der Lösung wurde p-Nitrophenylester
von Benzyloxycarbonyl-S-benzy!penicillamin (0,4 g) in
Dimethylformamid (3 ml) zugegeben. Nach zweitägigem Rühren wurde eine weitere Menge des aktiven Esters (0,04 g) zugefügt
und das Rühren weitere zwei Tage fortgesetzt. Dann wurde das Dimethylformamid abgedampft und der Trockenrest mit Petrolether
und Ether verrieben, abfiltriert und mit Wasser, IM HCl,
Wasser, 0,25 M NaHCO3 und Wasser gewaschen. Die gewonnene
Substanz (0,77 g) wurde in Trifluoressigsäure (77 ml) gelöst. Nach 1 h Stehen bei Raumtemperatur wurde zu dem Reaktionsgemisch Toluol (77 ml) zugegeben, worauf die Lösung zur
Trockne eingedampft wurde. Der Trockenrest wurde mit Ether verrieben, abfiltriert und im Exsikkator über P9O5 und KOH
getrocknet. Es wurden 0,7 g (57 %) Produkt gewonnen. 0,5 g dieser Substanz wurden in zwei Teilmengen von je 0,25 g
durch Gelfiltration weiter gereinigt. Das Produkt wurde durch Abdampfen des Dimethyiformamids und Verreiben des
Trockenrests mit Ether isoliert. Es wurden 0,27 g (54 %) Produkt erhalten; F. 228 - 231 0C, [ocj Q = -42,1° (c = 0,2;
Dimethylformamid); Rp 0,54 (Sl), 0,33 (S2), 0,66 (S3), 0,77 (S4),
Aminosäureanalyse: Pen(Bzl) 0,96, Tyr 0,93, He 0,95,
GIu 0,99, Asp 1,02, Cys(BzI) 0,89,
Pro 1,04, Leu 1,02, GIy 0,97.
BAD ORIGINAL
- 11 -
Elementaranalyse für C67H9oNi2°i4S
% C % H % H
berechnet: 58,75 6,77 12,27
gefunden : 58,70 6,53 12,33.
Acetyl-S-benzylpenicillaminyl-tyrosyl-isoleucyl-glutaminylasparaginyl-S-benzylcysteinyl-prolyl-leucyl-glycinamid
Zu einer Lösung des oben hergestellten Nonapeptids (245 mg) in Essigsäure (2 ml) wurde 35 SSige Bromwasserstofflösung in
Essigsäure (2 ml) zugegeben. Nach 15 min Stehen bei Raumtemperatur wurde das Hydrobromid mit Ether ausgefällt (.E2 λ 0,51;
Rp 0,42 (Sl), 0,09 (S2), 0,43 (S3), 0,62 (S4)). Das Hydrobromid
wurde in Dimethylformamid (2,5 ml) gelöst; der pH-Wert der Lösung wurde mit N-Ethy!piperidin auf den Wert 7,7 - 8,0
(angefeuchtetes pH-Papier) eingestellt. Zu der Lösung wurde S-Chlor-e-hydroxychinolinylacetat (106 mg) zugegeben. Nach
zweitägigem Rühren wurde ein weiterer Teil des aktiven Esters (20 mg) zugefügt und das Rühren noch 24 h fortgesetzt.
Dann wurde das Dimethylformamid abgedampft, der Trockenrest ***" mit Petrolether und Ether verrieben, ab filtriert und mit
Wasser, IM HCl, Wasser, 0,25 M NaHCO, und mit Wasser gewaschen.
Es wurden 185 mg (70 %) Produkt gewonnen, das durch Gelfiltration weiter gereinigt wurde. Es wurden 151 mg (82 %, Gesamtausbeute
57 Si) Substanz erhalten; F. 226 - 231 0C,[0^0 -39,7°
(c = 0,1; Dimethylformamid); Rp 0,49 (Sl), 0,24 (S2), 0,58 (S3),
0,73 (S4).
Elementaranalyse für C6iH86Hi20i3S2"0>5 H2°
% C % H % N
berechnet: 57,76 6,91 13,25 gefunden : 57,73 6,89 13,57.
N -Acetyl-l-penicillamin-oxytocin (Verbindung 1)
Das oben beschriebene geschützte Nonapeptid (138 mg) wurde in siedendem flüssigen Ammoniak (150 ml) gelöst und mit Natrium
bis zum Auftreten einer blauen, während 10 s beständigen Färbung des Reaktionsgemischs reduziert. Die Lösung wurde dann
mit Ammoniumchlorid entfärbt und das Ammoniak absublimiert. Der Trockenrest wurde in 0,01 M HCl (100 ml) aufgelöst und
mit Wasser auf ein Gesamtvolumen von 300 ml verdünnt; der pH-Wert der Lösung wurde mit Ο,ΟΙΜ NaOH auf 7,0 eingestellt. Die
Oxidation wurde mit 3,3-10"2M K3[Fe(CN)6] durchgeführt, das
bis zum Auftreten einer gelben, während 1 h beständigen Färbung des Reaktionsgemischs zugegeben wurde. Während der Oxidation
wurde der pH-Wert des Reaktionsgemischs zwischen 6,9 und 7,0 gehalten. Das Reaktionsgemisch wurde anschlieOend mit IM HCl
auf pH 4,1 angesäuert und auf eine mit einem schwach basischen Anionenaustauscher in Chloridform (50 ml) gefüllte Säule aufgegeben.
Die Säule wurde mit Wasser (50 ml) gewaschen; die vereinigten Eluate wurden auf einer mit Separon SI-C-18 gefüllten
Säule entsalzt. Nach Durchwaschen der Säule mit Wasser wurde das Produkt mit 90 %igem Methanol ausgewaschen. Das
Eluat wurde mit Essigsäure auf pH 4,5 angesäuert und das Methanol abgedampft. Nach der Lyophilisierung wurden 72 mg
Produkt gewonnen. 35 mg dieses Produkts wurden durch Hochdruck-Flüssigchromatographie (Methanol - Wasser 4:6)
gereinigt. Es wurden 11 mg Produkt gewonnen.[ötj -47,0 °
(c = 0,18; 3M Essigsäure); Rp 0,64 (S4), 0,76 (S6).
Aminosäureanalyse: Pen(Q H) + CyS(O3H) (2,00), Tyr 0,97 (0,66),
lie 1,00 (1,00), GIu 0,97 (1,00), Asp 0,97 (1,00), Pro 1,03 (0,77),
Leu 1,06 (1,00), GIy 1,00 (1,00). Die in Klammern angegebenen Werte beziehen
sich auf die mit Perameisensäure oxidierte Probe.
- 13 -
Elementaranalyse für C47H72N12O13S2^CH3COOH-OH2O (1305):
% C % H % N
berechnet: 46,92 7,10 12,87 gefunden : 46,87 6,72 12,81.
t-Butyloxycarbonyl-O-methyltyrosyl-isoleucyl-glutaminylasparaginyl-S-benzylcysteinyl-prolyl-leucyl-glycinamid
Das oben beschriebene Heptapeptid (2,1 g) wurde in Dimethylformamid
(50 ml) gelöst; zu der Lösung wurde 2,4,5-Trichlorphenylester von t-Butyloxycarbonyl-O-methyltyrosin (1,1 g)
zugegeben. Nach zweitägigem Rühren wurde ein weiterer Teil des aktiven Esters zugefügt (0,2 g) und das Rühren bis zum nächsten
Tag fortgesetzt. Dann wurde das Dimethylformamid abgedampft, der Trockenrest mit Petrolether und Ether verrieben,
abfiltriert und mit Wasser, 5 %iger Citronensäure, Wasser, 0,25M NaHCO3 und Wasser gewaschen. Es wurden 1,9 g (67 %)
Produkt erhalten. F. 225 - 228 0C; [<*3D -35,2° (c = 0,2;
Dimethylformamid); RF 0,50 (Sl), 0,32 (S2), 0,59 (S3),
0,72 (S4).
Aminosäureanalyse: Tyr(Me) + Tyr 0,93, He 0,96, Glu 0,99,
Asp 1,01, Cys(Bzl) 1,03, Pro 1,02, Leu 1,04, GIy 1,00.
Elementaranalyse für C53H79N11O13S'0'5 H2° (lli9>·
% C % H % N
berechnet: 56,87 7,20 13,76 gefunden : 56,62 7,10 13,73.
Benzyloxycarbonyl-S-benzylpenicillaminyl-O-methyltyrosyl-iso-
leucyl-glutaminyl-asparaginyl-S-benzylcysteinyl-prolyl-leucyl-
glycinamid
Zu einer Lösung des oben hergestellten Octapeptids (1,5 g) in Essigsäure (15 ml) wurde 35 %ige Bromwasserstofflösung
in Essigsäure (15 ml) zugegeben. Nach 5 min bei Raumtemperatur wurde das Hydrobromid mit Ether ausgefällt
(E^1I 0,57, Ες1:! 0,27; RF 0,23 (Sl), 0,20 (S2),
0,34 (S3), 0,59 (S4)). Das Hydrobromid wurde in Dimethylformamid
der Lösung
(15 ml) gelöst; der pH-Wert/wurde mit N-Ethylpiperidin auf
(15 ml) gelöst; der pH-Wert/wurde mit N-Ethylpiperidin auf
7,5 - 8,0 (angefeuchtetes pH-Papier) eingestellt; zu der Lösung wurde p-Nitrophenylester von Benzyloxycarbonyl-S-benzy!penicillamin
(0,7 g) in Dimethylformamid (4 ml) zugegeben. Nach 4 Tagen Rühren wurde das Dimethylformamid abgedampft
und der Trockenrest mit Petrolether und Ether verrieben, abfiltriert und mit Wasser, IM HCl, Wasser, 0,25M NaHCO3
und Wasser gewaschen. Es wurde 1,0 g (54 %) Produkt gewonnen, das in vier Teilmengen von je 0,25 g durch Gelfiltration weiter
gereinigt wurde. Es wurden 0,59 g (59 %, Gesamtausbeute
32 %) Produkt erhalten; F. 233 - 239 0C; [0O0 -40,2° (c = 0,2,
Dimethylformamid); Rf 0,54 (Sl), 0,33 (S2), 0,66 (S3),
0,76 (S4).
Aminosäureanalyse: Pen(Bzl) 0,87, Tyr(Me) + Tyr 0,87,
He 0,94, GIu 0,99, Asp 1,04, Cys(Bzl) 0,88,
Pro 1,04, Leu 1,04, GIy 0,99.
Elementaranalyse für C,J-L0N10O ,,S0-H0O (1384):
OO 7£. i.e. 14 Z. *■
% C % H % N
berechnet: 59,03 6,85 12,15 gefunden : 59,05 6,79 12,26.
- 15 -
l-Penicillamin-2-O-methyltyrosin-oxytocin (Verbindung 2)
Das oben beschriebene geschützte Octapeptid (238 mg) wurde in siedendem flüssigen Ammoniak (250 ml) gelöst und mit Natrium
bis zum Auftreten einer blauen, 30 s beständigen Färbung des Reaktionsgemischs reduziert. Die Lösung wurde mit Ammoniumchlorid
entfärbt; das Ammoniak wurde absublimiert und der Trockenrest in 0,01 M HCl (100 ml) gelöst. Die Lösung wurde mit Wasser
auf ein Gesamtvolumen von 500 ml verdünnt; der pH-Wert der Lösung wurde mit O,1M NaOH auf 7,0 eingestellt. Die Oxidation
wurde mit 3,3·10"2M K3LFe(CN)6] durchgeführt, das bis
zum Auftreten einer gelben, 1 h beständigen Färbung des Reaktionsgemischs zugegeben wurde. Während der Oxidation wurde
der pH-Wert des Reaktionsgemischs zwischen 6,9 und 7,0 gehalten. Die Lösung wurde dann mit IM HCl auf 4,5 angesäuert
und auf eine mit einem schwach basischen Anionenaustauscher in Chloridform gefüllte Säule aufgegeben. Die Kolonne wurde
mit Wasser (50 ml) gewaschen; die Eluate wurden lyophilisiert. Das Produkt wurde durch kontinuierliche trägerfreie Elektrophorese
gereinigt. Es wurden 23,1 mg Produkt gewonnen;
[öc] D o° (c = 0,14; 3M Essigsäure), E^ 0,62, E^ 0,23;
RF 0,62 (S4), 0,56 (56).
Aminosäureanalyse: Pen(03H) + CyS(O3H) 2,09, Tyr(Me) + Tyr
0,95 (0,82), He 0,96 (0,93), GIu 1,02 (1,02), Asp 1,00 (1,02),
Pro 0,98 (1,02), Leu 1,02 (1,00), GIy 1,00 (1,00). Die Werte in Klammern beziehen sich auf die mit Perameisensäure oxidierten
Probe.
Elementaranalyse für C46 H 72Ni20i2S2'0'5 CH3C00H'2»5 H 2°
% C % H % N
berechnet: 50,21 7,08 14,95 gefunden : 50,30 6,72 14,94.
Acetyl-S-benzylpenicillaminyl-O-methyltyrosyl-isoleucyl-glutaminylasparaginyl-S-benzylcysteinyl-pröiyl-leucyl-glycinamid
Zu einer Lösung des Nonapeptids (190 mg) in Essigsäure
(2 ml) wurde 35 %ige Bromwasserstofflösung in Essigsäure
(2 ml) zugegeben. Nach 10 min Stehen bei Raumtemperatur wurde das Hydrobromid mit Ether ausgefällt (E^ ^ 0,50; Rp. 0,47
(Sl), 0,28 (S2), 0,44 (S3), 0,63 (S4)). Das'Hydrobromid wurde dann in Dimethylformamid (5 ml) gelöst; der pH-Wert der
Lösung wurde mit N-Ethylpiperidin auf 7,5 - 8,0 (angefeuchtetes pH-Papier) eingestellt, worauf die Lösung mit 5-Chlor-8-hydroxychinolinylacetat
(39 mg) versetzt wurde. Nach zweitägigem Rühren wurde eine weitere Teilmenge des aktiven
Esters zugefügt und das Rühren weitere zwei Tage fortgesetzt. Dann wurde das Dimethylformamid abgedampft und der
Trockenrest mit Petrolether und Ether verrieben, abfiltriert und mit Wasser, IM HCl, Wasser, 0,25M NaHCCL und Wasser gewaschen.
Es wurden 140 mg (79 %) Produkt erhalten, das durch Gelfiltration weiter gereinigt würde. Es wurden 97 mg
Produkt gewonnen; F. 234 - 238 0C, B*!^ -47,2° (c = 0,1;
Dimethylformamid); RR 0,49 (Sl), 0,27 (S2), 0,55 (S3), 0,73 (S4). :
Elementaranalyse für C 62 H88H12°1352'2 H2° ^1310):
% C % H ■' % N
berechnet: 56,86 7,08 12,83 gefunden : 56,61 6,84 j 12,76.
N -Acetyl-l-penicillamin^-O-methyltyrosin-oxytocin (Verbindung 3)
Das oben beschriebene geschützte Nonapeptid (87 mg) wurde in siedendem flüssigen Ammoniak (100 ml) gelöst und mit
BAD ORIGINAL
- 17 -
Natrium bis zum Auftreten einer blauen, 10 s beständigen Färbung
des Reaktionsgemischs reduziert. Die Lösung wurde mit Ammoniumchlorid
entfärbt und das Ammoniak absublimiert. Der Trockenrest wurde in Ο,ΟΙΜ HCl (100 ml) aufgelöst. Die Lösung wurde
auf ein Gesamtvolumen von AOO ml verdünnt. Die Oxidation wurde mit 3,3-10" M K3[Fe(CN)6] durchgeführt, das bis zum Auftreten
einer gelben, 1 h beständigen Färbung des Reaktionsgemischs zugegeben wurde. Die Lösung wurde dann mit IM HCl auf pH 4,5
angesäuert und auf eine mit einem schwach basischen Anionenaustauscher in Chloridform (50 ml) gefüllte Säule aufgegeben.
Die Säule wurde mit Wasser (50 ml) gespült. Die Eluate wurden lyophilisiert. Die erhaltene Substanz wurde durch Gegenstromverteilung
im System s-Butanol-0,05 % wässerige Essigsäure
(1:1) weiter gereinigt. Nach 100 Verschiebungen der oberen, und 100 Verschiebungen der unteren Phase wurde die Verbindung
aus den Röhrchen 44-56 isoliert und durch Gelfiltration weiter gereinigt. Es wurden 7,1 mg Produkt erhalten; PiL -67,0° (c =
0,10; 3M Essigsäure); Rp 0,64 (S4), 0,83 (S6).
Aminosäureanalyse: Pen(03H) + CyS(O3H) (2,05),
Tyr(Me) + Tyr 0,98 (o,35), He 0,98 (1,00), GIu 1,05 (1,03), Asp 1,00 (1,01),
Pro 0,96 (0,95), Leu 1,00 (1,00), GIy 1,00 (1,00). Die in Klammern angegebenen
Werte beziehen sich auf die mit Perameisensäure oxidierten Probe.
Elementaranalyse für C48 H 7A N 12 013S2'6 H2° (1199):
% C % H % N
berechnet: 48,07 7,23 14,01 gefunden : 48,09 7,34 14,23.
[ NAOHQEREK.»·» ι
0-Nitrobenzolsulfe,nylasparaginyl-S-ben2ylcysteinyl-prolyl-N£ p-toluolsulfonyllysyl-glycinamid
Das Amid des S-Benzylcysteinyl-prolyl-Ne -p-toluolsulfonyllysyl-glycins
(14,0 g) wur.de in Dimethylformamid (70 ml) gelöst; der pH-Wert der Lösung wurde mit N-Ethy!piperidin, auf 7,5 - 8,0
(angefeuchtetes pH-Papier) eingestellt. Zu der Lösung wurde
2,4,5-Trichlorphenylester des o-Nitrobenzolsulfehylasparagins
(11,0 g) zugegeben; das Gemisch wurde bei Raumtemperatur gerührt. Nach 24 h wurde eine weitere Teilmenge des aktiven Esters (1,0 g)
zugegeben und das Rühren weitere 24 h fortgesetzt. Dann wurde das Dimethylformamid abgedampft und der Trockenrest mit Petrolether
und Ether verrieben, abfiltriert und mit Wasser, O,1M HJ30.,
Wasser, 0,25M NaHCO, und Wasser gewaschen. Es wurden 15,1 g
(76 %) Produkt erhalten; F. 175-179 0C; [al0 -62,1° (c = 0,2;
Dimethylformamid); Rp 0,55 (Sl), 0,39 (S2), 0,60 (S3), 0,69 (S4).
Aminosäureanalyse: Asp 0,97, Cys(Bzl) 0,98, Pro 1,03, GIy 1,01,
Elementaranalyse für c 4u H51N9u10S3
% C % H % N
berechnet: 52,56 5,62 13,79 gefunden : 52,23 5,54 13,70.
o-Nitrobenzolsulfenylglutaminyl-asparaginyl-S-benzylcysteinylprolyl-N
-p-toluolsulfonyllysyl-glycinamid
Zu einer Lösung der oben hergestellten Verbindung (14,0 g) in Dimethylformamid (50 ml) wurde 2.26M HCl in Ether (14,2 ml)
zugegeben. Nach 7 min Stehen wurde das Hydrochlorid mit Ether
ausgefällt und mit Ether aus Dimethylformamidlösung umgefällt.
-BAD ORIGINAL
- 19 -
Es wurden 12,3 g Hydrochlorid gewonnen (Eg1JJ 0,76, E^ 0,42;
Rp 0,23 (Sl), 0,21 (S2), 0,21 (S3), 0,64 (S4)). Das Hydrochlorid
wurde in Dimethylformamid (50 ml) gelöst; der pH-Wert der Lösung wurde mit N-Ethylpiperidin auf 7,5 - 8,0 eingestellt
(angefeuchtetes pH Papier); die Lösung wurde mit 2,4,5-Trichlorphenylester von o-Nitrobenzolsulfenylglutamin (7,9 g)
versetzt. Nach 24 h Rühren wurde eine weitere Teilmenge des aktiven Esters (o,8 g) zugegeben. Nach weiteren 24 h wurde
das Dimethylformamid abgedampft und der Trockenrest mit Petrolether und Ether verrieben, abfiltriert und mit
Wasser, 0,1M H2SO., Wasser, 0,25M NaHCO und Wasser gewaschen.
Es wurden 10,5 g (65 %) Produkt erhalten; F-. 187 - 192 0C;
Hn -43,0° (c = 0,2; Dimethylformamid); Rp 0,38 (S1), 0,24
(S2), 0,49 (S3), 0,69 (S4).
Aminosäureanalyse: GIu 1,08, Asp 1,07, Cys(Bzl) 0,72, Pro 1,01,
GIy 1,06.
Elementaranalyse für
% | C | % | H | % | N | |
berechnet: | 50 | ,98 | 5, | 80 | 14 | ,53 |
.gefunden : | 50 | ,79 | 5, | 74 | 14 | ,61. |
o-Nitrobenzolsulfenylphenylalanyl-glutaminyl-asparaginyl-S-benzylcysteinyl-prolyl-N
-p-toluolsulfonyllysyl-giycinamid
Zu einer Lösung der oben hergestellten Verbindung (10 g) in Dimethylformamid (50 ml) wurde 2,26M HCl in Ether (8,9 ml) zugegeben.
Nach 7 min Stehen wurde das Hydrochlorid mit Ether ausgefällt und einigemale mit Ether verrieben. Es wurden 7,9 g
Hydrochlorid gewonnen (E^ 0,70, E^ 0,40; fy 0,09 (Sl),
0,10 (S2), 0,09 (S3), 0,55 (S4)). Das'Hydrochlorid wurde in Dimethylformamid
(40 ml) gelöst; der pH-Wert der Lösung wurde mit N-Ethylpiperidin auf 7,5 - 8,0 (angefeuchtetes pH-Papier)
eingestellt; die Lösung wurde mit 2,4,5-Trichlorphenylester von
o-Nitrobenzolsulfenylphenylalanin (4,6 g) versetzt. Nach 24 h
Rühren wurde eine weitere Teilmenge (1,0 g) des aktiven Esters zugefügt, worauf das Rühren weitere 24 h fortgesetzt wurde.
Dann wurde das Dimethylformamid abgedampft und der Trockenrest mit Ether und Petrolether verrieben, abfiltriert und
mit Wasser, O,IM H2SO^, Wasser, 0,25M NaHCO, und Wasser
gewaschen. Es wurden 8,5 g (74 %) Produkt erhalten; F. 206 - 209 0C;
IKI0 -24,0° (c = 0,2; Dimethylformamid); Rp 0,53 (Sl), 0,29 (S2),
0,58 (S3), 0,72 (S4).
Aminosäureanalyse: Phe 1,05, GIu 1,05, Asp 1,03, Cys(Bzl) 0,83,
Pro 1,03, GIy 1,01.
Elementaranalyse für C^1FU3N10O1,S,-0,5 H„0 (1198):
24 OO JLZ iJ J Δ
% C Si H % N
berechnet: 54,12 5,80 14,02 gefunden : 54,02 · 5/64 14,32.
o-Nitrobenzolsulfenyl-O-t-butyltyrosyl-phenylalanyl-glutaminyl- ·
.asparaginyl-S-benzylcysteinyl-prolyl-N f-p-toluolsulfonyllysylglycinamid
.-
Zu einer Lösung des oben beschriebenen Heptapeptids (2,4 g) in Dimethylformamid (100 ml) wurde 2,05M HCl in Ether (5,1 ml)
zugegeben. Nach 7 min Stehen wurde das Hydrochlorid mit Ether ausgefällt (E^ 0,63, E^ 0,37; Rp 0,18 (Sl), 0,18 (S2),
0,17 (S3), 0,63 (S4)). Das Hydrochlorid wurde in Dimethylformamid (50 ml) gelöst; der pH-Wert der Lösung wurde mit
N-Ethylpiperidin auf 7,5 - 8,0 eingestellt (angefeuchtetes
pH-Papier); die Lösung wurde mit N-Hydroxysuccinimidester von o-Nitrobenzolsulfenyl-O-t-butyltyrosin (1,1 g) versetzt.
Nach 24 h Rühren wurde eine weitere Teilmenge des aktiven Esters (0,2 g) zugefügt und das Rühren bis zum nächsten Tag
♦ «4
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- 21 -
fortgesetzt. Dann wurde das Dimethylformamid abgedampft und der Trockenrest mit Petrolether und Ether verrieben, abfiltriert
und mit Wasser, O,1M H2SO4, Wasser, 0,25M NaHCO3
und Wasser gewaschen. Es wurden 2,5 g (88 %) Produkt erhalten; F. 193 - 197 0C; G*]n -21,1° (c = 0,2; Dimethylformamid);
Rp 0,58 (Sl), 0,34 (S2), 0,63 (S3), 0,77 (S4)).
Aminosäureanalyse: Tyr 0,95, Phe 1,02, GIu 1,05, Asp 0,97,
Cys(Bzl) 0,85, Pro 1,06, GIy 1,01.
Elementaranalyse für
% C | % H | % N | |
berechnet: | 56,41 | 6,18 | 12,76 |
gefunden : | 56,24 | 6,03 | 12,94. |
Benzyloxycarbonyl-S-benzylpenicillaminyl-tyrosyl-phenylalanyl-
glutaminyl-asparaginyl-S-sulfonyllysyl-glycinamid
glutaminyl-asparaginyl-S-benzylcysteinyl-prolyl-N -p-toluol-
Aus dem Octapeptid (1,5 g) wurde auf die oben beschriebene Weise das Hydrochlorid hergestellt, wobei 1,1 ml 2,05M
HCl in Ehter verwendet wurde. Das Hydrochlorid wurde in Dimethylformamid (10 ml) gelöst und der pH-Wert der Lösung mit
N-Ethylpiperidin auf 7,5 - 8,0 eingestellt (angefeuchtetes
pH-Papier); die Lösung wurde mit p-Nitrophenylester von Benzyloxycarbonyl-S-benzylpenicillamin
(0,5 g) in Dimethylformamid (4 ml) versetzt. Nach zweitägigem Rühren wurde eine weitere
Teilmenge des aktiven Esters (0,05 g) in Dimethylformamid (1 ml) zugegeben und das Rühren weitere zwei Tage fortgesetzt.
Dann wurde das Dimethylformamid abgedampft und der Trockenrest mit Petrolether und Ether verrieben, abfiltriert
und mit Wasser, IM HCl, Wasser, 0,25M NaHCO3 und Wasser gewaschen.
Das gewonnene Produkt (1,2 g) wurde in Trifluoressigsäure (120 ml) gelöst und 1 h bei Raumtemperatur stehengelassen.
Zu der Lösung wurde Toluol (120 ml) zugefügt und
das Gemisch im Vakuum eingedampft. Nach Verreiben des Trockenrests
mit Ether wurden 1,1 g (.66 %) Produkt gewonnen; 1,0 g dieses Produkts wurden in vier Teilmengen von je 0,25 g durch
Gelfiltration weiter gereinigt. Es wurden 438 mg (58 %) Produkt erhalten; F. 136 - 141 °C;[<*]D -31,2° (c = 0,2; Dimethylformamid);
RF 0,56 (Sl), 0,30 (S2), 0,68 (S3), 0,71 (S4).
Aminosäureanalyse: Pen(Bzl) 0,88, Tyr 0,87, Phe 1,05, GIu
1,01, Asp. 0,99, Cys(Bzl) 0,88, Pro 0,99, GIy 1,01.
Elementaranalyse | für C | 77H95 | N13 | O16S3- | 1H2O | (1573): |
% | C | Λ> Π | % | N | ||
berechnet: | 58 | ,80 | 6 | ,22 | 11 | ,58 |
gefunden : | 58 | ,83 | 6 | ,10 | 11 | ,76. |
l-Penicillamin-8-lysin-vasopressin (Verbindung 4)
Das geschützte Peptid (144 mg) wurde in siedendem flüssigen Ammoniak (150 ml) gelöst und mit Natrium bis zum Auftreten einer
blauen, 20 s beständigen Färbung des Reaktionsgemischs reduziert. Das Reaktionsgemisch wurde dann.mit Ammoniumchlorid
entfärbt und das Ammoniakisublimiert. Der Rückstand wurde
in Ο,ΟΙΜ HCl (50 ml) gelöst; die Lösung wurde mit Wasser auf
ein Volumen von 400 ml verdünnt und mit Ether ausgeschüttelt. Reste des Ethers wurden aus der Lösung im Vakuum beseitigt.
Die Oxidation wurde mit 3,3·10"2M K3[Fe(CN)5] durchgeführt,
das bis zum Auftreten einer gelben, 1 h beständigen Färbung zugegeben wurde, wobei der pH-Wert des Reaktionsgemischs mit
O,1M NaOH zwischen 6,9 und 7,0 gehalten wurde. Nach der
Oxidation wurde das Reaktionsgemisch mit Essigsäure auf pH 3,6 angesäuert und die Lösung an einer mit einem Kationenaustauscher
in Carboxylatform (30 ml, 0,07 - 0,15 mm) gefüllten Säule chromatographiert. Nach Waschen der Säule mit
0,25 % Essigsäure wurde das Produkt mit 50 %iger Essigsäure
BAD ORIGINAL
* «a
tr 4 » · * ·
- 23 ~
eluiert und lyophilisiert. Das gewonnene Lyophylisat (71 mg)
wurde durch trägerfreie Elektrophorese weiter gereinigt. Es wurden 13,5 mg Produkt erhalten; KD -12,1° (c = 0,14;
3M Essigsäure); E^f 0,63, E^ 0,61; Rr 0,32 (S4), 0,03 (S6).
Aminosäureanalyse: Pen(03H) + CyS(O3H) (1,94), Tyr 0,97
(0,58), Phe 1,01 (0,96), GIu 1,05 (1,03),
Asp 1,04 (1,03), Pro 0,99 (0,93), GIy 1,03 (1,00). Die Werte in Klammern beziehen sich
auf die mit Perameisensäure oxidierte Probe.
(1412)
Elementaranalyse | fur C | 481 69 | N13O12S2. | 3,5 CH3COC |
% | C | % H | % N | |
berechnet: | 46 | ,80 | 6,85 | 12,90 |
gefunden : | 46 | ,61 | 6,06 | 12,82. |
Beispiel 8 |
Acetyl-S-benzylpenicillaminyl-tyrosyl-phenylalanyl-glutaminyl-
asparaginyl glycir.amid
asparaginyl-S-benzylcysteinyl-prolyl-N -p-toluolsulfonyllysyl-
Das oben beschriebene geschützte Nonapeptid (200 mg) wurde in
Essigsäure (2 ml) gelöst; die Lösung wurde mit 35 %iger Bromwasserstoff
lösung in Essigsäure (2 ml) versetzt. Nach 10 min Stehen bei Raumtemperatur wurde das Hydrobromid mit Ether
ausgefällt (E^ 0,53, Rf 0,55 (Sl), 0,16 (S2), 0,54 (S3),
0,62 (S4). Das Hydrobromid wurde in Dimethylformamid (5 ml) gelöst; der pH-Wert der Lösung wurde mit N-Ethylpiperidin
auf 7,5 - 8,0 (angefeuchtetes pH-Papier) eingestellt; zu der Lösung wurde S-Chlor-e-hydroxychinolylacetat (56 mg) zugegeben.
Nach zweitägigem Rühren wurde eine weitere Teilmenge des aktiven Esters zugefügt und das Rühren weitere zwei
Tage fortgesetzt. Dann wurde das Dimethylformamid abgedampft
und der Trockenrest mit Ether und Petrolether verrieben, ab filtriert und mit Wasser, IM HCl, Wasser, 0,25M NaHCO3 und
Wasser gewaschen; es wurden 126 mg (67 %) Produkt erhalten; F. 136 - IAO 0C; E5O0 -7,9° (c = 0,1; Dimethylformamid),
R,- 0,54 (Sl), 0,24 (S2), 0,60 (S3), 0,72 (S4).
Elementaranalyse | für C7 | 1H91N | 130I | 5S3' | ■ 4 | H2O (1535): |
% | C | % | H | % N | ||
berechnet: | 55, | 56 | 6 | ,50 | 11,86 | |
gefunden : | 55, | 38 | 6 | ,02 | 11,83. |
N^Acetyl-l-penicillamin-S-lysin-vasopressin (Verbindung 5)
Das geschützte Nonapeptid (105 mg) wurde in siedendem flüssigen Ammoniak (100 ml) gelöst und mit Natrium bis zum
Auftreten einer blauen, 10 s beständigen Färbung des Reaktionsgemischs
reduziert. Die Lösung wurde mit Ammoniumchlorid entfärbt und das Ammonial^sublimiert. Das Lyophilisat
wurde in Ο,ΟΙΜ HCl (100 ml) gelöst, mit Wasser auf ein
Volumen von 400 ml verdünnt und mit Ether ausgeschüttelt. Die Oxidation wurde mit 3,3-10~2M K3[Fe(CN)6] durchgeführt,
das bis zum Auftreten einer gelben, 1 h beständigen Färbung der Lösung zugegeben wurde; der pH-Wert wurde mit O,1M NaOH
zwischen 6,9 und 7,0 gehalten. Nach der Oxidation wurde das Reaktionsgemisch mit Essigsäure auf pH 3,5 angesäuert
und an einer mit einem Kationenaustauscher in Carboxylatform (20 ml, 0,07 - 0,15 mm) gefüllten Säule chrornatographiert.
Die Säule wurde mit 0,25 % Essigsäure gewaschen und das Produkt mit 50 % Essigsäure eluiert. Nach der
Lyophilisierung wurden 59 mg Produkt gewonnen, das durch trägerfreie Elektrophorese weiter gereinigt wurde. Es wurden
14,8 mg Produkt erhalten; [°30 -51,0° (c = 0,14; 3M Essigsäure);
E^ 0,51, e"1^ 0,38; Rf 0,40 (S4), 0,26 (S6).
BAD ORIGINAL
- 25 -
Aminosäureanalyse: Pen (0,H) + CyS(O3H), (1,88), Tyr 0,94
(0,61), Phe 0,96 (1,02), GIu 1,05 (1,00),
Asp 1,12 (1,00), Pro 1,21 (1,00), Lys 0,96 (0,98), GIy 1,02 (Q95), Die Werte in
Klammern beziehen sich auf die mit Perameisensäure oxidierte Probe.
Elernentaranalyse für c 5u H7iNi3Oi3S2'2 CH3COOH^,5 H5O (13S):
% C % H % N berechnet: 48,86 6,68 13,72 gefunden : 48,80 5,94 13,76.
t-Butyloxycarbonyl-O-methyltyrosyl-phenylalanylglutaminylasparaginyl-S-benzylcysteinyl-prolyl-N
^ -p-toluolsulfonyllysyl-glycinamid
Aus dem Heptapeptid (2,4 g) wurde auf die oben erläuterte Weise das Hydrochlorid hergestellt, wobei 5,1 ml 2,05M HCl
*·■"■■ in Ether verwendet wurden. Das Hydrochlorid wurde in Dimethylformamid
(50 ml) gelöst; der pH-Wert der Lösung wurde mit N-Ethylpiperidin auf 7,5 - 8,0 eingestellt (angefeuchtetes
pH-Papier) und die Lösung mit 2,4,5-Trichlorphenylester von
t-Butyloxycarbonyl-O-methyltyrosin (1,0 g) versetzt. Nach
24 h Rühren wurde eine weitere Teilmenge des aktiven Esters (0,2 g) zugegeben und das Rühren weitere 24 h fortgesetzt.
Dann wurde das Dimethylformamid abgedampft und der Trockenrest mit Petrolether und Ether verrieben, abfiltriert und
mit Wasser, 10 fciger Citronensäure, Wasser, 0,25M NaHCO3
und Wasser gewaschen. Es wurden 2,2 g (8430 Produkt erhalten; F. 196-200 0C; H0 -21,6° (c = 0,2; Dimethylformamid);
RF 0,55 (Sl), 0,25 (S2), 0,46 (S3), 0,66 (S4).
Aminosäureanalyse: Tyr + Tyr(Me) 0,92, Phe 0,98, GIu 1,00,
Asp 1,00, Cys(Bzl) 0,82, Pro 1,05, GIy 1,00.
Elementaranalyse für cg3H84Ni20i5S2'2'5 H2° ^359 ^
% C % H % N
berechnet: 55,70 6,60 12,37 gefunden : 55,54 6,22 12,43.
Benzyloxycarbonyl-S-benzylpenicillaminyl-O-methyltyrosylphenylalanyl-glutaminyl-asparaginyl-S-benzylcysteinylprolyl-N
^-p-toluolsulfonyllysyl-glycinamid
Aus dem oben beschriebenen Octapeptid (1,35 g), das in
Essigsäure (10 ml) gelöst wurde, wurde in üblicher Weise das Hydrobromid hergestellt, wobei 5 ml 35 %iger Bromwasserstoff
in Essigsäure verwendet wurden. Das Hydrobromid wurde in Dimethylformamid (10 ml) gelöst und der pH-Wert der Lösung mit
N-Ethylpiperidin auf 7,5 - 8,0 eingestellt (angefeuchtetes pH-Papier); die Lösung wurde mit p-Nitrophenylester von
Benzyloxycarbonyl-S-benzylpenicillamin (0,51 g) in Dimethylformamid
(2 ml) versetzt. Nach zweitägigem Rühren wurde eine weitere Teilmenge des aktiven Esters (o,25 g) in Dimethylformamid
(2 ml) zugefügt und das Rühren weitere zwei Tage fortgesetzt. Dann wurde das Dimethylformamid abgedampft und
der Trockenrest mit Petrolether und Ether verrieben, abfiltriert und mit Wasser, IM HCl, Wasser, 0,25M NaHCO, und Wasser gewaschen.
Es wurden 1,2 g (74 %) Produkt gewonnen; 0,75 g dieser
Substanz wurden in drei Teilmengen von je 0,25 g durch Gelfiltration weiter gereinigt. Es wurden 361 mg (49 %) Produkt
erhalten; F. 202 - 205 0C;i*3D -34,6° (c = 0,1; Dimethylformamid);
Rp 0,60 (Sl), 0,31 (S2), 0,68 (S3), 0,76 (S4).
Aminosäureanalyse: Pen(Bzl) 1,04, Tyr + Tyr(Me) 0,94, Phe 1,03,
GIu 1,00, Asp 0,99, Cys(Bzl) 0,92, Pro 1,00, GIy 1,00.
BAD ORIGINAL
- 27 -
Elementaranalyse für C78H97Ni3°i6S3'1'5 H2°
3SC % H % N
berechnet: 58,70 6,31 11,41 gefunden : ' 58,65 6,25 11,57.
l-Penicillamin^-O-methyltyrosin-S-lysin-vasopressin (Verbindung 6)
Das oben beschriebene Nonapeptid (145 mg) wurde in siedendern flüssigen Ammoniak (150 ml) gelöst und mit Natrium
bis zum Auftreten einer blauen, 10 s beständigen Färbung reduziert. Die Lösung wurde dann mit Ammoniumchlorid entfärbt
und das Ammoniak absublimiert. Der Rückstand wurde in
Ο,ΟΙΜ HCl (100 ml) gelöst, mit Wasser auf ein Gesamtvolumen
von 450 ml verdünnt und die Lösung mit Ether ausgeschüttelt. Reste des Ethers wurden durch Verdampfen im Vakuum beseitigt.
Die Oxidation wurde mit 3,3-10"2M K3[Fe(CN)^j durchgeführt,
das bis zum Auftreten einer gelben, 1 h beständigen Färbung
zugegeben wurde. Der pH-Wert des Reaktionsgemischs wurde während der Oxidation mit O,1M NaOH auf 6,9 - 7,0 gehalten. Nach der
Oxidation wurde die Lösung mit Essigsäure auf pH 4,0 angesäuert und an einer mit einem Kationenaustauscher in Carboxylatform
gefüllten Säule (20 ml, 0,07 - 0,15 mm) chromatographiert. Die
ioer
Säule wurde mit 0,25 %> essigsäure.gewaschen. Das Produkt wurde mit 50 %iger Essigsäure eluiert und lyophilisiert. Es wurden 86 mg Lyophilisat gewonnen, das'durch trägerfreie Elektrophorese weiter gereinigt wurde. Es wurden 10,3 mg Produkt erhalten; (α] oo (c _ o}i5; 3M Essigsäure); rf1^ 0,64, Eg 7 0,60; RF 0,34 (S4), 0,05 (S6).
Säule wurde mit 0,25 %> essigsäure.gewaschen. Das Produkt wurde mit 50 %iger Essigsäure eluiert und lyophilisiert. Es wurden 86 mg Lyophilisat gewonnen, das'durch trägerfreie Elektrophorese weiter gereinigt wurde. Es wurden 10,3 mg Produkt erhalten; (α] oo (c _ o}i5; 3M Essigsäure); rf1^ 0,64, Eg 7 0,60; RF 0,34 (S4), 0,05 (S6).
Aminosäureanalyse: Pen(03H) + CyS(O3H) (1^94), Tyr + Tyr(Me)
0,94 (0,82), Phe 1,06 (1,04), GIu 0,96
(1,00), Asp 1,06 (1,00), Pro 1,00 (0,99), Lys 0,97 (1,04), GIy 1,00 (0,99). Die Werte
in Klammern beziehen sich auf die mit Perameisensäure oxidierte Probe.
-^ 28 -
Elementaranalyse | fur C^ | 9H71f | s|13°12S2" | 3 CH3COOH-5 |
% | C | % H | % N | |
berechnet: | 48, | 27 | 6,85 | 13,30 |
gefunden : | 48, | 30 | 6,27 | 13,42. |
Beispiel 7 |
(1369)
Acetyl-S-benzylpenicillaminyl-O-methyltyrosyl-phenylalanylglutaminyl-asparaginyl-S-benzylcysteinyl-prolyl-N€
-ptoluolsulfonyllysyl-glycinamid
Das oben beschriebene Nonapeptid (200 mg) wurde in Essigsäure (2 ml) gelöst; die Lösung wurde mit 35 %iger
Bromwasserstofflösung in Essigsäure (2 ml) versetzt. Nach
10 min Stehen bei Raumtemperatur wurde das Hydrobromid mit Ether ausgefällt (E^ 0,49; Rp 0,07 (S2), 0,63 (SA)). Das
Hydrobromid wurde in Dimethylformamid (2 ml) gelöst; der pH-Wert der Lösung wurde mit N-Ethylpiperidin auf 7,5 - 8,0
(angefeuchtetes pH-Papier) eingestellt; zu der Lösung wurde S-Chlor-S-hydroxychinolinylacetat (43 mg) zugegeben. Nach
zweitägigem Rühren wurde eine weitere Teilmenge des aktiven Esters (15 mg) zugefügt und das Rühren weitere zwei Tage
fortgesetzt. Dann wurde das Dimethylformamid abgedampft und der Trockenrest mit Petrolether und Ether verrieben, abfiltriert
und mit Wasser, IM HCl, Wasser, 0,25M NaHCO3 und
Wasser gewaschen. Es wurden 142 mg (74 %) Produkt gewonnen,
das durch Gelfiltration weiter gereinigt wurde. Es wurden 109 mg Produkt erhalten; F. 190 - 195 0C; [öj Q -31,2° (c = 0,1;
Dimethylformamid); Rf 0,56 (Sl), 0,26 (S2), 0,59 (S3), 0,74 (S4).
Elementaranalyse | für C7 | 2H93 | H13 | °15S3* | 2,5 H | 20( |
% | C | % H | % | N | ||
berechnet: | 56, | 83 | 6 | ,49 | 11 | ,96 |
gefunden : | 56, | 50 | 6 | ,30 | 11 | ,99. |
BAD ORIGINAL
s » » ι
- 29 -
N^-Acetyl-l-penicillamin-^-O-methyltyrosin-S-lysin-vasopressin
(Verbindung 7)
Das oben beschriebene geschützte Nonapeptid (92 mg) wurde in siedendem flüssigen Ammoniak (150 ml) gelöst und mit
Natrium bis zum Auftreten einer blauen, 10 s beständigen Färbung des Reaktionsgemischs reduziert. Die Lösung wurde
dann mit Ammoniumchlorid entfärbt und das Ammoniak absublimiert. Der Rückstand wurde in Ο,ΟΙΜ HCl (100 ml) gelöst,
mit Wasser auf ein Volumen von 450 ml verdünnt und mit Ether ausgeschüttelt. Reste des Ethers wurden aus der Lösung durch
Abdampfen im Vakuum entfernt. Die Oxidation wurde mit 3,3-10"2M K3[Fe(CN)6] durchgeführt, das bis zum Auftreten
einer gelben, 1 h beständigen Färbung des Reaktionsgemischs zugegeben wurde. Während der Oxidation wurde der pH-Wert des
Reaktionsgemischs mit O,1M NaOH zwischen 6,9 und 7,0 gehalten.
Nach der Oxidation wurde die Lösung mit Essigsäure auf pH 4,0 angesäuert und an einer mit einem Kationenaustauscher in
Carboxylatform gefüllten Säule (25 ml, 0,07 - 0,15 mm) chromatographiert. Die Säule wurde mit 0,25 %iger Essigsäure gewaschen;
das Produkt wurde mit 50 %iger Essigsäure eluiert und die Lösung lyophilisiert. Es wurden 60 mg Lyophilisat
gewonnen. Nach Reinigung durch trägerfreie Elektrophorese wurden 2,4 mg Produkt erhalten; UK)n -32,8° (c = 0,13; 3M Essigsäure),
E^ 0,51, E^ 0,35; Rf 0,43 (S4), 0,39 (S6).
Aminosäureanalyse: PentO^H) +CyS(O3H) (1,96), Tyr + Tyr(Me)
0,96 (0,69), Phe 1,04 (0,99), GIu 1,01
(1,00), Asp 1,03 (1,00), Pro 1,03 (0,97), Lys 0,95 (0,98), GIy 1,03 (1,01).
O (1628):
Elementaranalyse | für | C51H | 73 Nl | 3 °13S: | ?-6 CH | 3C00H-7 |
% | C | % H | % | N | ||
berechnet: | 46, | 51 | 6 | ,88 | 11, | ,91 |
gefunden : | 46, | 40 | 6 | ,43 | 11, | .08. |
ö-Penicillamin-e-lysin-vasopressin (Verbindung 8)
Das geschützte Nonapeptid, das Amid des Benzyloxycarbonyl-S-benzylcysteinyl-tyrosyl-phenylalanyl-glutaminyl-asparaginyl-S-benzylpenicillaminyl-prolyl-N-p-toluolsulfonyllysyl-glycins,
(90 mg), das durch stufenweisen Aufbau der Peptidkette in Lösung hergestellt worden war, wurde in flüssigem Ammoniak
(100 ml) bis zum Auftreten einer blauen, 20 s beständigen Färbung reduziert. Die Lösung wurde mit Ammoniumchlorid
entfärbt und das Ammoniak absublimiert. Der Trockenrest wurde in Ο,ΟΙΜ HCl (100 ml) gelöst; die Lösung wurde mit Wasser
(50 ml) verdünnt und mit Ether ausgeschüttelt. Nach Verdünnen auf ein Volumen von 300 ml wurde der pH-Wert der
Lösung auf 7,0 eingestellt und die Oxidation durch Zugabe von 3,3-10 M K3CFe(CN),] bis zum Auftreten einer gelben,
1 h beständigen Färbung durchgeführt. Der pH-Wert wurde während der Oxidation zwischen 6,9 und 7,0 gehalten. Nach
Beendigung der Oxidation wurde das Reaktionsgemisch mit Essigsäure auf pH 4,5 angesäuert und auf eine mit einem
Kationenaustauscher in Carboxylatform gefüllte Säule aufgegeben. Die Säule wurde mit 0,25 %iger Essigsäure gewaschen
und das Produkt mit 50 %iger Essigsäure eluiert. Nach Lyophilisierung
wurde das Produkt durch kontinuierliche trägerfreie Elektrophorese gereinigt. Es wurden 10,2 mg Lyophilisat gewonnen;
Mn +13,6° (c =0,13; 3M Essigsäure); E^l1J 0,66,
ETn 0,61; Rr 0,33 (S4)>
0,03 (56).
Aminosäureanalyse: CyS(O3H) + Pen(03H) (1,94), Tyr 0,92
(0,56), Phe 1,00 (0,96), GIu 0,92 (0,91),
Asp 1,00 (1,01), Pro 1,00 (1,03), Lys 1,07 (o,98), GIy 0,96 (1,07). Die Werte in
Klammern beziehen sich auf die mit Perameisensäure oxidierte Probe.
BAD ORIGINAL
- 31 -
Elementaranalyse für C48 H 69Ni3°i2S2'5 CH3C00H'8 K2° (1529)
% C % H % N berechnet: 41,81 6,35 10,93 gefunden (auf 9 %' 5Q , 44 1£J 92
Asche korrigiert): i>PU 6'44 iU'y/'
Beispiel 9
Disulfid-l-penicillamin-o-penicillamin-e-lysin-vasopressin
Disulfid-l-penicillamin-o-penicillamin-e-lysin-vasopressin
Das geschützte Nonapeptid, das Amid des Benzylo ycarbonyl-S-benzylpenicillaminyl-tyrosyl-phenylalanyl-glutaminyl-asparaginyl-S-benzylpenicillaminyl-prolyl-N
£ -p-toluolsulfonyllysyl-glycins
(120 mg), das durch stufenweisen Aufbau der Peptidkette in Lösung hergestellt worden war, wurde in
flüssigem Ammoniak reduziert, mit K-.[Ve(CN) J oxidiert und
J O
wie in Beispiel 1 gereinigt. Es wurden 10,5 mg Produkt erhalten ;(*] -11,0° (c = 0,13; 3M Essigsäure); E^ 0,61,
E^ 7 0,60; Rp 0,36 (S4), 0,04 (S6).
Aminosäureanalyse: Pen(0,H) (1,80), Tyr 0,86 (0,82),
Phe 1,00 (1,06), GIu 0,92 (0,98), Asp 1,00 (0,91), Pro 1,00 (1,13),
Lys 1,00 (0,98), GIy 1,00 (0,99). Die Werte in Klammern beziehen sich
auf die mit Perameisensäure oxidierte Probe.
Elementaranalyse für c 5oH73Ni3°i2S2*3'5 CH 3 Cu0H'5 H 2°
% C % H % N
berechnet: 48,57 6,92 12,89 gefunden : 48,54 6,80 12,86.
Claims (12)
- BEETZ & PARTNER Steinsdorfstr. 10 ■ D-8000 München 22 Telefon (089) 227201 - 227244 - 295910 Telex 5 22 048 - Telegramm Allpat'· München233-34.991PPatentanwälte European Patent AttorneysDipl.-Ing. R. BEETZ sen.Dr.-Ing. R. BEETZ jun.Dr.-lng. W. TlMPE Dipl.-Ing. J. SIEGFRIED Priv.-Doz. Dipl.-Chem. Dr. rer. nat. W. SCHMITT-FUMiANDipl.-Ing. K. LAMPRECHT 11981 3. Juni 1983AnsprücheI 1. Analoga von neurohypophysären Hormonen mit Inhibierungswirkungen der Formel IA-V-Tyr(B)-X-GIn-ASn-Y-PrO-Z-GIyNH2 (I),in der bedeuten:A CH3CO oder H,V den Penicillaminrest oder Cys, B CH3 oder H,X He oder Phe,Y den Penicillaminrest oder Cys und Z Leu oder Lys,wobei alle chiralen Aminosäuren L-Konfiguration besitzen.
- 2. l-N-Acetylpenicillamin-oxytocin als Verbindung der Formel I nach Anspruch 1.
- 3. l-Penicillamin^-O-methyltyrosin-oxytocin als Verbindung der Formel I nach Anspruch 1.
- 4. l-N-Acetylpenicillamin-2-O-methyltyrosin-oxytocin als Verbindung der Formel I nach Anspruch 1.233-S10244-SF-BkBAD ORIGINAL
- 5. l-Penicillamin-S-lysin-vasopressin als Verbindung der Formel I nach Anspruch 1. j
- 6. l-N-Acetylpenicillamin-e-lysin-vasopressin als Verbindung der Formel I nach Anspruch 1.
- 7. l-Penicillamin^-O-methyltyrosin-S-lysin-rvasopressin als Verbindung der Formel I nach Anspruch 1.
- 8. l-N-Acetylpenicillamin-^-O-methyltyrosin-e-lysin-vasopressin als Verbindung der Formel I nach Anspruch 1.
- 9. o-Penicillamin-S-lysin-vasopressin als Verbindung der Formel I nach Anspruch 1.
- 10. l-Penicillamin-ö-penicillamin-e-lysin-vasopressin als Verbindung der Formel I nach Anspruch 1.
- 11. Verfahren zur Herstellung der Analoga nach einem der Ansprüche■ "I Tdis 10, gekennzeichnet durch Oxidation eines linearen Peptids der Formel IIH Hι IA-V-Tyr(B)-X-GIn-ASn-Y-PrO-Z-GIyNH2 (II)mit A, B, V, X, Y und Z wie in Anspruch 1 unter Erzeugung einer Disulfidbindung.
- 12. Pharmazeutische Mittel, gekennzeichnet durch mindestens eines der Analoga nach einem der Ansprüche 1 bis 10 als Wirkstoff.BAD ORIGINAL οοργ
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