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Die Erfindung betrifft chromophore Peptide der allgemeinen Formel I DIS-D-Ala-Pro-R (T) worin R für Gly-OH oder NH2 steht und DIS 5-Dimethylamino-naphthalin-l-sulfonyl bedeutet, sowie deren Salze.
Als Salze kommen insbesondere Alkali-und Erdalkalisalze, Salze mit Aminen und Salze mit anorganischen oder organischen Säuren, wie beispielsweise Salzsäure, Bromwasserstoffsäure, Schwefelsäure, Maleinsäure oder Fumarsäure, in Betracht
Die peptidylglycin-Alpha-amidierende Monooxygenase (PAM) ist ein wichtiges Enzym, das aus Peptiden mit C-terminalem Glycin (Peptidylglycin) die entsprechenden Peptidamide bildet. Bei vielen Peptidhormonen, wie z.
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F.Glembotski, J. Biol. Chem. 259 (1984) 13041-13048) verantwortlich ist.
Diese Monooxygenase ist abhängig von Ascorbinsäure, Kupferionen und Sauerstoff und wird dort gebildet, wo auch Peptidamide ausgeschieden werden. Bisher wurde die peptidylglycin-Alpha-amidierende Monooxygenase vor allem in der Hypophyse und im zentralen Nervensystem gefunden. Aber auch im Plasma lässt sich dieses Enzym nachweisen. Bei peptidamid-bildenden Tumoren ist die Aktivität des Enzyms im Plasma stark erhöht und kann somit als Marker für bestimmte endocrine Tumore dienen.
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Um nicht radioaktiv arbeiten zu müssen, wurde nach einem neuen Weg zur Bestimmung der peptidylglycin- Alpha-amidierenden Aktivität gesucht.
Diese Aufgabe wurde gelöst durch ein fluoreszierendes Substrat, das mittels chromatographischer Methoden (DC, HPLC) abgetrennt und identifiziert werden kann. Das erfindungsgemässe DIS-D-Ala-Pro-Gly-OH hat neben dem Vorteil seiner fluoreszierenden 5- Dimethylamino-naphthalin-l-sulfonyl (DIS-) Gruppe auch noch den Vorzug, dass durch den Einbau des Prolins ein C-terminaler Abbau durch Carboxypeptidasen erschwert isL Das DIS-D-AlaPro-NH2 dient als Vergleich.
Die Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren zur Herstellung eines Peptids der Formel I, das dadurch gekennzeichnet ist, dass man eine Verbindung der Formel II
DIS-Hal (II) in welcher DIS 5-Dimethylamino-naphthalin-l-sulfonyl und Hal, Halogen, vorzugsweise Chlor, bedeuten, mit einer Verbindung der Formel m
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den Zwischenprodukten der Formel IV DIS-D-Ala-Pro-Gly-R (IV)
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aus dem entsprechenden tert.-Butylester durch eine saure Behandlung gewonnen. Die Peptide der oben genannten Formel III können nach den allgemeinen Methoden der Peptidchemie, beispielsweise durch Kupplung entsprechender gegebenenfalls geschützter Fragmente in Gegenwart von Dicyclohexylcarbodiimid und gegebenenfalls I-Hydmxy-1H-benzotriazol in einem geeigneten Lösungsmittel (vgl.
Chem. Ber. 103 [1970] 788, 2024) hergestellt werden.
Die Erfindung betrifft des weiteren ein Verfahren zum qualitativen oder quantitativen Nachweis der peptidylglycin-Alpha-amidierenden Monooxygenase, das dadurch gekennzeichnet ist, dass man eine Lösung der Formel I, worin R Gly-OH bedeutet, mit der die peptidylglycin-Alpha-amidierenden Monooxygenase enthaltenden Analysenprobe inkubiert, die entstandene Verbindung der Formel I, worin R NH2 bedeutet, abtrennt und deren Menge quantitativ bestimmt, die Verwendung einer Verbindung der Formel I zum qualitativen oder quantitativen Nachweis der peptidylglycin-Alpha-amidierenden Monooxygenasen, und Mittel enthaltend eine Verbindung der Formel I.
Das Enzym (PAM) wurde nach einer Methode von Eipper et al. (Peptides 4. (1983) 921-928) aus Rinderhypophysen isoliert. Dabei wurden frische Hypophysen in Trispuffer homogenisiert, das Homogenat über eine Percoll-Gradientenzentrifugation aufgetrennt und die Vesikelfraktion isoliert. In dieser Fraktion konnte die höchste Aktivität nachgewiesen werden. Durch Ammonsulfat-Fällung und konsekutive Gelfiltration (Glembotski, Arch. Biochem. Biophys. 241 (1985) 673-683) konnte die Aktivität weiter angereichert werden.
Die Versuche mit dem erfindungsgemässen Substrat der Formel I (R = Gly-OH) und der Vergleichssubstanz der Formel I (R = NH2) wurden sowohl mit den Rohfraktionen als auch mit den angereicherten Fraktionen durchgeführt.
Die nachstehenden Beispiele dienen zur Erläuterung der Erfindung, ohne dass diese darauf beschränkt wäre.
Beispiel l DIS-D-Ala-Pro-Gly-OH
A) Ausgangsprodukt a) Z-D-Ala-Pro-Gly-OBut
Zu einer Lösung von 11, 4 g Z-D-Ala-OH, 13, 5 g H-Pro-Gly-OBut-HCl und 6, 9 g HOBt in 100 ml Dimethylformamid gibt man bei 0 C 6,54 ml N-Äthylmorpholin und 10, 7 g DCC. Man rührt 1 Stunde bei 0 C, 4 Stunden bei Raumtemperatur und lässt über Nacht bei Raumtemperatur stehen. Der Niederschlag wird abgesaugt und das Filtrat eingeengt. Der Rückstand wird zwischen Essigester und Wasser verteilt. Die Essigesterphase wird nacheinander mit gesättigter wässriger NaHCOg-Lösung, KHSO4/K2SO4-Puffer und Wasser ausgeschüttelt, über NaSO getrocknet und eingeengt.
Die Substanz wird auf 300 g Kieselgel chromatographiert
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: 1 ;Substanz : 10, 3 g. b) H-D-Ala-Pro-Gly-OBut-HCI
10 g Z-D-Ala-Pro-Gly-OBut werden in 100 ml Methanol gelöst und mit Pd-Katalysator unter pH-Kontrolle (Autotitrator mit methanolischer HCI bei pH 4, 5) hydriert. Nachdem alles hydriert ist (DC-Kontrolle in CH2Cl2/CH3OH im Verhältnis 9:1) wird der Katalysator abgesaugt und das Filtrat eingeengt. Es bleiben 6, 2 g einer farblosen amorphen Substanz zurück.
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B) Erfindungsgemässes Verfahren :
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68Ausbeute : 3, 5 g amorphe Substanz. b) DIS-D-Ala-Pro-Gly-OH
Eine Lösung von 3, 5 g DIS-D-Ala-Pro-Gly-OBut in 10 ml 90 %iger Trifluoressigsäure lässt man 1 Stunde bei Raumtemperatur stehen. Danach engt man die Lösung im Vakuum ein. Es bleiben 3, 2 g einer amorphen Substanz zurück. Zur Reinigung werden 300 mg über eine Kieselgelsäule (40 x 4 cm) chromatographiert.
Elutionsmittel: CH2Cl2/CH3OH/CH3COOH/H2O im Verhältnis 9 : 1 : 0, 1 : 0, 1. Die Fraktionen mit der reinen Substanz werden eingeengt. Der Rückstand wird in Wasser gelöst und gefriergetrocknet. Ausbeute : 191 mg ; [Alpha]24D = -51, 80 (C = 1, in 5 %iger wässriger Essigsäure).
H-NMR (270 MHz) in 2H-DMSO : Charakteristische Signale bei Delta = 1,0 [d, 3H, -CH3 (Ala)]; 2,83 [2s, 6H, -N(CH3)2 (DIS)]; 3,7 [d, 2H, -CH2- (Gly)]; 7,25-8,5 [d, m, 8H (2 = NH und 6 arom. H von DIS)].
Beispiel 2 DIS-D-Ala-Pro-NH2
A) Ausgangsprodukt a) Z-D-Ala-Pro-NH2
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mmol) HOBt in 100 ml Dimethylformamid gibt man bei 0 C 6, 4 ml (50 mmol) N-Ethylmorpholin und 11, 4 g (55 mmol) Dicyclohexylcarbodümid (DCC). Man lässt 1 Stunde bei 0 C und 5 Stunden bei Raumtemperatur rühren und lässt über Nacht bei Raumtemperatur stehen. Der Niederschlag wird abgesaugt und das Filtrat eingeengt. Der Rückstand wird zwischen Essigester und Wasser verteilt. Die Essigesterphase wird nacheinander mit gesättigter wässriger NaHCOg-Lösung und KHS04/K2S04-Puffer und Wasser gewaschen, über NaSO getrocknet und eingeengt.
Der Rückstand wird mit Petrolether mehrmals digeriert und anschliessend über 180 g Kieselgel chromatographiert (CH2Cl2/CH3OH im Verhältnis 9, 5 : 0, 5). Ausbeute an reinem Peptid : 6, 74 g farblose amorphe Substanz. b) H-D-Ala-Pro-NH2. HCI
6, 4 g (20 mmol) Z-D-Ala-Pro-NH2 werden in Methanol gelöst und wie bei Ib katalytisch hydriert. Der Rückstand wird mit Ether verrieben. Ausbeute : 4, 11 g einer farblosen Substanz.
B) Erfindungsgemässes Verfahren : DIS-D-Ala-Pro-NH2
Zu einer Suspension von 0, 442 g (2 mmol) H-D-Ala-Pro-NH2 und 0, 6 g (2, 2 mmol) DIS-Chlorid in 15 ml abs. Tetrahydrofuran gibt man bei 0 C 0, 56 ml (4 mmol) Triethylamin. Man lässt 1 Stunde bei 0 C und 5 Stunden bei Raumtemperatur rühren und lässt über Nacht bei Raumtemperatur stehen. Aufarbeitung wie bei Beispiel 1 Reinigung an Kieselgel (40 x 4 cm; Elutionsmittel CH2Cl2/CH3OH im Verhältnis 9, 5 : 0, 5).
Ausbeuten an reiner Substanz : 0, 23 g [Alpha] = = -18,4 (C=1, in 5 %iger wässriger Essigsäure).
1H-NMR (270 MHz) in 2H-DMSO : Charakteristische Signale bei Delta = 0, 97 [d, 3H, -CH3 (Ala) ] ; 2, 83 [2s, 6H, -N (CH3) 2 (DIS) ] ; 6, 9-8, 5 [d, m, 9H, 3 = NH und 6 arom. H von DIS].
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Beispiels Durchführung des Enzym-Assays mit dem Substrat der Formel 1 (R = Gly-Om und der Referenz-Substanz der
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Die Enzymtests werden in einem Puffer von pH 7, 4 durchgeführt. Der wässrige Puffer besteht aus der Puffersubstanz N-[Tris-(hydroxymethyl)-methyl]-2-amino-ethansulfonsäure (100 mM), CuS04 (3 M), Peptidsubstrat der Formel I (R = Gly-OH) (50 pM) und Katalase aus Rinderleber (100 Jg/ml). 100 pl dieser Pufferlösung werden mit 100 il der PAM-haltigen Lösung inkubiert und nach 3 Stunden bei 37 C durch Zugabe von 700 pl CH2C12 gestoppt. Durch kurzes Ausschütteln wird das Peptidamid selektiv in die organische Phase überführt (Extraktionsausbeute : ca. 60 %).
Nach Zentrifugation und Abnahme der organischen Phase wird diese in einer Vakuumzentrifuge eingedampft und in einem konstanten Volumen CH2Cl2 wieder aufgenommen. Zur Vermeidung von Photo-Reaktionen des lichtempfindlichen Substrats werden alle Operationen unter Lichtausschluss durchgeführt. Die erhaltenen Lösungen werden mit einem Autospotter aufHPTLC-Platten (Merck Si 60) aufgetragen und mit Hilfe eines Laufmittelgemisches (CH2Cl2/CH3OH/H2O/CH3COOH im Verhältnis 90 : 10 : 1 : 1) getrennt. Die Quantifizierung des entstandenen Amids der Formel I (R = NH2) mit einem
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unterschiedlicher Konzentration als Referenz.
Zeitabhängigkeit des Umsatzes von DIS-D-Ala-Pro-Gly-OH mit PAM-Aktivität : t (min.) : 60 120 180
Peptidamidbildung (ng) : 21, 5 43, S 67, 5
Nach 3 Stunden sind ca. 5 % des Substrates der Formel I (R = Gly-OH) umgesetzt bei einem Umsatz von 0, 29 ng/Stunde pro 1 g zugesetztes Protein mit PAM-Aktivität.
PATENTANSPRÜCHE 1. Peptid der Formel I
DIS-D-Ala-Pro-R (l) in welcher R Gly-OH oder NH2 und DIS 5-Dimethy1amino-naphthalin-l-sulfonyl bedeuten, sowie deren Salze.