CH658061A5 - Analoga von neurohypophysaeren hormonen mit inhibierungswirkungen. - Google Patents

Description

658 061

PATENTANSPRÜCHE 1. Analoga von neurohypophysären Hormonen mit Inhi-bierungswirkungen der chemischen Formel I

A-V-Tyr(B)-X-Gln-Asn-Y-Pro-Z-GlyNH2

I I

CO

wo A CH3CO oder H, V den Rest des Penicillamins oder Cys-teins, B CH3 oder H, X den Rest des Isoleucins oder Phenylalanins, Y den Rest des Penicillamins oder Cysteins, Z den Rest des Leucins oder Lysins bedeutet.

2. (l-N-Acetylpenicillamin)oxytocin als Verbindung nach dem Patentanspruch 1.

3. (1-penicillamin, 2-0-methyltyrosin)oxytocin als Verbindung nach dem Patentanspruch 1.

4. (l-N-Acetylpenicillamin, 2-0-methyltyrosin)oxytocin als Verbindung nach dem Patentanspruch 1.

5. (1-Penicillamin, 8-lysin)vasopressin als Verbindung nach dem Patentanspruch 1.

6. (l-N-Acetylpenicillamin, 8-lysin)vasopressin als Verbindung nach dem Patentanspruch 1.

7. (1-Penicillamin, 2-O-methyltyrosin, 8-lysin)-vasopres-sin als Verbindung nach dem Patentanspruch 1.

8. (l-N-Acetylpenicillamin, 2-O-methyltyrosin, 8-lysin)-vasopressin als Verbindung nach dem Patentanspruch 1.

9. (6-Penicillamin, 8-lysin)vasopressin als Verbindung nach dem Patentanspruch 1.

10. (1-Penicillamin, 6-penicillamin, 8-lysin)vasopressin als Verbindung nach dem Patentanspruch 1.

bierungswirkungen gegenüber dem Einfluss des Oxytocins oder Vasopressins führt.

Ähnlicherweise starke Inhibierungseigenschaften weisen auch Analoga des Vasopressins auf, in welchen sich der Peni-s cillaminrest in der Stellung 6, bzw. in den Stellungen 1 und 6, befindet.

•Das Wesen der Erfindung bilden also neue Analoga von neurohypophysären Hormonen mit Inhibierungswirkungen der allgemeinen Formel I

10

A-V-Tyr(B)-X-Gln-Asn-Y-Pro-Z-GlyNH2 (I)

I I

wo A CH3CO oder H, V den Penicillaminrest (weiter Pen) oder Cys, B CH3 oder H, X Ile oder Phe, Y Cys oder Pen, Z Leu oder Lys bedeutet.

Es handelt sich besonders um folgende Analoga: [l-N-Acetylpenicillamin]oxytocin (Ia)

[1-Penicillamin, 2-0-Methyltyrosin]oxytocin (Ib)

[l-N-Acetylpenicillamin, 2-0-Methyltyrosin]oxytocin (Ic) [1-Penicillamin, 8-Lysin] Vasopressin (Id)

[l-N-Acetylpenicillamin, 8-Lysin]vasopressin (Ie)

[1-Penicillamin, 2-O-Methyltyrosin, 8-Lysin]vasopressin (If) [l-N-Acetylpenicillamin, 2-O-Methyltyrosin, 8-Lysin]-25 Vasopressin (Ig)

[6-Penicillamin, 8-Lysin] Vasopressin (Ih)

[1-Penicillamin, 6-penicillamin, 8-Iysin] Vasopressin (Ii)

Die einzelnen die angeführten Analoga Ia—Ii betreffende Variationen sind in der Tabelle I zusammengefasst.

Das Wesen des Herstellungsverfahrens von neuen Analoga des Oxytocins und Vasopressins nach der Formel I liegt darin, dass man das lineare Peptid der Formel II

30

Den Gegenstand der Erfindung bilden Analoga von neurohypophysären Hormonen mit Inhibierungswirkungen.

Es handelt sich um Analoga, welche die Inhibierungswir-kung gegenüber einigen biologischen Aktivitäten der neurohypophysären Hormone aufweisen. Diese Inhibitoren können sowohl zum Beweis der neurohypophysären Hormone in Leibesflüssigkeiten als auch zur potentiellen ärztlichen Verwendung dienen, d.h. der pathologischen Überproduktion von endogenen Hormonen.

Bisher wurden hauptsächlich zwei strukturelle Zeichen bekannt, deren Gegenwanrt im Molekül des Oxytocins die Inhibierungswirkungen hervorruft: Austausch der Hydroxylgruppe von Tyrosin in der Stellung 2 gegen die Methoxyl-gruppe (Beränkovä Z., Rychlik I., Jost K., Rudinger J., Sorm F.: Coll. Czechoslov. Chem. Commun. 26,2673 (1961) ), wobei die Inhibierungswirkung durch gleichzeitige Acetylierung der a-Aminogruppe des Cysteins in der Stellung 1 vertieft werden kann (Jost K., Sorm F.: Coli. Czechoslov. Chem. Commun. 36,297 (1971) ). Die Einführung von zwei Methylgruppen (Schulz H., du Vigneau V.: J. Med. Chem. 9,647 (1966) ) oder von zwei Ethylgruppen (Vavrek R.J., Ferger M. F., Allen G.A., Rieh D.H., Blomquist A.T., du Vigneaud V.: J. Med. Chem. 15,124 (1972) ) oder der Polymethylenkette (Nestor J.J., Ferger M.F., du Vigneaud V.: J. Med. Chem. 18, 284 (1975) ) in die ß-Stellung der ß-Mercaptopropionsäure in Kombination mit der Alkylierung des Tyrosins (Sawyer W.H., Grzonka Z., Manning M.: Mol. Cell. Endocrinol, 22, 117 (1981) ) bildet aus diesen Substanzen einen weiteren Typ von wirksamen Inhibitoren.

Es wurde derzeit festgestellt, dass auch gegenseitige Kombination der strukturellen Variationen wie Alkylierung des Tyrosins und Einführung von zwei Methylgruppen in ß-Stel-lung des Cysteins in der Stellung 1 der peptidischen Kette mit eventueller Acetylierung der primären Aminogruppe des Cysteins zur Bildung von Verbindungen mit ausgeprägten Inhi-

H H

I I

35 A-V-Tyr(B>-X-Gln-Asn-Y-Pro-Z-GlyNH2,

(II)

40

wo A, B, V, X, Y, Z dieselbe Bedeutung wie in der Formel I haben, unter Entstehung der disulfidischen Bindung auf bekannte Weise oxidiert.

Einige biologische Wirkungen von Analoga des Oxytocins und Vasopressins sind in der Tabelle I angeführt. Die Inhibierungswirkungen der Substanzen im Test in vivo sind in den pA2-Werten ausgedrückt, was den negativen Logarithmus jener molaren Konzentration des Inhibitors darstellt, die 45 die Antwort der 2X Einheiten des Agonisten so erniedrigt, damit sie der Antwort von IX Einheiten in Abwesenheit des Inhibitors gleich wäre (Schild H.O.: Brit. J. Pharmacol. 2,189 (1947)); Dyckes D.F., Nestor J. J., Ferger M.F., du Vigneaud: J. Med. Chem. 17 260 (1974)). Im Test in vitro (Gebärmutter 30 in vitro) entspricht der pA2-Wert dem negativen Logarithmus der Inhibierungskonstante nach der Beziehung pA2 =

-log

B

55

A50B~1

MO

wo B die Konzentration des Inhibitors (M), A50 die Agoni-stenkonzentration, welche zu 50% der maximalen Wirkung führt, und A50b die Agonistenkonzentration, welche zu 50% 60 der maximalen Wirkung in Gegenwart des Inhibitors B führt, darstellt (Eggene P., Schwartz I.L., Walter R.: J. Gen. Phy-siol. 52,465 (1968) ). Die in den Ausführungsbeispielen ver-' wendeten Methoden:

Die Aminosäure Analysen wurden auf dem automati-65 sehen Apparat, Typ 6020 durchgeführt (Entwicklungswerkstätten der Tschechoslov. Akademie der Wissenschaften). Die Peptidproben wurden durch 6M-HC1 im Vakuum 150 Pa bei der Temperatur 105 °C innerhalb von 20 Stunden hydroly-

siert. Die Oxidation wurde mit der Perameisensäure durchgeführt. Die Dünnschichtchromatographie wurde auf den Sili-cagelfolien (Silufol, Kavalier) in folgenden Systemen durchgeführt: 2-Butanol - 98%ige Ameisensäure - Wasser (75:13,5:11,5; Sl), 2-Butanol-25%iges wässriges Ammoniak - Wasser (85:7,5:7,5, S2), 1-Butanol - Essigsäure - Wasser (4:1:1, S3), 1 -Butanol - Pyridin - Essigsäure - Wasser (15:10:3:6, S4) und Methanol-Chloroform-Essigsäure-Wasser (10:15:3:2, S6). Analytische Elektrophorese wurde auf den Papieren Whatman 3MM in feuchter Kammer beim Potentialgefälle 20V/cm innerhalb von einer Stunde in IM Essigsäure (pH 2,4) und im Pyridin-acetat Puffer (pH 5,7) durchgeführt. Die Substanzen wurden mit Ninhydrin oder mit der Chlorierungsmethode nachgewiesen. Für die Gegenstromverteilung wurde der ganzgläserne Apparat mit der Verschiebungsmöglichkeit der Ober- und Unterphase verwendet. Die präparative trägerfreie Elektrophorese wurde auf dem früher beschriebenen Apparat durchgeführt (Prusik Z., Sedlâkovâ E., Barth T.: Hoppe-Seyler's Z. Physiol. Chem. 353,1837 (1972)). Für die hochwirksame Flüssigkeitschromatographie wurde ein aus kommerziellen Teilen aufgestellter Apparat und die mit Separone SI-C-18 gefüllten Kolonnen verwendet (Laboratorni pristroje, Praha).

Beispiel 1

Amid von o-Nitrobenzolsulfenyl-O-tert.butyltyrosyl-isoleucyl glutaminyl-asparaginyl-S- benzylcysteinyl-prolyl- leucyl-glycin

Zur Lösung des Amids von Isoleucyl-glutaminyl-aspara-ginyl-S- benzylcysteinyl-prolyl- leucyl-glycin (1,27 g; Jost K., Rudinger J., Sorm F.: Coli. Czechoslov. Chem. Commun. 26, 2496 (1961) ) in Dimethylformamid (25 ml) wurde N-Hydro-xysuccinimidester von O-Nitrobenzolsulfenyl-O-tert.butylty-rosin (0,56 g) zugegeben. Nach zweitägigem Rühren wurde der weitere Teil von aktivem Ester (0,05 g) zugefügt und das Rühren wurde weitere 24 Stunden fortgesetzt. Das Dimethylformamid wurde abgedampft und der Trockenrest mit Petrol-äther und Äther zerrieben, abfiltriert und mit Wasser 0,1M-H2S04, Wasser, 0,25M-NaHC03 und Wasser durchgewaschen. Es wurden 1,2 g (65%) Produkt vom Schmp. 225-229 °C [a]D 0° (s 0,2,Dimethylformamid) gewonnen. RF 0,51 (Sl), 0,36 (S2), 0,65 (S3), 0,74 (S4). Analyse der Aminosäuren: Tyr 0,94, Ile 0,94, Glu 1,03, Asp 1,06, Cys(Bzl) 0,95, Pro 0,95, Leu 1,08, Gly 1,04. Für D57H8oNi2013Ss • H20 (1223) berechnet: 55,96% C, 6,76% H, 13,74% N; gefunden: 55,97% C, 6,57% H, 13,70% N.

Amid von Benzyloxycarbonyl-S-benzylpenicillaminyl- tyrosyl-isoleucyl-glutaminyl-asparaginyl-S- benzylcysteinyl-prolyl-leucyl-glycin

Zur Lösung des oben hergestellten Oktapeptids (1,1 g) in Dimethylformamid (15 ml) wurden 2,05M-HC1 in Äther (1 ml) zugegeben. Nach 7 Minuten Stehen wurde das Hy-

drochlorid mit Äther ausgefällt. E 0,59, E

His 5,7

0,33;

Rf 0,25 (Sl), 0,17 (S2), 0,24 (S3), 0,64 (S4). Das Hydrochlo-rid wurde in Dimethylformamid (10 ml) aufgelöst, pH-Wert der Lösung wurde mit N-Äthylpiperidin auf 7,5-8,0 (angefeuchtetes pH-Papier) reguliert und zu der Lösung wurde p-Nitrophenylester von Benzyloxycarbonyl-S-benzylpenicilla-min (0,4 g) in Dimethylformamid (3 ml) zugegeben. Nach zweitägigem Rühren wurde der weitere Teil des aktiven Esters (0,04 g) zugefügt und das Rühren wurde weitere zwei Tage fortgesetzt. Das Dimethylformamid wurde abgedampft und der Trockenrest wurde mit Petroläther und Äther zerrieben, abfiltriert und mit W.asser, 1M-HC1, Wasser, 0,25M-NaHCOj und Wasser durchgewaschen. Die gewonnene Substanz (0,77 g) wurde in der Trifluoressigsäure (77 ml) aufgelöst. Nach einstündigem Stehen bei der Raumtemperatur

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wurde zu dem Reaktionsgemisch Toluol (77 ml) zugegeben und die Lösung wurde bis zum Trockenrest abgedampft. Der Trockenrest wurde mit Äther zerrieben, abfiltriert und im Ex-sikkator über P205 und KOH ausgetrocknet. Es wurden 0,7 g 5 (57%) Produkt gewonnen. 0,5 g dieser Substanz wurden weiter in zwei Teilen je 0,25 g durch die Gelfiltration gereinigt. Das Produkt wurde durch Abdampfen des Dimethylform-amids und durch Zerreiben des Trockenrestes mit Äther isoliert. Es wurden 0,27 g (54%) Produkt vom Schmp. io 228-231 °C, [a]D - 42,1° (c 0,2, Dimethylformamid) gewonnen. RF 0,54 (Sl), 0,33 (S2), 0,66 (S3), 0,77 (S4). Analyse der Aminosäuren: Pen(Bzl) 0,96, Tyr 0,93, Ile 0,95, Glu 0,99, Asp 1,02, Cys (Bzl) 0,89, Pro 1,04, Leu 1,02, Gly 0,97. Für C67H90Ni2O14S2 • H20 (1370) berechnet: 58,75% C, 6,77% H, 15 12,27% N; gefunden: 58,70% C, 6,53% H, 12,33% N.

Amid von Acetyl-S-benzylpenicillaminyl- tyrosyl-isoleucyl-glutaminyl- asparaginyl-S-benzylcysteinyl-propyl- leucyl-glycin

20 Zur Lösung des oben hergestellten Nonapeptids (245 mg) in Essigsäure (2 ml) wurde 35%iger Bromwasserstoff in Essigsäure (2 ml) zugegeben. Nach 15 Minuten Stehen bei der Raumtemperatur wurde das Hydrobromid mit Äther ausge-

23 fällt. D 0,51; Rf 0,42 (Sl), 0,09 (S2), 0,43 (S3), 0,62

(S4). Das Hydrobromid wurde in Dimethylformamid (2,5 ml) aufgelöst, pH der Lösung wurde mit N-Äthylpiperi-din auf den Wert 7,7-8,0 (angefeuchtetes pH-Papierchen) reguliert und zu der Lösung wurde das 5-Chlor-8-hydroxychi-30 nolinylester der Essigsäure (106 mg) zugegeben. Nach zweitägigem Rühren wurde der weitere Teil des aktiven Esters (20 mg) zugefügt und das Rühren wurde nach 24 Stunden fortgesetzt. Das Dimethylformamid wurde abgedampft, der Trockenrest mit Petroläther und Äther zerrieben, abfiltriert 35 und mit Wasser, 1M-HC1, Wasser, 0,25N-NaHC03 und mit Wasser durchgewaschen. Es wurden 185 mg (70%) Produkt gewonnen, das weiter durch die Gelfiltration gereinigt wurde. Es wurden 151 mg (82%, Gesamtausbeute 57%) Substanz vom Schmp. 226-231 °C, [a]D—39,7° (c 0,1, Dimethylform-40 amid) gewonnen. RF 0,49 (Sl), 0,24 (S2), 0,58 (S3), 0,73 (S4). Für C61H86HI2013S2 • 0,5 H20 (1269) berechnet: 57,76% C, 6,91% H, 13,25% N; gefunden 57,73% C, 6,89% H, 13,57% N.

45 Na-Acetyl[l-penicillamin]oxytocin (Ia)

Das geschützte oben beschriebene Nonapeptid (138 mg) wurde in siedendem flüssigem Ammoniak (150 ml) gelöst und mit Natrium bis zur blauen innerhalb von 10 Sekunden stän-50 digen Färbung des Reaktionsgemisches reduziert. Die Lösung wurde mit Ammoniumchlorid entfärbt und das Ammoniak ablyophilisiert. Der Trockenrest wurde in 0,01M-HC1 (100 ml) aufgelöst, mit Wasser auf das Gesamtvolumen 300 ml verdünnt und pH der Lösung mit O.OlM-NaOH auf 55 den Wert 7,0 eingestellt. Die Oxidation wurde mit 3,3 ■ 10-2M-K3[Fe(CN)6] durchgeführt, welches bis zur gelben innerhalb von einer Stunde ständigen Färbung des Reaktionsgemisches zugegeben wurde. Während der Oxidation wurde der pH-Wert des Reaktionsgemisches im Intervall 6,9-7,0 ge-60 halten. Das Reaktionsgemisch wurde mit 1M-HC1 auf pH 4,1 angesäuert und auf die mit schwach basischem Anione-naustauscher im Chloridzyklus (50 ml) gefüllte Kolonne aufgetragen. Die Kolonne wurde mit Wasser (50 ml) durchgewaschen und die verbundenen Eluate wurden auf der mit Sepa-65 ron SI-C-18 gefüllten Kolonne entsalzt. Nach Durchwaschen der Kolonne mit Wasser wurde das Produkt mit 90%-igem Methanol ausgewaschen. Das Eluat wurde mit der Essigsäure auf den pH-Wert 4,5 angesäuert und Methanol

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wurde abgedampft. Nach der Lyophilisierung wurden 72 mg Produkt gewonnen. 35 mg von diesem Produkt wurden durch Hochdruckflüssigkeitschromatographie (Methanol-Wasser [4:6] gereinigt. Es wurden 11 mg Produkt gewonnen. [a]D —47,0° (c 0,18,3M Essigsäure). RF 0,64 (S4), 0,76 (S6). Analyse der Aminosäuren: Pen(03H)+Cys(03H) (2,00), Tyr (0,97 (0,66), Ile 1,00 (1,00), Glu 0,97 (1,00), Asp 0,97 (1,00, Pro 1,03 (0,77), Leu 1,06 (1,00), Gly 1,00 (1,00). (In Klammern sind die Werte für die Perameisensäure oxidierte Probe angegeben). Für C47H72NUO13S2 • 2CH3COOH • 6H20 (1305) berechnet: 46,92% C, 7,10% H, 12,87% N; gefunden: 46,87% C, 6,72% H, 12,81% N.

Beispiel 2

Amid von tert.-Butyloxycarbonyl-O-methyltyrosyl- isoleucyl-glutaminyl-asparaginyl- S-benzylcysteinyl-prolyl- leucyl-glycin

Das oben beschriebene Heptapeptid (2,1 g) wurde in Dimethylformamid (50 ml) aufgelöst und zu der Lösung wurde das 2,4,5-Trichlorphenylester von tert.Butyloxycarbonyl-0-methyltyrosin (1,1g) zugegeben. Nach zweitägigem Rühren wurde der weitere Teil des aktiven Esters zugefügt (0,2 g) und das Rühren wurde bis zum nächsten Tag fortgesetzt. Das Dimethylformamid wurde abgedampft, der Trockenrest mit Petroläther und Äther zerrieben, abfiltriert und mit Wasser, 5% Zitronensäure, Wasser, 0,25M-NaHC03 und Wasser durchgewaschen. Es wurden 1,9 g (67%) Produkt vom Schmp. 225-228 °C [a]D —35,2° (c 0,2, Dimethylformamid) gewonnen. RF 0,50 (Sl), 0,32 (S2), 0,59 (S3), 0,72 (S4). Analyse der Aminosäuren: Tyr(Me) -i-Tyr 0,93, Ile 0,96, Glu 0,99, Asp l,01,Cys(Bzl), 1,03, Pro 1,02, Leu 1,04, Gly 1,00. Für Cj^NnOnS • 0,5 H20 (1119) berechnet: 56,87% C, 7,20% H, 13,76% N; gefunden 56,62% C, 7,10% H, 13,73% N.

Amid des Benzyloxycarbonyl-S- benzylpenicillaminyl-O- me-thyltyrosyl-isoleucyl-glutaminyl- asparaginyl-S- benzyl-cysteinyl-prolyl- leucyl-glycins

Zur Lösung des obenhergestellten Oktapeptids (1,5 g) in Essigsäure (15 ml) wurde 35% HBr in Essigsäure (15 ml) zugegeben. Nach 5 Minuten bei der Raumtemperatur wurde das

Hydrobromid durch Äther ausgefällt. E 0,57, E

0,27; Rf 0,23 (Sl), 0,20 (S2), 0,34 (S3), 0,59 (S4). Das Hydrobromid wurde in Dimethylformamid (15 ml) aufgelöst, pH der Lösung mit N-Äthylpiperidin auf den Wert 7,5-8,0 (angefeuchtetes pH-Papierchen) eingestellt und zur Lösung wurde das p-Nitrophenylester des Benzyloxycarbonyl-S- benzylpe-nicillamins (0,7 g) in Dimethylformamid (4 ml) zugegeben. Nach Rühren innerhalb von 4 Tagen wurde das Dimethylformamid abgedampft, der Trockenrest wurde mit Petroläther und Äther zerrieben, abfiltriert und mit Wasser, 1M-HC1, Wasser, 0,25M-NaHC03 und Wasser durchgewaschen. Es wurde 1,0 g (54%) Produkt gewonnen, das weiter in vier Teilen je 0,25 g durch die Gelfiltration gereinigt wurde. Es wurden 0,59 g (59%, Gesamtausbeute 32%) Produkt vom Schmp. 233-239 °C, [a]D —40,2 (c 0,2, Dimethylformamid) gewonnen. RF 0,54 (Sl), 0,33 (S2), 0,66 (S3), 0,76 (S4). Analyse der Aminosäuren: Pen(Bzl) 0,87, Tyr(Me) -1-Tyr 0,87, Ile 0,94, Glu 0,99, Asp 1,04, Cys(Bzl) 0,88, Pro 1,04, Leu 1,04, Gly 0,99. Für Q8H92N12O14S2 • H20 (1384) berechnet: 59,03%, C, 6,85% H, 12,15%, N; gefunden: 59,05% C, 6,79% H, 12,26% N.

[l-Penicillamin-2-O-methyltyrosin] oxytocin (Ib)

Das geschützte oben beschriebene Oktapeptid (238 mg) wurde in siedendem flüssigem Ammoniak (250 ml) gelöst und mit Natrium bis zur blauen innerhalb von 30 Sekunden ständigen Färbung des Reaktionsgemisches reduziert. Die Lösungwurde mit Ammoniumchlorid entfärbt, das Ammoniak wurde ablyophilisiert und der Trockenrest in 0,01M-HC1

(100 ml) aufgelöst. Die Lösung wurde auf das Gesamtvolumen 500 ml mit Wasser verdünnt, pH der Lösung wurde auf den Wert 7,0 mit O.lM-NaOH eingestellt. Die Oxydation wurde mit 3,3M • 10~2M-K3[Fe(CN)6] durchgeführt, welches bis zur gelben innerhalb von einer Stunde ständigen Färbung des Reaktionsgemisches zugegeben wurde. Während der Oxidation wurde der pH-Wert des Reaktionsgemisches im Intervall 6,9-7,0 gehalten. Die Lösung wurde mit 1M-HC1 auf den pH-Wert 4,5 angesäuert und auf die mit schwach basischem Anionenaustauscher im Chloridzyklus gefüllte Kolonne aufgetragen. Die Kolonne wurde mit Wasser (50 ml) durchgewaschen und die Eluate wurden lyophylisiert. Die Verbindung wurde mit kontinuierlicher trägerfreie Elektrophorese gereinigt. Es wurden 23,1 mg Produkt gewonnen.[a]D 0° (c 0,14,

3M-Essigsäure). E 0,62, E 0,23. RF 0,62 (S4), 0,56

(S6). Analyse der Aminosäuren: Pen(03H)+Cys(03H) 2,09, Tyr(Me)2Tyr 0,95 (0,82), Ile 0,96 (0,93), Glu 1,02 (1,02), Asp 1,00 (1,02), Pro 0,98 (1,02), Leu 1,02 (1,00), Gly 1,00 (1,00) (In Klammern sind die Werte für die durch Perameisensäure oxidierte Probe angegeben). Für C46H72NUO12S2 • 0,5 CH3COOH • 2,5 H20 (1124) berechnet: 50,21% C, 7,08% H, 14,95% N; gefunden: 50,30% C, 6,72% H, 14,94% N.

Beispiel 3

Amid von Acetyl-S-benzylpenicillaminyl- O-methyltyrosyl-iso-leucyl- glutaminyl-asparaginyl- S-benzylcysteinyl-prolyl- leucyl-glycin

Zur Lösung des Nonapeptids (190/mg) in Essigsäure (2 ml) wurde 35% HBr in Essigsäure (2 ml) zugegeben. Nach Stehen innerhalb von 10 Minuten bei der Raumtemperatur wurde das Hydrobromid mit Äther ausgefällt. E 0,50;

Rp 0,47 (Sl), 0,28 (S2), 0,44 (S3), 0,63 (S4). Das Hydrobromid wurde in Dimethylformamid (5 ml) aufgelöst, pH der Lösung mit N-Äthylpiperidin auf den Wert 7,5-8,0 (angefeuchtetes pH-Papierchen) eingestellt und zur Lösung das 5-Chlor-8-hydroxychinolinylester der Essigsäure (39 mg) zugegeben. Nach zweitägigem Rühren wurde der weitere Anteil des aktiven Esters zugefügt und das Rühren wurde weitere zwei Tage fortgesetzt. Das Dimethylformamid wurde abgedampft, der Trockenrest mit Petroläther und Äther zerrieben, abfiltriert und mit Wasser, 1M-HC1, Wasser, 0,25M-NaHC03 und Wasser durchgewaschen. Es wurden 140 mg (79%) Produkt, das weiter mit der Gelfiltration gereinigt wurde, gewonnen. Es wurden 97 mg Produkt vom Schmp. 234-238 °C [a]D —47,2° (c 0,1, Dimethylformamid) gewonnen. RF 0,49 (Sl), 0,27 (S2), 0,55 (S3), 0,73 (S4). Für C62H88H12013S2 • 2H20 (1310) berechnet: 56,86% C, 7,08% H, 12,83% N; gefunden: 56,61% C, 6,84% H, 12,76% N.

N°-Acetyl [l-penicillamin-2-O-methyltyrosin] oxytocin (lc)

Das geschützte oben beschriebene Nonapeptid (87 mg) wurde in flüssigem siedendem Ammoniak aufgelöst (100 ml) und mit Natrium bis zur blauen innerhalb von 10 Sekunden ständigen Färbung des Reaktionsgemisches reduziert. Die Lösung wurde mit Ammoniumchlorid entfärbt und das Ammoniak wurde ablyophylisiert. Der Trockenrest wurde in 0,1M-HC1 (100 ml) aufgelöst. Die Lösung wurde auf das Gesamtvolumen 400 ml verdünnt. Die Oxidation wurde mit 3,3-10 ~2M-K3[Fe(CN)6], welches bis zur gelben innerhalb von einer Stunde ständigen Färbung des Reaktionsgemisches zugegeben wurde, durchgeführt. Die Lösung wurde mit 1M-HC1 auf den pH Wert 4,5 angesäuert und auf die mit schwach basischem Anionenaustauscher im Chloridzyklus (50 ml) gefüllte Kolonne aufgetragen. Die Kolonne wurde mit Wasser durchgespült (50 ml) und die Eluate wurden lyophylisiert. Die Substanz wurde weiter durch die Gegenstromverteilung

4

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

im System sec. Butanol-0,05% wässrige Essigsäure (1:1) gereinigt. Nach 100 Verschiebungen der oberen und nach 100 Verschiebungen der unteren Phase wurde die Verbindung aus den Röhren 44-56 isoliert und weiter durch die Gelfiltration gereinigt. Es wurden 7,1 mg Produkt vom [a]D — 67,0° (c 0,10, 3M-Essigsäure) gewonnen; RF 0,64 (S4), 0,83 (S6). Analyse der Aminosäuren: Pen(03H) + Cys(Ò3H) (2,05), Tyr(Me) + Tyr 0,98 (0,35), Ile 0,98 (1,00), Glu 1,05 (1,03), Asp 1,00 (1,01), Pro 0,96 (0,95), Leu 1,00 (1,00), Gly 1,00 (1,00). (In Klammern sind Werte für die durch Perameisensäure oxidierte Probe angegeben). Für C48H74Ni2013S2 ■ 6HzO (1199) berechnet: 48,07% C, 7,23% H, 14,01% N; gefunden: 48,09% C, 7,34% H, 14,23% N.

Beispiel 4

Amid des o-Nitrobenzolsulfenylasparaginyl- S-benzylcysteinyl-prolyl-Nz- p-toluolsulfonyllysyl- glycins

Amid des S-Benzylcysteinyl-prolyl- Ne-p- toluolsulfenyl-lysyl-glycins (14,0 g) wurde in Dimethylformamid (70 ml) gelöst und pH der Lösung wurde mit N-Äthylpiperidin auf den Wert 7,5-8,0 (angefeuchtetes pH-Papierchen) eingestellt. Zur Lösung wurde das 2,4,5-Trichlorphenylester des o-Nitroben-zolsulfenylasparagins (11,0 g) zugegeben und das Gemisch wurde bei der Raumtemperatur gerührt. Nach 24 Stunden wurde der weitere Anteil des aktiven Esters (1,0 g) zugegeben und das Rühren wurde weitere 24 Stunden fortgesetzt. Das Dimethylformamid wurde abgedampft und der Trockenrest mit Petroläther und Äther zerrieben, abfiltriert und mit Wasser, 0,1M-H2S04, Wasser 0,25M-NaHC03 und Wasser durchgewaschen. Es wurden 15,1 g (76%) Produkt vom Schmp. 175-179 °C [a]D —62,1° (c0,2, Dimethylformamid) gewonnen. RF 0,55 (Sl), 0,39 (S2), 0,60 (S3), 0,69 (S4). Analyse der Aminosäuren: Asp 0,97, Cys(Bzl) 0,98, Pro 1,03, Gly 1,01. Für C4oH51N901oS3 (914,1) berechnet: 52,56% C, 5,62% H, 13,79% N; gefunden: 52,23% C, 5,54% H, 13,70% N.

Amid des o-Nitrobenzolsulfenylglutaminyl-asparaginyl- S-ben-zylcysteinyl-prolyl- N£-p- toluolsulfonyllysyl-glycins

Zur Lösung der oben hergestellten Verbindung (14,0 g) in Dimethylformamid (50 ml) wurde 2,26M-HC1 in Äther (14,2 ml) zugegeben. Nach Stehen innerhalb von 7 Minuten wurde das Hydrochlorid mit Äther ausgefallt und mit Äther aus der Dimethylformamidlösung umgefällt. Es wurden

12,3 g Hydrochlorid gewonnen. E 0,76, E 0,42,

Rf 0,23 (Sl), 0,21 (S2), 0,21 (S3), 0,64 (S4). Das Hydrochlorid wurde in Dimethylformamid (50 ml) aufgelöst, pH der Lösung mit N-Äthylpiperidin auf den Wert 7,5-8,0 geregelt (angefeuchtetes pH Papierchen) und zur Lösung wurde das 2,4,5-Trichlorphenylesters des o-Nitrobenzolsulfenylglut-amin (7,9 g) zugefügt. Nach dem Rühren innerhalb von 24 Stunden wurde der weitere Teil des aktiven Esters (0,8 g) zugegeben. Nach weiteren 24 Stunden wurde das Dimethylformamid abgedampft, der Trockenrest mit Petroläther und Äther zerrieben, abfiltriert und mit Wasser, 0,1M-H2S04, Wasser, 0,25M-NaHC03 und Wasser durchgewaschen. Es wurden 10,5 g (65%) Produkt vom Schmp. 187-192 °C, [a]D —43,0° (c 0,2, Dimethylformamid). RF 0,38 (Sl), 0,24 (S2), 0,49 (S3), 0,69 (S4). Analyse der Aminosäuren: Glu 1,08, Asp 1,07, Cys(Bzl) 0,72, Pro 1,01, Gly 1,06. Für C45H59N110I2S3 • H20 (1060) berechnet: 50,98% C, 5,80% H, 14,53% N; gefunden: 50,79% C, 5,74% H, 14,61% N.

Amid des o-Nitrobenzolsulfenylphenylalanyl- glutaminyl-aspa-raginyl-S- benzylcysteinyl-prolyl- NB-p- toiuoïfenyllysylglycins

Zur Lösung der oben hergestellten Verbindung (10 g) in Dimethylformamid (50 ml) wurde 2,26M-HC1 in Äther (8,9ml) zugegeben. Nach 7 Minuten Stehen wurde das Hydro-

5 658 061

chlorid mit Äther ausgefällt und einigemal mit Äther zerrieben. Es wurden 7,9 g Hydrochlorid gewonnen. E 0,70, E 0,40. Rf 0,09 (Sl), 0,10 (S2), 0,09 (S3), 0,55 (S4). Das

5 Hydrochlorid wurde in Dimethylformamid (40 ml) aufgelöst, pH der Lösung mit N-Äthylpiperidin auf den Wert 7,5-8,0 (angefeuchtetes pH-Papierchen) eingestellt und zur Lösung das 2,4,5-Trichlorphenylester des o-Nitrobenzolsulfenylphe-nylalanins (4,6 g) zugegeben. Nach 24stündigem Rühren 10 wurde der weitere Anteil (1,0 g) des aktiven Esters zugefügt und das Rühren wurde innerhalb von weiteren 24 Stunden fortgesetzt. Das Dimethylformamid wurde abgedampft und der Trockenrest mit Äther und Petroläther zerrieben, abfiltriert und mit Wasser, 0,1M-H2S04, Wasser, 0,25M-15 NaHC03 und Wasser durchgewaschen. Es wurden 8,5 g (74%) Produkt vom Schmp. 206-209 °C, [a]D —24,0° (C 0,2-Dimethylformamid) gewonnen. RF 0,53 (Sl), 0,29 (S2), 0,58 (S3), 0,72 (S4). Analyse der Ameisensäuren: Phe 1,05, Glu 1,05, Asp 1,03, Cys(Bzl) 0,83, Pro 1,03, Gly 1,01. Für 20 C54H68N12Oi3S3 • 0,5 H20 (1198) berechnet: 54,12% C, 5,80% H, 14,02% N; gefunden: 54,02% C, 5,64% H, 14,32% N.

Amid des o-Nitrobenzolsulfenyl- O-tert.butyltyrosyl-phenyl-alanyl- glutaminyl-asparaginyl- S-benzylcysteinyl-prolyl- NB-p-toluolsulfonyllysyl-glycins

Zur Lösung des oben beschriebenen Heptapeptids (2,4 g) in Dimethylformamid (100 ml) wurde 2,05M-HC1 in Äther 3o (5,1 ml) zugegeben. Nach 7 Minuten Stehen wurde das Hydrochlorid mit Äther ausgefällt. E 0,63, E 0,37.

RF 0,18 (Sl), 0,18 (S2), 0,17 (S3), 0,63 (S4). Das Hydrochlorid wurde in Dimethylformamid (50 ml) gelöst, pH der Lösung mit N-Äthylpiperidin auf den Wert 7,5-8,0 eingestellt (angefeuchtetes pH-Papier) und zur Lösung wurde das N-Hydro-xysuccinimidester des o-Nitrobenzolsulfenyl-O- tert-butylty-rosins (1,1g) zugegeben. Nach 24-stündigem Rühren wurde der weitere Anteil des aktiven Esters (0,2 g) zugefügt und das 40 Rühren wurde bis zum nächsten Tag fortgesetzt. Das Dimethylformamid wurde abgedampft, der Trockenrest mit Petroläther und Äther zerrieben, abfiltriert und mit Wasser, 0,1M-H2S04, Wasser, 0,25M-NaHC03 und Wasser durchgewaschen. Es wurden 2,5 g (88%) Produkt vom Schmp. 193-197 °C, [a]D —21,1° (c0,2, Dimethylformamid) gewonnen. Rf 0,58 (Sl), 0,34 (S2), 0,63 (S3), 0,77 (S4). Analyse der Aminosäuren: Tyr 0,95, Phe 1,02, Glu 1,05, Asp 0,97, Cys(Bzl) 0,85, Pro 1,06, Gly 1,01. Für C67H85N130I5S3 • H20 (1427) berechnet: 56,41% C, 6,18% H, 12,76% N; gefunden: 56,24% C, 6,03% H, 12,94% N.

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50

Amid das Benzyloxycarbonyl-S-benzylpenicillaminyl- tyrosyl-phenylalanyl-glutaminyl- asparaginyl-S- benzylcysteinyl-pro-lyl-NF--p- toluolsulfonyllysyl-glycins 55 Aus dem Oktapeptid (1,5 g) wurde Hydrochlorid auf die oben beschriebene Weise (es wurden 1,1 ml 2,05M-HC1 in Äther verwendet) hergestellt. Das Hydrochlorid wurde in Dimethylformamid (10 ml) aufgelöst, pH der Lösung mit N-Äthylpiperidin auf den Wert 7,5-8,0 eingestellt (angefeuchte-6o tes pH-Papierchen) und zur Lösung wurde das p-Nitro-phenylester des Benzyloxycarbonyl-S-benzylpenicillamins (0,5 g) in Dimethylformamid (4 ml) zugefügt. Nach zweitägigem Rühren wurde der weitere Anteil des aktiven Esters (0,05 g) in Dimethylformamid (1 ml) zugegeben und das 65 Rühren wurde weitere zwei Tage fortgesetzt. Das Dimethylformamid wurde abgedampft und der Trockenrest mit Petroläther und Äther zerrieben, abfiltriert und mit Wasser, 1M-HC1, Wasser, 0,25M-NaHC03 und Wasser durchgewaschen.

658 061 6

Das g^0°Annnne ^0duk^(1.'2 wurde in der Trifluoressig- ser, 1M-HC1, Wasser, 0,25M-NaHC03, Wasser durchgewa-

saure (120 ml) gelost und eine Stunde bei der Raumtempera- sehen; es wurden 126 mg (67%) Produkt von Schmp 136-

tostehen gelassen. Zur Lösungwurde Toiuoi (120 m1)^- 140°C gewonnen. [a]D -7,9° (c 0,1 Dimethylformamid).

tugt und das Gemisch im Vakuum abgedampft. Nach Zerrei- RF 0,54 (S 1), 0,24 (S2), 0,60 (S3), 0,72 (S4) Für ben des Trockenrestes mit Äther wurden 11 g (66%) Produkt 5 C71H91N130I5S3 ■ 4H20 (1535) bereichnet: 55,56% C, 6,50% gewonnen, 1,0 g von diesem Produkt wurde weiter m vier Tei- H, 11,86% N; gefunden: 55,38% C, 6,02% H, 11 83%N

len je 0,25 g durch die Gelfïltration gereinigt. Es wurden '

f^odukt SclmiP-136-141 °C, [a]D - 31,2° Na-Acetyl[l-penicillamin, 8-lysin]vasopressin (le)

nCis /q?^67 ^ gewonnen. RF 0,56 (Sl), 0,30 (S2), Das geschützte Nonapeptid (105 mg) wurde in siedendem

Tvr n R7'pd i(n?'r^a, ynT A6' °'88' 10 P,Üssigem Ammoniak (100 ml) aufgelöst und mit Natrium zur n od ni' ? m 2«:' j?' ' CysCBzl) °>88>Pro blauen innerhalb von 10 Sekunden ständigen Färbung des

?s 8nS Vf owUu i7?Ä13216 V i (l5o7o3Lberechnet: Reaktionsgemisches reduziert. Die Lösung wurde mit Am-

7 T Ao/u t ' 'ge en: 58>83 % c> moniumchlorid entfärbt und das Ammoniak ablyophilisiert.

' ' ii'/6/" N- Das Lyophilisat wurde in 0,01M-HC1 (100 ml) aufgelöst, mit ri „ . ... . 0. ., . „ « Wasser auf das Volumen 400 ml verdünnt und mit Äther aus-

Ll-Pemcillamin,8-lysin]vasopressin(Id) geschüttelt. Die Oxidation wurde mit 3,3 • 10_2M-K3

Das geschützte Peptid (144 mg) wurde in flüssigem sieden- [Fe(CN)g] durchgeführt, welches bis zur gelben innerhalb von dem Ammoniak (150 ml) aufgelöst und mit Natrium bis zur einer Stunde ständigen Färbung der Lösung zugegeben blauen innerhalb von 20 Sekunden ständigen Färbung des wurde; pH wurde im Intervall 6,9-7,0 mit Hilfe von 0,1M-Reaktionsgemisches reduziert. Das Reaktionsgemisch wurde 20 NaOH gehalten. Nach der Oxidation wurde das Reaktionsge-mit Ammoniumchlorid entfärbt und das Ammoniak ablyo- misch mit der Essigsäure auf den pH-Wert 3,5 angesäuert und phylisiert. Das Lyophylisat wurde in 0,01M-HC1 (50 ml) ge- auf der Kolonne mit Carboxylatkationenaustauscher (20 ml, löst, die Lösung wurde mit Wasser auf das Volumen von 100-200 mesh) gefüllten chromatographiert. Die Kolonne 400 ml verdünnt und mit Äther ausgeschüttelt. Die Reste wurde mit 0,25 % Essigsäure durchgewaschen und das Prowurden aus der Lösung im Vakuum beseitigt. Die Oxidation 25 dukt wurde mit 50% Essigsäure eluiert. Nach der Lyophilisie-wurde mit 3,3 • 10-2M-K3[Fe(CN)6] durchgeführt, welches rung wurden 59 mg Produkt gewonnen, welches weiter durch bis zur gelben innerhalb von einer Stunde ständigen Färbung die trägerfreie Elektrophorese gereinigt wurde. Es wurden zugegeben wurde: pH des Reaktionsgemisches wurde im In- 14,8 mgProdukt vom [a]D — 51,0° (c 0,14,3M Essigsäure) ge-tervall 6,9-7,0 mit Hüfe von O.lM-NaOH gehalten. Nach der wonnen £ Gly E His Q } } Oxidation wurde das Reaktionsgemisch mit der Essigsaure 30 2,4 5,7

auf den pH-Wert 3,5 angesäuert und die Lösung wurde auf Analyse der Äminosäuren: Pen (03H)+Cys(03H), (1,88), der mit dem Carboxylatkationenaustauscher (30 ml, Tyr 0,94 (0,061), Phe 0,96 (1,02), Glu 1,05 (1,00), Äsp 1,12 100-200 mesh) gefüllten Kolonne chromatographiert. Nach (1,00), Pro 1,21 (1,00), Lys 0,96 (0,98), Gly 1,02 (0,95). (In Durchwaschen der Kolonne mit 0,25% Essigsäure wurde das Klammern sind Werte für die mit Perameisensäure oxidierte Produkt mit 50%iger Essigsäure eluiert und lyophilisiert. Das 35 Probe angegeben). Für C5oH7INI3Oi3S2 • 2CH3COOH • 4,5 • gewonnene Lyophylisat (71 mg) wurde weiter mit der träger- H20 (1328) berechnet: 48,86% C, 6,68% H, 13,72% N; gefreie Elektrophorese gereinigt. Es wurden 13,5 mgProdukt funden: 48,80% C, 5,94% H, 13,76% N.

His vom [a]D —12,1° (c 0,14,3M Essigsäure) gewonnen. E 2 4

0,63,E ®s 0,61. Rf0,32(S4), 0,03 (S6). Analyse der Alni- «

nosäuren: Pen(03H)+Cys(03H) (1,94), Tyr 0,97, (0,58), Phe nylglutaminyl- asparaginyl- S-benzylcysteinyl-prolyl- N£-p-to-

1,01 (0,96), Glu 1,05 (1,03), Asp 1,04 (1,03) Pro 0,99 (0,93), luolsulfonyllysyl- glycins

Gly 1,03 (1,00). In Klammern werden Werte für die mit der Aus dem Heptapeptid (2,4 g) wurde auf die früher ver-

Perameisensäure oxidierte Probe angegeben. Für wendete Weise (es wurden 5,1 ml 2,05M-HC1 im Äther ver-

C48H69N13012S2 • 3,5 CH3COOH • 6,5 H20 (1412) berechnet: wendet) das Hydrochlorid hergestellt. Das Hydrochlorid

46,80% C, 6,85% H, 12,90% N; gefunden: 46,61 % C, 6,06% wurde im Dimethylformamid (50 ml) gelöst, pH der Lösung

H, 12,82% N. wurde mit N-Äthylpiperidin auf den Wert 7,5-8,0 eingestellt

(angefeuchtetes pH-Papierchen) und zur Lösung wurde das

Beispiel 5 50 2,4,5-Trichlorphenylester des tert.Butyloxycarbonyl-O-

Amid des Acetyl-S-benzylpenicillaminyl- tyrosyl-phenylalanyl- methyltyrosins (1,0 g) zugegeben. Nach 24-stündigem Rüh-

glutaminyl-asparaginyl-S-benzylcysteinyl-prolyl- N£-p-toluol- ren wurde der weitere Anteil des aktiven Esters (0,2 g) zugege-

sulfonyllysyl-glycins ben und das Rühren wurde innerhalb von weiteren 24 Stun-

Das oben beschriebene geschützte Nonapeptid (200 mg) den fortgesetzt. Das Dimethylformamid wurde abgedampft wurde in Essigsäure (2 ml) aufgelöst und zur Lösung wurde 55 und der Trockenrest mit Petroläther und Äther zerrieben, ab-

35% HBr in Essigsäure (2 ml) zugefügt. Nach 10 Minuten filtriert und mit Wasser, 10% Zitronensäure, Wasser, 0,25 Stehen bei der Raumtemperatur wurde das Hydrobromid mit M-NaHC03 und Wasser durchgewaschen. Es wurden 2,2 g

Äther ausgefallt. E 0,53, RF 0,55 (Sl), 0,16 (S2), 0,54 g^£™S)Sge—ï°o°,5?(st otÄ!«

(S3), 0,62 (S4). Das Hydrobromid wurde in Dimethylform- 6o (S3), 0,66 (S4). Analyse der Aminosäuren: Tyr+Tyr(Me)

amid (5 ml) aufgelöst. pH der Lösung wurde mit N-Äthylpi- 0,92, Phe 0,98, Glu 1,00, Asp 1,00, Cys (Bzl) 0,82, Pro 1,05, peridin auf den Wert 7,5-8,0 (angefeuchtetes pH-Papierchen) Gly 1,00. Für C63H84N12Oi5S2 • 2,5 H20 (1359) berechnet:

eingestellt und zur Lösung wurde das 5-Chlor-8-hydroxychi- 55,70% C, 6,60% H, 12,37% N; gefunden 55,54% C, 6,22%

nolylester der Essigsäure (56 mg) zugegeben. Nach zweitägi- H, 12,43%) N.

gern Rühren wurde der weitere Änteil des aktiven Esters zuge- 65

fügt und das Rühren wurde weitere zwei Tage fortgesetzt. Amid des Benzyloxycarbonyl-S- benzylpenicillaminyl- O-me-

Das Dimethylformamid wurde abgedampft, der Trockenrest thyltyrosyl-phenylalanyl- glutaminyl-asparaginyl- S-benzyl-

mit Äther und Petroläther zerrieben, abfiltriert und mit Was- eysteinyl-prolyl-W- p-toluolsulfonyllysyl-glycins.

Aus dem beschriebenen Oktapeptid (1,35 g), welches in der Essigsäure (10 ml) aufgelöst wurde, wurde das Hydrobromid auf übliche Weise hergestellt (es wurden 5 ml 35% HBr in Essigsäure verwendet). Das Hydrobromid wurde in Dimethylformamid (10 ml) gelöst, pH der Lösung mit N-Äthylpiperidin auf den Wert 7,5-8,0 eingestellt (angefeuchtetes pH-Papier) und zu der Lösung wurde p-Nitrophenylester des Benzyloxycarbonyl-S- benzylpenicillamins (0,51 g) in Dimethylformamid (2 ml) zugegeben. Nach zweitägigem Rühren wurde der weitere Anteil des aktiven Esters (0,25 g) in Dimethylformamid (2 ml) zugefügt und das Rühren wurde weitere zwei Tage fortgesetzt. Das Dimethylformamid wurde abgedampft, der Trockenrest mit Petroläther und Äther zerrieben, abfiltriert und mit Wasser, 1M-HC1, Wasser, 0,25M-NaHC03 und Wasser durchgewaschen. Es wurden 1,2 g Produkt 74%) gewonnen, 0,75 g von dieser Substanz wurden weiter in drei Teilen je 0,25 g durch die Gelfiltration gereinigt. Es wurden 361 mg (49%) Produkt vom Schmp. 202-205 °C, [a]D — 34,6° (c 0,1, Dimethylformamid) gewonnen. RF 0,60 (Sl), 0,31 (S2), 0,68 (S3), 0,76 (S4). Analyse der Aminosäure: Pen(Bzl) 1,04, Tyr+Tyr(Me) 0,94, Phe 1,03, Glu 1,00, Asp 0,99,Cys(Bzl) 0,92, Pro 1,00, Gyl 1,00. Für C78H97N13016S3 • 1,5H20 (1596) berechnet: 58,70% C, 6,31% H, 11,41% N; gefunden: 58,65% C, 6,25% H, 11,57% N.

[1-Penicillamin, 2-O-methyltyrosin, 8-lysin]-vasopressin (If)

Das oben beschriebene Nonapeptid (145 mg) wurde in siedendem flüssigem Ammoniak (150 ml) aufgelöst und mit Natrium bis zur blauen innerhalb von 10 Sekunden ständigen Färbung reduziert. Die Lösung wurde mit Ammoniumchlorid entfärbt und das Ammoniak wurde ablyophylisiert. Das Lyophilisat wurde in 0,01M-HC1 (100 ml) aufgelöst, mit Wasser auf das Gesamtvolumen 450 ml verdünnt und die Lösung mit Äther ausgeschüttelt. Die Reste des Äthers wurden durch Verdampfen im Vakuum beseitigt. Die Oxidation wurde mit 3,3 • 10~2M-K3/Fe(CN)6/durchgeführt, welches bis zur gelben innerhalb von einer Stunde ständigen Färbung zugegeben wurde. pH des Reaktionsgemisches wurde während der Oxidation mit 0,lM-NaOH auf dem Wert 6,9-7,0 gehalten. Nach der Oxidation wurde die Lösung mit der Essigsäure auf pH 4,0 angesäuert und auf der mit Carboxylatkationenaustauscher gefüllten Kolonne (20 ml, 100-200 mesh) chromatographiert. Die Kolonne wurde mit 0,25% Essigsäure durchgewaschen. Das Produkt wurde mit 50% Essigsäure eluiert und lyophylisiert. Es wurden 86 mg Lyophylisat gewonnen, welche weiter durch trägerfreie Elektrophorese gereinigt wurde. Es wurden 10,3 mgProdukt vom [a]D 0°

(c 0,15 3M Essigsäure) gewonnen. E 0,64, E 0,60.

Rf 0,34 (S4), 0,05 (S6). Analyse der Aminosäuren:-Pen (03H)+Cys (03H) (194), Tyr-(-Tyr (Me) 0,94 (0,82), Phe 1,06 (1,04), Glu 0,96 (1,00), Asp 1,06 (1,00), Pro 1,00 (0,99), Lys 0,97 (1,04), Gly 1,00 (0,99). (In den Klammern sind Werte für die mit der Perameisensäure oxidierte Probe angegeben). Für C49H7IN13012S2 • 3CH3COOH • 5H20 (1369) berechnet: 48,27% C, 6,85% H, 13,30% N; gefunden: 48,30% C, 6,27% H, 13,42% N.

Beispiel 7

Amid des Acetyl-S-benzylpenicillaminyl- O-methyltyrosyl-phe-nylalanyl- glutaminyl-asparaginyl- S-benzylcysteinyl-prolyl-NE-p- toluolsulfenyllysyl-glycins

Das oben beschriebene Nonapeptid (200 mg wurde in der Essigsäure (2 ml) aufgelöst und zur Lösung wurde 35% HBr in Essigsäure (2 ml) zugegeben. Nach 10 Minuten Stehen bei der Raumtemperatur wurde das Hydrobromid mit Äther ausgefällt. E 0,49. RF 0,07 (S2), 0,63 (S4). Das Hydrobro-

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mid wurde in Dimethylformamid (2 ml) aufgelöst, pH der Lösung wurde mit N-Äthylpiperidin auf den Wert 7,5-8,0 (angefeuchtetes pH-Papier) eingestellt und zur Lösung wurde das 5-Chlor-8- hydroxychinolinylester der Essigsäure (43 mg) zugegeben. Nach zweitägigem Rühren wurde der weitere Teil des aktiven Esters (15 mg) zugefügt und das Rühren wurde weitere zwei Tage fortgesetzt. Das Dimethylformamid wurde abgedampft, der Trockenrest wurde mit Petroläther und Äther zerrieben, abfiltriert und mit Wasser, 1M-HC1, Wasser, 0,25M-NaHC03 und Wasser durchgewaschen. Es wurden 142 mg (74%) Produkt gewonnen,welches weiter mit der Gelfiltration gereinigt wurde. Es wurden 109 mg Produkt vom Schmp. 190-195 °C [a]D —31,2° (c0,l, Dimethylformamid) gewonnen. RF 0,56 (Sl), 0,26 (S2), 0,59 (S3), 0,74 (S4). Für C72H93H13015S3 • 2,5H20 (1522) berechnet: 56,83% C, 6,49% H, 11,96% N; gefunden 56,50% C, 6,30% H, 11,99% N.

NVAcetyl [l-penicillamin-2-0 -methyltyrosin-8-lysin] Vasopressin (Ig)

Das oben beschriebene geschützte Nonapeptid (92 mg) wurde in siedendem flüssigem Ammoniak (150 m) aufgelöst und mit Natrium bis zur blauen innerhalb von 10 Sekunden ständigen Färbung des Reaktionsgemisches reduziert. Die Lösung wurde mit Ammoniumchlorid entfärbt und das Ammoniak wurde ablyophilisiert. Das Lyophilisat wurde in 0,01-M-HC1 (100 ml) gelöst, mit Wasser auf das Volumen 450 ml verdünnt und mit Äther ausgeschüttelt. Die Reste von Äther wurden aus der Lösung durch Abdampfen im Vakuum entfernt. Die Oxidation wurde mit 3,3 • 10~2M-K3[Fe(CN)6] durchgeführt, welches bis zur gelben innerhalb von einer Stunde ständigen Färbung des Reaktionsgemisches zugegeben wurde. Während der Oxidation wurde pH des Reaktionsgemisches mit 0,lM-NaOH im Intervall 6,9-7,0 gehalten. Nach der Oxidation wurde die Lösung mit Essigsäure auf den pH-Wert 4,0 angesäuert und auf der mit dem Carboxylatkationenaustauscher gefüllten Kolonne (25 ml, 100-200 mesh) chromatographiert. Die Kolonne wurde mit 0,25% Essigsäure durchgewaschen, das Produkt wurde mit der 50%-igen Essigsäure eluiert und die Lösung wurde lyophilisiert. Es wurden 60 mg Lyophilisat gewonnen. Nach seiner Reinigung durch trägerfreie Elektrophorese wurden 2,4 mg Produkt vom [a]D —32,8° (c0,13,3M Essigsäure) gewonnen,

E 0,51, E 0,35. RF 0,43 (S4), 0,39 (S6). Analyse der Aminosäuren: Pen(03H) + Cys(03H) (1,96), Tyr+ Tyr(Me) 0,96 (0,69), Phe 1,04, (0,99), Glu 1,01 (1,00), Asp 1,03 (1,00), Pro 1,03 (0,97), Lys 0,95 (0,98), Gly 1,03 (1,01). Für C51H73Ni3013S2 • 6CH3COOH • 7H20 (1628) berechnet: 46,51% C, 6,88% H, 11,91% N; gefunden: 46,40% C, 6,43% H, 11,08% N.

Beispiel 8

[6-Penicillamin, 8-lysin]Vasopressin (Ih)

Das geschützte Nonapeptid, Amid des Benzyloxycar-bonyl S-benzylcysteinyl-tyrosyl- phenylalanyl-glutaminyl- as-paraginyl-S- benzylpenicillaminyl-prolyl- M-p-toluolsulfo-nyllysylglycins, (90 mg), welches durch stufenweisen Aufbau der peptidischen Kette in Lösung hergestellt wurde, wurde in flüssigem Ammoniak (100 ml) bis zur blauen innerhalb von 20 Sekunden ständigen Färbung reduziert. Die Lösung wurde mit Ammoniumchlorid entfärbt und das Ammoniak wurde ablyophilisiert. Der Trockenrest wurde in 0,01M-HC1 (100 ml) aufgelöst, die Lösung wurde mit Wasser (50 ml) verdünnt und mit Äther ausgeschüttelt. Nach Verdünnen auf das Volumen 300 ml wurde pH der Lösung auf den Wert 7,0 eingestellt und die Oxidation wurde durch Zugabe von 3,3 •

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55

60

65

658 061

10~2M-K3[Fe(CN)6] bis zur gelben innerhalb von einer Stunde ständigen Färbung durchgeführt. Der pH-Wert wurde während der Oxidation im Intervall 6,9-7,0 gehalten. Nach Oxidationsende wurde das Reaktionsgemisch mit der Essigsäure auf pH 4,5 angesäuert und auf die mit dem Carboxylatkationenaustauscher gefüllte Kolonne aufgetragen. Die Kolonne wurde mit 0,25% Essigsäure durchgewaschen und das Produkt wurde mit der 50%-igen Essigsäure ausgewaschen. Nach der Lyophylisierung wurde das Produkt mit der kontinuierlichen trägerfreien Elektrophorese gereinigt. Es wurden 10,2 mg Lyophilisat vom [a]D 4-13,6° (c 0,13 3M Essigsäure) gewonnen. E 0,66, E 0,61; RF 0,33 (S4),

0,03 (S6). Analyse der Aminosäuren: Cys(03H)+Pen(03H) (1,94), Tyr 0,92 (0,56), Phe 1,00 (0,96), Glu 0,92 (0,91), Asp 1,00 (1,01), Pro 1,00 (1,03), Lys 1,07 (0,98), Gly 0,96 (1,07). In Klammern sind Werte für die mit der Perameisensäure oxidierte Probe angeführt. Für C48H69NI3012S2 • 5CH3COOH • 8H20 (1529) berechnet: 41,81% C, 6,35% H, 10,39% N; gefunden (auf 9% Asche korrigiert): 41,50% C, 46,44% H, 10,92% N.

Beispiel 9

[Disulfid 1-penicillamin, 6-penicillamin, 8-lysin]Vasopressin Das' geschützte Nonapeptid, Amid des Benzyloxycarbo-nyl- S-benzylpenicillaminyl-tyrosyl-phenylalanyl- glutami-j nyl-asparaginyl- S-benzylpenicillaminyl-prolyl- NE-p-toluol-sulfonyllysyl- glycins (120 mg), welches durch stufenweisen Aufbau der peptidischen Kette in Lösung hergestellt wurde, wurde in flüssigem Ammoniak reduziert, mit K3[Fe(CN)]6 oxidiert und auf dieselbe Weise wie im Beispiel 1 gereinigt. Es 10 wurden 10,5 mg Produkt vom [a]D —11,0° (c0,13,3M Essigsäure), E 0,61, E 0,60, RF 0,36 (S4), 0,04 (S6)ge-

15 wonnen. Analyse der Aminosäuren (in Klammern sind Werte für die mit der Perameisensäure oxidierte Probe angegeben): Pen (03H) (1,80), Tyr 0,86 (0,82), Phe 1,00 (1,06), Glu 0,92 (0,98), Asp 1,00 (0,91), Pro 1,00 (1,13), Lys 1,00 (0,98), Gly 1,00 (0,99). Für C5oH73N130I2S2 • 3,5 CH3COOH • 5H20 20 (1443) berechnet: 48,57% C, 6,92% H, 12,89% N; gefunden: 48,54% C, 6,80% H, 12,86% N.

Tabelle I

Übersicht der strukturellen Modifikationen und einigen biologischen Werten von Analoga Ia-Ii

Analog

B

X

Inhibierungsaktivität pA2 bei der Wirkungsbestimmung unterotonische pressorische galaktogogische in vitro in situ

Ia ch3co

Pen h

Uè

Cys

Leu

4,4

a unwirksam

0,04b

Ib h

Pen ch3

Ile

Cys

Leu

8,0

6,9

7,2

6,8

Ic

CH3CO

Pen ch3

Ile

Cys

Leu

5,4

a

6,4

0,45b

Id h

Pen h

Phe

Cys

Lys

6,6

6,3

6,9

a

Ie ch3co

Pen h

Phe

Cys

Lys

5,5

6,3

unwirksam unwirksam

If h

Pen ch3

Phe

Cys

Lys

8,1

6,9

7,4

6,8

Ig

CH3CO

Pen ch3

Phe

Cys

Lys a

a

6,7

unwirksam

Ih h

Cys h

Phe

Pen

Lys

6,0

6,16

6,73

a

Ii h

Pen h

Phe

Pen

Lys

6,8

6,8

7,18

a a) nicht bestimmt b) eigene Aktivität in I.U/mg

C