CH653346A5 - Analoga der neurohypophysaeren hormone oxytocin und vasopressin mit inhibierungseigenschaften gegenueber der aktivitaet dieser natuerlichen hormone. - Google Patents

Description

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PATENTANSPRUCH

Analoga der neurohypophysären Hormone Oxytocin und der uterotonischen und pressorischen Aktivität dieser Natur-Vasopressin, welche Inhibierungseigenschaften gegenüber hormone aufweisen, gemäss der allgemeinen Formel I

R"

2 1

R-C

R

-CH.

R3-CH-C0-NH-CH-C0-X"''-Gln-As n-NH-CH-CO-P ro-X^-X3

worin die mit * bezeichnete chirale aromatische Aminosäure der D-Reihe und die übrigen chiralen Aminosäuren der L-Reihe angehören und worin R1 und R2 Wasserstoff oder Methyl, R3 Wasserstoff, Amino oder Triglycylamino, R4 Wasserstoff, Amino oder Triglycylamino, R4 Wasserstoff, Methyl, Äthyl oder Äthoxyl, Rs eine Gruppe S-CH2 oder S-S, X1 einen Isoleucin- oder Phenylalanin-Rest, X2 einen Leucin- oder Lysin-Rest und X3 einen Glycinamid-Rest oder Hydroxyl bedeuten.

Den Gegenstand der Erfindung bilden Analoga der neurohypophysären Hormone Oxytocin und Vasopressin, welche Inhibierungswirkungen gegenüber der uterotonischen und pressorischen Aktivität dieser natürlichen Hormone aufweisen.

Es ist bekannt, dass neurohypophysäre Hormone eine Reihe von biologischen Aktivitäten aufweisen (Handbook of Expérimental Pharmacology. Vol. XXIII: Neurohypophysial Hormones and Similar Polypeptides [B. Berde, Ed.],

Springer-Verlag, 1968 Berlin), für welche sie in der Medizin verwendet werden. In gewissen Fällen können jene Stoffe von Nutzen sein, welche manche von diesen Aktivitäten 25 hemmen (inhibieren). Es wurde gefunden, dass solche Verbindungen durch Einführung eines aromatischen hydrophoben D-Aminosäure-Rests in das Molekül der genannten neurohypophysären Hormone anstelle des Tyrosin-Rests gewonnen werden können. Im Vergleich mit den früher 30 publizierten Analoga (Rudinger J., Krejci I. im Buch: Handbook of Expérimental Pharmacology. Vol. XXIII. Neurohypophysial Hormones and Similar Polypeptides [B. Berde, Ed.], S. 748-801. Springer Verlag, Berlin 1968; Sawyer W.H. Grzonka Z., Manning M.: Mol. Cell. Endocrinol. 22,117-134 35 [1981]) sind die Substanzen nach dieser Erfindung wirksamere Inhibitoren, welche auch die Möglichkeit der qualitativen Änderungen von biologischen Aktivitäten (z.B. protrahierte Inhibierungswirkung] bieten.

Erfindungsgemässe Analoga der neurohypophysären Hor-4» mone Oxytocin und Vasopressin, welche Inhibierungseigenschaften gegenüber der uterotonischen und pressorischen Aktivität dieser Naturhormone aufweisen, entsprechen der allgemeinen Formel I

R-

2 1

R -C

R

~CH,

R3-CH-C0-NH-CH-C0-X1-Gln-Asn-NH-CH-C0-Pro-X2-X3

worin die mit * bezeichnete chirale aromatische Aminosäure der D-Reihe und die übrigen chiralen Aminosäuren der L-Reihe angehören, und worin R1 und R2 Wasserstoff oder Methyl, R3 Wasserstoff, Amino oder Triglycylamino, R4 Wasserstoff, Methyl, Äthyl oder Äthoxyl, R5 eine Gruppe 65 S-CH2 oder S-S, X1 einen Isoleucin- oder Phenylalanin-Rest, X2 einen Leucin- oder Lysin-Rest und X3 einen Glycinamid-Rest oder Hydroxyl bedeuten.

Gemeinsames Strukturmerkmal aller erfindungsgemässen Analoga ist der chirale, aromatische, hydrophobe D-Aminosäure-Rest anstelle des Thyrosin-Rests als in Stellung 2 substituierter Aminosäure-Rest. Im wesentlichen ist dieses Strukturmerkmal für die Inhibierungseigenschaften verantwortlich, wobei weitere im Molekül eingeführte strukturelle Modifikationen die Inhibierungseigenschaften verstärken oder qualitativ ändern können.

3 653346

In der nachstehenden Tabelle I werden einige Beispiele nischen Chemie realisierbar ist. In den Ausführungsbei-von erfindungsgemässen Analoga angegeben, deren Herstel- spielen sind einige mögliche Herstellungsverfahren ange-lung mit Hilfe der allgemein bekannten Verfahren der orga- geben.

Tabelle I

Verbindung R1 R2 R3 R4 R5 X1 X2 X3

la

H

H

H

H

S-CH2

Ile

Leu

GlyNH2

Ib

H

H

H

OC2H5

S-CH2

Ile

Leu

GlyNH2

Ic

H

H

H

CH3

s-crn

Ile

Leu

GlyNH2

Id

H

H

H

C2H5

S-CH2

Ile

Leu

GlyNH2

Ie

H

H

H

C2H5

S-S

Ile

Leu

GlyNHz

If

H

H

NH2

C2H5

S-S

Ee

Leu

GlyNH2

Ig

CHs cm

NH2

C2H5

S-S

Ile

Leu

GlyNH2

Ih

H

H

NH2

C2H5

S-S

Phe

Lys

GlyNH2

Ii

H

H

Gly-Gly-Gly-NH

C2H5

S-S

Ile

Leu

GlyNH2

Ij

H

H

H

cm s-cm

Ile

Leu

OH

Alle angeführten Analoga weisen starke Inhibierungswir-kungen auf. Tabelle II gibt numerische Werte dieser Aktivitäten an, wobei pA2 den negativen dezimalen Logarithmus der Inhibierungskonstante nach der Beziehung pAì = -log

B

A50B

Aso bedeutet, worin B die Konzentration des Inhibitors (in Mol/1), Aso die zur 50%iger maximaler Wirkung führende Agonistenkonzentration (von Oxytocin) und Asob die zur 50%igen maximalen Wirkung führende Agonistenkonzentration in Gegenwart des Inhibitors mit Konzentration B (Eggens P., Schwartz I.L., Walter R.: J. Gen. Physiol. 52,465 [1968]) darstellt.

Tabellen pA2-Werte im Test auf isolierter Rattengebärmutter

Verbindung der Formel pA2

Ia

8,26

Ib

7,54

Ic

8,73

Id

8,73

Ie

8,06

If

8,15

Ig

8,09

Ih

7,05a)

Ii

6,14b)

Ij

8,8

a) Der negative dezimale Logarithmus der Analogkonzentration, welche zur Verminderung der biologischen Wirkung des Vasopressins (d.h. des Blutdrucks bei der despinalisierten Ratte) auf 50% der ursprünglichen Antwort führt (Schild H.O.: Brit. J. Pharmacol. Chemother. 2,189 [1947]); im Test in vivo setzt man das Blutvolumen bei der Ratte 6,7 ml (100 g Rattengewicht) (Nestor J.J., Ferger M.F., du Vigneaud V.: J. Med. Chem 18,284 [1975]) voraus.

b) Das Analog hat prolongierte Inhibierungswirkung gegenüber der uterotonischen Aktivität des Oxytocins beim Test auf der Rattengebärmutter in vivo im Vergleich mit der aequipotenten Dosis der vorausgesetzten generierten Verbindung ([2-D-p-Äthylphenylalanin]oxytocin).

25 Die Inhibierungswirkungen bleiben auch in dem Fall erhalten, wo aus dem Molekül der Glycinamidrest beseitigt ist (Verbindung Ij); von diesem Typ der Modifikation ist bekannt, dass er die endokrinen Aktivitäten eliminiert, was im Falle der Ausnützung von Inhibitoren sehr geeignet ist. 30 Durch Acylierung der primären a-Aminogruppe mit einer kurzen peptidischen Kette wurde ein Inhibitor mit verlängerter Wirkung gewonnen. Diese verlängerte Wirkung ist durch sukzessive enzymatische Abspaltung des zugegebenen Molekülteils und durch sukzessive Produktion des eigenen 35 Inhibitors verursacht, d.h. durch Ausnützung des Prinzips der Hormonogenwirkung (Beränkovä-Ksandrovä Z., Bisset G.W., Jost K., Krejci I., Pliska V., Rudinger J., Rychlik I., Sorm F.: Brit. J. Pharmacol. 26 615-632 [1966]) für das Gebiet der Inhibitoren.

40 Das Herstellungsverfahren der Analoga der genannten neurohypophysären Hormone ist weiter in den Ausführungsbeispielen beschrieben.

Beispiel 1

45 [2-D-Phenylalanin]deamino-6-carba-oxytocin o-Nitrobenzolsulfenyl-D-phenylalanyl-isoleucyl-gluta-minyl-asparaginyl-S-(ß-carboxyäthyl)homocysteinyl-prolyl-leucyl-glycinamid (150 mg) wurde in Dimethylformamid (4 ml) aufgelöst und nach Zugabe von Chlorwasserstofflö-50 sung in Äther (3,2 N; 0,4 ml) wurde das entstandene Gemisch innerhalb von 6 Minuten bei der Raumtemperatur stehen gelassen. Durch Zugabe von Äther wurde das Hydrochlorid des Oktapeptids ausgefällt, welches noch einmal aus Dimethylformamid und Äther umgefällt und im Vakuum ausge-55 trocknet wurde. Danach wurde es in Dimethylformamid (4 ml) aufgelöst, und nach Zugabe von Hydroxybenzotriazol (181 mg) und Abkühlung auf 0°C wurde dem Gemisch Dicy-klohexylcarbodiimid (200 mg) zugegeben. Die Lösung wurde während einer Stunde bei 0°C und 1,5 Stunden bei Raumtem-60 peratur gerührt. Die ausgeschiedenen Kristalle von Harnstoff wurden abgesaugt, die Lösung wurde in auf 45°C erhitztes Methanol (150 ml) eingegeben und das pH des Gemisches wurde durch Zugabe von N-Äthylpiperidin auf 8,5 eingestellt. Das Gemisch wurde auf 45°C während 2 Stunden 65 erhitzt und danach auf kleines Volumen konzentriert. Durch Zugabe von Äther wurde das Produkt ausgefällt, welches dann abgesaugt und im Vakuum getrocknet wurde (140 mg). Ein Teil des Produktes (30 mg) wurde in einem Gemisch aus

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Methanol und Wasser (1:1,10 ml) aufgelöst und auf eine Kolonne von mit Oktadecylketten modifiziertem Silicagel aufgetragen (50 x 0,9 cm). Die Elution wurde mit einem Gemisch aus 55% Methanol und 0,05%iger wässriger Trifluor-essigsäure durchgeführt. Die die Verbindung vom k = 7,3 enthaltende Fraktion wurde im Vakuum konzentriert und lyophilisiert. Es wurden 6,5 mg reine Verbindung nach HPLC und TLC in vier Systemen gewonnen. Für C44H67NuOhS.2 HaO (994,2) berechnet: 53,16% C 7,20% H, 15,50% N; gefunden: 52,88% C, 7,39% H, 15,29% N. Analyse der Aminosäuren: Asp 1,04, Glu 1,05, Pro 0,95, Gly 1,04, Ile 0,94, Leu 1,05, Phe 0,98, Hcy(C2H4COCH) 0,97.

Beispiel 2

[2-D-ß-Äthyltyrosin]deamino-6-carba-oxytocin o-Nitrobenzolsulfenyl-D-O-äthyltyrosyl-isoleucyl-gluta-minyl-asparaginyl-S-(ß-carboxyäthyl)homocysteinyl-prolyl-leucyl-glycinamid (130 mg) wurde auf dieselbe Weise wie im Beispiel 1 zyklisiert. Es wurden 135 mg Rohprodukt gewonnen, von dem ein Teil (30 mg) in einem Gemisch Methanol-Wasser (4:6) aufgelöst und auf eine Kolonne mit Silicagel, welches mit Oktadecylketten modifiziert worden war, aufgetragen wurde (50 x 0,9 cm). Die Elution wurde mit einem Gemisch aus Methanol und 0,05%iger Trifluoressig-säure (1:1) durchgeführt. Die die Verbindung vom k = 26,3 enthaltende Fraktion wurde konzentriert und lyophilisiert. Es wurden 6,2 mg reine Verbindung nach HPLC und TLC gewonnen. Für C46H71N11O12S.4 H2O (1074) berechnet: 51,43% C, 7,41% H, 14,34% N; gefunden: 51,27% C, 7,65% H, 14,08% N. Analyse der Aminosäuren: Asp 1,02, Gen 1,03, Pro 1,00, Gly 1,04, Ile 0,93, Leu 0,98, Tyr(Et) 0,41, Tyr 0,56, Hcy(C2H4COOH)0,92.

Beispiel 3

[2-D-p-Methylphenylalanin]deamino-6-carba-oxytocin o-Nitrobenzolsulfenyl-D-p-methylphenylalanyl-isoleucyl-glutaminyl-asparaginyl-S-(ß-carboxyäthyl)homocysteinyl-prolyl-leucyl-glycinamid (220 mg) wurde auf gleiche Weise wie im Beispiel 1 zyklisiert. Ein Teil des Rohproduktes (30 mg) wurde auf gleiche Weise wie im Beispiel 1 gereinigt. Die die Verbindung vom k = 13,6 enthaltende Fraktion wurde im Vakuum konzentriert und lyophilisiert. Es wurden 7,3 mg reine Verbindung nach HPLC und TLC gewonnen. Für C45H69N11O11S.3 H2O (1026) berechnet: 52,67% C, 7,37%

H, 15,01% N; gefunden 52,40% C, 7,61% H, 14,83% N. Analyse der Aminosäuren: Asp. 1,00, Glu 1,00, Pro 1,05, Gly

I,01, Ile 0,91, Leu 1,04, Phe(Me) 0,99, Hcy(C2H»COOH)

0,99.

Beispiel 4

[2-D-p-Äthylphenylalanin]deamino-6-carba-oxytocin o-Nitrobenzolsulfenyl-D-p-äthylphenylalanyl-isoleucyl-glutaminyl-asparaginyl-S-(ß-carboxyäthyl)homocysteinyl-prolyl-leucyl-glycinamid (200 mg) wurde zyklisiert und ein Teil des Produktes (30 mg) auf gleiche Weise wie im Beispiel 1 gereinigt. Es wurden 5,3 mg reine Substanz nach HLPC und TLC gewonnen. Für C46H71N11O11S.4 H2 (1058) berechnet: 52,21% C, 7,52% H, 14,56% N; gefunden: 51,90% C, 7,54% H, 14,41% N. Analyse von Aminosäuren: Asp 1,01, Glu 1,03, Pro 0,94, Gly 0,99, Ile 0,92, Leu 1,05, Phe(Aet) 1,00, Hcy(C2H4COOH)0,95.

Beispiel 5

[2-D-p-Äthylphenylalanin]]deamino-oxytocin S-Benzylmercaptopropionyl-D-p-äthylphenylalanyl-iso-leucyl-glutaminyl-asparaginyl-S-benzylcysteinyl-proly-leucyl-glycinamid (50 mg) wurde in flüssigem Ammoniak gelöst und mit Natriumstäbchen bis zur Erreichung einer blauen, 1 Minute dauernden Färbung reduziert. Dieblaue Färbung wurde durch Zugabe eines Tropfens Essigsäure beseitigt und das Gemisch wurde lyophilisiert. Das Lyophilisat wurde in 0,1M HCL (8 ml) aufgelöst und die Lösung wurde mit Wasser auf 100 ml verdünnt und ihr pH-Wert mit 0,1 M NaOH auf 7 eingestellt. Danach wurde eine Lösung von K3Fe(CN)ó (25 mg in 5 ml Wasser) während 20 Minuten unter Konstanthaltung des pH-Wertes auf 7 zugegeben. Das Gemisch wurde noch 40 Minuten bei Raumtemperatur gerührt. Dann wurde der pH-Wert durch Zugabe von Essigsäure auf 4 eingestellt und die Lösung wurde mit Hilfe einer Hochdruckpumpe auf eine Kolonne mit Silicagel, welches mit Oktadecylketten modifiziert worden war, aufgetragen (25 x 0,4 cm). Die Kolonne wurde mit Wasser durchgewaschen und die Peptide wurden mit einem Gemisch aus 80% Methanol und 0,55%iger wässriger Trifluoressigsäure eluiert. Das Eluat wurde im Vakuum konzentriert und lyophilisiert. Das Lyophilisat wurde erneut in einem Gemisch von Methanol und Wasser (1:1:8 ml) aufgelöst, auf eine Kolonne mit Silicagel, welches mit Oktadecylketten modifiziert worden war, aufgetragen (50 x 0,9 cm) und mit einem Gemisch aus Methanol und 0,05%iger Trilfluoressigsäure (65:35) eluiert. Die die Verbindung vom k = 16,6 enthaltende Fraktion wurde im Vakuum konzentriert und lyophilisiert. Es wurden 8,6 mg reine Substanz nach HLPC und TLC gewonnen. Für C45H69N11O11S2.4 H2O (1076) berechnet: 50,22% C, 7,21% H, 14,3% N; gefunden: 49,94% C, 7,24% H, 14,18% N. Analyse der Aminosäuren: Asp 1,02, Glu 0,97, Pro 0,89, Gly 1,00, Cys 0,53, Ile 0,91, Leu 1,00 Phe(Et) 1,00.

Beispiel 6

[2-D-p-Äthylphenylalanin]oxytocin

Na-Benzyloxycarbonyl-S-benzylcysteinyl-D-p-äthyl-phenyl-alanyl-isoleucyl-glutaminyl-asparaginyl-S-benzylcy-steinyl-prolyl-leucyl-glycinamid (200 mg) wurde auf gleiche Weise wie im Beispiel 5 reduziert und oxidiert. Die Zyklisie-rungslösung wurde auf die Kolonne eines Carboxylkationen-austauschers (30 ml) aufgetragen, die Kolonne wurde mit 0,25%iger Essigsäure durchgewaschen und die Peptide wurden mit 50%iger Essigsäure eluiert. Ein Teil des durch Lyophilisierung gewonnenen Produktes (Vi) wurde in einem Gemisch aus Methanol und Wasser (1:1,8 ml) gelöst und auf eine Kolonne mit Silicagel, welches mit Oktadecylketten modifiziert worden war aufgetragen (50 x 0,9 cm). Die Elution wurde mit einem Gemisch von Methanol (60%) und 0,1 M Ammoniumazetat (40%) vom pH-Wert 7 durchgeführt. Die die Substanz vom k = 21,1 enthaltende Fraktion wurde im Vakuum konzentriert und lyophilisiert. Es wurden 16,3 mg reine Verbindung nach HLPC und TLC gewonnen. Für C45H70N12O11S2.2 H2O.C2H4O2 (1115) berechnet: 50,61% C, 7,05% H, 15,07% N; gefunden: 50,36% C, 6,181% H, 15,23% N. Analyse der Aminosäuren Asp 0,96, Glu 0,98, Pro 1,02, Gly 0,96, Cys 1,73, Ile 1,06, Leu 1,03, Phe (Et) 1,02.

Beispiel 7

[l-Penicillamin,2-D-p-äthylphenylalanm]oxytocin

Na-Benzyloxycarbonyl-S-benzylpenicillaminyl-D-p-äthyl-phenylalanyl-isoleucyl-glutaminyl-asparaginyl-S-benzylcy-steinyl-prolyl-leucyl-glycinamid (200 mg) wurde auf gleiche-Weise wie im Beispiel 5 reduziert und oxidiert. Das Zyklisie-rungsgemisch wurde wie im Beispiel 6 verarbeitet und gereinigt mit der Ausnahme, dass für die Elution ein 65% Methanol enthaltendes Gemisch verwendet wurde. Es wurden 8,2 mg reine Substanz nach HLPC und TLC gewonnen. Für C47H74N12O11S2.3 H2O.C2H4O2 (1161) berechnet: 50,67% C, 7,29% H, 14,47% N; gefunden: 50,78% C, 7,43% H, 14,31% N. Analyse der Aminosäuren: Asp. 0,98, Glu 1,00, Pro 0,89, Gly 1,00 Ile 1,03, Leu 1,02, Phe(Et) 0,97, Cys+Pen 1,48.

4

s

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

Beispiel 8

[2-D-p-Äthylphenylalanin,8-lysin]vasopressin

N-Benzyloxycarbonyl-S-benzylcysteinyl-D-p-äthylphenyl-alanyl-phenylalanyl-glutaminyl-asparaginyl-S-benzylcy-steinyl-prolyl-N£-p-toIuolsulfenylIysyl-glycinamid (100 mg) wurde im flüssigen Ammoniak (40 ml) mit Natrium bis zur Entstehung einer blauen, 60 Sekunden dauernden Färbung reduziert. Danach wurde die Farbe durch Zugabe von Essigsäure beseitigt und die Lösung wurde lyophilisiert. Der Trok-kenrest wurde in 0,1M-HCL (10 ml) gelöst, mit Wasser auf ein Volumen von 200 ml verdünnt, der pH-Wert wurde auf 7 eingestellt und nach Zugabe einer Lösung von KjFe(CN)6 bis zur konstanten gelben Färbung wurde dieser Wert unter Rührung während einer Stunde gehalten. Danach wurde die Lösung auf eine Kolonne mit Carboxylkationenaustauscher aufgetragen, die Säule wurde mit 0,05%iger Essigsäure durchgewaschen und das Produkt wurde mit 50%iger Essigsäure eluiert. Nach einer Lyophilisierung wurde das Produkt in Wasser (10 ml) aufgelöst und auf eine Kolonne mit Silicagel, welches mit Oktadecylketten modifiziert worden war, aufgetragen. (Kolonnedimensionen: 50 x 0,9 cm). Die Elution wurde mit einem Gemisch aus 40% Methanol und 60% Tri-fluoressigsäure (0,l%iger wässriger Säure) durchgeführt. Die entsprechenden Fraktionen wurden lyophilisiert). Die Reinheit des Produktes wurde durch Dünnschichtchromatographie (4 Systeme), Flüssigkeitchromatographie und Papierelektrophorese (2 Puffer von verschiedenem pH-Wert) kontrolliert. Analyse von Aminosäuren: Lys 1,07, Asp. 1,03, Glu 0,92, Pro 0,94, Gly 1,04, Cys 1,84, Phe 1,06, Phe(Et) 0,92.

Beispiel 9

Na-Glycyl-glycyl-glycyl[2-D-p-äthylphenylalanin]oxy-tocin

Zu einer Lösung von [2-D-p-äthyIphenylalanin]oxytocin (4 mg) in 0,3 ml Wasser wurde eine Lösung vom N-Hydroxy-succinimidester des o-Nitrobenzosulfenyl-glycyl-glycyl-gly-cins (10 mg) in 0,3 ml Dimethylformamid zugefügt. Nach zweistündigem Rühren bei Raumtemperatur wurden noch 14 mg aktiver Ester des Triglycins zugegeben und die Lösung wurde durch Zugabe von 11 ul IM-NaOH auf einen pH-Wert von 8 alkalisiert. Die Reaktion wurde mit Hilfe der Hochdruckflüssigkeitchromatographie auf der Umkehrphase verfolgt. Nach dem Verschwinden der Ausgangssubstanz (20

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Stunden) wurde die Lösung im Vakuum einer Ölpumpe bei Raumtemperatur abgedampft, der Trockenrest wurde in Methanol (1 ml) und nach Zugabe von 2,3M-HC1 in Äther (60 jj.1) aufgelöst und nach Stehen während 5 Minuten bei s Raumtemperatur wurde die Lösung wieder abgedampft. Der Trockenrest wurde in 1 ml 3M-Essigsäure suspendiert, abfiltriert und das Filtrat nach Verdünnung mit 5 ml Wasser auf eine Kolonne mit Silicagel, welche mit Oktadecylketten modifiziert worden war, (Kohleostoffgehalt 15%) aufge-lo tragen (Dimensionen 50 x 0,9 cm). Die Elution wurde unter Druckfluss (4 ml/min) mit folgendem Programm der mobilen Phase durchgeführt: 0-40 Minuten Methanol-0,l%igeTrifluoressigsäure 40:60,40-60 Minuten linearer Gradient bis zum Erhalt von 60% Methanol. Die entspre-is chenden Fraktionen wurden im Vakuum konzentriert und lyophilisiert. Es wurden 2,3 mg chromatographisch (TLC, HPLC) und elektrophoretisch reine Substanz gewonnen. Aminosäureanalyse: Asp 0,99, Glu 1,05, Pro 0,90, Gly 4,08, Cys 1,29, Ile 0,96, Leu 1,02, Phe(Et) 0,99.

Beispiel 10

[2-D-p-Methylphenylalanin,9-desglycinamid]deamino-6-25 carba-oxytocin

[2-D-p-Methylphenylalanin]deamino-6-carba-oxytocin (2,5 mg) wurde in 50 jxl Methanol und 300 [il 20 mM-Phos-phatpuffer von pH-Wert 7,7 aufgelöst und nach Zugabe von 2,5 mg Chymotrypsin wurde das Gemisch bei einer Tempe-30 ratur von 37°C während 12 Stunden inkubiert. Die Reaktion wurde mit Hilfe der hochwirksamen Flüssigkeitchromatographie verfolgt und nach dem Verschwinden des Ausgangstoffes wurde das Reaktionsgemisch auf eine Kolonne (25 x 0,4 cm) mit Silicagel, welches mit dem Oktadecylketten 35 modifiziert worden war, aufgetragen. Als mobile Phase wurde das Gemisch aus 40% Methanol und 60% 0,05M-Ammoniumacetat von pH-Wert 7,0 verwendet. Nach der Lyophilisierung wurden 1,6 mg Substanz I gewonnen, welche in vier Systemen bei der Dünnschichtchromatographie und 40 in zwei Systemen bei der hochwirksamen Flüssigkeitchromatographie chromatographisch rein war, Aminosäureanalyse: Asp 0,96, Glu 0,98, Pro 1,02, Hcy(C2H4C02H) 0,93, Ile 1,03, Leu 1,03, Phe (Me) 1,05.

B