DE2625330A1 - Somatostatinanaloge, verfahren zu ihrer herstellung und sie enthaltende arzneimittel - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft Derivate des T -radecapeptids Somatostatin. Insbesondere betrifft die Erfindung Derivate von
Somatostatin und deren Salze» ein Verfahren zur Herstellung der Derivate und Salze, Zwischenprodukte, die beim Herstellungsverfahren verwendet werden und Arzneimittel, die die
Derivate und deren Salze enthalten.

Der Name "Somatostatin" wurde für den Faktor vorgeschlagen, der in Hypothalamusextrakten gefunden wird und die Sekretion des Wachstumshormons (Somatotropin) inhibiert. Die Struktur

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dieses Paktors wurde von P. Brazeau et al., Science, 179, 77 (1973) bestimmt; es wurde berichtet, daß das Somatostatin die nachfolgende Tetradecapeptidstruktur besitzt:

H-Ala-Gly-Cys-Lys-Asn-Phe-Phe-Trp-Lys-Thr-Phe-Thr-Ser-Cys-OH

L_ _i

Die hier für die verschiedenen Aminosäuren verwendeten Abkürzungen sind:

AIa = Alanin, Asn = Asparagin, Cys = Cystein, G-Iy = Glycin» Lys = Lysin, Phe = Phenylalanin, Ser = Serin, Thr = Threonin und Trp = Tryptophan.

Die Konstitution des Tetradecapeptids Somatostatin wurde durch Synthese bestätigt; vgl. beispielsweise D. Sarantakis und W.A. McKinley, Biochem. Biophys. Res.Comm. 54, 234 (1973)» J. Rivier et al., Compt. Rend. Ser.D. 276, 2737 (1973) und H.U. Immer et al. HeIv. Chim. Acta, 52» 730 (1974).

Die große physiologische Aktivität dieses Tetradecapeptids hat es zu einer wichtigen Verbindung für die klinische Pharmakologie bezüglich der Behandlung von Acromegalie und der Lenkung von Diabetes gemacht; vgl. beispielsweise K. Lundbaek et al., Lancet, 2, 131 (1970) und R. Guillemin in "Chemistry and Biology of Peptides", J. Meienhofer» Ed., 3rd American Peptide Symposium Boston 1972, Ann Arbor Science Publications, Ann Arbor, Mich., 1972.

Die lineare Form von Somatostatin mit zwei Sulfhydrylgruppen

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anstelle einer Disulfiderücke wurde von J.E.P. Rivier, J. Amer.Chem.Soc, 96., 2986 (1974) hergestellt. Er berichtet, daß die lineare Form gleich wirksam wie das Somatostatin ist, bezogen auf die Fähigkeit der beiden Verbindungen, die Sekretionsrate des Wachstumshormons bei Rattenhypophysenzellen in einschichtigen Gewebekulturen zu inhibieren.

Kürzlich wurde von Polypeptiden berichtet, die vom natürlichen Hormon verschieden sind und deren lineare Form soaatostatinartige Aktivität besitzt. D. Sarantakis et al., Biochem. Biophys. Res. Comm., 55» 538, (1973) berichteten kürzlich von der Synthese des Somatostatinanalogen [AIa ]-Somatostatin durch Festphasenmethoden. Dieses Analogon besitzt eine sehr geringe Menge an Aktivität, ungefähr 0,01 $ der Wirksamkeit von Somatostatin. P. Brazeau et al., Biochem. Biophys. Res. Comm., 60, 1202 (1974) hat kürzlich die Synthese einer Anzahl acylierter DeS-[AIa -GIy J-somatostatinderivate durch Festphasenmethoden berichtet.

Die vorliegende Erfindung offenbart Derivate des Somatostatins, die einen größeren Aktivitätsspiegel oder einen Aktivitätsspiegel in der gleichen Größenordnung wie das natürliche Hormon, sowie eine Aktivitätsdauer aufweisen, die größer als die des Somatostatins ist. Diese Derivate werden leicht nach einem bequemen Verfahren hergestellt, das die folgenden Vorteile aufweist: Das Verfahren geht von leicht zugänglichen Materialien aus, vermeidet schädliche Reagentien, wird leicht durchgeführt und gebraucht leicht entfernbare Schutzgruppen.

Die vorstehenden Vorteile und Eigenschaften machen die erfindungsgemäßen Peptide brauchbar zur lenkung der Diabetes und zur Behandlung von Acromegalie.

Die erfindungsgemäßen Peptide sind durch die Formeln I und Ia dargestellt (wobei die Formel I die erfindungsgemäßen cyclischen Peptide und die Formel Ia die linearen reduzierten Pep-

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tide darstellt);

SCH₂CH(R¹JCO-Lys-Asn-Phe-Phe-Trp-Lys-Thr-Phe-Thr-Ser-NHCH(R )CH₂S

(D

HSCH₂CH(R'jCO-Lys-Asn-Phe-Phe-Trp-Lys-Thr-Phe-Thr-Ser-NHCHiR²)CH₂SH

(Ia)

worin:

(a) R¹ für H-Gly-Gly-Ala-Gly-ÜHtH-Gly-Gly-Gly-Ala-Gly-NH

oder H-Ieu-Gly-Gly-Ala-Gly-NH steht und R die Bedeutungen H oder COOH besitzt; oder

(b) R für H oder NHR steht, worin R^ Acyl oder Benzoyl be-

2
deutet und R H darstellt; oder

(c) R¹ für H-Ala-Gly-NH steht und R² die Bedeutung COOAIk besitzt, worin Alk eine geradkettige oder verzweigte Alkylgruppe mit 1 bis H Kohlenstoffatomen darstellt.

In den Rahmen der Erfindung fallen auch die therapeutisch verträglichen Salze der Verbindungen der Formel I und Ia.

Die erfindungsgemäßen Peptide werden durch ein Verfahren hergestellt, das dadurch gekennzeichnet ist_f daß man:

ein lineares Peptid der Formel II

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Trt-SCH₂CH(R )CO-Lys(Boc)-Asn-Phe-Phe-Trp-Lys(Boc)-THr(Bu⁺)-Phe~Thr(Bu⁺)-

(II)

Ser(Bu⁺)-NHCH(R²)CH₂S-Trt

worin

(a) R² für H oder COOH steht und R⁴" für Boc-Gly-Gly-Ala-Gly-NH, Boc-Gly-Gly-Gly-Ala-Gly-NH oder Boc-Leu-Gly-Gly-Ala-Gly-iTH steht; oder

(b) R² für H steht und R⁴" die Bedeutungen H oder NHR⁵ besitzt, worin R die vorstehende Definition besitzt; oder

(c) R² für COOAIk steht und R⁴ die Bedeutung Boc-Ala-Gly-NH besitzt»

mit Jod oder Thiocyanogen oxidiert, um das entsprechende cyclische Disulfidderivat der Formel III

SCH₂CH(R⁴)CO-Lys(Boc)-Asn-Phe-Phe-Trp-Lys(Boc)-ThT(Bu⁺)-Phe-Thr(Bu⁺)-Ser(Bu⁺)-NHCH(R²)CH₂S

(III)

O λ

zu erhalten, worin R und R die vorstehenden Definitionen besitzen, und anschließend alle verbleibenden Schutzgruppen unter mäßig sauren Bedingungen entfernt,, um das entsprechende Peptid der Formel I zu erhalten; oder indem man das lineare Peptid einer Behandlung entweder mit Quecksilber-II-acetat, Quecksilber-II-chlorid, Silberacetat oder Silbernitrat unterwirft, um selektiv die Sulfhydrylschutzgruppen zu entfernen, um das Quecksilber-II- oder Disilbersalz des entsprechenden Disulfhydrylderivats zu erhalten, das letztere Salz durch Behandlung mit Schwefelwasserstoff in sein entsprechendes Disulfhydrylderivat überführt, das zuletzt genannte Derivat durch

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Behandlung mit Sauerstoff, 1,2-Dijodäthan, Natrium- oder KaXiumhexacyanoferrat-III oder Jod oxidiert, um das entsprechende cyclische Disulfidderivat zu erhalten, und die verbleibenden Schutzgruppen unter mäßig sauren Bedingungen entfernt, um das gewünschte Peptid der Formel I zu erhalten. Alternativ wird das cyclische Disulfidderivat zum entsprechenden freien Disulfhydrylderivat durch Mittel reduziert, von denen bekannt ist, daß sie zur Reduktion "bekannter cyclischer Disulfide zu ihren entsprechenden Disulfhydrylderivaten wirksam sind.

Die Erfindung betrifft auch die Entfernung aller Schutzgruppen vom zuvor erwähnten linearen Peptid oder zuvor erwähnten Disulfhydrylderivat unter mäßig sauren Bedingungen» um das erfindungsgemäße lineare reduzierte Peptid der Formel Ia

HSCH₂CH(R¹)CX)-Lys-Asn-Phe-Phe-Trp-Lys-Thr-Phe-Thr-Ser-NHpH(R²)CH₂SH "

1 2
worin R und Il die vorstehenden Bedeutungen besitzen, zu

erhalten.

Die letztere Verbindung wird auch durch direkte Reduktion des cyclischen Peptids der Formel I durch Mittel erhalten, von denen bekannt ist, daß sie zur Reduktion bekannter cyclischer Disulfide in ihre entsprechenden Disulfhydrylderivate wirksam sind. Gewünschtenfalls wird die reduzierte Form des cyclischen Peptids durch eines der obigen Oxidationsmittel in das entsprechende Derivat der Formel I überführt.

Das lineare Peptid der Formel II wird leicht durch ein Verfahren hergestellt, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man:

nach, der Azidkupplungsmethode ein Peptid der Formel IV

Trt-SCH₂CH(R⁴)CO-Lys(Boc)-Asn-Phe-Phe-NHNH₂ (IV)

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mit einem Peptid der Formel V

H-Trp-Lys(Boc)-Thr(Bu⁺)-Phe-Thr(Bu⁺)-Ser(Bu⁺)-NHCH(R²)CH₂S-Trt

(V)

worin R und R die vorstehenden Definitionen besitzen» umsetzt» um das entsprechende lineare Peptid der Formel II zu erhalten, worin R und R die vorstehenden Bedeutungen besitzen» oder alternativ nach der Azidkupplungsmethode ein Pentapeptid der Formel YI

Trt-Cys(Trt)-Lys(Boc)-Asn-Phe-Phe-NHNH₂ (VI)

2 mit einem Peptid der Formel V, worin R für H oder COOH steht, umsetzt, und anschließend die terminale Aminoschutzgruppe entfernt, um ein Peptid der Formel VIII

H-Cys(Trt)-Lys(Boc)-Asn-Phe-Phe-Trp-Lys(Boc)-Thr(Bu )-Phe-Thr(Bu )

Ser(Bu⁺)-NHCH(R²)CH₂S-Trt

(VIII)

2
zu erhalten, worin R für H oder COOH steht und die zuletzt

genannte Verbindung mit einem Peptid der Formel IX

R⁵-G Iy-G Iy-A Ia-G Iy-NH_-NH₂ (IX)

worin R-^ für Boc, Boc-Gly oder Boc-Leu steht, nach der Azidkupplungsmethode umsetzt» um das entsprechende lineare Peptid

— V —

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2
der Formel II zu erhalten, worin R für H oder COOH stellt und R⁴ die Bedeutung Boc-Gly-Gly-Ala-Gly-NH, Boc-Gly-Gly-Gly-Ala-Gly-NH oder Boc-Leu-Gly-Gly-Ala-Gly-NH besitzt.

Im allgemeinen "beruhen die hier verwendeten Abkürzungen zur Bezeichnung der Aminosäuren und der Schutzgruppen auf Empfehlungen der IUPAC-IUB Commission on Biochemical Nomenclature, vgl. Biochemistry, 11, 1726 - 1732 (1972). So stellen beispielsweise Cys, Lys, Asn, Phe, Trp,'lhr und Ser die "Reste" von L-Cystein» L-Iysin, L-Asparagin, L-Phenylalanin, L-Tryptophan, L-Threonin und I-Serin dar. Der Rest bedeutet eine Gruppe, die sich durch Eliminierung des OH-Teils der Carboxylgruppe und des Η-Teils der Aminogruppe von der entsprechenden !-Aminosäure ableitet. Alle Aminosäuren weisen die natürliche L-Konfiguration auf.

Heutzutage sind eine Anzahl von Arbeitsweisen oder Techniken zur Herstellung von Peptiden gut ausgearbeitet. So werden beispielsweise die funktioneilen Gruppen, die bei der Peptidbindungsbildung nicht teilnehmen, vor der Kondensationsreaktion gewünschtenfalls durch eine Schutzgruppe oder durch Schutzgruppen geschützt. Zu Beispielen für Schutzgruppen, die für eine Aminofunktion eines Peptids oder eine Aminosäure, die nicht an der Peptidbindungsbildung beteiligt sind, gehören: die Alkoxycarbonyle, einschließlich Benzyloxycarbonyl (durch Z dargestellt) ₉ tert.-Butoxycarbonyl (durch Boc dargestellt), a,a-Dimethyl-3»5-dimethoxybenzyloxycarbonyl (durcli Mz dargestellt), 2-(p-Biphenyl)-iaopropyloxycarbonyl (durch Bpoc dargestellt)» p-Ghlorbenzyloxycarbonyl, p-Methoxybenzi/loxycarbonyl, I3opropyloxycarbonyi oder Äthoxycarbonyi, die Schutzgruppen des Äcyltyps» einschließlich Iormyl, Irlfluoracetyl, jphthaljlj Acetyl (Ac) oder -toluol sulfonyl j die Schutzgruppe!! des Alkyl tjpsj einschließlich 2riphenylmetliyl oder Sriiyl (durcli ^k2rt darge-

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stellt) oder Benzyl j die bevorzugten Schutzgruppen insbesondere beim erfindungsgemäßen Verfahren, sind Benzyloxycarbonyl, tert.-Butoxycarbonyl, Triphenylmethyl und a,oc-Dimethyl-3»5-dimethoxybenzyloxycarbonyl. Die Schutzgruppen für die Hydroxylgruppe des Serins und Tyrosine sind durch Acetyl, Tosyl, Benzoyl, tert.-Butyl (durch Bu dargestellt), Trityl und Benzyl dargestellt» die bevorzugte Schutzgruppe ist tert.-Butyl. Die Schutzgruppen am Schwefel des Cysteine oder des modifizierten Cysteine sind durch Benzyl, Triphenylmethyl oder Trityl (durch Trt dargestellt), Benzyloxycarbonyl oder Acetamidomethyl (durch Acm dargestellt), erläutert; die bevorzugten Schutzgruppen sind Trityl und Acetamidomethyl. Die Carbonsäurefunktion eines Peptids oder einer Aminosäure kann als durch einen niedrigen Alkyl- oder niedrigen Aralkylester geschützt betrachtet werden; hierzu gehören Methyl (durch OMe dargestellt), Äthyl (durch OEt dargestellt)» oder Benzyl (durch OBzI dargestellt) und auch substituierte Hydrazide, zu denen tert.-Butoxycarbonylhydrazid (durch NHIiH Boc dargestellt), Benzyloxycarbonylhydrazid (durch NHNH Z dargestellt) oder a,a-Dimethyl-3»5-dimethoxybenzyloxycarbonylhydrazid (durch NHNH Ddz dargestellt) gehören.

TJm eine leichte Kondensation der Peptidcarboxylgruppe mit einer freien Aminogruppe eines anderen Peptids zur Bildung einer neuen Peptidbindung zu fördern, muß die terrainale Carboxylgruppe aktiviert werden. Beschreibungen derartiger carboxyl-aktivierender Gruppen sind in allgemeinen Textbüchern über Peptidchemie zu finden, beispielsweise bei K.D. Kopple, "Peptides and Amino Acids", W.A. Benjamin, Inc., New York, 1966, Seiten 45-51 und E. Schröder und K. Lübke, "The Peptides", Band 1, Academic Press, New York, 1965» Seiten 77-128. Zu Beispielen für die aktivierte Form der terminalen Carboxylgruppe gehören ein Säurechlorid , ein Anhydrid, ein Azid, ein aktivierter Ester oder ein o-Acylharnstoff eines Dialkylcarbodiimids. Die folgenden aktivierten Ester haben sich als besonders brauchbar beim erfin-

— Q- —

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eUmgsgemäßen Verfahren erwiesen: 2,4->5-Trichlorphen3'"l (durch GTcp dargestellt)» Pentachlorphenyl (durch OPcp dargestellt)» p-Nitrophenyl (durch ONp dargestellt), oder 1-Benzotriazolyl; die Succinimidogruppe ist für eine derartige Aktivierung ebenfalls geeignet.

Der hier verwendete Begriff "Azidmethode" betrifft die Methode der Kupplung von zwei Peptidfragmenten_t die die Reaktion eines Peptidhydrazids mit einem Reagens umfaßt, welches in situ salpetrige Säure liefert. Zu geeigneten Reagentien für diesen Zweck gehören organische Nitrite (beispielsweise tert.-Butylnitrit, Isoamylnitrit), oder Alkalimetallnitritsalze (beispielsweise Natriumnitrit, Kaliumnitrit) in Gegenwart einer starken Säure, wie Chlorwasserstoff oder Schwefelsäure oder Phosphorsäure. Das so erhaltene entsprechende Peptidazid wird dann mit einem Peptid mit einer freien Aminogruppe umgesetzt, um das gewünschte Peptid zu erhalten. Bevorzugte Bedingungen für die Azidmethode zur Kupplung bestehen in der Reaktion des Peptidhydrasids mit salpetriger Säure» die aus einem organischen Nitrit in situ hergestellt wird» in Gegenwart einer starken Säure, vorzugsweise Chlorwasserstoff (wobei der pH üblicherweise von 0,1 bis 2 variiert) in einem wasserfreien inerten organischen Lösungsmittel, beispielsweise Dimethylformamid, Dimethylsulfoxyd, Äthylacetat, Bichiοrmethan, Tetrahydrofuran, Dioxan und dergleichen, bei -30⁰C bis 20⁰C, vorzugsweise bei ungefähr -15⁰C während 10 bis 30 Min., um das entsprechende Azid zu erhalten. Das Peptidazid kann isoliert und kristallisiert werden; man beläßt es vorzugsweise in der Reaktionsmischung. Danach wird in der obigen Mischung das Azid mit der Peptideinheit, die die freie Aminogruppe aufweist, bei Temperaturen im Bereich von -30⁰C bis 20⁰C während ungefähr einer bis zwei Stunden und anschließend 10 bis 30 Std. bei O⁰C bis 30⁰C, umgesetzt. In der Reaktionsmischung liegt ein Säureakzeptor, vorzugsweise eine organische Base» beispielsweise N-Äthyldiisoproyplamin, N-A'thylmorpholin oder Triäthyl-

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amin» vor» um das Reaktionsmedium leicht alkalisch zu machen» vorzugsweise um einen pH von 7»0 bis 7»5 zu schaffen. Vergl. auch die vorstehend genannten Textbücher von Kopple oder Schröder und Lübke "bezüglich zusätzlicher Beschreibungen dieser Methode.

Die hier verwendeten Begriffe "Peptid, Tripeptid, Hexapeptid und dergleichen" sind nicht auf die entsprechenden zugrundeliegenden Peptide beschränkt, sondern werden auch unter Bezugnahme auf modifizierte Peptide mit funktionalisierten Gruppen oder Schutzgruppen gebraucht. Der hier verwendete Begriff "Peptid" wird unter Bezugnahme auf ein Peptid mit zwei bis siebzehn Aminosäureresten gebraucht. Der hier verwendete Rest "SCH₉CH(R¹)C0" wird in dem Fall» in dem R für H steht» unter Bezugnahme auf einen modifizierten Rest des Cysteine, oder in dem Fall,

1 ^ "3

in dem R für NHIr, worin R die vorstehende Definition besitzt, H-Gly-Gly-Ala-Gly-NH, H-Gly-Gly-Gly-Ala-Gly-NH, H-Leu-Gly-Gly-Ala-Gly-NH oder H-Ala-Gly-NH steht, unter , Bezugnahme auf einen Cysteinrest verwendet. Zusätzlich wird der Rest "NHCH(R²)CH₂S" in dem Fall, in dem R² für COOH oder COOAIk steht» unter Bezugnahme auf den Cysteinrest, oder in dem Fall» in dem R die Bedeutung H besitzt, unter Bezugnahme auf einen modifizierten Cysteinrest» gebraucht.

Die Abkürzung Me stellt eine Methylgruppe dar und NHNH2 bedeutet eine Hydrazidgruppe.

Der hier verwendete Begriff "niedriges Alkyl" umfaßt Kohlenwasserstoffreste mit 1 bis 3 Kohlenstoffatomenj er schließt Methyl, Äthyl und Propyl ein. Das Symbol "Alk" bedeutet eine geradkettige oder verzweigte Alkylgruppe mit 1 bis 14 Kohlenstoffatomen.

, Der hier verwendete Begriff "Acyl" umfaßt eine niedrige all·

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phatische Acylgruppe mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen und steht für geradkettige oder verzweigte Acylgruppen; er umfaßt Formyl, Acetyl, Propionyl, Butyryl, Isobutyryl» Pivaloyl, n-Hexanoyl und dergleichen.

Der Begriff "niedriges aliphatisches Acyl mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen" bedeutet geradkettige oder verzweigte Acylgruppen; er umfaßt Formyl₅ Acetyl, Propionyl, Butyryl, Isobutyryl, Pivaloyl, n-Hexanoyl und dergleichen.

Der hier verwendete Begriff "Mineralsäure" betrifft die starken anorganischen Säuren und umfaßt Chlorwasserstoffsäure, Bromwasserstoffsäure, Schwefelsäure oder Phosphorsäure. Wenn der Begriff in Verbindung mit einem wasserfreien System gebraucht wird, stellt wasserfreier Chlorwasserstoff die bevorzugte Mineralsäure dar,

Der hier verwendete Begriff "mildsaure Bedingungen⁵¹ betrifft Bedingungen, bei denen eine verdünnte wäßrige Lösung einer organischen Säure, beispielsweise 30-bis 80%ige wäßrige Ameisensäure, Essigsäure oder Propionsäure, vorzugsweise 70-bis 80$ig, oder Mischungen davon» eine Hauptkomponente des Reaktionsmediums darstellte

Der hier verwendete Begriff "mäßig saure Bedingungen⁸³ betrifft Bedingungen, bei äenen konzentrierte organische Säuren oder Lösungen der Mineralsäuren als Hauptkoaponente des Reaktionsmediums bei Ssaperatnirea» die tos Migsfäiir -3O⁰O bis 50⁰O reichen, verwendet werden. Eil Beispielen für bevorzugte 3edingungen gehören is diesem Jail's Sie TsrweneUing von 50- "oie lOOjtiger Trifluoresslgsäure sei ^⁹O bis 30⁰Q eier Oj1 Me 12n Chlorwasserstoffsäure in Paariger S3sung oder in Lösung in sinem organisches Zi3sungsmi*iüelD c-üLer Slilorwasstretoff in liösung in wasserfreien or/gaaisehen Sösiangsmitteln "bei -fO°(J Ms 10⁰O₀

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Der Begriff "organisches Nitrit" schließt die im Handel erhältlichen Alkylnitrite, beispielsweise tert.-Butylnitrit, Isoamylnitrit» und dergleichen, ein.

Der hier verwendete Begriff "organische Base" umfaßt Triäthylamin, N-A'thylmorpholin, N-lthyldiisopropylamin und dergleichen.

Der hier verwendete Begriff "starke Base" betrifft sowohl organische Basen, wie zuvor beschrieben, und starke anorganische Basen, einschließlich der Hydroxyde und Carbonate von Kalium und Natrium.

Die erfindungsgemäßen Peptide, einschließlich der cyclischen und der linearen reduzierten Formen, werden in Porm der freien Base oder eines Säureadditionssalzes entweder direkt aus dem erfindungsgemäßen Verfahren, oder durch Umsetzung des Peptids mit einem oder mehr Äquivalenten der entsprechenden Säure, erhalten. Beispiele bevorzugter Salze sind diejenigen mit pharmazeutisch verträglichen organischen Säuren, beispielsweise Essigsäure, Milchsäure, Bernsteinsäure, Benzoesäure» Salicylsäure, Methansulfonsäure oder Toluolsulfonsäure, sowie mit polymeren Säuren, wie Tanninsäure oder Carboxymethylcellulose, und Salze mit anorganischen Säuren, wie Halogenwasserstoffsäuren, beispielsweise Chlorwasserstoffsäure* oder Schwefelsäure, oder Phosphorsäure. Es sollte bemerkt werden, daß die Peptide zwei basische Stickstoffe enthalten, die zu Additionssalzen mit einem bis möglicherweise zwei Äquivalenten Säure führen. Gewünschtenfalls wird ein bestimmtes Säureadditionssalz in ein anderes Säureadditionssalz , beispielsweise ein Salz mit einer nicht-toxischen, pharmazeutisch verträglichen Säure, durch Behandlung mit dem entsprechenden Ionenaustauscherharz in der von R.A. Boissonas et al, HeIv.Chim. Acta, £3» 1349 (1960) beschriebenen Weise überführt. Geeignete Ionenaustauscherharze sind Kationenaustauscher auf Cellulosebasis, beispielsweise Carboxymethylcellulose oder chemisch mo-

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dlfizierte, vernetzte Dextrankationenaustauschex*, beispielsweise die des Sephadex C-Typs» und stark basische Anionen» austauscherharze, beispielsweise die in J.P. G-reenstein und Μ« Winitz "Chemistry of the Amino Acids", John ¥iley and Son£_s Inc., New York und London» 1961» Band 2, Seite 1456» aufgeführten Anionenaustauscherharze.

Mit Schwermetallionen ergeben die Somatostatinanalogen der Formeln I und Ia Komplexsalze. Ein Beispiel für einen pharmazeutisch verträglichen Schwermetallkomplex ist ein Komplex» d&r mit Zink oder mit Zinkprotamin gebildet ist.

Die durch das erfindungsgemäße Verfahren hergestellten Peptide, sowie ihre entsprechenden pharmazeutisch verträglichen Salze sind brauchbar, da sie die pharmakologische Aktivität des natürlichen Tetradeeapeptids Somatostatin besitzen. Ihre Aktivität läßt sich bei pharmakologischen Tests leicht demonstrieren, so bei einer Modifikation [A.V. Schally et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., j?2, 1314 (1973); J. Rivier et al., CR. Acad. Sei. Paris, Ser.D, 276, 2737 (1973)3 der in vitro-Hethode von M, Saffran und A.V. Schally, Can. J. Biochem. Physiol., 21» 405 (1955).

PIe Aktivität der erfindungsgemäßen Peptide der Formel I osier Ia wird auch in vivo demonstriert,und zwar durch eine Kodifikation der durch pentobarbital-induzierten Zunahme des Wachstumshormonspiegels im Plasma bei der Ratte« wie dies von Brazeau et al., loc.cit. beschrieben ist. Bei diesem Test zeigen die erfindungsgemäßen Peptide einen Aktivitätsspiegel, der größer als der von Somatostatin ist oder sich in derselben Größenordnung bewegt.

Die erfindungsgemäßen Peptide sind brauchbar zur Behandlung von Acromegalie und verwandten hypersekretorischen endocrine^ Zuständen, und bei der Lenkung von Diabetes bei Säugern; vgl_s

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beispielsweise P. Brazeau et al_t loc.cit* Wenn die Peptide oder deren Salze für eine derartige Behandlung oder Lenkung verwendet werden» werden sie systemischf vorzugsweise parenteral» in Verbindung mit einem pharmazeutisch verträglichen flüssigen Träger» verabreicht. Die Peptide der Formel I oder Ia besitzen eine geringe Toxizität. Der Anteil des Peptide oder dessen Salz wird durch seine Löslichkeit im gegebenen Träger, durch den gegebenen Träger, oder durch den gewählten Verabreichungsweg» bestimmt. Wenn man das Peptid oder ein SaIs davon in einer sterilen wäßrigen Lösung gebraucht, kann eine derartige Lösung auch andere gelösten Stoffe, wie Puffer oder Schutzmittel, sowie ausreichende Mengen pharmazeutisch verträglicher Salze, oder Glucose enthalten, um die Lösung isotonisch zu machen. Die Dosierung variiert mit der Verabreichungsform und mit der zu behandelnden besonderen Spezies und wird vorzugsweise bei 1 γ bis 300 γ/kg Körpergewicht gehalten. Um wirksame Ergebnisse zu erzielen» verwendet man am wünschenswertesten einen Dosisspiegel im Bereich von ungefähr 1γ bis ungefähr 50 γ/ kg Körpergewicht.

Die Peptide oder deren Salze können auch in einer der lange wirksamen» nachstehend beschriebenen Retard- oder Depotdosisformen, vorzugsweise durch intramuskuläre Injektion oder durch Implantation, verabreicht werden. Derartige Dosisformen sind so ausgebildet, daß sie ungefähr 0,1 γ bis 0,50 γ/ kg Körpergewicht/Tag freisetzen.

Es ist oft wünschenswert, das Mittel über längere Zeiträume hinweg in lange wirksamen, Eetard- oder Bepotdosisformen kontinuierlich zu verabreichen. Derartige Doeisformen können entweder ein pharmazeutisch verträgliches Salz des Peptide mit einem geringen Löslichkeitsgrad in den KÖrperfluiden» beispielsweise eines der nachstehend beschriebenen Salze» enthalten, oder sie können das Peptid in Jona eines wasserlöslichen Salzes zusammen mit einem Schutsträger, ier eine schnelle Freisetzung verhindert, enthalten. Im letzteren Jail*

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kann das Peptid beispielsweise mit einer nicht-antigenen, teilweise hydrolysieren Gelatine in Form einer viskosen Flüssigkeit formuliert werden, oder das Peptid kann an einem pharmazeutisch verträglichen festen Träger, beispielsweise Zinkhydroxyd, adsorbiert werden und in Suspension in einem pharmazeutisch verträglichen flüssigen Vehiculum verabreicht werden, oder man kann das Peptid in Gelen oder Suspensionen mit einem schützenden, nicht-antigenen Hydrokolloid, beispielsweise Natriumcarboxymethylcellulose, Polyvinylpyrrolidon, Natriumalginat, Gelatine, Polygalacturonsäuren, beispielsweise Pectin» oder bestimmten Mucopolysaccariden, zusammen mit wäßrigen oder nicht-wäßrigen, pharmazeutisch verträglichen flüssigen Vehicula, Schutzstoffen oder oberflächenaktiven Mitteln, formulieren. Beispiele für derartige Formulierungen findet man in der üblichen pharmazeutischen Literatur, beispielsweise in Remington's Pharmaceutical Sciences, 14.Ausgabe, Mack PublishingCo., Easton, Pennsylvania, 1970. Man kann lange-wirksame, Retardpräparationen des nach dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellten Peptide auch durch Mikrοverkapseiung in einem pharmazeutisch verträglichen Überzug, beispielsweise Gelatine, Polyvinylalkohol oder Äthylcellulose» erhalten. Weitere Beispiele für Überzugsmaterialien und die zur Mikrοverkapseiung angewendeten Arbeitsweisen sind von J.A. Herbig in "Encyclopedia of Chemical Technology", Band 13» 2.Ausgabe, Wiley,New York 1967» Seiten 436-456» beschrieben. Derartige Formulierungen, sowie Suspensionen von Salzen des Peptide, die in den Körperfluiden nur mäßig löslich sind, beispielsweise Salzen mit Pamoasäure oder Tanninsäure, sind so ausgelegt, daß sie ungefähr 1,0 γ bis ungefähr 100 γ der aktiven Verbindung pro Kilogramm Körpergewicht pro Tag freisetzen, und sie werden vorzugsweise durch intramuskuläre Injektion verabreicht. Alternativ können auch einige der oben aufgeführten festen Dosieformen, beispielsweise bestimmtet mäßig wasserlösliche Salze oder Dispersionen in oder Adsorbate von Salzen des Peptide an festen Trägern, beispieleweise Dispersionen in einem

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neutralen Hydrogel eines Polymeren des Äthylenglykolmethacrylats oder ähnlicher vernetzter Monomerer» wie beispielsweise in der US-PS 3 551 556 beschrieben» auch in Form von Pellets formuliert werden» die ungefähr dieselben Mengen wie zuvor gezeigt» freisetzen und die subkutan oder intramuskulär implantiert werden können.

Das erfindungsgemäße Verfahren wird durch die nachfolgenden Ausführungsformen erläutert» bei denen spezifische Peptide der Formeln I und Ia hergestellt werden.

(a) Verbindungen der Formel I und la» worin R =

H-Gly-Gly-Ala-Gly-NH-, H-Gly-Gly-Gly-Ala-Gly-NH- oder H-Leu-Gly-Gly-Ala-Gly-NH- und worin R² für H oder COOH steht

Der geschützte niedrige Alkylester von Alanylglycin, vorzugsweise Boc-Ala-Gly-OMe [von H.ü. Immer et al., HeIv.
Chim. Acta.» £7» 730 (1974) beschrieben] wird in Trifluoressigsäure gelöst, und die Lösung wird ungefähr 1 Std. bei 0 bis 10⁰C gehalten und anschließend wird die Trifluoressigsäure eingedampft, wobei man H-AIa-Gly-OMe in Form seines
Trifluoressigsäureadditionssalzes erhält» das gewünschtenfalls in die Form der freien Base überführt und als solche verwendet werden kann.

Zu anderen Spaltreagentien zur Entfernung der Boc-Schutzgruppe gehören Bromwasserstoff in Essigsäure, alkoholische Lösungen von Chlorwasserstoff, und dergleichen. Diese zuletzt genannte Verbindung wird in einem inerten organischen Lösungsmittel, vorzugsweise Dimethylformamid, gelöst, und die erhaltene Lösung wird auf ungefähr O⁰C bis 10⁰C gekühlt. Man gibt einen Überschuß, vorzugsweise 1,1 bis 1,3 Äquivalente einer organischen Base, vorzugsweise N-Äthylmorpholin, zur Lösung; die Lösung weist nunmehr einen pH von ungefähr 8 auf. Im wesentlichen ein Äquivalent eines geschützten aktivierten Esters von Glycin, vorzugsweise Boc-Gly-OTcp (von J.Pless und

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H.A. BoissonnaSf HeIv. CMm. Acta, 46., 1609 (1963) beschrieben) wird zugesetzt und die Reaktionsmischung wird ungefähr 2 Tage bei ungefähr O⁰C bis 20⁰C gehalten. Man dampft das Lösungsmittel ein und kristallisiert den Rückstand, wobei man den geschützten niedrigen Alkylester von Glycyl-alanylglycin, vorzugsweise Boc-Gly-AIa-Gly-OMe, erhält, der bei der Behandlung mit Trifluoressigsäure auf die zuvor genannte Weise den niedrigen Alkylester des Tripeptide Glycyl-alanylglycin, vorzugsweise H-Gly-AIa-Gly-OMe, in Form des Trifluoressigsäureadditonssalzes ergibt, das gewünsentenfalls in die Form der freien Base überführt werden kann. Das letztere Tripeptid wird mit Boc-Gly-OTcp auf die zuvor erwähnte Weise umgesetzt, wobei man den geschützten niedrigen Alkylester von Glycyl-glycyl-alanyl-glycin, vorzugsweise Boc-Gly-Gly-Ala-Gly-OMe, erhält, der bei Behandlung mit Trifluoressigsäure auf die zuvor erwähnte Weise den niedrigen Alkylester von Glycyl-glycyl-alanyl-glycin, vorzugsweise. H-Gly-Gly-Ala-Gly-OMe» in Form seines Trifluoressigsäureadditionsalzes ergibt, und der wiederum» gewünschtenfalls, in die Form der freien Base überführt werden kann. Das letztere Tetrapeptid wird mit einem geschützten aktivierten Ester von Glycin, vorzugsweise Boc-Gly-OTcp, auf die zuvor erwähnte Weise umgesetzt, wobei man den niedrigen Alkylester von Glycyl-glycyl-glycyl-alanyl-glycin, vorzugsweise Boc-Gly-Gly-Gly-Ala-Gly-OMe, erhält.

Das zuvor erwähnte, entschützte Tetrapeptid H-Gly-Gly-Ala-GIy-OMe, vorzugsweise in Form des Trifluoressigsäureadditionssalzes, wird mit einem geschützten aktivierten Ester von !Leucin, vorzugsweise tert.-Butyloxycarbonyl-leucin-1-benzotriazolylester, umgesetzt, indem man bei ungefähr O⁰C bis 15°C in einem inerten organischen Lösungsmittel, vorzugsweise Dimethylformamid, das obige entschützte Tetrapeptid, im wesentlichen 1,5 bis 2,0 Äquivalente Boc-Leu-OH, im wesentlichen 1,5 bis 2,0 Äquivalente 1-Hydroxybenzotriazol, im wesentlichen 1,5 bis 2,5 Äquivalente Dicyclohexylcarbodiimid und einen Überschuß einer organischen Base, vorzugsweise N-Äthylitiorpholin,

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vereinigt, um den pH der Lösung auf ungefähr 8 zu bringen. Die erhaltene Mischung wird 20 bis 30 Std. bei ungefähr O⁰C bis 15⁰C gehalten. Entfernung des Niederschlags, Eindampfen des Filtrats und Kristallisation ergibt den geschützten niedrigen Alkylester von Leucyl-glycyl-glycyl-alanyl-glycin, vorzugsweise Boc-Leu-Gly-Gly-Ala-Gly-OMe.

Das zuvor erwähnte Tetrapeptid der Formel Boc-Gly-Gly-Ala-GIy-OMe und die Pentapeptide der Formel Boc-Gly-Gly-Gly-AIa-GIy-OMe und Boc-Leu-Gly-Gly-Ala-Gly-OMe, werden hier als R -Gly-Gly-Ala-Gly-OMe bezeichnet, worin R für Boc, Boc-Gly bzw. Boc-Leu, steht.

Die letzteren Verbindungen der Formel R -Gly-Gly-Ala-Gly-OMe, worin Έ? wie zuvor definiert ist, werden durch Reaktion mit einem Überschuß (20 bis 50 molare Äquivalente) Hydrazinhydrat leicht in die entsprechenden Hydrazide überführt. Zu bevorzugten Bedingungen gehört die Behandlung der letzteren Ester mit 40 bis 50 molaren Äquivalenten Hydrazinhydrat bei O⁰C bis 30°C während ungefähr 2 Std. bis ungefähr 1 Tag in einem inerten organischen Lösungsmittel, beispielsweise Methanol, n-Butanol oder Dimethylformamid. Entfernung des Lösungsmittels und des überschüssigen Hydrazinhydrats ergibt das entsprechende aminogeschützte Peptidhydrazid der Formel IX

R⁵-GIy-GIy-AIa-GIy-NHNH₂ (IX)

worin Έ? für Boc, Boc-Gly oder Boc-Leu steht.

Das zuvor erwähnte Peptid der Formel ΪΧ und ein Pentapeptid der Formel

H-Cys(Trt)-Lys(Boc)-Asn-Phe-Phe-OMe

(von H.U. Immer et al., loc.cit. beschrieben) werden nach der

- 19 -

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Azidkupplungsmethode gekuppelt, um das Peptid der Formel

R^-GIy-Gly-Ala-Gly-Cys(Trt)-Lys(Boc)-Asn-Phe-Phe-OMe zu erhalten.

Zu einer bequemen und wirksamen Arbeitsweise bei dieser Stufe gehört das Auflösen des Peptids der Formel IX in einem inerten organischen Lösungsmittel, vorzugsweise Dimethylformamid, oder einer Mischung von Dimethylformamid und Dimethylsulfoxyd. Man gibt zur letzteren Lösung bei -20⁰C bis -10⁰G» vorzugsweise bei ungefähr -15⁰C, eine Lösung von ungefähr 2 bis 5 molaren Äquivalenten, vorzugsweise 3 molaren Äquivalenten, einer Lösung einer starken Mineralsäure in einem organischen Lösungsmittel, vorzugsweise Chlorwasserstoff in Äthylacetat, und man gibt zur gerührten Lösung ein organisches Nitrit, vorzugsweise tert.-Butylnitrit (1,0 bis 1,5 molare Äquivalente, vorzugsweise 1,2 Äquivalente) zu. Nach ungefähr 15 Min. bei -20⁰C bis O⁰C wird die Mischung mit einem Überschuß einer organischen Base, vorzugsweise N-Äthyldiisopropylamin, alkalisch gemacht, vorzugsweise auf einen pH von ungefähr 7,0 bis 7t5> und anschließend wird im wesentlichen 1 Äquivalent des eben erwähnten Pentapeptids zugegeben. Man kann eine weitere Sugabe der organischen Base, vorzugsweise N-Äthylmorpholin, vornehmen, um die Mischung leicht alkalisch zu halten. Dann wird die Reaktionsmischung 1 bis 2 Std. bei -1O⁰C bis O⁰C und dann 20 bis 30 Std. bei 20⁰C bis 3O⁰C gerührt. Eindampfen des Lösungsmittels, Aufnehmen des Rückstands in einem organischen Lösungsmittel, vorzugsweise Methanol, Zugabe eines Lösungsmittels $ in dem eine Ausfällung erfolgt, vorzugsweise Wasser oder Diäthyläther, und Sammeln des Niederschlags ergibt das zuvor erwähnte Peptid der Formel

■ R^-Gly-GIy-Ala-Gly-Ci/s^rti-LvsCBocJ-Asn-Phe-Phe-OMe.

- 20 S 0 9 8 5 1 / 1 1 1 7

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Kurz gesagt ι wird das o'cige betreffende! in der obigen Veröffentlichung beschriebene Pentapeptidfragment leicht erhalten, indem man einen aktivierten Ester von Boc-Phe-QH mit H-Phe-OKe umsetzt, uc Ξθΰ-Phe-Piie-GKe zu erhalten, das ϊΐ&:·1 der Entfernung der terminalen Schutzgruppe (Boc) unter mäSIg sauren Bedingungen das E-Phe-Phe-CMe ergibt. Die letztere Verbindung wiederum wird mit einem aktivierten Ester von Boc-Asn-OH umgesetzt, um c?.as Boc-Asn-Phe-Phe-OK? zu erhalten. AnBchiießende Entfernung der terminalen Amiaöschutzgruppe der letzteren Verbindung unter mäßig sau:? ^n Beäinguzigen ergibt das Tripeptid K-Asn-Phe-Phe-OMe,

Danach wird die letztere Verbindung verwendet, iüü das gewünschte Pentapeptidfragment zu ergeben, und zvmr durch Umsetzung des letzteren Tripeptide mit eines alrti. i"ri*en Is;:=!= von Z-Lys(Boc)-OH, um das 2-lys(Boc)-Asn-Phe-Phe-"0Me zu ^f3vhalten, Hydrieren der zuletzt genannten Verbindung in Gegenwart eines Edelmetallkatelysators, um das H-LjEV"oc)-Asn-?h3-Phe-OMe zu erhalten, Kondensation der zuletst genannten Verbindung mit einem aktivierten Ester von Trt-Cys'Trt^-OE vaa das Trt-Cys(Trt)-Lys(Boc)-Asn-Phe-Phe-OMe zn erhalten, und Entfernung der terminalen N-Schutzgruppe (ffrt) ei sr jsuletzt genannten Verbindung unter mildsauren Bedingung??., im das gewünschte Pentapeptid H-Cys(Trt)-Lys(Boc)-Asn-Phe-?he-OMs su erhalten.

Zurück zur Herstellung der Verbindungen der Ponael I und Ia* Der zuvor erwähnte Peptidester R -G-Iy-Giy-AIa-Gi;;-Cys(Trt)-Lys(Boc)-Asn-Phe-Phe-OMe» worin 'S? die vorstehende Definition besitzt, wird durch Reaktion mit einem Überschuß an Hydraainhydrat in das entsprechende Hydrazid überführt, und zwar auf dieselbe W<=>ise wie zuvor besciu-ieb ¹^j., um das Peptidhydrazid der Formel (IVa) R^-Gly-Gly-Ala-Gly-Cys(Trt)-Iys(Boc)-Asn-

5
Phe-Phe-NHNHp zu erhalten, worin R die vorstehende Definition besitzt, oder, alternativ geschrieben, als Peptid der Formel IV, worin R⁴ für Boc-Oly-Gly-Ala-Gly-NH, Boc-Gly-Gly-Gly-Ala-Gly-NH

- 21 -6 0 9 8 5 1/1117

oder Boc-Leu-Gly-Gly-Ala-Gly-NH, stelle.

In der nachfolgenden Stufe des erfindungsgemäßen Verfahrens wird die zuletzt genannte Verbindung der Formel IV und ein Peptid der Formel V

H-Irp-Lys (Boc) -!Ehr (Bu*) -Ehe-Tnr(Bu^x) -Ser(Bu*) -NHCH (E²) CH₂S-TrO

ρ
worin R für H oder COOH steht» nach der hier beschriebenen Azidkupplungsmethode gekuppelt» um das lineare Peptid der Formel Ha

R^-Gly-Gly-Ala-Gly-Cys(Trt)-Lys(Boc)-Asn-Phe-Phe-

Srp-Lys(Boc)-T-hr(Bii^t)-Phe-Thr(Bu")-3er(Bu^t)-MHCH(H")CH₂S-Trt

zu erhalten, worin iP die vorstehende Definition besitzt und

ο R" für H oder COOH steht» oder? alternativ geschrieben, als das lineare Peptid der Formel II, worin R^ für H oder COOH steht und R**" die Bedeutungen Boc-Gly-Gly-Ala-Gly-NH, 3oc-Gly-Gly-Gly-Ala-Gly-HH oder Boc-Leu-Gly-Gly-Ala-Gly-UH,

"besitzt-c

Zn einer günstigen und wirksamen Arbeitsweise für diese Stufe gehört das Auflösen dee Peptidhydrasids der formel IVa in Dimethylformamid. Zur letzteren Lösung gibt man bei -20⁰C bis -1O⁰Cs vorzugsweise bei ungefähr -15⁰C, eine lösung von ungefähr 2 bis 5 molares. Äquivalenten« vorzugsweise 3 molaren Äquivalenten? einer Lösung einer starten Mineralsäure in einem organischen Lösungsmittel₉ vorzugsweise Chlorwasserstoff in Athylacetat* zu, und gibt zu. der gerührten Lösung tert»-Butylnitrit (1,0 bis 1,5 molare Äquivalente» vorzugsweise 1,2 Äquivalente). Nach ungefähr 15 Min. bei -20⁰G bis 10⁰G wird eine Lösung von im wesentlichen einem Äquivalent des Peptids der Formel V und eine organische Base, vorzugsweise 3 bis 5 Äquivalente N-Äthyldiisopropylamin in Dimethylformamid₉ die auf

-' 22 609851/1117

ungefähr -15⁰C gekühlt ist, zugegeben.

Dann wird die Reaktionsmischung 1 bis 2 Std. bei -2O⁰C bis O⁰C und anschließend 15 bis 25 Std. bei 20 bis 30⁰C gerührt. Eindampfen des Lösungsmittels, Verreiben des Rückstands mit Wasser, Methanol oder einer Mischung aus Methanol und wäßriger Zitronensäure (2 bis 5 #) und Abtrennen des Feststoffs ergibt das zuvor erwähnte lineare Peptid der Formel Ha, das bei der nachfolgenden Stufe (vgl. unten) ohne weitere Reinigung verwendet werden kann.'

Kurz gesagt, wird das zuvor erwähnte Peptid der Formel V

H-Trp-Lys(Boc)-Thr(Bu⁺)-Phe-Thr(Bu⁺)-Ser(Bu⁺)-NHCH(R²)CH₂S-Trt

2
worin R für COOH steht» oder das alternativ als das Hepta-

peptid der Formel Va

H-Trp-Lys(Boc)-Thr(Bu⁺)-Phe-Thr(Bu⁺)-Ser(Bu⁺)-Cys(Trt)-OH,

geschrieben wird, und das von H.U. Immer et al.» loc.cit. und in der US-PS 3 917 578 beschrieben ist, leicht erhalten, indem man den O-tert.-Butylserinmethylester mit einem aktivierten Ester von Benzyloxycarbonyl-(0-tert.-butyl)-threonin umsetzt, um Z-Thr(Bu )-Ser(Bu )-OMe zu erhalten. Dann wird die terminale Aminoschutzgruppe (Z) von der letzteren Verbindung durch Hydrieren in Gegenwart eines Edelmetallkatalysators entfernt, um H-Thr(Bu )-Ser(Bu )-OMe zu erhalten.

Anschließend wird der letztere Methylester mit einem aktivierten Ester von Z-Phe-OH umgesetzt, um Z_TPhe-Thr(Bu )-Ser(Bu )-OMe zu erhalten, aus dem die terminale Aminoschutzgruppe (Z) anschließend durch Hydrierung in Gegenwart eines Edelmetallkatalysators entfernt wird, wobei man H-Phe-Thr(Bu )-Ser(Bu )-OMe erhält. Anschließend wird der letztere Tripeptidester mit einem aktivierten Ester von Z-Thr(Bu )-0H umgesetzt, um das Z-Thr(Bu^t)-Phe-Tlir(Bu^t)-Phe-Thr(Bu"^fc)-Ser(Bu^t)-OMe zu erhalten.

- 23 603851/1117

Wiederum wird die terminale Aminoschutzgruppe (Z) der zuletzt genannten Verbindung durch Hydrierung in Gegenwart eines Edelmetallkatalysators entfernt, um das H-Thr(Bu )-Phe-Thr(Bu )-Ser(Bu )-0Me zu erhalten. Die letztere Verbindung wird mit einem aktivierten Ester von Z-Lys(Boc)-OH umgesetzt, um das Z-Lys(Boc)-Thr(Bu^t)-Phe-Thr(Bu^t)-Ser(Bu^t)-OMe zu erhalten, gefolgt von der Entfernung der terminalen Aminoschutzgruppe (Z) der zuletzt genannten Verbindung durch Hydrierung in Gegenwart eines Edelmetallkatalysators, um das H-Iys(Boc)-Thr(Bu^t)-Phe-Thr(Bu^t)-Ser(Bu^t)-OMe zu erhalten. Die letztere Verbindung wird nun mit einem aktivierten Ester von Ddz-Trp-OH umgesetzt, um Ddz-Trp-Lys(Boc)-Thr(Bu )-Phe-Thr(Bu^t)-Ser(Bu'^fc)-OMe zu erhalten, das wiederun mit Hydrazinhydrat umgesetzt wird, wodurch das entsprechende Hexapeptidhydrazid, Ddz-Trp-LysiBoO-ThriBu^-Phe-IhrtBu^-Ser (Bu¹¹) -NHNH₂, isoliert wird. Dieses Hexapeptid wird nun nach der Azidkupplungsmethode mit H-Cys(Trt)-OH gekuppelt, um das entsprechende Heptapeptid, Ddz-Trp-Lys(Boc)-Ihr(Bu )-Phe-Thr(Bu )-Ser(Bu )-Cys(Trt)-0H, zu ergeben. Behandlung der letzteren Verbindung unter mildsauren Bedingungen liefert das gewünschte Heptapeptid der Formel Va oder das Peptid der Formel V, worin R für COOH steht.

7-rz gesagt, wird das zuvor erwähnte Peptid der Formel V, worin R² für H steht, und das in der US-PS 3 917 581 beschrieben ist, leicht erhalten, indem man das zuvor beschriebene Hexapeptidhydrazid der Formel

D.dz-Trp-Lys(Boc)-Thr(Bu⁺)-Phe-Thr(Bu⁺)-Ser(Bu⁺)-NHNH

nach der zuvor beschriebenen Azidkupplungsmethode mit 2-Tritylthioäthylamin kuppelt, um das entsprechende Hexapeptid der Formel

Ddz-Trp-Iys(Boc)-Thr(Bu^t)-Phe-Thr(Bu^t)-Ser(Bu^t)-NHCH_i,CH₉S-Trt

- 24-609851/1117

zu erhalten. Wenn die letztere Verbindung unter mildsauren

Bedingungen umgesetzt wird, erhält man das Peptid der Formel V»

worin R für H steht» in Form des Ameisensäureadditionssalzes,

das gewünschtenfalls in die Form der freien Base überführt wird.

Alternativ wird das zuvor beschriebene lineare Peptid der Formel Ua leicht auf die folgende Weise hergestellt:

Der zuvor beschriebene geschützte niedrige Alkylester des Pentapeptids der Formel

Trt-Cys(Trt)-Lys(Boc)-Asn-Phe-Phe-OMe

wird durch Reaktion mit einem Überschuß an Hydrazinhydrat leicht in das entsprechende Hydrazid überführt. Zu bevorzugten Bedingungen gehören Behandlung des letzteren Esters in einem inerten Lösungsmittel» beispielsweise Methanol, Butanol oder Dimethylformamid, mit 20 bis 40 molaren Äquivalenten Hydrazinhydrat 1 bis 2 Tage lang bei O⁰C bis 30⁰C. Entfernung des Lösungsmittels und Kristallisation ergibt das entsprechende Pentapeptidhydrazid der Formel VI

Trt-Cys(Trt)-Lys(Boc)-Asn-Phe-Phe-NHNH₂·

Die zuletzt genannte Verbindung und das Peptid der Formel V»

2
worin R für H oder COOH steht, werden nach der Azidkupplungsmethode auf dieselbe Weise wie zuvor beschrieben, gekuppelt, um das entsprechende Peptid der Formel VII

Trt-Cys(Trt)-Lys(Boc)-Asn-Phe-Phe-Trp-Lys(Boc)-Thr(Bu⁺)-Phe-Thr(Bu⁺)-Ser(Bu⁺)-NHCH(R²)CH2S-Trt

- 25· -

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2
worin R für H oder COOH steht, zu erhalten, gefolgt von Entfernung der terminalen N-Schutζgruppe (Trt) der zuletzt genannten Verbindung der Formel VII. um das entsprechende Peptid der Formel VIII

H-Cys(Trt)-Lys(Boc)-Asn-Phe-Phe-Trp-Lys(Boc)-Thr(Bu )-Ser(Bu⁺)-NHCH(R²)CH₂S-Trt

worin R für H oder COOH steht, zu erhalten. Die Entfernung dieser Schutzgruppe (Trt) wird leicht unter mildsauren Bedingungen erzielt. Zu bevorzugten Bedingungen gehören das Auflösen des Peptide der Formel VII in einer Mischung aua 5-bis 15 zeiger Ameisensäure in 60- bis 80#iger Essigsäure und Stehenlassen der Lösung während 3 bis 10 Std. bei 20⁰C bis 30⁰C. Konzentrieren der lösung liefert das Peptid der Formel VIII, worin R für H oder COOH steht, in Form seines ' Ameisensäureadditionssalzes, das gewünschtenfalls in die Form der freien Base überführt wird.

Die zuletzt genannte Verbindung der Formel VIII und ein Peptidhydrazid der Formel IX, worin Ή? die vorstehenden Bedeutungen besitzt, werden nach der Azidkupplungsmethode auf dieselbe Weise wie zuvor beschrieben, gekuppelt, um das entsprechende lineare Peptid der Formel Ha oder der Formel II, worin E für H oder COOH steht und R^ die Bedeutungen Boc-Gly-Gly-Ala-Gly-NH-, Boc-Gly-Gly-Gly-Ala-Gly-NH oder Boc-Leu-Gly-Gly-Ala-Gly-NH- besitzt, zu erhalten.

Die Umwandlung des zuletzt genannten linearen Peptids der Formel II, das durch eines der oben beschriebenen Verfahren erhalten wurde, in die entsprechende Verbindung der Formel I wird bequem und wirksam erreicht, indem man zuerst das lineare Peptid der Formel II der Wirkung von Jod, vorzugsweise in Gegenwart eines niedrigen Alkanols oder Essigsäure, unterwirft, wobei eine gleichzeitige Entfernung der Sulfhydrylschutz-

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gruppen» d.h. Trt, und die Bildung der Dieulfidbrücke erfolgt, wobei man das entsprechende cyclische Disulfidderivat der Formel III

-Lys (Boc )-Asn-Phe-Phe-Trp-Lys( Boc )-Thr( Bu⁺)-

Phe-Thr(Bu⁺)-Ser(Bu⁺)-NHCH(R²)CH₂S

(in)

erhält, worin R² für H oder COOH steht und R^4- die Bedeutungen Boc-Gly-Gly-Ala-Gly-NH, Boc-Gly-Gly-Gly-Ala-Gly-NH oder Boc-Leu-Gly-Gly-Ala-Gly-NH, besitzt. Die letztere Verbindung der Formel III, worin R für COOH steht und R^" die Bedeutungen Boc-Gly-Gly-Ala-Gly-NH, Boc-Gly-Gly-Gly-Ala-Gly-NH oder Boc-Leu-Gly-Gly-Ala-Gly-NH besitzt, kann alternativ als Formel IHa

r⁵_q ly-Qiy-Ai _a_(3 Iy-Cy s-Ly s (Boc) -Asn-Phe-Phe-Trp-Lys (Boc) Thr(Bu⁺)-Phe-Thr(Bu⁺)-Ser(Bu⁺)-Cys-OH . .

geschrieben werden, worin R^ die vorstehende Definition besitzt.

Die anschließende Behandlung der Verbindung der Formel III, worin R² für H oder COOH steht und R⁴ die Bedeutungen Boc-Gly-Gly-Ala-Gly-NH, Boc-Gly-Gly-Gly-Ala-Gly-NH oder Boc-Leu-Gly-Gly-Ala-Gly-NH besitzt, unter mäßig sauren Bedingungen führt zur Entfernung der verbleibenden Schutzgruppen (d.h. Boc und Bu ), wobei man die entsprechende Verbindung der Formel I erhält, worin R¹ für H-Gly-Gly-Ala-Gly-NH, H-Gly-Gly-Gly-Ala-Gly-NH oder H-Leu-Gly-Gly-Ala-Gly-NH steht und R die Bedeutungen H oder COOH besitzt.

Bei einer bevorzugten Ausführungsform der obigen Umwandlung

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wird das lineare Peptid der Formal Ha in Essigsäure oder Methanol, Äthanol oder einem anderen geeigneten niedrigen Alkenol, beispielsweise Propanol, Isopropanol oder Butanol gelöst und die Lösung wird zu einem Überschuß Jod (5 bis 25» vorzugsweise 10 molare Äquivalente), das in einem der obigen Lösungsmittel gelöst ist, vorzugsweise zu 2 bis 5 $> Jod in Methanol, zugegeben. Zeit und Temperatur dieser Reaktion sind nicht kritisch, jedoch ist es wünschenswert, die Reaktion durch Regulierung der Zugabe der Jodlösung oder durch Kühlung der Reaktionsmischung oder durch eine Kombination von beiden Maßnahmen zwischen 0 und 3O⁰C zu halten. Unter diesen Bedingungen erfordert die Zugabe üblicherweise 30 bis 60 Minuten. Nach der Zugabe wird die Mischung 30 bis 120 Minuten, vorzugsweise 60 Minuten, bei 20 bis 30⁰C gerührt. Danach kühlt man die Mischung auf ungefähr O⁰C und gibt einen Überschuß eines milden Reduktionsmittels» vorzugsweise Natriumthiosulfat in wäßriger Lösung, zu. Die Mischung wird konzentriert und der Rückstand wird in Wasser suspendiert. Sammeln des festen Materials liefert das gewünschte cyclische Disulfidderivat der Formel IHa, worin die Schutzgruppen Boc und Bu noch immer vorhanden sind.

Alternativ kann das lineare Peptid der Formel Ha nach der Methode von R.G-. Hiskey und R.L. Smith, J* Amer.Chem.Soc.♦ ftO, 2677 (1968), unter Verwendung von Thiocyanogen in das zuvor erwähnte entsprechende cyclische Disulfidderivat der Formel IHa überführt werden.

Wiederum alternativ wird das cyclische Disulfidderivat der Formel IHa auch erhalten, indem man im obigen linearen Peptid der Formel Ha die Sulfhydrylschutzgruppen selektiv entfernt und zwar durch Einwirkung eines Quecksilber-H- oder Silbersalzes, beispielsweise einem Nitrat, in einem inerten organischen Lösungsmittel, beispielsweise Dimethyl-' formamid oder Essigsäure, gemäß bekannten Methoden; vgl. beispielsweise B* Kamber und W, Rittel* Helv.Chem.Acta, £2_» 1079

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(1964). L. Zervas, et al., J. Amer.Chem. Soc. 87, 4922 (1965) und R.G. Denkewalter et al., J. Amer.Chem.Soc., 9_1» 502 (1969).

Dann wird das entsprechende Quecksilber-II- oder Disilbersalz durch Behandlung mit Schwefelwasserstoff in das entsprechende freie Disulfhydrylderivat überführt; vgl. L. Zervas et al., loc.cit. Das letztere Derivat wird dann durch ein mildes Oxidationsmittel, ausgewählt unter Jod, gemäß der zuvor beschriebenen Methode, Sauerstoff, gemäß der Methode von J. Rivier, et. al., C.R.Acad. Sei. Ser. D, 276, 2737 (1973), 1,2-Dijodäthan, gemäß der Methode von 3?. Weygand und G.Zumach, Z. Naturforsch. 17b, 807 (1962) und Natrium- oder Kaliumhexacyanoferrat-III, gemäß der Methode von D. Jarvis et al., J. Amer.Chem.Soc., 8_3, 4780 (1961), in das zuvor erwähnte cyclische Disulfidderivat der Formel IHa überführt.

Schließlich wird das zuvor erwähnte cyclische Disulfidderivat der Formel IHa in das entsprechende Peptid der Formel I überführt, indem man die erstere Verbindung mäßig sauren Bedingungen unterwirft, wodurch die verbleibenden Schutzgruppen des cyclischen Disulfidderivats entfernt werden. Im allgemeinen wird diese Stufe ausgeführt, indem man das cyclische Disulfidderivat in einem wäßrigen Reaktionsmedium, das eine organische Säure enthält, bei 0 bis 20⁰C während 10 bis ungefähr 60 Min. zur lösung bringt. Zu Beispielen für derartige Medien gehören Trifluoressigsäure, 10- bis 20$ige wäßrige Schwefelsäure, 10^ige Phosphorsäure, 10- bis 30%ige Bromwasserstoffsäure und 10- bis 36$ige Chlorwasserstoffsäure. Ein äußerst brauchbares Medium ist konzentrierte Chlorwasserstoffsäure. Zu bevorzugten Bedingungen für die vorliegende Stufe gehören das Auflösen des cyclischen Disulfids in einem Minimum an konzentrierter Chlorwasserstoffsäure, die auf O⁰C gekühlt wurde und Rühren der Mischung 5 bis 10 Min. lang unter einer Stickstoffatmosphäre bei O⁰C. Danach gibt man Eisessig (10fach.es Volumen) zu und kühlt die Lösung auf ungefähr -70⁰C und lyophilisiert dann, um das cyclische Peptid der Formel I

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zu erhalten. Das letztere Produkt wird durch Ionenaustauscherchromatographie» vorzugsweise unter Verwendung eines Carboxymethylcellulose-Kationenaustauschers und Ammoniumacetat als Eluiermittel, weiter gereinigt, In diesem Falle erhält man das Produkt in Form seines Säureadditionssalzes mit Essigsäure. Alternativ wird das Produkt durch Verteilungschromatographie auf einem chemisch modifizierten, vernetzten Dextran, beispielsweise Sephadex LH-20 oder Sephadex G-25 unter Verwendung von Methanol bzw. Essigsäure als eluierendes Lösungsmittel, gereinigt. In dem Falle, in dem man Sephadex LH-20 einsetzt und Methanol als eluierendes Lösungsmittel verwendet» wird das Produkt in Form seines Chlorwasserstoff säureadditionssalzes erhalten. In dem Falle, in dem man Sephadex 6-25 einsetzt und Essigsäure verwendet, erhält man das Produkt in Form seines Essigsäureadditionssalzes. Wiederholte lyophilisierung des Produkts in Form seines Essigsäureadditionssalzes aus Wasser liefert im wesentlichen reines Peptid der Formel I, worin R für H-Gly-Gly-Ala-Gly-NH, H-Gly-Gly-Gly-Ala-Gly-NH oder H-Leu-Gly-Gly-Ala-Gly-NH steht und R die Bedeutungen H oder COOH besitzt, in Form der freien Base.

Das lineare reduzierte Peptid der Formel Ia, in der R für H-Gly-Gly-Ala-Gly-NH, H-Gly-Gly-Gly-Ala-Gly-NH oder H-Leu-Gly-Gly-Ala-Gly-NH steht und R² die Bedeutungen H oder COOH besitzt, wird vorzugsweise durch Entfernung der Schutzgruppen aus dem zuvor erwähnten linearen Peptid der Formel II, worin R² für H oder COOH steht und R⁴" die Bedeutungen Boc-Gly-Gly-Ala-Gly-NH, Boc-Gly-Gly-Gly-Ala-Gly-HH oder Boc-Leu-Gly-Gly-Ala-Gly-NH besitzt, erhalten. Günstige Bedingungen für diese Entschützungsstufe umfassen das Auflösen des linearen Peptids der Formel II in konzentrierter Chlorwasserstoffsäure bei ungefähr O⁰C bis 5⁰C in einer inerten Atmosphäre, beispielsweise Stickstoff oder Argon. Die Mischung wird 5 bis 10 Min. bei dieser Temperatur gehal~ ten. Anschließende Isolierung des linearen reduzierten Pep-

- 30 609851 /1117

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tids der Formel Ia wird auf dieselbe Weise wie zuvor für die Isolierung des Peptids der Formel I beschrieben, durchgeführt .

Das oben beschriebene lineare reduzierte Peptid der Formel Ia wird auch direkt durch Reduktion des entsprechenden Peptids der Formel I erhalten. Die Reduktion mit Dithioaerythrit nach der Methode von W.W. Cleland, Biochem. 2» 480 (1964) ist bevorzugt, obgleich auch andere Mittel, von denen bekannt ist, daß sie zur Reduktion cyclischer Eisulfide in das entsprechende Disulfhydrylderivat wirksam sind, beispielsweise Natriumbisulfit, gefolgt von Hydrolyse des intermediären Dithiosulfatderivats, brauchbar sind.

(b) Verbindungen der Formel I und Ia, worin R für H oder NHR steht, worin R* wie zuvor definiert ist und R die Bedeutung H besitzt

Das entsprechende Peptidhydrazid der Formel IV Trt-SCH₂CH(R⁴)C0-Lys(Boc)-Asn-Phe-Phe-NHNH2

worin R^ für NHEr steht, worin R⁵ die vorstehende Definition besitzt, oder das alternativ durch die Formel IVb

R³-Cys(Trt)-Lys(Bcx:)-Asn-Phe-Phe-NHNH₂ •x

worin R die vorstehende Definition besitzt» bezeichnet wird» wird durch Acylierung des Pentapeptids der Formel

H-Cys(Trt)-Lys(Boc)-Asn-Phe-Phe-OMe

hergestellt, wobei man daß Pentapeptld der Formel R -Cys(Trt)-Lys(Boc)-Asn-Phe-Phe-OMe erhält, das einer Hydrazinolyse unterworfen wird» um das Pentapeptidhydrazid der Formel IV zu

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4 3

erhalten, worin R die Bedeutung NHR besitzt.

Bei einer bevorzugten Ausführungsform der Herstellung des obigen Pentapeptidhydrazids IVb v/ird eine Mischung von im wesentlichen äquimolaren Mengen einer organischen Base, vorzugsweise N-Äthylmorpholin und das Pentapeptid der Formel

H-Cys(Trt)-Lys(Boc)-Asn-Phe-Phe-OMe,

das wie von H.U. Immer et al., loc.cit. beschrieben, hergestellt wird» in einem inerten organischen Lösungsmittel, vorzugsweise Dimethylformamid oder Tetrahydrofuran bei ungefähr O⁰C bis 10⁰C mit einem Überschuß, vorzugsweise 1,1 bis 2 molaren Äquivalenten, des gewünschten p-Nitrophenylacylats oder -benzoats, beispielsweise p-Nitrophenylacetat, hergestellt wie von F.D. Chattaway, J. Chem. Soc, 2495 (1931) beschrieben, behandelt. Man hält die Mischung ungefähr 15 bis 30 Std. bei 0 bis 10⁰C und dampft dann ein. Den Rückstand nimmt man in einem polaren organischen Lösungsmittel, vorzugsweise Methanol, auf und gibt langsam ein nicht-polares organisches Lösungsmittel, vorzugsweise Diäthyläther, zu. Man sammelt den Rückstand und kristallisiert, um das entsprechende acylierte oder benzoylierte Pentapeptid» beispielsweise das Pentapeptid der Formel

R³-Cys(Trt)-Lys(Boc)-Asn-Phe-Phe-0Me

worin R die vorstehende Definition besitzt» zu erhalten. Diese letztgenannte Verbindung wird in einem inerten organischen Lösungsmittel, beispielsweise Methanol, Äthanol, Dimethylformamid, und dergleichen, vorzugsweise Methanol, gelöst. Man behandelt die Lösung mit einem Überschuß an Hydrazinhydratf beispielsweise 15 bis 30 molaren Äquivalenten. Die Reaktionsmischung wird ungefähr 40 bis 60 Std. bei ungefähr O⁰C bis 10⁰C gehalten. Man sammelt den Niederschlag und trocknet, wobei man das Pentapeptidhydrazid der Formel IV,

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worin R für NHR steht, worin R die vorstehende Definition besitzt, oder der Formel ITb, worin R die vorstehende Definition besitzt, erhält.

Bei einer weiteren Ausführungsform der Erfindung wird das entsprechende Peptidhydrazid, nämlich das Tetrapeptid der Formel IV

Trt-S-CH₂CH(R⁴)CO-Lys(Boc)-Asn-Phe-Phe-NHH^,

worin R für Wasserstoff steht, hergestellt, indem man einen aktivierten Ester der 3-Tritylthiopropionsäure mit einem Tetrapeptid der Formel

H-Lys(Boc)-Asn-Phe-Phe-OMe umsetzt, um das Tetrapeptid der Formel

Trt-SCHgCHgCO-Lys(Boc)-Asn-Phe-Phe-OMe

zu erhalten, das einer Hydrazinolyse unterworfen wird, um das genannte Tetrapeptidhydrazid
serstoff steht, zu erhalten.

genannte Tetrapeptidhydrazid der Formel IV, worin Ή7 für Was-

Bei einer bevorzugten Ausführungsform zur Herstellung des obigen Tetrapeptidhydrazids wird der aktivierte Ester von 3-Tritylthiopropionsäure, vorzugsweise der Pentachlorphenylester, hergestellt, indem man im wesentlichen äquimolare Mengen an 3-Tritylthiopropionsäure, Pentachlorphenol und Dicyclohexylcarbodiimid in einem inerten organischen Lösungsmittel, vorzugsweise Tetrahydrofuran, bei ungefähr O⁰C bis 10⁰C, zusammengibt. Die Mischung wird ungefähr 1 Std. bei 0 bis 10⁰C und anschließend ungefähr 1 Std. bei ungefähr bis 30⁰C gerührt. Man kühlt die Mischung auf ungefähr O⁰C, filtriert und dampft das Filtrat ein. Den Rückstand kristal-

- 33.-609851/1117

lisiert man, wobei man den 3-Tritylthiopropionsäurepentachlorphenylester erhält. Eine Lösung der zuletztgenannten Verbindung und eine im wesentlichen äquimolare Menge des Tetrapeptide der Formel

H-Iys(Boc)-Asn-Phe-Phe-OMe-Acetat

das zuvor bei Punkt (a) beschrieben wurde* in einem inerten organischen Lösungsmittel, vorzugsweise Dimethylformamid oder Tetrahydrofuran, wird mit einer im wesentlichen äquimolaren Menge einer organischen Base, vorzugsweise Triäthylamin, bei ungefähr 20 bis 30⁰C, behandelt. Man rührt die Mischung 2 bis 3 Tage bei ungefähr 20 bis 30⁰C und dampft das Lösungsmittel unter vermindertem Druck ein. Den Rückstand verreibt man mit kalter verdünnter wäßriger Zitronensäure und Wasser, trocknet und kristallisiert, wobei man das Tetrapeptid der . Formel

TTt-SCH₂CH₂CO-LyS(Boc)-Asn-Phe-Phe-OMe

erhält. Die zuletzt genannte Verbindung wird in einem inerten organischen Lösungsmittel, beispielsweise Methanol, Äthanol oder vorzugsweise Dimethylformamid, gelöst. Man behandelt die Lösung mit einem Überschuß an Hydrazinhydrat, beispielsweise 15 bis 30 molaren Äquivalenten. Die Reaktionsmischung wird ungefähr 20 bis 30 Std. bei ungefähr 20 bis 30⁰C gehalten und unter vermindertem Druck eingedampft. Den Rückstand verreibt man mit kaltem Wasser und trocknet, wobei man das Tetrapeptidhydrazid der Formel IV, worin R für H steht, erhält.

Bei der nächsten Stufe des erfindungsgemaßen Verfahrens wird das obige erste Peptidhydrazid der Formel IV, worin R für H oder NHR steht, und das zweite Peptid der Formel V

H-Trp-Lys(Boc)-Thr(Bu*)-Phe-Thr(Bu*)-Ser(Bu*)-NHCH₂CH(R²)S-Trt

- 34 609851/1117

M/17 130 35

worin R für H steht, und das zuvor "bei Punkt (a) beschrieben wurde, gemäß der hier beschriebenen Azxdkupplungsmethode gekuppelt, wobei man das entsprechende lineare Peptid der Formel II, worin R für H steht und R die Bedeutungen H oder KHR⁵ besitzt, erhält.

Die Überführung des zuletztgenannten linearen Peptids der Formel II in die entsprechende Verbindung der Formel I wird bequem und wirksam erzielt, indem man zuerst das zuletzt erwähnte lineare Peptid der Formel II der Wirkung von Jod, vorzugsweise in Gegenwart von Methanol (wie zuvor für die Herstellung des cyclischen Disulfidderivats der formel III inter Punkt (a) beschrieben) unterwirft, wodurch die SuIfhydrylschutzgruppe, d.h. Trt, entfernt und die Disulfidbrücke gebildet wird, und wobei man das entsprechende cycli-

sehe Disulfidderivat der Formel III erhält, worin R für H

A -λ -τ.

steht und R die Bedeutungen H oder NHR besitzt, wobei R·^ die vorstehende Definition besitzt. letztere Verbindung der Formel III, wor:
der Formel IHb

Formel III, worin R für NHR steht, kann alternativ in Form

R³-Cvs-Lys(Boc)-Asn-Phe-Phe-Trp-Thr(Bu )-Phe-

ThP(Bu⁺)-Se r (Bu⁺)-NH-CH (R²) CH₂S

2 "5

geschrieben werden, worin R für H steht und R die vorstehende Definition besitzt.

Anschließende Behandlung der letzteren Verbindung der Formel III, worin R für H steht und R^" die Bedeutungen H oder NHR besitzt unter mäßig sauren Bedingungen, vorzugsweise mit konzentrierter Chlorwasserstoffsäure, die auf ungefähr O⁰C gekühlt wurde (wie zuvor bei der Herstellung des cyclischen Peptids der Formel I unter Punkt (a) beschrieben) führt

-.35 609851/1117

zur Entfernung der verbleibenden Schutzgruppen (d.h. Boc und Bu ), wobei man das entsnrechende Perctid der Eormel I

1 "3 ■*

erhält» worin R für H oder NHR steht» worin R-' die vor-

2
stehende Definition besitzt -und R für H steht, in Form der

freien Base oder des Säureadditionssalzes.

Das lineare reduzierte Peptid der Formel Ia, worin R für H

■2 ρ

oder NHR steht, und R die Bedeutung H besitzt» wird vorzugsweise durch Entfernung der Schutzgruppen von dem zuvor

2 erwähnten linearen Peptid der Eormel II, worin R für H steht und R die Bedeutungen H oder NHR besitzt, erhalten.

Günstige Bedingungen für diese Entschützungsstufe stellen das Auflösen der zuletzt genannten Verbindung in konzentrierter Chlorwasserstoffsäure auf die zuvor zur Herstellung des linearen reduzierten Peptids der Formel Ia unter Punkt (a) beschriebene Weise dar. Alternativ wird die lineare reduzierte Form durch direkte Reduktion des obigen Peptids der Formel I, worin

1 "3 2

R für H oder NHR steht und R die Bedeutung H besitzt,

auf die unter Punkt (a) beschriebene Weise erhalten.

(c) Verbindungen der Eormel I und Ia, worin R für

Boc-Ala-Gly-NH steht und R² die Bedeutung COOAIk besitzt

Das entsprechende erste Peptidhydrazid der Eormel IV, worin R für Boc-Ala-Gly-NH steht, oder das alternativ als ein Heptapeptid der Eormel IVc

Boc-Ala-Gly-Cys(Trt)-Lys(Boc)-Asn-Phe-Phe-NHNH₂ (IVc)

H₂

geschrieben wird, ist von H.U. Immer et al., loc.cit.» vollständig beschrieben.

2 Das zweite entsprechende Peptid der Eormel V, worin R die Bedeutung COOAIk besitzt, und das alternativ als ein Hepta-

- 36 609851/1117

peptidester der Formel Vb

H-Trp-Lys(Boc)-Thr(Bu⁺)-Phe-Thr(Bu⁺)-Ser(Bu^f)-Cys(Trt)-COOA!k

(Vb)

geschrieben wird» wird auf die folgende Weise leicht hergestellt.

Man setzt das Heptapeptid der Formel Ddz-Trp-Iys(Boc)-Thr(Bu^t)-Hie-Thr(Bu^t)-Ser(Bu^t)-Cys(!rrt)-OH

(zuvor unter Punkt (a) beschrieben) in Lösung in einem inerten Lösungsmittel mit einem Diazoalkan der Formel

(Alk minus H)N₂

in Lösung in einem inerten Lösungsmittel bei Temperaturen von 0 bis 20⁰C während Zeiträumen von 1 bis 48 Stunden um; Eindampfen der Lösungsmittel und des überschüssigen Diazoalkans, Entfernen der Schutzgruppe Ddz und Reinigung ergibt den entsprechenden Heptapeptidester der Formel Vb. Diazoalkane, die für diesen Zweck brauchbar sind» sind beispielsweise Diazomethan, Diazoäthan (von Pechmann, Ber.Deutsch, Ohem.Ges. 21» 2640 (1898)), 1-Diazopropan (Niedlinger et al., Am. Chem. J. 4_3» 378 (1910)), 2-Diazopropan (Staudinger et al.» Ber. Deutsch. Chem. Ges. 4_9, 1905 (1916)), 1-Diazobutan (Niedlinger et al., loc.cit., Seite 380), 1-Diazoisobutan (Adamson et al., J. Chem. Soc. 1935» 286), 4-Diazo-2-methylbutan (Werner, J. Chem.Soc. 115, 1101 (1919))» 1-Diazopentan, 1-Diazohexan, 1-Diazoheptan oder 1-Diazooctan, wobei die letzten vier Diazoalkane, wie von Adamson et al.» loc.cit. beschrieben, hergestellt werden. Bevorzugte inerte Lösungsmittel sind Alkanole, wie Methanol und A'ther» wie Diäthyl-

äther.

- 37 -

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Alternativ und insbesondere wenn es gewünscht ist, das Peptid der Formeln I oder Ia zu* erhalten, worin R für H-Ala-Gly-NH- steht und R² die Bedeutung COOAIk "besitzt, worin die Alkylgruppe (Alk) 9 bis 14 Kohlenstoffatome enthält, wird Cystein mit einem molaren "Überschuß des entsprechenden Alkanols, AIkOH, worin Alk die vorstehende Definition "besitzt, in Gegenwart von Chlorwasserstoff "bei 25 "bis 12C⁰C vorzugsweise bei 100⁰C bis 120⁰C, 1 bis 5 Stunden umgesetzt, wobei man das entsprechende Cysteinalkylester-hydrochlorid erhält. Die zuletzt genannte Verbindung wird dann mit angenähert einem molaren Äquivalent Triphenylcarbinol in Gegenwart von 0,1 bis 1,0 molaren Äquivalenten Bortrifluoridätherat bei 10 bis 30⁰C währnd 0,5 bis 3 Std., vorzugsweise mit 0,1 molaren Äquivalenten bei 25⁰C während 1 Std. behandelt, wobei man den entsprechenden Alkylester, H-Cys(Trt)OAlk, erhält.

Der zuletzt genannte Alkylester eines geschützten Cysteins wird dann mit Hilfe der Azidmethode mit'dem geschützten Hexapeptidhydrazid der Formel

Ddz-Trp-Lys(Boc)-ThT(Bu*)-Phe-Thr(Bu*)-Ser(Bu*)-

das zuvor bei Punkt (a) beschrieben wurde, gekuppelt, wobei man nach der Entfernung der Schutzgruppe Ddz unter mildsauren Bedingungen den gewünschten zweiten Heptapeptidester der Formel Vb erhält. Zu bevorzugten Bedingungen für die obige Reaktionssequenz gehören die Verwendung im wesentlichen äquimolarer Anteile des geschützten Hexapeptidhydrazids und an tert.-Butylnitrit in Gegenwart einer Mineralsäure, vorzugsweise 2 bis 3 molaren Äquivalenten Chlorwasserstoff, in einem inerten wasserfreien Lösungsmittel, vorzugsweise DMF, gefolgt von der Zugabe des entsprechenden Alkylesters der Formel

H-Cys(Trt)-OAlk - 38--

609851/1 1 17

M/17 130

mit 2 bis 3 molaren Äquivalenten einer organischen Base, vorzugsweise N-Athyldiisopropylaain» in einem inerten wasserfreien Lösungsmittelt vorzugsweise DMF, "bei -2O⁰G bis 25⁰C während 6 bis 12 Stunden, gefolgt von der Reinigung des erhaltenen geschützten Heptapeptidalkylesters der Formel

Ddz-Trp-Lys(Boc)-Ihr(Bu^t)-Phe-Thr(Bu*^SeriBu^-CysCTrt)-OAIk,

Die zuletzt genannte Verbindung wird dann mildsauren Bedingungen, vorzugsweise durch Rühren in einer Mischung von Essigsäure, Ameisensäure und Wasser (7:1:2) während 12 bis 18 Std. bei 20⁰C bis 25⁰C, unterworfen, wobei man den entsprechenden Heptapeptidalkylester der Formel Vb erhält.

Bei der nächsten Stufe des erfindungsgemäßen Verfahrens werden das erste Peptidhydrazid der Formel IVc und der zweite Heptapeptidester der Formel Vb nach der hier beschriebenen Azidkupplungsmethode gekuppelt, wobei man das entsprechende lineare Peptid der Formel II erhält, worin R für

ρ
Boc-Ala-G-ly-NH steht und R die Bedeutung COOAIk besitzt, oder das alternativ als das lineare Tetradecapeptid der Formel lic

Boc-AIa-GIy-Cys(Trt)-Lys(Boc)-Asn-Phe-Phe-Trp-Lys(Boc)-Thr(Bu⁺)-Phe-Thr(Bu⁺)-Ser(Bu⁺)-Cys(Trt)-OAIk

(lic)

geschrieben wird.

Die Überführung des vorstehenden linearen Tetrapeptide der Formel lic in die entsprechende Verbindung der Formel I, worin R¹ für H-Ala-Gly-NH steht und R² die Bedeutung COOAIk besitzt, wird bequem und wirksam durchgeführt, indem man zu-

- 39 -

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erst das zuletzt erwähnte lineare Tetradecapeptid der Wirkung von Jod» vorzugsweise in Gegenwart von Methanol (wie zuvor zur Herstellung des cyclischen Disulfidderivats der Formel III unter Punkt (a) beschrieben) unterwirft, was zur Entfernung der SuIfhydrylschutzgruppe, d.h. Trt» und zur Bildung der Msulfidbrücke führt» wobei man das entsprechende

2 cyclische Disulfidderivat der Formel III erhält» worin R

für COOAIk steht und R⁴" die Bedeutung Boc-Ala-Gly-lffi besitzt oder das alternativ als das cyclische Disulfidderivat der Eormel IHc

Boc-Ala-Gly-Cvs-Lys(Boc)-Asn-Phe-Phe-Trp-Lys(Boc)-Thr(Bu⁺)-Phe-

Thr(Bu⁺)-Ser(Bu⁺)-Cys-OAIk.

geschrieben wird.

Anschließende Behandlung der letzteren Verbindung unter mäßig sauren Bedingungen, vorzugsweise mit konzentrierter Chlorwasserstoffsäure, die auf ungefähr O⁰C gekühlt ist, (wie zuvor zur Herstellung des cyclischen Peptids der Formel I unter Punkt (a) beschrieben) führt zur Entfernung der verbleibenden Schutzgruppen (d.h. Boc und Bu ), und weitere Reinigung wie unter Punkt (a) beschrieben, ergibt

das Peptid der Formel I, worin R¹ für H-Ala-Gly-NH steht

2
und R die Bedeutung COOAIk besitzt, oder das alternativ

mit der Formel

H-AIa-Gly-Cys-Lys-Asn-Phe-Phe-Trp-Lys-Thr-Phe-Thr-Ser-Cys-OAIk

bezeichnet wird, in Form der freien Base oder eines Säureadditionssalzes davon.

- 40 -

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Das lineare reduzierte Peptid der Formel la» worin R für H-AIa-Gly-NH steht und R die Bedeutung COOAIk besitzt, wird vorzugsweise durch Entfernung der Schutzgruppen aus dem zuvor erwähnten linearen Tetradecapeptid der Formel lic erhalten. Zu günstigen Bedingungen für diese Entschützungsstufe gehören das Auflösen des linearen letradecapeptids der Formel lic in konzentrierter Chlorwasserstoffsäure auf die zur Herstellung des linearen reduzierten Peptide der Formel Ia unter Punkt (a) zuvor beschriebene Weise. Alternativ wird das lineare reduzierte Peptid der Formel Ia durch direkte Reduktion des obigen Peptids der Formel I» worin R für H-AIa-GIy-NH steht und R die Bedeutung COOAIk besitzt, auf die unter Punkt (a) beschriebene Weise erhalten.

Bei dem unter Punkt (c) beschriebenen obigen Verfahren kann die Schutzgruppe Bu für die Hydroxylgruppe des Serins und Threonine ohne schädliche Wirkungen weggelassen werden, d.h. Ser(Bu ) und Thr(Bu ) werden durch Ser bzw. Ihr ersetzt. Bezüglich des unter Punkt (c) genannten Verfahrens kann auch die Trt-Schutzgruppe der Cysteinaminosäurereste durch die Acm-Schutzgruppe ersetzt werden.

Die unter den obigen Punkten (a) bis (c) beschriebenen Arbeitsweisen sind durch die nachfolgenden Reaktionsdiagramme dargestellt:

- 41 -

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M/17 130

a) R¹ = H-Gly-Gly-Ala-Gly-NH, H-Gly-Gly-Gly-Ala-Gly-NH und H-Leu-Gly-Gly-Ala-Gly-NH und

R² = H oder COOH

_R ⁵__Gl_y_G|y-AIa-GIy Cys-Lys-Asn-Phe-Phe Trp-Lys-Thr-Phe-Thr-Ser-NHCHiR )CH₂S-Trt

IX

LVa

11 a -» I I la -» I und I a

oder
R⁵-GIy-GIy-AIa-GIy Cys-Lys-Asn-Phe-Phe Trp-Lys-Thr-Phe-Thr-Ser-NHCH(R )CH₂S-Trt

IX

Vl

VII

Ha-» ilia -> ι und

b) R¹ = H oder NHR³ und R² = H

Trt-SCH₂CH(R⁴)C0-Lys-Asn-Phe-Phe Trp-Lys-Thr-Phe-Thr-Ser-NHCH(R²)CH₂S-Trt

IV

III-» I und la

- 42·-
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M/17 130

c) R¹ = H-Ala-Gly-NH und R² = COOAIk

Boc-AIa-Gly-Cys-Lys-Asn-Phe-Phe Trp-Lys-Thr-Phe-Thr-Ser-Cys-OAIk

Vb

Mc-* JLMc -» 1 und la

Schließlich liegt es für den Fachmann auf der Hand, daß äquivalente Amino-, Hydroxy- oder Thiolschutzgruppen, äquivalente Methoden zur Kupplung der Peptidfragmente und äquivalente Methoden zur Entfernung der Amino-, Hydroxy- oder Thiolschutzgruppen, die von dem hier Offenbarten verschieden sind, "bei den Ausführungsformen der Erfindung gebraucht werden können, ohne den Rahmen der Erfindung zu verlassen. Derartige offensichtliche Alternativen fallen in den Rahmen der Erfindung.

Das nachfolgende Fließdiagramm und die nachfolgenden Beispiele dienen zur weiteren Erläuterung der Erfindung.

- 43 -

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lineares Peptid (II) En I, Benützung

Oxidation

1) Ag⁺ oder Hg⁺"¹"

2) H₂S

cn σ co

cyclischea Disulfidderivat (III) Entschützung

Peptid (I)

Oxidation

Reduktion

Reduktion

Meulfhydrylderivat

Entschützung

lineares reduziertes Peptid (Ia)

Oxidation

N) CT) K) Ul CO CO O

Beispiel

Alanyl-glycinmethylester-trifluoracetat (HrAIa-GIy-OMeOE₅COOH¹

Man löst Boc-Ala-Gly-OMe (10 g, 45 mMol, beschrieben von H.U. Immer et al., HeIv. Chim. Acta, £7, 730 (1974)) in kalter (Eisbad) Trifluoressigsäure (100 ml). Die lösung wird 1 Std. bei O⁰C gerührt und das lösungsmittel wird eingedampft. Den Rückstand löst man in Methanol» gibt ihn zu Diäthyläther und sammelt den Niederschlag» wobei man die Titelverbindung gewinnt.

Beispiel

Tert. -Butyloxycarbonyl-glycyl-alanyl-glycin-methylester (Boc-Gly-Ala-Gly-OMe)

Zu einer kalten (Eisbad) lösung von H-AIa-GIy-OMeOH₅CO₂H (45 mMol, in Beispiel 1 beschrieben) in Dimethylformamid (50 ml) gibt man N-Äthylmorpholin (pH ~8), gefolgt von einer kalten lösung von Boc-Gly-OTep (18 g, 45 mMol) in Dimethylformamid (50 ml) zu. Die Lösung wird 2 Tage in einem Eisbad gehalten. Das Lösungsmittel wird eingedampft und das Produkt wird durch Säulenchromatographie auf Silikagel unter Verwendung von A'thylacetat/Methanol/Pyridin 98:1:1 gereinigt. Man kristallisiert das Produkt aus Äthylacetat/Petroläther, wobei man die Titelverbindung mit Schmelzpunkt 98 bis 100⁰C erhält;
NMR (DMSO-d₆): 1,25 <f(3H), 1,4<T(9H), 3,68 «r(3H).

- 45 609851 /1117

Beispiel 3

Glycyl-alanyl-glycin-Methylester-trifluoracetat (H-Gly-Ala-Gly-OMe·CP₃COOH)

Boc-Gly-Ala-Gly-OMe (6,4 g, 20,1 mMol, in Beispiel 2 beschrieben) wird in kalter (Eisbad) Trifluoressigsäure (120 ml) gelöst und die Lösung wird 1 Std. bei O⁰C gerührt. Man dampft das Lösungsmittel ein, löst den Rückstand in Methanol und fällt das Produkt durch Zugabe von Diäthyläther aus. Man sammelt den Niederschlag und erhält die Titelverbindung.

Beispiel 4

Tert.-Butyloxycarbonyi-glyeyl-glycyl-alanyl-glycin-Methylester (Boc-Gly-Gly-Ala-Gly-OMe;

Zu einer kalten (Eisbad) gerührten Lösung von H-GIy-AIa-GIy-OMeOH₃CO₂H (6,4 gf 20,03 mMol, in Beispiel 3 beschrieben) in Dimethylformamid (30 ml) gibt man N-Ä'thylmorpholin (2,8 ml), gefolgt von einer Lösung von Boc-Gly-OTcp (8,5 gt 24 mMol) in Dimethylformamid (20 ml). Die Lösung wird 2 Tage in einem Eisbad gehalten. Man dampft das Lösungsmittel ein, löst den Rückstand in Methanol und fällt das Produkt mit Diäthyläther aus. Kristallisation aus Äthylacetat ergibt die Titelverbindung mit Schmelzpunkt 103 bis 105⁰C und 141⁰C (dimorph); KMR 1,25cT(3H), 1,38cf(9H)i 3»65cT(3H).

Beispiel .5

Tert.-Butyloxyearbonyl-glycyl-glycyl-alanyl-glycin-Hydrazid; IX, R⁵ = Boc (BoC-GIy-GIy-AIa-GIy-NH-NH₂)

Zu einer gekühlten (Eisbad) gerührten Lösung von Boc-Gly-Gly-Ala-Gly-OMe (2,5 gf 6*7 mMol, in Beispiel 4 beschrieben) in

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Methanol (50 ml) gibt man Hydrazinhydrat (2,5 ml). Sie Lösung wird 3 Std. "bei O⁰C und über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Man trennt den Niederschlag durch Filtrieren ab, wäscht mit Methanol und trocknet, wobei man die Titelverbindung erhält; Aminosäureanalyse: GIy = 31 Ala = 0,99.

Beispiel

Tert.-Butyloxycarbonyl-glycyl-glycyl-alanyl-glycyl-S-trityl-

cysteinyl-N ^ -tert.-butyloxycarbonyl-lysyl-asparaginyl-

phenylalanyl-phenylalanin-Methylester

(Bo c-Gly-Sl y-Ala-Gly-Cys (!Tr t) -Ly s (Bo c ) -Asn-Phe-Phe-OMe )

Zu einer Lösung von BoC-GIy-GIy-AIa-GIy-NH-NH₂ (1»57 g» 4»2 mMol» in Beispiel 5 beschrieben) in Dimethylsulfoxid (25 ml) und Dimethylformamid (25 ml) gibt man eine 2,04n Lösung von Chlorwasserstoff in A'thylacetat (5» 15 ßl) bei -1O⁰C. Die Lösung wird auf -12⁰C gekühlt und tert.-Butylnitrit (0,61 ml, 5>2 mMol) wird zugegeben. Man hält die Lösung 15 Min. bei -1O⁰C, kühlt auf -15⁰C und gibt N-Äthyldiisopropylamin (1,8 ml, pH 8) zu, gefolgt von einer Lösung von H-Cys(Trt)-Lys(Boc)-Asn-Phe-Phe-OMe [4»5 g» 4»18 mMol, beschrieben von H.U. Immer et al., Helv.Chim.Acta, £7» (1974)] und N-Äthyldiisopropylamin (0,72 ml) in Dimethylformamid (25 ml). Die Mischung wird 1 Std. bei -1O⁰C und über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Nach dem Eindampfen wird der Rückstand in Methanol gelöst, das Produkt wird mit Wasser ausgefällt und aus Methanol kristallisiert, wobei man die Titelverbindung erhält; Aminosäureanalyse: Lys = 1,07» Asp = 0,97» GIy = 3.27, Ala = 1,0, Phe = 2,08, Cysteinsäure = 1,35.

- 47 -

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Beispiel 7

Tert.-Butyloxycarbonyl-glycyl-glycyl-alanyl-glycyl-S-tritylcyBteinyl-N € -tert.-butyloxycarbonyl-lysyl-aeparaginylphenylalanyl-phenylalanin-Kydrazid; IV,

R⁴ ss Boc-Gly-GIy-AIa-GIy-NH (Boc-Gly-Gly-Ala-Gly-Cys(Trt)-Lys(ßoc)-Asn-Phe-Phe-NH-NH₂)

Zu einer kalten (Eisbad) Lösung von Boc-Gly-Gly-Ala-Gly-Cys(Trt)-IyS(BOc)-ASn-PlIe-PlIe-OMe (0,9 g» 0,66 mMol, beschrieben in Beispiel 6) in Dimethylformamid (25 ml) gibt man Hydrazinhydrat (1,5 ml). Die lösung wird 18 Std. bei Raumtemperatur gerührt. Man dampft das Lösungsmittel ein, verreibt den Rückstand mit Methanol und trocknet über Phosphorpentoxid, wobei man die Titelverbindung erhält. Aminosäureanalyse: Lys = 1,10, Asp = 1,00, G-Iy = 3»331 Ala =1,0, Phe = 2,14» Cysteinsäure = 1,35.

Beispiel 8

Tert.-Butyloxycarbonyl-glycyl-glycyl-alanyl-glycyl-S-tritylcysteinyl-N £ -tert.-butyloxycarbonyl-lysyl-asparaginylphenylalanyl-phenylalanyl-tryptophyi-N^ -tert.-butyloxycarbonyl-lysyl-O-tert.-butyl-threonyl-phenylalanyl-O-tert.-butyl-threonyl-O-tert.-butyl-seryl-S-trityl-cystein; II,

R² = COOH und

R = Boc-GIv-GIy-AIa-GIv-NH (Boc-Glv-G!v-Ala-Glv-Cys(Trt)-Lvs(Boc)-Asn-

Phe-Phe-Trp-Lys(3oc)-Thr(8u )-Phe-Thr(Bu^t)-Ser(8u^t)-Cys(Trf)-0H)

Zu einer bei -20⁰C gerührten Lösung von Boc-Gly-Gly-Ala-Gly-Cys(Trt)-Lys(Boc)-Asn-Phe-Phe-NHKH₂ (800 mg, 0,59 mMol, in Beispiel 7 beschrieben) in Dimethylformamid (12 ml) gibt man eine 1,85n Lösung von Chlorwasserstoff in Äthylacetat (0,795 mit 1,475 mMol). Die Mischung wird auf -15⁰C gebracht, tert.-Butylnitrit (0,081 ml, 0,71 mMol) wird zugegeben und die Lösung wird 15 Min. gerührt. Eine Lösung von H-Trp-Lys(Boc)-Thr(Bu^t)-Phe-Thr(Bu^t)-Ser(Bu^-Cys(Irt)-OH [816 mg, 0,59 mMol, von H.U. Immer et al., Helv.Chim.Acta,

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730 (1974) beschrieben] und N-Äthyldiisopropylamin (0,354 ml, 2,06 mMol) in Dimethylformamid (6 ml) wird auf -15⁰C gekühlt und zu der obigen Reaktionsmischung zugegeben. Man rührt die Mischung 1 Std. bei -15⁰C und 18 Std. bei Z5°G. Das Lösungsmittel wird eingedampft, der Rückstand wird mit eiskalter Zitronensäure verrieben, filtriert, mit Wasser und anschliessend mit Methanol gewaschen und getrocknet, wobei man die Titelverbindung erhält.

Aminosäureanalyse: Lys = 1,94» Asp = 0,96» Thr = 1,64» Ser = 0,49, GIy = 2,82, AIa = 1,00, Phe = 2,80.

Beispiel

Cyclisches Disulfid von Glycyl-glycyl-alanyl-glycyl-cysteinyllysyl-asparaginyl-phenylalanyl-phenylalanyl-tryptophyl-lysylthreonyl-phenylalanyl-threonyl-seryl-cystein; I,

R¹ = H-Gly-Gly-Ala-Gly-NH und R² = CCOH

(H-Gly-Gly-Ala-Glv-Cys-Lys-Asn-Phe-Phe-TrD-Lvs-Thr-Phe-Thr-Ser-CVs-nM^

Boc-Gly-Gly-Ala-Gly-Cys(Trt)-Lys(Boc)-Asn-Phe-Phe-Trp-Iys(Boc)-Thr(Bu^t)-Phe-Thr(Bu^t)-Ser(Bu^t)-Cys(Trt)-OH in Beispiel 8 beschrieben (0,871 g. 0,32 mMol) wird in Eisessig (150 ml) gelöst und bei Raumtemperatur tropfenweise zu einer Lösung von Jod in Methanol (0,5/6» 150 ml, 30 mMol) unter Rühren im Verlauf von 1 Std.. zugegeben. Man rührt die Mischung weitere 45 Min., kühlt in einem Eisbad ab und gibt eine Lösung von Natriumthiοsulfat in Wasser (1n, 6 ml) zu, um den Überschuß an Jod zu zerstören (farblose Lösung). Das Lösungsmittel wird eingedampft und der Rückstand wird mit Wasser verrieben, getrocknet und das trockene Produkt wird mit Isopropyläther verrieben, wobei man das cyclische Disulfidhexadecapeptid der Eormel III

Boc-GIy-GIy-AIa-Gly-Cys-Lys(Boc)-Asn-Phe-Phe-Trp-Lys(Boc)-Thr(Bu⁺)-Phe-Thr(Bu⁺)-Ser(Bu⁺)-Cys-OH.

erhält.

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Zur letzteren Verbindung gibt man unter einer Stickstoffatmosphäre unter heftigem Rühren in einem Eis/Waseerbad kalte konzentrierte Chlorwasserstoffsäure (23 ml) zu. Man rührt noch 10 Min.» gibt Eisessig (300 ml)" zu und lyophilisiert die lösung. Den Rückstand löst man in Wasser und lyophilisiert nochmals. Der Rückstand wird in 0,01n wäßriger Ammoniumacetatlösung gelöst und auf eine Säule mit Carboxymethylcellulose (Whatman CM-23t 2,5 χ 30 cm) aufgegeben. Man eluiert die reine Verbindung mit 0,06n Ammoniumacetatpuffer. Das gereinigte Material wird aus Wasser lyophilisiert» wobei man die Titelverbindung als weißen Feststoff in Form ihres Essigsäureadditionssalzes erhält.

282 nm (£ 5260}, 289 nm (£ 4730);

Aminosäureanalyse: Lys = 2,28, Asp = 1,05» Ihr = 1,95» Ser = 0,93, Cys = 2,34i GIy = 3,00, AIa = 1,05, Phe = 3,12

Wiederholtes Lyophilisieren des letzteren Produkts aus Wasser ergibt die Titelverbindung in Form der freien Base; Aminosäureanalyse: Lys = 2,10, Asp = 1,04, Thr = 1,80, Ser = O,95f Cys = 2,17, GIy = 3,00, AIa = 1,07, Phe = 2,99

Man erhält die Titelverbindung auch auf dieselbe Weise» indem man anstelle von Jod Thiocyanogen gemäß der Methode von Hiskey und Smith, loc.cit.» verwendet.

Beispiel 10

T ert.-Butyloxycarbonyl-leucyl-glycyl-glycyl-alanyl-glycin-

Methylester

(Boc-leu-Gly-Gly-Ala-Gly-OMe)

Eine Lösung von Boc-Gly-Gly-Ala-Gly-OMe (2,0 g, 5,35 mMol₉ in Beispiel 4 beschrieben) in Trifluoressigsäure (25 ml) wird 1 Std. bei O⁰C gerührt. Man dampft das Lösungsmittel ein, verreibt den Rückstand mit Äther» sammelt den Feststoff

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und trocknet, wobei man das Tetrapeptid der Formel H-Gly-Gly-Ala-Gly-OMe erhält, das als das Trifluoressigsäureadditionssalz isoliert wird.

Eine Lösung des letzteren Tetrapeptide (5»35 mMol), Boc-Ieu-OH (2,31 g» 1OmMoI), 1-Hydroxybenzotriazol (1.35 g» 10 mMol), Dicyclohexylcarbodiimid (2,27 g, 11 mMol) und N-Äthylmorpholin (0,68 ml) in Dimethylformamid (25 ml) wird 24 Std. bei O⁰C gerührt. Die Mischung wird filtriert, um den Niederschlag zu entfernen und das Filtrat wird zu Diäthyläther (200 ml} zugegeben. Man sammelt den Niederschlag und kristallisiert aus Methanol/ Isopropyläther, wobei man die !Eitelverbindung mit Schmelzpunkt 190,5 bis 193⁰C erhält;

= -15»2° (c = 1, Dimethylformamid).

Beispiel 11

Tert.-Butyloxycarbonyl-leucyl-glycyl-glycyl-alanyl-glycin-Hydrazid; IX,

R⁵ = Boc-Leu (BoC-LeU-GIy-GIy-AIa-GIy-NHNH₂)

Eine lösung von Boc-Leu-Gly-Gly-Ala-Gly-OMe (2,0 g, 4 mMol, in Beispiel 10 beschrieben) und Hydrazinhydrat (4»12 ml, 80 mMol) in Methanol (50 ml) wird 4 Std. bei O⁰C gerührt. Die Lösung wird auf 4 ml konzentriert und zu Diäthyläther (200 ml) zugegeben. Man sammelt den Niederschlag, löst in Methanol (4 ml) und gibt zu Diäthyläther (200 ml) zu. Der Niederschlag wird gesammelt und getrocknet, wobei man die Titelverbindung mit Schmelzpunkt 174 bis 176,5⁰C erhält; £ = -12,0° (c = 1, Dimethylformamid).

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Beispiel 12

Tert.-Butyloxycarbonyl-leucyl-glycyl-glycyl-alanyl-glycyl-S-trityl-cysteinyl-N^£-tert.-butyloxycarbonyl-lysyl-asparaginylphenylalanyl-phenylalanin-Methylester

(g_oc- Leu-Glv-G I y- A Ia-G I y-Cvs(Trt)-Lvs(Boc)-Asn-Phe-Phe-OMe)

Tert.-Butylnitrit (0,15 ml» 1>27 mMol) wird zu einer lösung von Boc-Leu-Gly-Gly-Ala-Gly-NgH^ (0,308 g, 0,635 mMol, in Beispiel 11 beschrieben) in Dimethylformamid (5 ml) bei -20⁰C und 2,4n Chlorwasserstoff in Äthylacetat (0,66 ml, 1,59 mMol) zugegeben. Nachdem man 15 Min. bei -20⁰C gerührt hat, gibt man eine Lösung von H-Cys(Trt)-Lys(Boc)-Asn-Phe-Phe-OMe [(0,62 g, 0,58 mMol) von H.U. Immer et al., Helv.Chim.Acta, 52 » 730 (1974) beschrieben] und Diisopropyläthylamin (0,372 ml) in Dimethylformamid (6 ml) zu. Nachdem man 1 Std. bei -20⁰C und 24 Std. bei O⁰C gerührt hat, wird die Lösung zu Diäthyläther (200 ml) zugegeben. Man sammelt den Niederschlag, löst in Methanol (5 ml) und gibt zu Diäthyläther (200 ml) zu. Der Niederschlag wird gesammelt und getrocknet, wobei man die Titelverbindung mit Schmelzpunkt 238 bis 240,5⁰C erhält.

Beispiel 13

Tert.-Butyloxycarbonyi-leucyl-glycyl-glycyl-alanyl-glycyl-S-trityl-cysteinyl-N^£-tert.-butyloxycarbonyl-lysyl-asparaginylphenylalanyl-phenylalanin-Hydrazid; IV,

^R = Boc-Leu-GIy-GIy-AIa-GIy-NH (Boc-Leu-GIy-GIy-AIa-Gly-Cys(Trt)-Lys(Boc)-Asn-Phe-Phe-NHNH₂)

Eine Lösung von Boc-Leu-Gly-Gly-Ala-Grly-Cys(Trt)-Lys(Boc)-Asn-Phe-Phe-OMe (0,56 g, 0,38 mMol, in Beispiel 12 beschrieben) und Hydrazinhydrat (0,74 ml) in Dimethylformamid (10 ml) wird 12 Std. bei O⁰C und 24 Std. bei 25⁰C gerührt. Man gibt die Lösung zu Diäthyläther (100 ml). Der Niederschlag wird gesammelt» in Dimethylformamid (3 ml) gelöst und zu Diäthyl-

- 52 -

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m/17 130

äther (100 ml) zugegeben. Man sammelt den Niederschlag und trocknet» wobei man die Titelverbindung mit Schmelzpunkt 239 bis 242⁰C erhält.

Aminosäureanalyse: Lys = 1»05» Cysteinsäure = 0,66, Asp = 0,99, GIy = 3,00, Ala = 1,11, 1/2 Cys = 0,21, Leu = 0,96, Phe = 1,86.

Beispiel

Tert.-Butyloxycarbonyl-leucyl-glycyl-glycyl-alanyl-glycyl-S-trityl-cysteinyl-N^-tert.-butyloxycarbonyl-lysyl-asparaginylphenylalanyl-phenylalanyl-tryptophyl-N^£-tert.-butyloxycarbonyl-lysyl-O-tert.-butyl-threonyl-phenylalanyl-O-tert.-butyl-threonyl-O-tert.-butyl-seryl-S-trityl-cystein; II, R² = COOH und

R⁴ = Boc-Leu-GIy-Gly-AJa-Gfv-NH (Boc-Leu-G1y-GlY-A!a-Gly-Cys(Trt)-LYS(Boc)· Asn-Phe-Phe-TrD-Lvs(Boc)-ThrrBu^t)-Phe-Thr(Bu⁺)-Ser(Bu⁺)-Cvs(Trt)-OH)

Tert.-Butylnitrit (0,03 ml, 0,28 mMol) wird bei -20⁰C zu einer Lösung von Boc-Leu-GIy-GIy-AIa-Gly-Cys(Trt)-Lys(Boc)-Asn-Phe-Phe-N₂H₃ (0,20 g, 0,14 mMol, in Beispiel 13 beschrieben) in Dimethylsulfoxid (2 ml), Dimethylformamid (4 ml) und 2,21n Chlorwasserstoff in Äthylacetat (0,16 ml, 0,35 mMol) zugegeben. Nachdem man 15 Min. bei -20⁰C gerührt hat, gibt man eine Lösung von H-Trp-LysCBocJ-ThriBu⁺)-Phe-Thr(Bu⁺)-Ser(Bu⁺)-Cys(Trt)-OH.HCO₂H [0,20 g, 0,14 mMol, von H.U. Immer et al., Helv.Chim.Acta, 57, 730 (1974) beschrieben] und Diisopropyläthylamin (0,08 ml, 0,49 mMol) in Dimethylformamid (5 ml) zu. Die Lösung wird 1 Std. bei -20⁰C und 24 Std. bei O⁰C gerührt. Die Lösung wird auf 2 ml konzentriert und zu Diäthyläther (100 ml) zu gegeben. Man sammelt den Niederschlag, wäscht mit Was3er (2x5 ml), Methanol (2x5 ml) und trocknet, wobei man die Titelverbindung erhält;

Aminosäureanalyse: Lys = 1,92, Cysteinsäure = 0,93, Asp = 0,93, Thr = 1,38, Ser = 0,66, GIy = 3.00, AIa = 1,02, 1/2 Cys = 0,39, Leu = 0,93, Phe = 2,70.

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Beispiel 15

Cyclisch.es Disulfid von Leucyl-glycyl-glycyl-alanyl-glycylcysteinyl-lysyl-asparaginyl-phenylalanyl-phenylalanyltryptophyl-lysyl-threonyl-phenylalanyl-threOnyl-seryl·- cystein; I,

R¹ = H-Leu-Gly-&ly-Ala-&ly-NH und R² = COOH

, j

(H-Leu-Glv-Glv-Ala-Gly-Cys-Lvs-Asn-Phe-Phe-Trp-Lvs-Thr-Phe-Thr-Ser-Cvs-CH^

Eine lösung von Boc-Leu-Gly-G!y-Ala-Gly-Cys(Trt)-Lys(Boc)-Asn-Phe-Phe-Trp-Lys(Boc)-Thr(Bu⁺)-Phe-Thr(Bu⁺)-Ser(Bu⁺)-Cys(Trt)-OH (0,23 g» 0,081 mMol, in Beispiel 14 beschrieben) in Essigsäure (90 ml) wird tropfenweise im Verlauf von 1 Std. zu einer Lösung von 0,5 $> Jod in Methanol (41,5 ml, 0,81 mMol) zugegeben. Nach, beendeter Zugabe wird die Lösung 1 Std. bei Raumtemperatur gerührt und dann auf O⁰C gekühlt. Man gibt 1 η Natriumthiοsulfat (1,62 ml) zu, bis die Lösung farblos wird. Das Produkt wird gesammelt, getrocknet, mit Äther verrieben und getrocknet, wobei man das cyclische Disulfidheptadecapeptid der Formel III

Boc-Leu-GIy-GIy-AIa-Gly-Cys-LysCBoc)-Asn-Phe-Phe-Trp-Lys(Boc)-Thr(Bu )-

Phe-Thr(Bu⁺)-Ser(Bu⁺)-Cys-OH. erhält.

Eine Lösung des cyclischen Disulfidheptadecapeptids (0,155 g» 0,066 mMol) in konzentrierter Chlorwasserstoffsäure (6,87 ml) wird unter einer Stickstoffatmosphäre bei O⁰C 8 Min. lang schnell gerührt. Man gibt Essigsäure (69 ml) zu und lyophilisiert die Lösung. Der Rückstand wird aus Wasser (50 ml) lyophilisiert. Den Rückstand chromatographiert man auf einer Säule mit chemisch modifiziertem, vernetztem Dextran "Sephadex G-25M" [3 x 50 cm, in der unteren Phase äquilibriert und dann in der oberen Phase von n-Butanol/ Essigsäure/Wasser (4:1:5) äquilibriert] unter Verwendung der oberen Phase zur Desorption des Peptide. Die das reine Peptid enthaltenden Fraktionen werden vereinigt, eingedampft

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und aus Wasser lyophilisiert» wobei man die Titelverbindung in Form ihres Essigsäureadditionssalzes erhält;

^max^{H 29}° ^(ε 5000), 281 (E 5540), 275 (£ 5205), 269 U 4980), 265 (£ 4625), 259 mn (£ 4085).

Wiederholtes Lyophilisieren des letzteren Produkts aus Wasser ergibt die Titelverbindung in Form der freien Base; Aminosäureanalyse: Lys = 1,98, Cysteinsäure = 1,41» Asp = 1,26, Thr = 1,92, Ser.= 0,96, GIy = 3,00, AIa = 1,02, Leu = 0,96, Phe = 2,76.

Auf dieselbe Weise kann man unter Verwendung von Thiocyanogen gemäß der Methode von Hiskey und Smith, loc.oit. anstelle von Jod, ebenfalls die Titelverbindung erhalten.

Beispiel VS_

Tert.-Butyloxycarbonyl-glycyl-glyeyl-glycyl-alanyl-glycin-

Methylester

(Boc-Gly-Gly-Gly-Ala-Gly-OMe)

Eine Lösung von Boc-Gly-OTcp (3,7 g, 10,04 mMol), H-GIy-GIy-AIa-GIy-OMe-CF₅CO₂H (3,12 g, 8,03 mMol, in Beispiel 10 beschrieben) und N-Äthylmorpholin (1,1 ml) in Dimethylformamid (15 ml) wird 20 Std. bei O⁰C gerührt. Man sammelt den Niederschlag und gibt das Filtrat zu Diäthyläther. Die beiden vereinigten Niederschläge werden aus Methanol kristallisiert, wobei man die Titelverbindung mit Schmelzpunkt 198 bis 201⁰C erhält; [aJ^" = -3,9° (c = 1, Dimethylformamid).

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Beispiel 17

Tert.-Butyloxycarbonyl-glycyl-glycyl-glycyl-alanyl-glycin-Hydrazid; IX,

R^ = Boc-Gly (BoC-GIy-GIy-GIy-AIa-GIy-NHNH₂)

Eine Lösung von Boc-Gly-Gly-Gly-Ala-Gly-OMe (1,0 g, 2,32 mMolj in Beispiel 16 besehrieben) und Hydrazinhydrat (1 ml, 23»2 mMol) in Methanol (30 ml) wird 4 Std. bei O⁰C gerührt. Nach dem Eindampfen wird der Rückstand mit Diäthyläther verrieben und getrocknet, wobei man die Titelverbindung mit Schmelzpunkt 221 bis 223⁰C erhält.

Beispiel 18

N,S-Ditrityl-cysteinyl-N^-tert.-butyloxycarbonyl-lysylasparaginyl-phenylalanyl-phenylalanin-Hydrazid; VI

(Trt-Cys(Trt)-Lys(Bo c)-Asn-Phe-Phe-1

Eine Lösung von Trt-Cys-(Trt)-Lys-(Boc)-Asn-Phe-Phe-OMe (1,25 g, 1»0 mMol, von H.ü. Immer et al. Helv.ChinuActa, 57> 730 (1974) beschrieben) und Hydrazinhydrat (0,97 ml, 20 mMol) in Methanol (30 ml) wird 2 Tage bei O⁰C gerührt. Man dampft das Lösungsmittel ein und kristallisiert den Rückstand aus ithanol/Isopropyläther, wobei man die Titelverbindung erhält:
NMR (DMS0-d₆):cf1,38 (s, 9H), 7t19 - 7.30 (m, 40H).

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Beispiel 19

N,S-Ditrityl-cysteinyl-N^£-tert.-butyloxycarbonyl-lysyl-

asparaginyl-phenylalanyl-phenylalanyl-tryptophyl-N^£-tert.-

butyloxycarbonyl-lysyl-O-tert.-butyl-threonyl-phenyl-

alanyl-O-tert.-butyl-threonyl-O-tert.-butyl-seryl-S-trityi-

cystein; VII»

R² = COOH (Trt-Cvs(Trt)-Lvs(Poc)-Asn-Phe-Phe-Trp-Lys(Eio^Thr(Bu⁺)-

Phe-The (Bu^-Ser C Pu⁺)-O/s(Trf) -GH)

Tert.-Butylnitrit (0,09 ml, 0,74 mMol) wird bei -20⁰C zu einer lösung von Trt-Cys(Trt)-Lys(Bcc)-Asn-Phe-Phe-NHHH₂ (0,62 g, 0,4-93 mMol, in Beispiel 18 beschrieben) in Dimethylformamid (10 ml) und 2,6n Chlorwasserstoff in Ä'thylacetat (0,475 ml, 1,23 mKol) zugegeben. Nachdem man 15 Min. lang bei -20⁰C gerührt hat, gibt man eine Lösung von H-Trp-Lys(Boc)-Thr(Bu⁺)-Phe-Thr(Bu⁺)-Ser(Bu⁺)- Cys(Trf)-OH.HCOOH (0,70 g, 0,493 mMol, von H.U. Immer et al., Helv.Chim.Acta, 57, 730 (1974) beschrieben) und Diisopropyläthylamin (0,30 ml, 1,65 mMol) in Dimethylformamid (10 ml)zu. Die Lösung wird 1 Std. bei -20⁰C und 24 Std. bei 25⁰C gerührt und eingedampft. Den Rückstand verreibt man mit Wasser, Diäthyläther, kalter 1n Zitronensäure und trocknet, wobei man die Titelverbindung erhält:

NMR (CDCl₃) d" 1,08 und 1,13 (s, 27H), 1,37 (s, 18H), 7,28 (m, 60H);

Aminosäureanalyse: Lys = 2,23» Cysteinsäure = 1,10, Asp = 1,00, Thr = 2,12, Ser = 1,02, 1/2 Cys = 0,64, Phe = 3,18.

- 57 -

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M/17 130

Beispiel 20

S-Trityl-cysteinyl-N^-tert.-butyloxycarbonyl-lysylasparaginyl-phenylalanyl-phenylalanyl-tryptophyl-N -tert.-butyloxycarbonyl-lysyl-O-tert. -butyl-threonyl-phenylalanyl-0-tert.-butyl-threonyl-O-tert.-butyl-seryl-S-tritylcystein-Formiat; VIII»

2 t

R = COOH (H-Cys(Trt)-Lys(Eoc)-Asn-Phe-Phe-Trp-Lvs(Boc)-Thr(Bu )-

Phe-Thr(Bu )-Ser(Bu )-CvsCTrf)-QH.HCCCH )

Eine Lösung von Trf-Cys(Trt)-LyS(BoO-Asn-Phe-Phe-Trp-Lys (BoO-Thr(Bu*)-Phe-IhrtBu^-Ser(Bu^-Cysdrt)-OH (0,50 g, 0,192 mMol, in Beispiel 19 beschrieben) in 6 ml Essigsäure/ Ämelsensäure/wasser (7:1:2) wird 6 Std. bei 25⁰C gerührt, lian dampft das Lösungsmittel ein und verreibt den Rückstand mit Diäthyläther, wobei man die Titelverbindung erhält: Aminosäureanalyse; Lys =2,23» Cysteinsäure = 1,38, Asp = 1,00, Kir = 2,14-» Ser = 0,86, Phe = 3»24.

spiel 21

Cert.-Butyloxycarbonyl-glycyl-glycyl-glycyl-alanyl-glycyl-S-trityl-oysteinyl-i?^£-tert.-butyloxycarl3onyl-lysylasparaginyl-phenylalanyl-phenylalanyl-trypt ophyl-ii^e-t ert. butyloxycarbonyl-lysyl-O-tert.-butyl-threonyl-phenylalanyl-O-tert.-butyl-threonyl-O-tert.-butyl-seryl-S-trityl-cystein; II»

R² = COOK und R⁵ = Boc-Gly-Gly-Gly-Ala-Gly-NH

'.Boc-S Iy-G Iy-G Iy-A Ia-G iy-Cys(Trt)-Lys( BoO-Asn-Phe- £!ig--Jrp-Lvs(Buc^-Thrf6u⁺)-Phe-Thr(Bu'^t*)-Ser(B'.i^t)-Cvs(Trt)-0H)

Tert.-Butylnitrit (0,04 ml, 0,34 mMol) wird bei -20⁰C zu einer Lösung von BoC-GIy-GIy-AIa-G-Iy-NHNH₂ (0,076 g, 0,176 mMol, in Beispiel 17 beschrieben) in Dimethylsulfoxid (1 ml), Dimethylformamid (2 ml) und 2,5n Chlorwasserstoff in Äthylacetat (0,176 ml, 0,44 mMol) zugegeben. Nachdem man 15 Kin. bei -20⁰C gerührt hat, gibt man eine Lösung von

- 58 -609851/1117

H-Cys(Trt)-Lys(Boc)-Asn-Phe-Phe-Trp-Lys(Boc)-Thr(Bu^)-Phe-Thr(Bu^t)-Ser(Bu^t)-Cys(Trt)-OH-HCOOH (0,385 g, 0,16 mMol, in Beispiel 20 beschrieben.) und Diisopropyläthylamin (0,12 ml) in Dimethylformamid (5 ml) zu. Die Lösung wird 1 Std. bei -20⁰C, 1 Std. bei O⁰C und 20 Std. bei 25⁰C gerührt. Man dampft das Lösungsmittel ein und gibt den Rückstand zu Diäthyläther (100 ml) zu. Der Niederschlag wird gesammelt, mit Wasser und mit Methanol gewaschen und getrocknet, wobei man die Titelverbindung erhält;

Iminosäureanalyse: Lys = 2,30, Cysteinsäure = 1,42, Asp = 1,00, Thr = 2,27, Ser = 1,00, GIy = 3.84» AIa = 1,00, Phe = 3»34.

Beispiel 22

Cyclisches Disulfid von Glycyl-glycyl-glycyl-alanyl-glycylcysteinyl-lysyl-asparaginyl-phenylalanyl-phenylalanyltryptophyl-lysyl-threonyl-phenylalanyl-threonyl-serylcysteinj I,

R¹ = H-Gly-Gly-Gly-Ala-Gly-NH und R² = COOH

(H-G IV-GI v-G tv-A Ia-G Iv-Cv'S-Lvs-AETPhe-Phe-Trp-Lvs-Thr-Phe-Thr-Ser-Cvs-OH)

Eine Lösung von Boc-GIy-GIy-GIy-AIa-Gly-Cys(Trt)-Lys(Boc)-Asn-Phe-Phe-Trp-

Lys(Boc)-Asn-Phe-Phe-Trp-Lys(Boc)-Thr(ßu⁺)-Phe-Thr(Bu^f)-

Ser (Bu¹O-CyS(Trt)-OH (0,285 g» 0,103 mMol, in Beispiel beschrieben) in Essigsäure (200 ml) wird zu einer Lösung von 0,5 # Jod in Methanol (52 ml, 1,03 mMol) im Verlauf von 60 Min. zugegeben, und man läßt bei Raumtemperatur 60 Min. lang rühren. Die Lösung wird auf O⁰C gekühlt und 1n Natriumthiosulfat (2»06 mMol) wird zugesetzt» um eine farblose Lösung zu erhalten. Man dampft das Lösungsmittel ein und gibt den öligen Rückstand zu Wasser (100 ml) zu.

Der Niederschlag wird gesammelt und getrocknet» wobei man das cyclische Disulfidheptadecapeptid der Formel III

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M/17 130

Boc-GIy-GIy-GIy-Ala-Giy-Cys-Lys(Boc)-Asn-Phe-Phe-Trp-Lys(Boc)-Thr(Bu )■ Phe-Thr(Bu⁺)-Ser(Bu⁺)-Cys-OH

erhält.

Eine Lösung des zuletzt erwähnten cyclischen Disulfidheptadecapeptids (0,10 mMol) in konz. Chlorwasserstoffsäure (10 ml) wird 10 Min. unter Stickstoff "bei O⁰C gerührt. Man gibt Essigsäure (100 ml) zu und lyophilisiert die Lösung. Nach einer weiteren Lyophilisierung aus Wasser (100 ml) wird der Rückstand einer Verteilungschromatographie auf einer Säule mit chemisch modifiziertem, vernetztem Dextran ("Sephadex G-25M", 3 χ 50 cm, in der unteren Phase mit n-Butanol/Essigsäure/Wasser (4:1:5) vorbereitet und dann in der oberen Phase äquilibriert) unter Verwendung der oberen Phase zur Desorption des im wesentlichen reinen Heptadecäpeptids, unterworfen. Man vereinigt die reinen Fraktionen, dampft ein und lyophilisiert, wobei man die Titelverbindung in Form ihres Essigsäureadditionssalzes erhält;

^{283 (£ 6702)}' ²⁸⁹

Wiederholtes Lyophilisieren des letzteren Produkts aus Wasser ergibt die Titelverbindung in Form einer freien

Base;

Aminosäureanalyse: Lys = 2,00, Cysteinsäure = 1,42, Asp = 1,09, Thr = 1,89, Ser = 0,91, GIy = 3,64, AIa = 0,98,

Phe = 2,95.

Auf dieselbe Weise, jedoch unter Verwendung von Thiocyanogen gemäß der Methode von Hiskey und Smith, loc.cit. anstelle von Jod, kann man ebenfalls die Titelverbindung erhalten.

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M/17 130

B e i s ρ i e 1 2

•x.

NiS-Ditrityl-cysteinyl-N^-tert.-butyloxycarbonyl-lysylasparaginyl-phenylalanyl-phenylalanyl-tryptophyl-N^-tert,-butyloxycarbonyl-lysyl-O-tert.-butyl-threonyl-phenylalanyl-O-tert .-butyl-threonyl-O-tert .-butyl-seryl-2-tritylthioäthylamid; VII,

R=H (Trt-Cys(Trt)-Lys(Boc)-Asn-Phe-Phe-TrD-Lvs(Boc)-Thr(Bu⁺)-Phe-Thr(Bu⁺)-Ser(Bu⁺)-NHCH₂CH₂S-Trt)

Das Pentapeptidhydrazid Trt-Cys(Trt)-Lys(Boc)-Asn-Phe-Phe-NHNH₂ (0,80 g, 0,637 mMol, in Beispiel 18 beschrieben) wird in trockenem Dimethylformamid (9 ml) gelöst und auf -20⁰C abgekühlt. Man gibt Chlorwasserstoffsäure in Äthylacetat (2,4n, 0,691 ml) zu, gefolgt von tert.-Butylnitrit (0,0872 ml, 0,764 mMol). Die Mischung wird 15 Min. bei -15⁰C gerührt. Eine Lösung von H-Trp-Lys(Boc)-Thr(Bu )-Phe-ThriBu^-SertBu^-NHCHgCH^-Trt (0,852 g, 0,637 mMol, wie in der US-PS 3 917 581 beschrieben hergestellt) in Dimethylformamid (8 ml), das N-lthyldiisopropylamin (0,272 ml, 1,59 mMol) enthält, wird auf -15⁰C gekühlt und zur obigen Reaktionsmischung tropfenweise zugesetzt. Man setzt das Rühren 1 Std. lang bei -15⁰C und über Nacht bei Raumtemperatur fort. Man dampft die Reaktionsmischung unter vermindertem Druck ein, verreibt den Rückstand mit Wasser, filtriert, wäscht mit Wasser und trocknet über Phosphor ρ ent oxid. Der Rückstand wird auf einer Säule mit Silikagel (163 g) mit Chloroform, das Methanol (3 #) und Pyridin (0,3 fi) enthält, als Eluiermittel chromatographiert, und das reine Produkt wird aus Methanol/Isopropyläther kristallisiert, wobei man die Titelverbindung mit Schmelzpunkt 163 bis 180⁰C (Zers.) erhält.

Analyse C₁₄₉H₁₈₀N₁₆O₁₉S₂:

CHN

ber.: 69,85 7,04 8,76 # gef.: 69,24 7,09 8,90 36

- 6t 609851 /1117

Beispiel 24

S-Trityl-cysteinyl-N^-tert.-butyloxycarbonyl-lysylasparaginyl-phenylalanyl-phenylalanyl-tryptophyl-N^-tert.-butyloxycarbonyl-lysyl-O-t ert. -butyl-threonyl-phenylalanyl-O-tert.-butyl-threonyl-O-tert.-butyl-seryl-2-tritylthio-

äthylamid-IOrmiat i VIII,
2

R=H (H-Cvs(Trt)-Lys(Boc)-Asn-Phe-Phe-Trp-Lys(ßoc)-Thr(Bu⁺)-Phe-Thr(Bu⁺)-Ser(Bu⁺)-NHCH₂CH₂S-Trt.HCOOH)

Das Undecapeptid Trt-Cys(Trt)-Lys(3oc)-Asn-Phe-Phe-Trp-LysCBoc)-Thr(Bu^t)-Hie-!nir(Bu^t)-Ser(Bu^t)-NHCH₂CH₂S-!Ert (0,909 g, 0,355 mMol, in Beispiel 23 beschrieben) wird in einer Mischung aus Essigsäure/Ameisensäure/Wasser (7:1:2, 10 ml) gelöst und die Lösung wird bei Raumtemperatur über Nacht gerührt. Man dampft das Lösungsmittel ein und verreibt den Rückstand mit Wasser. Der erhaltene Niederschlag wird filtriert» mit Wasser gewaschen und über Phosphorpentoxid getrocknet. Den Eeststoff verreibt man mehrmals mit Petroläther/Xther und trocknet, wobei man die Titelverbindung erhält;

Aminosäureanalyse: Lys = 2,03» Asp = 1,00, Ser = 0,87, Phe = 2,97» Cysteinsäure = 0,90, Thr =1,85.

Beispiel 25

Tert.-Butyloxycarbonyl-leucyl-glycyl-glycyl-alanyl-glycyl-S-trityl-cysteinyl-N^f-tert.-butyloxycarbonyl-lysyl-asparaginylphenylalanyl-phenylalanyl-tryptophyl-N^£-tert.-butyloxycarbonyl-lysyl-O-t ert .-butyl-threonyl-phenylalanyl-O-tert.-butyl-threonyl-O-tert.-butyl-seryl-2-tritylthioäthylamid; II,

R² = H und

R⁴" = Boc-Leu-Glv-Slv-AIa-Giv-NH (Bcc-Leu-Gly-Glv-A!a-S!v-Cvs(Trt)-Lys(Boc)-Asn-Phe-Phe-Trp-Lys(Boc)-Thr(Bu⁺)-Phe-Thr(Bu⁺)-Ser(Bu⁺)-NHCH₂CH₂S-TrT)

Das Pentapeptidhydrazid BoC-LeU-G-Iy-G-Iy-AIa-GIy-IIHNH₂ (0,066 g, 0,136 mMol, in Beispiel 11 beschrieben) wird in

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trockenem Dimethylformamid (3 ml) gelöst und auf -20⁰C abgekühlt. Man gibt Chlorwasserstoffsäure in Äthylacetat (2n, 0,175 ml) zu, gefolgt von tert.-Butylnitrit (0,0186 ml, 0,163 mMol). Die Mischung wird 15 Min. bei -15⁰C gerührt. Eine Lösung von H-Cys(Trt)-Lys(Boc)-Asn-Phe-Phe-Trp-Lys(Boc)-Thr(Bu^t)-Phe-Thr(Bu^t)-Ser(Bu^t)-NHCH₂CH₂S-Trt (0,315 g» 0,133 mMol, in Beispiel 24 beschrieben) in Dimethylformamid (4 ml), die N-Äthyldiisopropylamin (0,082 ml, 0,476 mMol) enthält, wird auf -15⁰C gekühlt und tropfenweise zur obigen Reaktionsmischung zugegeben. Man rührt noch 1 Std. bei -15⁰C und über Nacht bei Raumtemperatur. Die Reaktionsmischung wird unter vermindertem Druck eingedampft, der Rückstand wird mit eiskalter Zitronensäure (in) verrieben, filtriert und mit Wasser gewaschen. Den festen Rückstand verreibt man mit Methanol und trocknet über Phosphorpentoxid, wobei man die Titelverbindung erhält. Aminosäureanalyse: Lys = 1,88, Cysteinsäure = 0,84, Asp = 1,00, (Ehr = 1,94, Ser = 0,97, GIy = 2,78, AIa = 0,89, Leu = 0,89, Phe = 3,11.

Beispiel 26

Cyclisches Disulfid von Leucyl-glycyl-glycyl-alanyl-glycylcysteinyl-phenylalanyl-phenylalanyl-tryptophyl-lysylthreonyl-phenylalanyl-threonyl-seryl-2-thioäthylamid; I,

R¹ = H-Leu-Gly-Gly-Ala-Gly-NH und R² = H (H-Leu-οΐγ-

Gly-Ala-Gly-Cys-Lys-Asn-Phe-Phe-Trp-Lys-Thr-Phe-Thr-Ser-NH^CH S)

Eine Lösung von Boc-Leu-Gly-Gly-A!a-Gly-Cys(Trt)-Lys(Boc)-Asn-Phe-Phe-Trp-Lys(Boc)-Thr(Bu⁺)-Phe-Thr(Bu⁺)-Ser(Bu )-NHCH₂CH₂S-Trt (0,230 g, 0,083 mMol, in Beispiel 25 beschrieben) in Essigsäure (100 ml) wird langsam zu einer heftig gerührten Lösung von Jod (0,211 g, 0,83 mMol) in Methanol (42 ml) bei Raumtemperatur zugegeben. Nach Beendigung der Zugabe wird die Lösung 60 Min. bei Raumtemperatur gerührt. Man kühlt die Lösung auf O⁰C und gibt langsam eine Lösung von Natriumthio-

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sulfat in Wasser (1n) zu, um den Überschuß an Jod zu zerstören (farblose lösung). Das Lösungsmittel wird beinahe zur Trockene eingedampft» der Rückstand wird mit kaltem Wasser verrieben, filtriert» mit Wasser gewaschen und über PhOBphorpentoxid getrocknet. Den Feststoff wäscht man mit Äther und trocknet» wobei man das cyclische Disulfid der Formel III

Boc-Leu-G Iy-G Iy-A I'a-G I y-Cys-Ly s(Boc )-Asn-

+ t t ' Phe-Phe-Trp-Lys(Boc)-Thr(Bu )-Phe-Thr(Bu')-Ser(Bu )-NHCH₂CH₂S.

erhält.

Dieses cyclische Hexadecapeptid wird bei CPc unter einer Stickstoffatmosphäre 10 Min. lang in konz. Chlorwasserstoffsäure (7 ml) heftig gerührt. Man gibt Essigsäure (90 ml) zu und lyophilisiert die Lösung. Den Rückstand nimmt man in 2 ^iger Essigsäure in Wasser auf und lyophilisiert. Der Rückstand wird einer Verteilungschromatographie auf einer Säule mit einem chemisch modifizierten, vernetzten Dextran ("Sephadex G--25M", 3 x 50 cm» in der unteren Phase von n-Butanol/Essigsäure/ Wasser (4:1:5) und anschließend in der oberen Phase äquilibriert) unter Verwendung der oberen Phase zur Desorption des im wesentlichen reinen Hexadecapeptids, unterworfen. Die reinen Fraktionen werden vereinigt, eingedampft und lyophilisiert» wobei man die Titelverbindung in Form ihres Essigsäureadditionssalzes erhält.

²⁹° ^{(4 29}$* ^{282 i4 910)f 273 1}^ ^{(£ 4 63O)}·

Wiederholtes Lyophilisieren des letzteren Produkts aus Wasser ergibt die Titelverbindung in Form der freien Base; Aminosäureanalyse: Lys = 2,01, Asp = 1,35» Ser = 0,93» AIa = 0,99» Phe = 2,52, Cysteinsäure = 0,66, Thr = 1,98, G-Iy = 3»00, Leu = 0,96.

- 64 -

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Beispiel 27

Tert.-Butyloxycarbonyl-glycyl-glycyl-glycyl-alanyl-glycyl-S-trityl-cysteinyl-N -tert.-butyloxycarbonyl-lysyl-asparaginylphenylalanyl-phenylalanyl-tryptophyl-N^£-tert. -butyloxycarbonyl-lysyl-O-tert.-butyl-threonyl-phenylalanyl-O-tert.-butyl-threonyl-0-tert.-butyl-seryl-2-tritylthioäthylamid; II, R² = H und
R⁴" = Boc-Gly-Gly-Ala-Gly-NH

(Boc-G Iv-G W-G! y-ALa-Giy-CysCTrt)-Lv siBoc)-Asn-Phe-Phe-Trp-Lys(Boc)-ThP(Bu⁺)-Ser(Bu⁺)-NHCH₂CH₂S-TrH

Das Pentapeptidhydrazid BoC-GIy-GIy-GIy-AIa-NHNH₂ (0,0608 g, 0,141 mMol, beschrieben in Beispiel 17) wird in trockenem Dimethylformamid (6 ml) und Dimethylsulfoxid (2 ml) gelöst und auf -20⁰C gekühlt. Man gibt Chlorwasserstoffsäure in Äthylacetat (2n, 0,176 ml, 0,352 mMol) zu, gefolgt von tert.-Butylnitrit (0,0194 ml, 0,169 mMol). Die Mischung wird 15 Min. bei -15⁰C gerührt. Eine Lösung von H-Cys(Trt)-Lys(Boc)-Asn-Phe-Phe-Trp-Lys(BoC)-ThP(Bu⁺)-Phe-Thr(Bu⁺)-Ser(Bu⁺)-NHÖ^ CH Trt (0,327 g» 0,138 mMol, in Beispiel 24 beschrieben) in Dimethylformamid (4 ml), das N-Äthyldiisopropylamin (0,085 ml, 0,494 mMol) enthält, wird auf -15⁰C gekühlt und tropfenweise zur obigen Reaktionsmischung zugegeben. Man rührt noch 1 Std. bei -15⁰C und über Nacht bei Raumtemperatur. Die Reaktionsmischung wird unter vermindertem Druck eingedampft, der Rückstand mit eiskalter Zitronensäure (1n) verrieben, filtriert und mit Wasser gewaschen. Der feste Rückstand wird mit Methanol verrieben und über Phosphorpentoxid getrocknet, wobei man die Titelverbindung erhält; Aminosäureanalyse: Lys = 2,31, Cysteinsäure = 0,84, Asp = 1,00, Thr = 2,26, Ser = 1,19t GIy = 4,00, AIa = 0,84, Phe = 3,2.

- 65 -

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Beispiel 28

Cyclisches Disulfid von Glycyl-glycyl-glycyl-alanyl-glycylcysteinyl-phenylalanyl-phenylalanyl-tryptophyl-lysylthreonyl-phenylalanyl-threonyl-seryl-2-thioäthylamidj I»

R¹ = H-(JIy-GIy-GIy-AIa-GIy-NH und R² = H (H-Gly-Gly-

Γ— 1

GIy-AIa-GIy-Cys-Lys-Asn-Phe-Phe-Trp-Lys-Thr-Phe-Thr-Ser-HHCH_?CH₂S)

Eine Lösung von Boc-Gly-Gly-Gly-A!a-Gly-Cys(Trt)-Lys(Boc)-Asn-Phe-Phe-Trp-Lys(Boc)-Thr(Bu⁺)-Phe-Thr(Bu⁺)-Ser(Bu⁺)-Nh'CH₂CH₂S-Trt (0,224- g» 0,083 mMol, in Beispiel 2? beschrieben) in Essigsäure (160 ml) wird langsam zu einer heftig gerührten Lösung von Jod (0,211 g, 0,83 mMol) in Methanol (4-2 ml) bei Raumtemperatur zugegeben. Nach beendeter Zugabe rührt man die Lösung 60 Min. bei Raumtemperatur. Die Lösung wird auf O⁰C gekühlt» und eine Lösung von Natriumthiοsulfat in Wasser (in) wird langsam zugegeben, um den Überschuß an Jod zu zerstören (farblose Lösung). Das Lösungsmittel wird fast zur Trockene eingedampft, der Rückstand wird mit kaltem Wasser verrieben, filtrierte mit "Nasser gewaschen und über Phosphorpentoxid getrocknet. Den Feststoff wäscht man mit Äther und trocknet, wobei man das cyclische Disulfid der Formel III

Boc-G Iy-G Iy-Giy-AIa-G!y-Cvs-Lys(Boc)-Asn-Phe-Phe-Trp-Lys(Boc)-Thr(Bu⁺)-

Phe-Thr(Bu⁺)-Ser(Bu⁺)-NHCH₂CH₂S. erhält.

Dieses cyclische Hexadecapeptid wird bei O°C heftig unter einer Stickstoffatmosphäre 10 Min. lang in konz. Chlorwasserstoffsäure (7 ml) gerührt. Man gibt Essigsäure (90 ml) zu und lyophilisiert die Lösung. Der Rückstand wird in 2?tdger Essigsäure in Wasser aufgenommen und lyophilisiert. Man unterwirft den Rückstand einer VerteilungschromatograpMe auf einer Säule mit einem chemisch modifizierten, vernetzten Dextran ("Sephadex G-25M^:I, 3 σ 50 cm, in der unteren Phase von n-Butanol/Essigsäure/Wasser (4:1:5) und anschließend in der oberen Phase äquilibriert), wobei man die

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obere Phase zur Desorption des im wesentlichen reinen Hexadecapeptids gebraucht. Die reinen Fraktionen werden vereinigt» eingedampft und lyophilisiert, wobei man die !Eitelverbindung in Eorm ihres Essigsäureadditionssalzes erhält.

Xmax^{H 288 (£ 487}°)' ²⁸⁰ tt 5575). 274 (£ 5380), 268 (E 5185), 265 mn U 4955).

Wiederholtes Lyophilisieren des letzteren Produkts aus Wasser ergibt die Titelverbindung in Porm einer freien Base; Aminosäureanalyse: Lys = 1,72, Asp = 1,00, Ser = 0,73» AIa = 0,69, Phe = 2,78, Cysteinsäure = 0,57, Ihr = 1,69» GIy = 3,59.

Beispiel 29

Tert.-Butyloxycarbonyl-glycyl-glycyl-alanyl-glycyl-S-tritylcysteinyl-lr -tert.-butyloxycarbonyl-lysyl-asparaginyl-phenylalanyl-phenylalanyl-tryptophyl-ir -tert.-butyloxycarbonyllysyl-O-tert.-butyl-threonyl-phenylalanyl-O-tert.-butylthreonyl-0-tert.-butyl-seryl-2-tritylthioäthylamid; II,

R² = H und R⁴ = Boc-GIy-GIy-Ala-GIy-NH (Boc-G Iv-G Iy-AIa-GIy-Cys(Trt)-|_y_s( 3oc)-Asn-Phe-Phe-Trp-Lys(Boc)-Thr(Bu⁺)-Phe-Thr(Bu⁺)-Ser(Bu⁺)-NHCH₂CH2-Trt)

Zu einer Lösung von Boc-Gly-Gly-Ala-Gly-Cys(Trt)-Lys(Boc)-Asn-Phe-Phe-NHNH₂ (800 mg, 0,59 mMol, wie in Beispiel 7 beschrieben hergestellt) in Dimethylformamid (12 ml) gibt man bei -20⁰C unter Rühren eine 1»85n Lösung Chlorwasserstoff in Äthylacetat (0,795 ml, 1,475 mMol) zu. Die Mischung wird auf -15⁰C gebracht, tert.-Butylnitrit (0,081 ml, 0,71 mMol) wird zugegeben und die Lösung wird 15 Min. gerührt. Eine Lösung von H-Trp- Lys(Boc)-Thr(Bu⁺)-Phe-Thr(Bu⁺)-Ser(Bu )-NHCH₂CH₂S-Trt (0,852 g, 0,637 mMol, wie in der US-PS 3 917 581 beschrieben hergestellt) und N-Äthyldiisopropylamin (0,354 ml, 2,06 mMol) in Dimethylformamid (6»0 ml.) wird auf -15⁰C gekühlt und zur obigen Reaktionsmischung zugegeben. Man rührt die Mischung

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1 Std. bei -15⁰C und 18 Std. tei 25⁰C. Das Lösungsmittel wird eingedampft, der Rückstand wird nit eiskalter Zitronensäure verrieben, filtriert, mit Wasser, gefolgt von Methanol gewaschen und getrocknet, wobei man die Titelverbindung erhält;

Aminosäureanalyse: lys = 2,01, Asp = O,97> Thr = 1,60, Ser = 0,65, Cysteinsäure = 0,87. GIy = 2,92, AIa = 1,00, Phe = 2,97.

Beispiel 30

Cyclisches Disulfid von Glycyl-glyeyl-alanyl-glycyl-cysteinyllysyl-asparaginyl-phenylalanyl-phenylalanyl-tryptophyl-lysylthreonyl-phenylalanyl-tiLreonyl-seryl-2-thioätliylaiiiid·, I,

E¹ = H-GIy-G-Iy-GIy-AIa-GIy-NH und R² = H

(H-G Iy-GIy-A Ia-Giy-Cys-Lys-Asn-Phe-Phe-Trp-Lys-Thr-Phe-~nr-Ser-NHCH₀CFl.S)

Eoc-G Iy-GIy-AIa-G!y-Cys<Trt)-Lys(Boc)-Asn-Phe-Phe-Trp-Lys· BoO- !Ehr(Bu^t)-Phe-a}hr(Bu^t)-Ser(Bu^t)-NHCH₂CH₂S-Trt, in Eeispiel beschrieben (0,860 g, 0,30 mMol) wird in Eisessig (150 ml) gelöst und tropfenweise bei Eaumtemperatur zu einer lösung von Jod in Methanol (0,5 #> 150 ml, 30 mMol) im Verlauf von . Std. unter Rühren zugegeben. Die Mischung wird weitere «15 Min. gerührt, in einem Eisbad abgekühlt, und eine Lösung von Natriumthiοsulfat in Wasser (1n, 6 ml) wird zugesetzt, um den Überschuß an Jod zu zerstören (farblose Lösung). Bas Lösungsmittel wird eingedampft und der Rückstand wird mit Wasser verrieben, getrocknet und das trockene Produkt wird mit Isopropyläther verrieben, wobei man das cyclische Disulfid-Pentadecapeptid der Formel III

Boc-GIy-GIy-AIa-G!y-Cys-Lys(Boc)-Asn-Phe-Phe-Trp-Lys(Boc)-Thr(Bu⁺)-Phe-Thr(Bu^f)-Ser(Bu⁺)-NHCH₂CH₂S.
erhält. ·

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M/17 130

Zur letzteren Verbindung gibt man kalte konz. Chlorwasserstoff säure (23 ml) in einem Eis/Wasserbad unter einer Stickst off atmosphäre unter heftigem Rühren zu. Man rührt noch 10 Min., gibt Eisessig (300 ml) zu und lyophilisiert die Lösung. Der Rückstand wird in Wasser gelöst und wiederum lyophilisiert. Den Rückstand löst man in 0,01n wäßriger Ammoniumacetatlösung und bringt ihn auf eine Säule mit Carboxymethylcellulose ("Whatman CM-23", 2,5 χ 30 cm) auf. Die reine Verbindung wird mit 0,06n Ammoniumacetatpuffer eluiert. Das gereinigte Material wird aus Wasser lyophilisiert, wobei man die Titelverbindung als weißen Feststoff in Form ihres Essigsäureadditionssalzes erhält;

282 nm (E 5120), 289 nm (i 4610).

Wiederholtes Lyophilisieren des letzteren Produkts aus Wasser ergibt die Titelverbindung in Fora der freien Base; Aminosäureanalyse: lys = 2,06, Asp = 1,02, Thr = 1,75» Ser = 0,91» Cysteinsäure = 0,73» GIy = 3>00, AIa = 1,10, Phe = 3t11.

Auf dieselbe Weise, jedoch unter Verwendung von Thiocyanogen gemäß der Methode von H-^skey und Smith, loc.cit.» anstelle von Jod, erhält man ebenfalls die Titelverbindung.

Beispiel 31

Acetyl-(S-trityl)-cysteinyl-(ΪΓ -tert.-butoxycarbonyl)-lysyl-asparaginyl-phenylalanyl-phenylalanin-Methylester (Ac-Cys(Trt)-Lys(Boc)-Asn-Phe-Phe-OMe)

Eine Lösung von p-Nitrophenylacetat [0,191 g> 1»05 mMol, wie von F.D. Chattaway, J. Chem. Soc, 2495 (1931) beschrieben hergestellt] in Dimethylformamid (4 ml) wird bei O⁰C zu einer Lösung von H-Cys (Trt) -Lys (Boc) -Asn-Phe-Phe-OMe (0,750 g, 0,698 mMDl/ hergestellt wie von H.U. Immer et al., HeIv. Chim.Acta., 5J7, 730 (1974) beschrieben) und N-Äthyl-

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morpholin (0,1 ml) zugegeben. Nach 24-stündigem Rühren bei O⁰C wird das Lösungsmittel unter vermindertem Druck eingedampft. Den Rückstand löst man in Methanol (3 ml) und gibt ihn langsam zu Diäthyläther (2CO ml) zu. Der Niederschlag wird gesammelt und aus Äthanol kristallisiert, wobei man die Titelverbindung mit Schmelzpunkt 219»5 bis 221⁰C erhält;

= -21,6° (c = 1, Dimethylformamid).

Auf dieselbe Weise erhält man unter Verwendung der p-Nitrophenylester der Ameisen-, Propion-, Butter-, Isobutter-, Pivalin-, η-Hexan- oder Benzoesäure anstelle von p-Nitrophenylacetat, die entsprechenden Verbindungen der obigen Formel» worin Ac durch Formyl, Propionyl» n-Butanoyl» Isobutanoyl, Pivaloyl, n-Hexanoyl oder Benzoyl ersetzt ist.

Beispiel 52

Acetyl-(S-trityl)-cysteinyl-(N' -tert.-butoxycarbonyl)-lysyl-asparaginyl-phenylalanyl-phenylalanin-Hydrazid; IV,

R⁴ = NHCOCH₅ (Ac-Cys(lrt)-Lys(Boc)-ASn-PlIe-PlIe-NHNH₂)

Eine Lösung von Ac-Cys(Trt)-Lys(Boc)-Asn-Phe-Phe-OMe (0,40 g, 0,379 mMol, in Beispiel 31 beschrieben) und Hydrazinhydrat (0,37 ml, 7»58 mMol) in Methanol (15 ml) wird 48 Std. bei O⁰C gerührt. Der Niederschlag wird gesammelt und getrocknet, wobei man die Titelverbindung mit Schmelzpunkt 236 bis 237⁰C erhält; [α]ψ = -28,6° (c = 1, Dimethylformamid).

Auf dieselbe Weise erhält man unter Verwendung der in Beispiel 31 beschriebenen entsprechenden anderen Ausgangsmaterialien die entsprechenden Verbindungen der Formel IV, wo-

a -ζ χ

rin R^ für NKEr steht, wobei R^ die Bedeutungen Pormyl,

Propionyl, n-Butanoyl, Isobutanoyl, Pivaloyl, n-Hexanoyl oder Benzoyl besitzt.

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Beispiel 33

Acetyl-(S-trityl)-cysteinyl-(N^i:-tert.-butoxycarbonyl)-lysylasparaginyl-phenylalanyl-phenylalanyl-tryptophyl-(N^£-tert.-butoxycarbonyl)-lysyl-(0-tert.-butyl)-threonyl-phenylalanyl-(0-t ert. -butyl) -threonyl- (O-t ert. -butyl) -seryl-2-tri tyl tiiioäthylamid; II,

R² = H und R⁴ = NHGOCH₅ (Ac-Cys(Trt)-Lys(Boc)-Asn-Phe-Phe-Trp-Lys(Boc)-Thr(Bu¹)-Ser(Bu*)-NHCH₂CH₂S-Trt)

Eine Lösung von Ac-Cys(Trt)-Lys(Boc)-Asn-Phe-Phe~NHNH₂ (IV) (0,240 g, 0,227 mMol, in Beispiel 32 beschrieben) in trockenem Dimethylformamid (2 ml) und Dimethylsulfoxid (1 ml) wird auf -20⁰C abgekühlt. Man gibt Chlorwasserstoffsäure in Äthylacetat (2,1n, 0,273 mMol) zu, gefolgt von tert.-Butylnitrit (0,0312 ml, 0,273 mMol). Die Mischung wird 15 Min. bei -15⁰C gerührt. Eine Lösung von H-Trp-Lys(Boc)-Thr(Bu^t)-Phe-Thr(Eu^t)-Ser(Bu^t)-NHCH₂CH₂S-Trt (V, 0,304 g, 0,227 mMol, wie in der US-PS 3 917 581 beschrieben, hergestellt) in Dimethylformamid (3 ml), das N-Äthyldiisopropylamin (0,097 ml, 0,568 mMol) enthält und die auf -15⁰C gekühlt ist, wird tropfenweise zur obigen Reaktionsmischung zugegeben. Man rührt die Mischung 1 Std. bei -15⁰C und 20 Std. bei 25⁰C. Das Lösungsmittel wird unter vermindertem Druck eingedampft. Den Rückstand verreibt man mit eiskalter Zitronensäurelösung (1n), filtriert, wäscht mit Wasser und trocknet über Phosphorpentoxid. Der feste Rückstand wird mit Methanol verrieben, filtriert und über Phosphorpentoxid getrocknet, wobei man die Titelverbindung erhält; Aminosäureanaly&e: Lys = 1,82, Asp = 1,00, Ser = 0,76, Cysteinsäure = 0,93» Thr = 1,87, Phe = 3,10.

Auf dieselbe Weise erhält man unter Verwendung der entsprechenden anderen Ausgangsmaterialien der Formel IV, worin R⁴ die Bedeutung NHR⁵ besitzt und die in Beispiel 32 beschrieben sind, die entsprechenden Verbindungen der Formel II, worin R die Bedeutung H besitzt und R^ für Nmr steht, wobei

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M/17 130

3
R die Bedeutungen Formyl, Propionyl, n-Butanoyl, Isobutanoyl, Pivaloyl» n-Hexanoyl oder Benzoyl_t besitzt.

Beispiel 34

Cyclisches Disulfid von Acetyl-cysteinyl-lysyl-asparaginylphenylalanyl-phenylalanyl-tryptophyl-lysyl-threonyl-phenylalanyl-threonyl-seryl-2-thioäthylamid; I,

R¹ = NHCOCH₃ und R² = H

(Ac-Cys-Lys-Asn-Phe-Phe-Trp-Lys-Thr-Phe-Thr-Ser-NHC^C^S)

Eine Lösung von Ac-Cys(Trt)-Lys(Boc)-Asn-Phe-Phe-Trp-Lys(Boc)-Thr-(Bu^t)-Phe-Thr(Bu^t)-Ser(Bu^t)-NHCH₂CH₂S-Trt (0,260 g, 0,110 mMol, in Beispiel 33 beschrieben) in Essigsäure (61 ml) wird langsam zu einer gerührten lösung von Jod (0,278 g, 1,1 mMol) in Methanol (56 ml) bei 25⁰C zugegeben. Nach beendeter Zugabe wird die Lösung 1 Std. bei 25⁰C gerührt. Man kühlt die Lösung auf O⁰C und gibt eine Lösung von 1n Natriumthiosulfat in Wasser langsam zu, um den Überschuß an Jod zu zerstören (farblose Lösung). Das Lösungsmittel wird unter vermindertem Druck eingedampft und der Rückstand wird mit Wasser verrieben. Der Niederschlag wird gesammelt, mit Wasser gewaschen und über Phosphorpentoxid getrocknet, wobei man das cyclische geschützte Undecapeptid der Formel III

Ac-C^s-Lys(Boc)-Asn-Phe-Phe-TrD-l_VS(Boc)-Thr(Bu⁺)-Phe-Thr(Bu⁺)-Ser(Bu⁺)-NHCHCHS

erhält.

Das letztere cyclische Peptid wird bei O⁰C unter einer Stickstoffatmosphäre 10 Min. lang in konz. Chlorwasserstoffsäure (9t1 ml) heftig gerührt. Man gibt Essigsäure (119 ml) zu und lyophilisiert die Lösung sofort. Den Rückstand löst man in Wasser und lyophilisiert. Der Rückstand

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wird in der oberen Phase des Lö'sungsmittelsystems Butanol/ Essigsäure/Wasser (4:1:5) gelöst und auf eine Säule mit einem chemisch modifizierten vernetzten Dextran (Sephadex G-25M), hergestellt in der unteren Phase des Lösungsmittelsystems, aufgegeben. Die obere Phase des obigen Lösungsmittelsystems wird verwendet, um das Undecapeptid zu desorbieren. Die das reine Produkt enthaltenden Fraktionen werden vereinigt und unter vermindertem Druck eingedampft. Den Rückstand verreibt man mit Diäthyläther, löst ihn in 5$iger Essigsäure und lyophilisiert, wobei man die Titelverbindung in Form des Essigsäureadditionssalzes erhält.
UV (Methanol): λ max 290 (ε 4990), 282 (S 5455).

274 nm (£ 5095).

Die letztere Verbindung in Form des Essigsäureadditionssalzes wird einer wiederholten Lyophilisierung aus Wasser unterworfen, wobei man die Titelverbindung in Form der freien Base erhält;

Aminosäureanalyse: Lys = 1,93, Asp = 1,00, Ser = 0,84» Cysteinsäure = 0,80, Thr = 1,84, Phe = 2,97.

Auf dieselbe Weise erhält man unter Verwendung der entspre-

2 chenden anderen Ausgangsmaterialien der Formel II, worin R

4 3

für H steht und R die Bedeutung UHR besitzt, und die in Beispiel 33 beschrieben sind, die entsprechenden Verbindungen der Formel III und I, worin R für H steht, und R bzw.

1 ^ 3

R für NIEEr stehen, worin R die Bedeutungen Formyl,

Propionyl, n-Butanoyl, Isobutanoyl, Pivaloyl, n-Hexanoyl oder Benzoyl, besitzt.

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Μ/17 Ϊ30

Beispiel 35

3-Tritylthiopropionsäurepentachlorphenylester (Trt-SCH₂CH₂C00Pcp)

Man löst 3-Tritylthiopropionsäure [i,0 g, 2ß7 mMol, von R.C. Hiskey und M.A. Harpold, J. Org. Chem., 33., 559 (1968) beschrieben] in trockenem Tetrahydrofuran (25 ml) und gibt Pentachlorphenol (0,765 g» 2,87 mMol) zu. Die Mischung wird auf O⁰C gekühlt, man gibt Dicyclohexylcarbodiimid (0,596 g, 2,87 mMol) zu und rührt die Reaktionsmischung 1 Std. bei O⁰C und 1 Std. bei 25⁰C. Dann wird die Reaktionsmischung auf O⁰C gekühlt, filtriert und das Piltrat wird unter vermindertem Druck eingedampft. Den Rückstand kristallisiert man aus Äthylacetat, wobei man die Titelverbindung mit Schmelzpunkt 154 bis 156⁰C erhält.

Beispiel 36

3-Tritylthiopropionyl-(lT-tert.-butoxycarbonyl)-lysylasparaginyl-phenylalanyl-phenylalanin-Methylester (Trt-SCH₉CH₉CO-Lys(Boc)-Asn-Phe-Phe-OMe)

Eine Lösung von 3-Tritylthiopropionsäurepentachlorphenylester (0,597 g» 1 mMol, in Beispiel 35 beschrieben), H-Lys(Boc)-Asn-Phe-Phe-OMe·HOAc [1 mMol, hergestellt wie von H.H. Immer et al., HeIv. Chim. Acta., £7, 730 (1974) beschrieben] und Triäthylamin (0,14 ml, 1 mMol) wird 3 Tage bei 25⁰C gerührt. Das lösungsmittel wird unter vermindertem Druck eingedampft. Den Rückstand verreibt man mit eiskalter 1n Zitronensäurelösung, filtriert, wäscht mit Wasser und trocknet über Kaliumhydroxid. Der Feststoff wird aus Methanol kristallisiert, wobei man die Titelverbindung mit Schmelzpunkt 215 bis 220⁰C erhält.

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M/17 130

Beispiel 37

3-Tritylthiopropionyl-(N^£-tert.-butoxycarbonyl)-lysylasparaginyl-phenylalanyl-phenylalanin-Hydrazid; IV,

R⁴ = H (Trt-SCH₂CH₂C0-Lys(Boc)-Asn-Phe-Phe-NHNH₂)

Eine Lösung von Trt-SCH₂CH₂C0-Lys(3oc)-Asn-,Phe-Phe-0Me (0,900 g, 0,9 mMol, in Beispiel 36 beschrieben) und Hydrazinhydrat (1 ml) in Dimethylformamid (20 ml) wird 20 Std. bei 25⁰C gerührt. Das Lösungsmittel wird unter vermindertem Druck eingedampft. Den Rückstand verreibt man mit kaltem Wasser, filtriert, wäscht mit Wasser und trocknet, wobei man die Titelverbindung mit Schmelzpunkt 225 bis 235⁰C erhält.

Beispiel 38

3-Tritylthiopropionyl-(N^£-tert.-butoxycarbonyl)-lysylasparaginyl-phenylalanyl-phenylalanyl-tryptophyl-(Ν^ε-tert.-botoxycarbonyl)-lysyl-(O-tert.-butyl)-threonyl-phenylalanyl-(O-tert.-butyl)-threonyl-(O-tert.-butyl)-seryl-2-tritylthioäthylamid; II,

R² und R⁴ = H
(Trt-SCH₂CH₂CO-Lys(Boc)-Asn-Phe-Phe-Trp-Lys(Boc)-Thr(Bu )-

Phe-Thr(Bu*)-Ser(Bu*)-NHCH₂CH₂S-Trt)

Eine Lösung von Trt-SCH₂CH₂C0-Lys(Boc)-Asn-Phe-Phe-NHNH₂ (0,500 g, 0,5 mMol, in Beispiel 37 beschrieben) in Dimethylsulfoxid (5 ml) und Dimethylformamid (20 ml) wird auf -2O⁰C gekühlt. Man gibt eine Lösung von Chlorwasserstoffsäure in Äthylacetat (1,4n, 0,895 ml) zu, gefolgt von tert.-Butylnitrit (0,069 ml, 0,6 mMol). Die Mischung wird 15 Min. bei -15⁰C gerührt und eine auf -15⁰C gekühlte Lösung von H-Trp-Lys(Boc)-Thr(Bu*)-Phe-Thr(Bu*)-Ser(Bu*)-NHCH₂CH₂S-Trt (0,670 g, 0,5 mMol, wie in der US-PS 3 917 581 beschrieben hergestellt) und N-Äthyldiisopropylamin (0,214 ml, 1,25 mMol)

-.75 -609851/1117

in Dimethylformamid (10 ml) wird zugegeben. Die Reaktionsmischung wird 1 Std. bei -15⁰C und 20 Std. bei 25⁰C gerührt und unter vermindertem Druck eingedampft. Den Rückstand verreibt man mit eiskalter 1n Zitronensäurelösung» filtriert» wäscht mit Wasser und trocknet über Phosphorpentoxid. Der Peststoff wird mit kaltem Methanol verrieben und getrocknet, wobei man die Titelverbindung erhält; Aminoeäureanalyse: Lys = 1,99» Asp = 1»15» Ihr = 1,73» Ser = 0,67» Phe = 3»00.

Beispiel 39

Cyclisches Disulfid von 3-Thiopropionyl-lysyl-asparaginylphenylalanyl-phenylalanyl-tryptophyl-lysyl-threonyl-phenylalanyl-threonyl-seryl-2-thioäthylamid; I,

R¹ und R² = H

(SGH₀CH₀CO-LyS-Asn-Phe-Phe-Trp-Lys-Thr-Phe-Thr-Ser-

ι ^{ά ά}

NHCH₂CH₂S)

Eine lösung von Trt-SCH₂CH₂C0-Lys(Boc)-Asn-Phe-Phe-Trp-Lys(Boc)-

Thr(Bu⁺)-Phe-Thr(Bu⁺)-Ser(Bu⁺)-NHCH CH S-Trt (°»500 g, 0,216 mMol, in Beispiel 38 beschrieben) in Essigsäure (100 ml) wird langsam bei 25⁰C zu einer gerührten Lösung von Jod (0,547 g» 2,16 mMol) in Methanol (110 ml) zugegeben. Nach beendeter Zugabe wird die Lösung 1 Std. bei 25⁰C gerührt. Man kühlt die Lösung auf O⁰C und gibt eine.Lösung von 1n Natriumthiosulfat in Wasser langsam zu, um das überschüssige Jcd zu zerstören (farblose Lösung). Das Lösungsmittel wird unter vermindertem Druck eingedampft und der Rückstand wird mit Wasser verrieben. Man sammelt den Niederschlag» wäscht mehrmals mit Wasser und trocknet über Phosphorpentoxid, wobei man das cyclische geschützte Decapeptid der Formel III

SCH₂CH₂C0-Lys(Boc)-Asn-Phe-Phe-Trp-Lys(Boc)-Thr(Bu^t)· Phe-Thr(Bu⁺)-Ser(Bu⁺)-NHCH₉CH7s.

- 76 -

609851/1117

erhält.

Das letztere cyclische Decapeptid wird bei O⁰C unter einer Stickstoffatmosphäre 10 Min. lang in konz.'Chlorwasserstoffsäure (18 ml) heftig gerührt. Man gibt Essigsäure (200 ml) zu und lyophilisiert die Lösung sofort. Den Rückstand löst man in Wasser und lyophilisiert. Der Rückstand wird in der oberen Phase des Lösungsmittelsystems Butanol/Essigsäure/ Wasser (4:1:5) gelöst und auf eine Säule mit chemisch-modifiziertem, vernetztem Dextran (Sephadex G-25M), hergestellt in der unteren Phase des Lösungsmittelsystems, aufgegeben. Die obere Phase des obigen Lösungsmittelsystems wird zur Desorption des Decapeptids verwendet. Die das reine Produkt enthaltenden Fraktionen werden vereinigt und unter vermindertem Druck eingedampft. Den Rückstand löst man in 5$iger Essigsäure und lyophilisiert, wobei man die Titelverbindung in Form des Essigsäureadditionssalzes erhält. U.V. (Methanol): λ max 290 (£4920), 282 nm (E 5390).

Die letztere Verbindung in Form des Essigsäureadditionssalzes wird wiederholt aus Wasser lyophilisiert, wobei man die Titelverbindung in Form der freien Base erhält; .Aminosäureanalyse: Lys = 1,97» Asp = 1,00, Thr = 1,64, Ser = 0,65» Phe = 2,94.

- 77 -

609851 /1117

«/π i,o

Beispiel 40

α,a-Dimethyl-3 > 5-dimethoxybenzyloxycarbonyl-tryptophyl-N tert.-butyloxycarbonyl-lysyl-O-tert.-butyl-threonyl-phenylalanyl-O-tert.-butyl~threonyl-0-tert.-butyl-seryl-S-tritylcystein-Methylester
(Ddz-Trp-Lys(Boc)-Thr(Bu^t)-Plie-Tlir(Bu^t)-Ser(Bu^t)-Cys(Trt)-OMe)

Eine Lösung von Diazomethan in Äther wird zu einer Lösung von Ddz-Trp-Lys(Boc)-Thr(Bu^t)-Phe-Thr(Bu^t)-Ser(Bu^t)-Cys(Trt)-OH (12,6 g, 0,785 mMol, von H.U. Immer et al.,HeIv. Chim. Acta, £7, 730 (1974) beschrieben) in Methanol (10 ml) bei O⁰G zugegeben. Man rührt die Mischung 1 Std. bei O⁰C und dampft ein. Der Rückstand wird auf Silikagel unter Verwendung von 3 % Methanol und 0,5 $> Pyridin in Chloroform zur Eluierung chromatographiert. Eindampfen des Eluats ergibt die Titelverbindung;

NMR (CDCl₃): ef1,13 (β, 18H), 1,27 (s, 9H), 1,48(s, 9H), 1,77 (s, 6H), 3,68 (s, 3H), 3,79 (s, 6H), 7,1 - 7,6 (m, 23H).

Auf dieselbe Weise erhält man unter Verwendung von Diazoäthan, 1-Diazopropan, 2-Diazopropan, 1-Diazobutan, 1-Diazoisobutan, 1-Diazορentan, 4-Diazo-2-methylbutan, 1-Diazohexan, 1-Diazoheptan oder 1-Diazooctan anstelle von Diazomethan, die entsprechenden Äthyl-» Propyl-, Isopropyl-, n-Butyl-, Isobutyl-, n-Pentyl-, 2-Methylbutyl-, n-Hexyl-, n-Heptyl- und n-Octylester der Titelverbindung.

Beispiel 41

S-Tritylcystein-decylester (H-Cys(Trt)-OCH₂(CH₂)gCH₃)

Eine Lösung von Cysteindecylester-hydrochlorid (0,894 g, 3 mMol, wie von Voullie et al., franz. Zusatzpatent 75 157 (1961), CA. £7, 15235c, be schrieb en. hergestellt), Triphenylcarfcdnal (0,78 g, 3 mMol) und Bortrifluorid-ätherat (0,42 ml) in Essigsäure (5,2 ml) wird 1 Std. bei Raumtemperatur gerührt.

- 78 -609851 /1117

M/17 130

Man entfernt das lösungsmittel unter vermindertem Druck und chromatographiert den Rückstand auf Silikagel unter Verwendung von 40 io Äthylacetat in Hexan, das 0,1 % Triäthylamin enthält, als Eluiermittel. Eindampfen des Eluats ergibt die !Eitelverbindung in Form eines Öls; [aJ^⁵ = +25,84° (c = 1, CHCl₃);

NMR (CDCl₃) :£ 0,89 (t, J = 5Hz, 3H), 1,3 (s, 16H),

1.55 (m, 2H), 2,55 (m, 2H), 3.25 (2d, J = 5Hz, 1H), 4,1 (t, J = 6Hz, 2H).

Auf dieselbe Weise erhält man unter Ersatz des AusgangsmaterialB durch eine äquivalente Menge an Cysteintetradecyl ester-hydrochlorid (wie von Voullie et al., loc.cit. beschrieben hergestellt), den S-Tritylcysteintetradecylester mit folgenden Daten:

[cc J^⁵ = +13,8° (c = 1, CHCl₃); NMR (CDCl₃) :ef 0,89 (t, J = 5Hz, 3H), 1,3 (s, 24H),

1.56 (m, 2H), 2,55 (m, 2H), 3,25 (2d, J = 5Hz, 1H), 4,1 (t, J = 6Hz, 2H).

Auf die gleiche Weise erhält man auch die entsprechenden Nonyl-, Undecyl-, Dodecyl- und Tridecylester von S-Tritylcystein.

Kuppeln der obigen Ester von S-Tritylcystein mit dem Hexapeptidhydrazid der Formel

NHNH₂

nach der Azidmethode ergibt die der Titelverbindung von Beispiel 40 entsprechenden Nonyl-, Decyl-, Undecyl-, Dodecyl-, Tridecyl- und Tetradecylester.

- 79 6 0 9 8 51/1117

M/17 130 *^U

Beispiel 42

Tryptophyl-N -tert.-butyloxycarbonyl-lysyl-O-tert.-butylthreonyl-phenylalanyl-O-tert.-butyl-threonyl-O-tert.-butyl seryl-S-trityl-cystein-ifethylester-Eormiat; V,

R² = COOCH₅

Eine Lösung von Ddz-Trp-Lys(Boc)-Thr(Bu )-Phe-Thr(Bu⁺)-Ser(Bu⁺)-Cys(Trt)-OMe (1,11 g, 0,685 mMol, in Beispiel 40 beschrieben) in 10 ml einer Mischung aus Ameisensäure/Essigsäure/ Wasser (1:7:2) wird über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Man dampft die Mischung ein und verreibt den Rückstand mit Wasser. Der Feststoff wird durch Filtrieren gesammelt und unter vermindertem Druck getrocknet, wobei man die Titelverb indung erhält;

3-max^H 290 (ε 6 335), 280 (£8 470), 273 ( 3 720), 216 nm (£ 78 400).

Auf dieselbe Weise erhält man unter Verwendung der anderen in den Beispielen 40 und 41 beschriebenen Heptapeptide als ii-tjgangsmaterialien die der Titelverbindung entsprechenden Äfayl-, Propyl-, Isepropyl-, η-Butyl-, Isobutyl-, n-Pentyl-, 2-"ethylbutyl-, n-Eexyl-, n-Heptyl-, n-Octyl-, n-Nonyl-, n-Decyl-, n-Undecyl-, n-Dodecyl-, n-Iridecyl- und n-Tetradecylester.

- 80 -

609851/1117

M/17 130 31

Beispiel 45

Tert.-Butyloxyearbonyl-alanyl-glycyl-S-trityl-cysteinyl-N^- tert.-butyloxycarbonyl-lysyl-asparaginyl-phenylalanyl-phenylalanyl-tryptophyl-N^£-tert.-butyloxycarbonyl-lysyl-0-tert.-butyl-threonyl-phenylalanyl-O-tert.-butyl-threonyl-O-tert.-butyl-seryl-S-trityl-cystein-Methylester; II»

R² = COOCH₃ und
R⁴ = Boc-Ala-Gly-NH

( Boc-Ala-G-ly-Cys (Trt) -lys (Boc) -Asn-Phe-Phe-Trp-Lys (Boc) ¹Q-S er (Bu¹Q-CyS (Trt)-CKe)

Zu einer Lösung des ersten Heptapeptidhydrazids (IV) Boc-Ala-Gly-Cys(Trt)-Lys(Boc)-Asn-Phe-Phe-NHUHg

(0,775 g» 0,624 mMol, von H.U. Immer et al., loc.cit. beschrieben) in Dimethylformamid (9 ml) gibt man bei -20⁰C 2,1n wasserfreien Chlorwasserstoff in JLthylacetat (1,56 mMol) gefolgt von der Zugabe von tert.-Butylnitrit (0,0863 ml, 0,749 mMol). Die Lösung wird 15 Min. bei -15⁰C gerührt. Eine Lösung des zweiten Heptapeptidmethylesters (V), H-Trp-Lys(Boc)-Thr(Bu^t)-Phe-Thr(Bu^t)-Ser(Bu^t)-Cys(Trt)-OMe-HCO₂H (0,900 g, 0,624 mMol, in Beispiel 42 beschrieben) und N-Äthyldiisopropylamin (0,373 ml, 2,184 mMol) in Dimethylformamid (5 ml) wird auf -15⁰C gekühlt und bei -15⁰C zur obigen Lösung zugegeben. Die erhaltene Mischung wird 1 Std. bei -15⁰C und 3 Tage lang bei Raumtemperatur gerührt. Man entfernt das Lösungsmittel unter vermindertem Druck. Der Rückstand wird mit 1n Zitronensäure verrieben, filtriert, der Niederschlag wird mit Wasser gewaschen und unter vermindertem Druck über Phosphorpentoxid getrocknet. Den getrockneten Rückstand verreibt man mit einer kleinen Menge Methanol und sammelt den Rückstand und trocknet, wobei man die Titelverbindung erhält;

Aminosäureanalyse: Lys = 2,06, Cysteinsäure = 1,75» Asp = 0,94, Thr = 1,93» Ser = 0,97, GIy = 1,00, AIa = 0,88, Phe = 3,10.

- 81 609851/1117

M/17 130

Auf dieselbe Weise erhält man unter Verwendung der anderen Heptapeptidalkylester der Formel V» die in Beispiel 42 beschrieben sind, die der Titelverbindung entsprechenden Äthyl-, Propyl-, Isopropyl-_f η-Butyl-, Isobutyl-» n-Pentyl-, 2-Methylbutyl-, n-Hexyl-, n-Heptyl-, n-Octyl-, n-Nonyl-, n-Decyl-, n-Undecyl-, n-Dodecyl-, n-Tridecyl- und n-Tetradecylester.

Beispiel 44

Cyclisches Disulfid von tert.-Butyloxycarbonyl-alanylglycyl-cysteinyl-N^-t ert .-butyloxycarbonyl-lysyl-asparaginylphenylalanyl-phenylalanyl-tryptophyl-N^e-tert.-butyloxycarbonyl-lysyl-O-tert.-butyl-threonyl-phenylalanyl-O-tert.-butyl-threonyl-O-tert.-butyl-seryl-cystein-Methylester; III,

R² = COOCH₃ und R⁴ = Boc-Ala-Gly-NH

(Boc-Ala-Gly-Cys-Lys (Boc) -Asn-Phe-Phe-Trp-Lys(Boc) -Thr (Bu^) SerCBu^-Cys-OMe)

Der linear geschützte Tetradecapeptidmethylester von Beispiel 43, Boc-A Ia-Gf y-Cys(Trt)-Lys( Boc)-Asn-Phe-Phe-Trp-Lys(BocMhr( Bu⁺)-Phe-Thr(Bu⁺)-Ser(Bu⁺)-Cys(Trt)-OMe (0,898 g, 0,345 mMol) wird in warmer Essigsäure (200 hlO gelöst. Die Lösung wird auf Raumtemperatur gekühlt und tropfenweise zu einer lösung von 5 % Jod in Methanol (175 ml, 3t45 mMol) Im Verlauf von 1 Std. zugegeben. Die Mischung wird 1 weitere Std. gerührt, auf O⁰C gekühlt und eine lösung von 1n Natriumthiosulfat in Wasser (15 ml) wird zugesetzt, um den Überschuß an Jod zu zerstören. Das Lösungsmittel wird eingedampft, der Rückstand wird mit Wasser verrieben und unter vermindertem Druck über Phosphorpentoxid getrocknet, wobei man die !Eitelverbindung erhält.

Auf dieselbe Weise erhält man unter Verwendung der anderen linearen geschützten Tetradecapeptidester der Formel II, die

- 82-609851/1117

in Beispiel 43 beschrieben sind, die der Titelverbindung entsprechenden Äthyl-, Propyl-, Isopropyl-, n-Butyl-, iBobutyl-, n-Pentyl-, 2-Methylbutyl-, n-Hexyl-, n-Heptyl-, n-Octyl-, n-Nonyl-, n-Decyl-, n-Undecyl-, n-Dodecyl-, n-Tridecyl- und n-Tetradecylester.

Beispiel 45

Somatostatinmethylester, cyclisches Disulfid von Alanyl-glycylcysteinyl-lysyl-asparaginyl-phenylalanyl-phenylalanyltryptophyl-lysyl-threonyl-phenylalanyl-threonyl-serylcystein-Methylester; I,

R¹ = H-Ala-Gly-NH und R² = COOCH₃

(H-AIa-Gly-Cvs-Lvs-Asn-Phe-Phe-Trp-Lys-Thr-Phe-Thr-Ser-Cvs-OMe )

Eine Lösung des cyclischen Disulfidtitelprodukts gemäß Beispiel 44, Boc-Ala-Gly-Cys-Lys(Boc)-Asn-Phe-Phe-Trp-Lys(Boc)-ThriBu^-Phe-ThriBu^-Ser^u^-Cys-OMe, (0,345 mMol) in konz. Chlorwasserstoffsäure (29 ml) wird 10 Min. bei O⁰C unter einer Stickstoffatmosphäre gerührt. Man gibt Eisessig (290 ml) zu und lyophilisiert die Lösung. Den Rückstand löst man in 5$iger Essigsäure und lyophilisiert wiederum. Der Rückstand wird in 0,2 m Ammoniumacetat gelöst, auf eine Säule mit Carboxymethylcellulose (Whatman CM-23) aufgegeben und mit 0,2 m Ammoniumacetatpuffer eluiert. Das Eluat wird lyophilisiert. Der Rückstand wird einer Verteilungschromatographie auf einer Säule mit einem chemisch modifizierten, vernetzten Dextran (Sephadex G-25M), das in der unteren Phase von n-Butanol/Essigsäure/Wasser (4:1:5) und dann in der oberen Phase äquilibriert wurde, unterworfen, wobei man die obere Phase zur Desorption des Somatostatinmethylesters verwendet. Man vereinigt die reinen Fraktionen, dampft ein und lyophilisiert, wobei man die Titelverbindung in Form ihres Essigsäureadditionssalzes erhält;

- 83 609851/1117

M/17 130

²⁹° ^{(£ 4 345)f 287 (ε 4 385)> 268 (ε 4 090)>} 265 (E 3 900), 215 nm (£ 38 305);

alkalische Hydrolyse und Gaschromatographie: berechnet für Methanol 1»75 $» gefunden 2,0 %;

NMR (DMS0-d₆): cT3,63 (s, 3H, OCH₃).

Wiederholtes Lyophilsieren des letzteren Säureadditionssalzes aus Wasser ergibt die Titelverbindung in Form der freien Base;

Aminosäureanalyse: Lys = 2,00, Cysteinsäure = 1,28, Asp = 0,95. Thr = 1,91, Ser = 0,97. GIy = 1,00, AIa = 0,94, 1/2 Cys = 0,30, Phe = 3,01.

Auf dieselbe Weise erhält man unter Verwendung der anderen cyclischen Disulfide der Formel III, die in Beispiel 44 beschrieben sind, die der Titelverbindung entsprechenden Äthyl-, Propyl-, Isopropyl-, η-Butyl-, Isobutyl-, n-Pentyl-, 2-Methylbutyl-, n-Hexyl-, n-Heptyl-, n-Octyl-, n-Nonyl-, n-Decyl-, n-Undecyl-, n-Dodecyl-, n-Tridecyl- und n-Tetradecylester.

Beispiel 46

Somatostatinmethylester, lineare reduzierte Form, Alanylglycyl-eysteinyl-lysyl-asparaginyl-phenylalanyl-phenylalanyl-tryptophyl-lysyl-threonyl-phenylalanyl-threonylseryl-cystein-Methylester; Ia,

R¹ = H-Ala-Gly-NH und R² = COOCH₃ (H-AIa-Gly-Cys-Lys-Asn-Phe-Phe-Trp-Lys-Thr-Phe-Thr-Ser-Cys-0Me)

(a) Befolgt man die Arbeitsweise des Beispiels 45, ersetzt jedoch das cyclische Disulfidtitelprodukt gemäß Beispiel 44 durch eine äquivalente Menge an Titelverbindung gemäß Beispiel 43» so erhält man Boc-Ala-Gly-Cys(Trt)-Lys(Boc)-Asn-Phe-Phe-Trp-Lys(Boc)-Thr(Bu^)7

- 84'-609851/1117

M/17 130

Phe-Thr(Bu^t)-Ser(Bu^t)-Cys(Trt)-OMe, die Titelverbindung dieses Beispiels.

(b) Alternativ erhält man auch die Titelverbindung, indem man den wie in Beispiel 45 erhaltenen Somatostatinmethylester mit Dithioaerytrit, oder mit Natriumbisulf it, gefolgt von Hydrolyse des hierbei erhaltenen Dithiosulfatderivats, behandelt.

Auf dieselbe Weise wie unter Punkt (a) oder (b) beschrieben, erhält man unter Verwendung der anderen Somatostatinalkyl-

1 2

ester der Formel I, worin E für H-AIa-Gly-NH steht und R die Bedeutung COCAIk besitzt, wie in Beispiel 45 beschrieben erhalten, oder der in Beispiel 43 beschriebenen anderen linearen, geschützten Tetradecapeptidester, die der Titelverbindung entsprechenden Äthyl-, Propyl-, Isopropyl-, n-Butyl-, Isobutyl-, n-Pentyl-, 2-I'Iethylbutyl-, n-Hexyl-, n-Heptyl-, n-Octyl-, n-Nonyl-, n-Decyl-, n-Undecyl-, n-Dodeeyl-, n-Tridecyl- und n-Tetradecylester.

- 85 -

609851/1117

Claims (69)

M/17 130 PATENTANSPRÜCHE

1./ Verfahren zur Herstellung eines Peptide der Formel I

SCH₂CH(R¹ )C0-Lys-Asn-Phe-Phe-Trp-Lys-Thr-Phe-Thr-Ser-MHCH(R²) CH₂S

(D

und seines linearen reduzierten Peptids der Formel Ia HSCH₂CH(R¹)CO-Lys-Asn-Phe-Phe-Trp-Lys-Thr-Phe-Thr-Ser-NHCH(R )CH₂SH

(Ia)

worin:

(a) R¹ für H-Gly-Gly-Ala-Gly-NH, H-Gly-Gly-Gly-Ala-Gly-NH oder H-Leu-Gly-Gly-Ala-Gly-NH steht und R² die Bedeutungen H oder COOH "besitzt; oder

(b) R¹ für H oder NHR⁵ steht, worin Έ? Acyl oder

ρ Benzoyl bedeutet und worin R für H steht; oder

(c) R¹ für H-Ala-Gly-NH steht und R² die Bedeutung COOAIk besitzt, worin Alk eine geradkettige oder verzweigte Alkylgruppe mit 1 bis 14 Kohlenstoffatomen bedeutet;

dadurch gekennzeichnet, daß man: ein lineares Peptid der Formel II

- 86 -

609851/1117

M/17 130

Trt-SCH₂CH(R )-CO-Lys(Boc)-Asn-Phe-Phe-Trp-Lys(Boc)-Thr(Bu⁺)-Phe-Thr(Bu⁺)-Ser(Bu⁺)-NHCH(R²)CH₂S-TM-

(ID

worin:

(a) E für H oder COOH steht und R⁴" die Bedeutungen Boc-Gly-Gly-Ala-Gly-NH, Boc-Gly-Gly-Gly-Ala-Gly-NH oder Boc-Leu-Gly-Gly-Ala-Gly-NH besitzt; oder

(b) R² für H steht und R⁴ die Bedeutungen H oder NHR³ besitzt, worin R die vorstehende Definition besitzt; oder

(c) R für COOAIk steht und R^ die Bedeutung Boc-Ala-GIy-NH besitzt,

mit Jod oder Thiocyanogen oxidiert, wobei man das entsprechende cyclische Disulfidderivat der Formel III

SCH₂CH(R⁴)CO-Lys(Boc)-Asn-Phe-Phe-Trp-Lys(Boc)-

Thr(Bu⁺)-Phe-Thr(B'j⁺)-Ser(Bu⁺)-NHCH(R²)CH₂S (III)

O Λ

erhält, worin R und R die vorstehenden. Definitionen besitzen und anschließend unter mäßig-sauren Bedingungen sämtliche verbleibenden Schutzgruppen entfernt» wobei man das entsprechende Peptid der Formel I erhält, oder das lineare Peptid der Formel II einer Behandlung entweder mit Quecksilber-II-chlorid, Silberacetat oder Silbernitrat unterwirft, um die Sulfhydrylschutzgruppen selektiv zu entfernen, wobei man das Quecksilber-II- bzw. Disllbersalz des entsprechenden Disulfhydrylderivats erhält, das letztere Salz durch Behandlung mit Schwefelwasserstoff in das entsprechende freie Disulfhydrylderivat überführt, das zuletzt genannte Derivat

- 97 609851/1117

M/17 130

durch Behandeln mit Sauerstoff» 1,2-Dijodäthan, Natrium- oder Kaliumhexacyanoferrat-III oder Jod oxidiert, wobei man das entsprechende cyclische Disulfidderivat der Formel III erhält, und die verbleibenden Schutzgruppen unter mäßig-sauren Bedingungen entfernt, wobei man das gewünschte Peptid der Formel I erhält, oder das lineare Peptid der Formel II oder das Disulfhydrylderivat mäßig-SÄuren Bedingungen unterwirft, wobei man das entsprechende lineare reduzierte Peptid der Formel Ia erhält.

2. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Lösung des linearen Peptids der Formel II in Essigsäure mit Jod in einer Lösung eines niedrigen Alkanols oder Essigsäure behandelt, das entsprechende cyclische Disulfid der Formel III mit Chlorwasserstoffsäure behandelt und das entsprechende Peptid der Formel I isoliert.

3. Verfahren gemäß Anspruch 1» dadurch gekennzeichnet, daß man das lineare Peptid der Formel II einer Behandlung mit Jod bei ungefähr 0 bis 30⁰C während ungefähr 30 bis 180 Minuten in einem niedrigen Alkanol oder in Essigsäure unterwirft, wobei man das entsprechende cyclische Disulfid der Formel III erhält.

4. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man das cyclische Disulfid der Formel III mit konz. Chlorwasserstoffsäure bei ungefähr O⁰C während ungefähr 5 bis 10 Minuten behandelt, wobei man das entsprechende Peptid der Formel I erhält.

5. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man das dort definierte lineare Peptid (II) mäßig-sauren Bedingungen unterwirft, wobei man das entsprechende lineare reduzierte Peptid der Formal Ia

-.88 -

609851/1117

ORIGINAL INSPECTED

HSCH₂CH(R¹)CO-Lys-Asn-Phe-Phe-Trp-Lys-Thr-Phe-Thr-Ser-NHCH(R )CH₂SH

(Ia)

1 2

worin R und R die dort genannten Bedeutungen besitzen,

erhält.

6. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man das dort definierte entsprechende Disulfhydrylderivat mäßig-sauren Bedingungen unterwirft, wobei man das entsprechende lineare reduzierte Peptid der Formel Ia

HSCH₂CH(R')C0-Lys-Asn-Phe-Phe-Trp-Lys-Thr-Phe-Thr-Ser-NHCH(R*")a-l₂SH

(Ia)

1 2

worin R und R die vorstehenden Definitionen besitzen,

erhält.

7. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man das lineare Peptid der Formel II nach der Azidkupplungsmethode durch Reaktion eines Peptids der Formel IV

TM-SCH₂CH (R⁴)C0-Ly s (Boc) -Asn-Phe-Phe-NHNH₂ ( jy )

mit einem Peptid der Formel V
H-Trp-Lys(Boc)-Thr(Bu⁺)-Phe-Thr(Bu⁺)-Ser(Bu⁺)-NHCH(R²)CH S-Trt

O A

worin R und R wie in Anspruch 1 definiert sind, umsetzt,

ρ wobei man das lineare Peptid der Formel II» worin R und

R die vorstehenden Definitionen besitzen, erhält.

8. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß

2 man das lineare Peptid der Formel II, worin R für H oder

- 89 609851/1117

μ/π 130

COOH steht und R⁴ die Bedeutungen Boc-Gly-Gly-Ala-Gly-NH, Boc-Gly-Gly-Gly-Ala-Gly-NK oder Boc-Leu-Gly-Gly-Ala-Gly-NH besitzt, nach der Azidkupplungsmethode durch Reaktion eines Pentapeptids der Formel VI

Trt-Cys(Trt)-Lys(Boc)-Asn-Phe-Phe-NHNH₂ (yj)

mit einem Peptid der Formel V

H-Trp-Lys(Boc)-Thr(Bu⁺)-Phe-Thr(Bu⁺)-Ser(Bu⁺)-NHCH(R²)CH₂S-Trt

(V)

worin R für H oder COOH steht, herstellt, wobei man das entsprechende Peptid der Formel VII

Trt-Cys(Trt)-Lys(Boc)-Asn-Phe-Phe-Trp-Lys(ßoc)-Thr(Bu⁺)-Phe-Thr(Bu⁺)-Ser(Bu^f)-NHCH(R²)CH₂S-Trt

(VII)

worin R für H oder COOH steht, erhält, von der zuletzt genannten Verbindung die terminale Aminoschutzgruppe entfernt, wobei man das entsprechende Peptid der Formel VIII

t t H-Cys(Trt)-Lys(Boc)-Asn-Phe-Phe-Trp-Lys(Boc)-Thr(Bu )-Phe-Thr(Bu )-Ser(Bu⁺)-NHCH(R²)CH₂S-Trt

(VIII)

2
worin R für H oder COOH steht, erhält» und die zuletzt genannte Verbindung mit einem Peptid der Formel IX

R⁵-G Iy-G Iy-A Ia-G Iy-NHNH₂ (IX)

5
worin R für Boc, Boc-Gly oder Boc-Leu steht, nach der Azidkupplungsmethode umsetzt, wobei man das entsprechende lineare Peptid der Formel II erhält.

-'90 609851/1117

9. Verfahren gemäß Anspruch 7» dadurch gekennzeichnet, daß man das Peptid der Formel IV

TrtSCH₂CH(R⁴)C0-Lys(Boc)-Asn-Phe-Phe-NHNH₂ (IV)

worin R^ für Boc-Gly-G Iy-AIa-GIy-NH, Boc-GIy-G Iy-GIy-AIa-G Iy-NH oder Boc-Leu-Gly-Gly-Ala-Gly-IIH steht, gemäß der Azidkupplungsmethode durch Reaktion eines Peptids der Formel IX

R⁵-G Iy-GIy-AIa-Gly-NHNH₂ c

worin R·^ für Boc, Boc-Gly oder Boc-Ieu steht, mit einem Pentapeptid der Formel

H-Cys(Trt)-Lys(Boc)-Asn-Phe-Phe-OMe

herstellt» wobei man das entsprechende Peptid der Formel

R -GIy-GIy-AIa-Gly-Cys(Trt)-Lys(Boc)-Asn-Phe-Phe-OMe

worin R** die vorstehenden Definitionen besitzt, erhält, und anschließend die zuletzt genannte Verbindung mit Hydrazinhydrat umsetzt und das Peptid der Formel IV isoliert.

10. Verfahren gemäß Anspruch 7» dadurch gekennzeichnet, daß man das Peptid der Formel IV

Trt-SCH2CH(R⁴)C0-Lys(Boc)-Asn-Phe-Phe-NHNH₂ (IV)

worin R⁴ für NHR⁵ steht, worin R die Bedeutungen Acyl oder Benzoyl. besitzt, durch Acylieren des Peptids der Formel

H-Cys(Trt)-Lys(Boc)-Asn-Phe-Phe-OMe - 91 -

. ' 609851/1117

herstellt» wobei man das entsprechende Pentapeptid der Formel

R-Cys(Trt)-Lys(Boc)-Asn-Phe-Phe-OMe

erhält und anschließend die zuletzt genannte Verbindung mit Hydrazinhydrat umsetzt und das Peptid der Formel IV isoliert.

11. Verfahren gemäß Anspruch 7» dadurch gekennzeichnet, daß man das Peptid der Formel IV

Trt-SCH₂CH(R⁴)C0-Lys(Boc)-Asn-Phe-Phe-NHNH₂ (IV)

worin R für Wasserstoff steht, durch Reaktion eines aktivierten Esters der 3-Tritylthiopropionsäure mit dem Tetrapeptid der Formel

H-Lys(Boc)-Asn-Phe-Phe-OMe

herstellt, wobei man das Tetrapeptid der Formel Trt-SCH₂CH₂C0-Lys(Boc)-Asn-Phe-Phe-0Me

erhält und anschließend die zuletzt genannte Verbindung mit Hydrazinhydrat umsetzt und das Peptid der Formel IV isoliert.

12. Verfahren gemäß Anspruch 7» dadurch gekennzeichnet, daß

ο man das Peptid der Formel V, worin R für COOAIk steht, durch Behandeln seiner entsprechenden freien Säure mit einem Diazoalkan der Formel (Alk minus H)N₂ herstellt und das entsprechende Peptid der Formel V isoliert.

13. Verfahren gemäß Anspruch 7» dadurch gekennzeichnet, daß man das Peptid der Formel V» worin R für COOAIk steht, herstellt, indem man

- 92 -

609851/1117

(a) Cystein mit einem Alkanol der Formel AIkOH, worin Alk die vorstehende Definition besitzt, in Gegenwart von Chlorwasserstoff behandelt» wobei man das entsprechende Cysteinalkylester-hydrochlorid erhält» die zuletzt genannte Verbindung mit Triphenylcarbinol in Gegenwart von Bortrifluorid-ätherat, oder mit N-Hydroxymethylacetamid in Trifluoressigsäure, behandelt, und den entsprechenden Alkylester des entsprechend geschützten Cysteins der

Formel

H-Cys( TYt)-OAIk;

isoliert,

(b) die zuletztgenannte Verbindung gemäß der Azidmethode mit einem Hexapeptidhydrazid der Formel

Ddz-Trp-Lys(Boc)-Thr(Bu⁺)-Phe-Thr(Bu⁺)-Ser(Bu⁺)-NHNH₂

kuppelt, wobei man den entsprechenden geschützten Heptapeptidalkylester der Formel

Ddz-Trp-Lys(Boc)-Thr(Bu⁺)-Phe-Thr(Bu^f)-Ser(Bu⁺)-Cys(Trt)-OA!k

erhält, und

(c) die zuletztgenannte Verbindung mildsauren Bedingungen unterwirft und das Peptid der Formel V isoliert.

14. Verbindungen der Formel I oder Ia

SCH₂CH(R^l)C0-Lys-Asn-Phe-Phe-Trp-Lys-Thr-phe-Thr-Ser-NHCH(R²)CH₂S

(D

HSCH₂CH(R JCO-Lys-Asn-Phe-Phe-Trp-Lys-Thr-Phe-Thr-Ser-NHCH(R²)CH₂SH

(Ia) - 93 -

609851/1117

worin:

(a) R¹ für H-Gly-Gly-Ala-Gly-NH, H-Gly-Gly-Gly-Ala-NH oder H-Leu-Gly-Gly-Ala-Gly-NH steht und R² die Bedeutungen H oder COOH besitzt, oder

(b) R¹ für H oder NHR steht, worin R^ die Bedeutungen

2 Acyl oder Benzoyl besitzt und R für H steht, oder

(c) R¹ für H-Ala-Gly-NH steht und R² die Bedeutung COOAIk besitzt,

oder ein pharmazeutisch verträgliches Salz davon.

15· Verbindung der Formel I

P&e-Tlr-

naehträglich Geändert

SCH₂CH(R )CO-Lys-Asn-Phe-Phe-Trp-Lys-Thr-Eer-NHCH(R )CH₉S

(D worin:

(a) R für H-Gly-Gly-Ala-Gly-NH, H-Gly-Gly-Gly-Ala-Gly-NH oder H-Leu-Gly-Gly-Ala-Gly-NH steht und R² die Bedeutungen H oder COOH besitzt, oder

(b) R¹ für H oder NKEr steht, worin R^ Acyl oder Benzoyl

ρ
darstellt und R die Bedeutung H besitzt, oder

(c) R¹ für H-Ala-Gly-NH steht und R² die Bedeutung COOAIk besitzt,

oder ein pharmazeutisch verträgliches Salz davon gemäß Anspruch 14.

16. Verbindung gemäß Anspruch 15, worin R für

H-Gly-Gly-Ala-Gly-NH steht und R² die Bedeutung COOH besitzt.

-.94 609851/1117

m/17 130

17. Verbindung nach Anspruch 15» worin R für H-Gly-Gly-

2
Gly-Ala-Gly-NH steht und R die Bedeutung H besitzt.

18. Verbindung nach Anspruch 15, worin R -für H-Gly-Gly-Gly-Ala-Gly-NH steht und R² die Bedeutung COOH besitzt.

19. Verbindung nach Anspruch 15» worin R für H-Leu-Gly-

2
Gly-Ala-Gly-NH steht und R die Bedeutung H besitzt.

20. Verbindung nach Anspruch 15» worin R für H-Leu-Gly-Gly-Ala-Gly-NH steht und R² die Bedeutung COOH besitzt.

21. Verbindung nach Anspruch 15» worin R für H-Gly-Gly-Ala-Gly-NH steht und R die Bedeutung H besitzt.

1 2

22. Verbindung gemäß Anspruch 15» worin R und R für H

stehen.

23. Verbindung nach Anspruch 15» worin R für NHCOCH, steht

2
und R die Bedeutung H besitzt.

24. Verbindung gemäß Anspruch 15» worin R für H-Ala-Gly-NH steht und R die Bedeutung COOCH, besitzt.

25. Verbindung der Formel Ia

HSCH₂CH(R')C0-Lys-Asn-Phe-Phe-Trp-Lys-Thr-Phe-Thr-Ser-NHCH(R²)CH₂SH

(Ia)

worin:

(a) R¹ für H-Gly-Gly-Ala-Gly-NH, H-Gly-Gly-Gly-Ala-Gly-NH oder H-Leu-Gly-Gly-Ala-Gly-NH steht und R die Bedeutungen H oder COOH besitzt» oder

- 95 609851 /1117

(b) R¹ für H oder NHR⁵ steht, worin R⁵ Acyl oder

2
Benzoyl bedeutet und R die Bedeutung H besitzt,

oder

(c) R¹ für E-Ala-Gly-NH steht und R die Eedeutung COOAIk besitzt,

oder ein pharmazeutisch verträgliches Salz davon gemäß Anspruch 14.

26. Verbindung der Formel III

SCH₂CH(R⁴)C0-Lys(Boc)-Asn-Phe-Phe-Trp-Lys(Boc)-Thr(Bu⁺)-Phe-Thr(Bu⁺)-Ser(Bu⁺)-NHCHCR²)CH₂S

worin:

(a) R² für H oder COOE steht und R⁴" die Bedeutungen

Boc-Gly-Gly-Ala-Gly-NH, Boc-Gly-Gly-Gly-Ala-Gly-NH oder Boc-Leu-Gly-Gly-Ala-Gly-NH besitzt oder

(b) R für H steht und R⁴ die Bedeutungen H oder NER

•5
besitzt, worin R Acyl oder Benzoyl bedeutet, oder

(c) R² für COOAIk steht und R⁴ für Boc-Ala-Gly-NH steht.

27. Verbindung gemäß Anspruch 26, worin R für H steht und

R⁴ die Bedeutung Boc-Gly-Gly-Gly-Ala-Gly-NH besitzt.

28. Verbindung gemäß Anspruch 26, worin R für H steht und

R die Bedeutung Boc-Leu-Gly-Gly-Ala-Gly-NE besitzt.

29. Verbindung gemäß Anspruch 26, worin R für H steht und

R⁴" die Bedeutung Boc-Gly-Gly-Ala-Gly-NH besitzt.

- 96 -

609851/1117

30. Verbindung gemäß Anspruch 26, worin R für COOH steht

und R⁴ die Bedeutung Boc-Gly-Gly-Ala-Gly-NH besitzt.

31. Verbindung gemäß Anspruch 26, worin R² für GOOH steht und R^ die Bedeutung Boc-Gly-Gly-Gly-Ala-Gly-NH besitzt.

32. Verbindung gemäß Anspruch 26, worin R für COOH steht

und R⁴" die Bedeutung Boc-Leu-Gly-Gly-Ala-Gly-NH besitzt.

33. Verbindung gemäß Anspruch 26, worin R und R für H stehen'.

34. Verbindung gemäß Anspruch 26, worin R für H steht und

R⁴ die Bedeutung KHCOCH₅ besitzt.

35. Verbindung gemäß Anspruch 26, worin R für COOAIk

steht und R die Bedeutung Boc-Ala-Gly-NH besitzt.

36. Verbindung der Formel II
Trt-SCH₂CH(R⁴)C0-Lys(Boc)-Asn-Phe-Phe-Trp-Lys(Boc)-ThT(Bu⁺)-Phe-Thr(Bu⁺)-

SeT(Bu⁺)-NHCH(R²)CH₂S-TTt

worin:

(ID

(a) R² für H oder COOH steht und R⁴ die Bedeutungen Boc-Gly-Gly-Ala-Gly-NH, Boc-Gly-Gly-Gly-Ala-Gly-NH oder Boc-Leu-Gly-Gly-Ala-Gly-NH besitzt, oder

(b) R² für H steht und R⁴ die Bedeutungen H oder NHR⁵ besitzt, worin R·^ Acyl oder Benzoyl bedeutet, oder

(c) R² für COOAIk steht und R^4- die Bedeutung Boc-Ala-Gly-NH besitzt.

-. 97 -609851 /1117

37. Verbindung gemäß Anspruch 36, worin R für H steht

und R^4- die Bedeutung Eoc-Gly-Gly-Gly-Ala-Gly-NH besitzt.

38. Verbindung gemäß Anspruch 36, worin R für H steht und

R⁴- die Bedeutung Boc-leu-Gly-Gly-Ala-Gly-NH besitzt.

39. Verbindung gemäß Anspruch 36, worin R für H steht

und R^4- die Bedeutung Boc-Gly-Gly-Ala-Gly-NH besitzt.

40. Verbindung gemäß Anspruch 36, worin R für COOH steht

und Ir die Bedeutung Boc-Gly-Gly-Ala-Gly-NH besitzt.

41. Verbindung gemäß Anspruch 36, worin R für COOH steht

und ΈΓ die Bedeutung Boc-Gly-Gly-Gly-Ala-Gly-NH besitzt.

42. Verbindung gemäß Anspruch 36, worin R für COOH steht

und R^ die Bedeutung Boc-Leu-Gly-Gly-Ala-Gly-NH besitzt.

Ο A

43. Verbindung gemäß Anspruch 36, worin R und R für H stehen.

44. Verbindung gemäß Anspruch 36, worin R für H steht und

R^ die Bedeutung NHCOCK₅ besitzt.

45. Verbindung gemäß Anspruch 36, worin R für COOAIk

steht und R^ die Bedeutung Boc-Ala-Gly-NH besitzt.

46. Verbindung der Formel IV

Trt-SCH₂CH(R⁴)C0-Lys(Boc)-Asn-Phe-Phe-NHNH₂

4 "5 3

worin R für H» NHR , worin R Acyl oder Benzoyl bedeu-

- 98 609851/1117

M/17 130

tet, Boc-Gly-Gly-Ala-Gly-NH, Boc-Gly-Gly-Gly-Ala-Gly-NH oder Boc-Ieu-Gly-Gly-Ala-Gly-NH, steht.

47. Verbindung gemäß Anspruch 46, worin R für H steht.

48. Verbindung gemäß Anspruch 46, worin ΈΓ für NHCOCH₅ steht.

49. Verbindung gemäß Anspruch 46, worin R für Boc-Gly-Gly-Ala-Gly-NH steht.

50. Verbindung gemäß Anspruch 46, worin R für Boc-Gly-Gly-Gly-Ala-Gly-NH steht.

51. Verbindung gemäß Anspruch 46, worin R für Boc-Leu-Gly-Gly-Ala-Gly-NH steht.

52. Verbindung der Formel V

H-Trp-Lys(Boc)-Thr(Bu⁺)-Phe-Thr(Bu^f)-Ser(Bu⁺)-NHCH(R²)CH S-Trt

(V)

worin R² für COOAIk steht.

53. Verbindung der Formel VII

^Tr+-Cys(Trt)-Lys(Boc)-Asn-Phe-Phe-Trp-Lys(Boc)-Thr(Bu⁺)-Ph_e-Thr(Bu⁺}-Ser(Bu⁺)-NHCH(R²JCH₂S-TPt

(VII) worin R² für H oder COOH steht.

ρ

54. Verbindung gemäß Anspruch 53» worin R für H steht.

- 99 609851/1117

M/17 130

55. Verbindimg gemäß Anspruch 53f worin R für COOH steht.

56. Verbindung gemäß Formel VIII

H-Cys(Trt)-Lys(Boc)-Asn-Phe-Phe-Trp-Lys(Boc)-Thr(Bu⁺)-Phe-Thr(Bu^t)-

(VIII)

Ser(Bu⁺)-NHCH(R²)CH₂S-Trt

worin R² für H oder CCOH steht.

57. Verbindung gemäß Anspruch 56» worin R für H steht

58. Verbindung gemäß Anspruch 56» worin R für COOH

steht.

59. Verbindung der Eormel

R -GIy-GIy-AIa-GIy-OMe worin R^ für Boc, Boc-G-ly oder Boc-Leu steht.

60. Verbindung gemäß Anspruch 59» worin R^ für Boc steht,

61. Verbindung gemäß Anspruch 59» worin R für Boc-Gly steht.

62. Verbindung gemäß Anspruch 59» worin R⁵ für Boc-Leu steht.

63. Verbindung der Formel IX

R⁵-GIy-GIy-AIa-GIy-NHNH₂

(IX)

worin R-' für Boc, Boc-Gly oder Boc-Leu steht.

- 100 -

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64. Verbindung gemäß Anspruch 63> worin R für Boc steht.

65. Verbindung gemäß Anspruch 63» worin R für Eoc-Gly steht.

66. Verbindung gemäß Anspruch 631 worin R für Boc-Leu steht.

67. Pharmazeutisches Mittel, bestehend aus einer Verbindung der Formel I oder Ia gemäß Anspruch 14 und einem pharmazeutisch verträglichen flüssigen oder festen Träger hierfür.

68. Pharmazeutisches Mittel zur Behandlung von Acromegalie und verwandten hypersekretorischen endocrinen Zuständen oder zur Leitung von Diabetes bei Säugern, bestehend aus einer wirksamen Dosis einer Verbindung der Formel I oder Ia gemäß Anspruch 14.

69. Verfahren zur Herstellung eines Peptide der Formel I

SCH₂CH(R¹JCO-Lys-Asn-Phe-Phe-Trp-Lys-Thr-Phe-Thr-Ser-NHCHCR²)CH₂S

(D

und seines linearen reduzierten Peptids der Formel Ia

HSCH₂CH(R')C0-Lys-Asn-Phe-Phe-Trp-Lys-Thr-Phe-Thr-Ser-NHCH(R²)CH₂SH

(Ia)

worin:

(a) R¹ für H-GIy-(JIy-AIa-GIy-NH, H-Gly-Gly-Gly-Ala-Gly-NH oder H-LeU-GIy-GIy-AIa-GIy-NH steht und R² die Bedeutungen H oder COOH besitzt, oder

- 101 609851/1117

(b) R¹ für H oder NHR⁵, worin R⁵ Acyl oder Benzoyl be-

2
deutet, steht, und R die Bedeutung H besitzt, oder

(c) R¹ für H-Ala-Gly-NH steht und R²'die Bedeutung COOAIk besitzt,

dadurch gekennzeichnet, daß man ein lineares Peptid der Formel II

Trt-SCH₂CH(R⁴)C0-Lys(Boc)-Asn-Phe-Phe-Trp-Lys(Boc)-Thr(Bu^t)-Phe-Thr(Bu⁺)-Ser(Bu⁺)-NHCH(R²)CH₂S-Trt

worin R die vorstehende Definition besitzt und R für H, NHR , worin R die vorstehende Definition besitzt, Boc-Ala-Gly-NH, Boc-Gly-Gly-Ala-Gly-NH, Boc-Gly-Gly-Gly-Ala-Gly-NH und Boc-Leu-Gly-Gly-Ala-Gly-NH steht, oxidierenden und/oder entschützenden Verfahrensstufen unterwirft.

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