CS207570B2

CS207570B2 - Method of making the tetradecapeptide

Info

Publication number: CS207570B2
Application number: CS763695A
Authority: CS
Inventors: Nedumparambil A Abraham; Hans U Immer; Verner R Nelson; Kazimir Sestanj
Original assignee: Ayerst Mckenna & Harrison
Priority date: 1975-06-04
Filing date: 1976-06-03
Publication date: 1981-08-31
Also published as: SU639446A3; SE7606314L; IL49731A0; CH616402A5; JPS5236682A; FR2313077A1; GB1545818A; FR2313077B1; DE2625330A1; NL7606008A

Description

(54) Způsob výroby tetradekapeptidu

Vynález se týká derivátů tetradekapeptidu somatostatinu. Přesněji se týká způsobu přípravy derivátů somatostatinu a jejich solí.

Název „somatostatin” byl navržen pro faktor nalezený v hypothalamických ex traktech, který inhibuje sekreci růstového hormonu (soímatotropin). Struktura tohoto faktoru byla stanovena v práci P. · Brazeau a j. Science 179, 77 (1973) · a bylo· nalezeno, že má následující strukturu tetradekapeptidu vzorce

H—Ala—Gly—Cys—Lys—Asn—Phe—Phe —Trp—Lys—Thr—Phe—Thr—Ser—C^;ys—OH

Zkratky zde použité pro různé aminokyseliny mají následující významy: Ala, alanin; Asn, asparagin; Cys, cystein; Gly, glycin; Lys, Lysin; Phe, fenylalanin; Ser, serin; Thr, threonin a Trp, tryptofan.

Struktura tetradekapeptidu somatostatinu byla potvrzena syntézou, např. viz D. Sarantakis a W. A. McKinley, . Biochem. Biophys. Res. Coimm, 54 234 (1973), J. River a j., Compt. Rend. Ser. D, 276, 2737 (1973) a H. U. Immer aj., Helv. Chim. Acta, 57, 730 (1974).

Důležitý fyziologický účinek tohoto tetradekapeptidu jej zařazuje mezi sloučeniny vhodné pro klinickou farmakologii při léčení akromegalie a k použití při cukrovce, viz. K. Lundbaek aj., Lancet, 2, 131 (1970) a R. Guillemin v „Chernistry and Biology of Peptides”, J. Meinhofer, Ed., 3rd Američani Peptide Symposium Bosthon 1972, Ann

Arbor Science Publications, Ann Arbor, Mich., 1972.

Lineární forma· ·'· somatostatinu s dvěma thiolovými skupinami místo disulfidového můstku byla připravena a · je popsána v práci J. E. F. Rivier, J. Amer. Chem. Soc., 96, 2986 (1974). Je popsáno, že lineární forma je stejně účinná jako . somatostatin, Účinnost byla stanovena podle schopnosti obou sloučenin inhibovat rychlost sekrece růstového hormonu slizovými buňkami krys pěstovaných v jednovrstvé tkáňové kultuře.

Nedávno^ byl nalezen polypeptid jiný než přírodní hormon a jeho lineární forma má aktivitu obdobnou somatostatinu. D. Sarantakis aj., Blochiem. Biophys. Res. Coimm., 55, 538 (1973) nedávno uvedli syntézu analogu somatostatinu [Ala³·¹⁴] somatostatinu v pevné fázi. Tento analog má velmi nízkou ák tivitu, asi 0,01 ·% somatostatinu. P. Brazeau aj., Biochem. Blophys. Res. Comm., 60, 1202 (1974) nedávno uvedli syntézu řady acylovaných derivátů des-[ Ala^Gly²] metodou v pevné fázi.

Vynalez uvádí deriváty somatostatinu, které mají účinek vyšší než přírodní hormon nebo stejného . řádu . a jejich účinek je větší než účinek somatostatinu. Tyto deriváty se připravují snadno běžným způsobem, který má následující výhody: vycháSCHžCH (R1) CO—Lys—Asn—Phe—Phe —Trp—Lys

kde

a) R1 je H—Gly—Gly—Ala—Gly—NH, H—Gly—Gly—Gly—Ala—Gly—NH nebo H—Leu—Gly—Gly—Ala—Gly—NH a · R² je H nebo COOH, nebo

b) ' · R1 je· H nebo NHR³, kde R³ je acylový zbytek nerozvětvené nebo rozvětvené alifatické karboxylové kyseliny s 1 až 6 atomy uhlíku nebo benzoyl a R² je H, nebo

c) . R1 je H—Ala—Gly—NH a R2 . je COOalk, kde álk ·· je nerozvětvený nebo rozvětvený alkylový řetězec s 1 až 14 atomy uhlíku.

Terapeuticky . vhodné soli sloučenin vzorce I jsou také zahrnuty v rozsahu vynálezu.

Peptidy podle vynálezu se připravují postupem, který se vyznačuje tím, že se oxiduje lineární peptid vzorce II, zí ze snadno· dostupných materiálů a nepoužívají se škodlivá reakční činidla, probíhá snadno a používají se snadno odštěpitelné chránící skupiny.

Předcházející výhody a vlastnosti prokazují, že peptidy podle vynálezu jsou použitelné při cukrovce a pro léčení akromegalie.

Vynález se týká peptidů obecného vzorce I, —Thr—Phe—Thr—Ser —NHCH(R2)CHžS (I)

Trt—SCH2CH (R4) CO—Lys (Boc) —Asn— —Phe—Phe—Trp—Lys (Boc) —Thr (Bu+) — —Phe—Thr (Bu+) —Ser (Bu⁺) — —NHCH(R2]CH2S—Trt

....................... (Π) kde

a) R2 je· H nebo COOH a R4 je Boc—Gly—Gly—Ala—Gly—NH,

Boc—Gly—Gly—Gly—Ala—Gly—NH nebo· Boc—Leu—Gly—Gly—Ala—Gly—NH, nebo

b) R2 je H a. R4 je H nebo NHR³, kde R3 má význam uvedený výše, nebo

c) R2 je COOAlk a R4 je Boc—Ala—Gly— —NH, jodem nebo rhodanem za vzniku odpovídajícího derivátu cyklického· disulfidu vzorce III,

SCH2CH (R4) CO—Lys (Boc) — Asn—Phe—Phe—Trp—Lys (Boc) —

Thr '(Bu⁺) —Phe—Thr (Bu+) —Ser (Bu+) ·—NHCH (R2) CH2S (III) kde

R² a R4 mají · význam uvedený výše, a pak se odštěpí zbylé . chránící skupiny reakcí s 50 až 100% kyselinou trifluoroctovou nebo· roztokem' ' minerální kyseliny.

Lineární peptidy vzorce II používané jako · výchozí . sloučeniny se snadno· připraví postupem, který se vyznačuje tím, že se azidovou .metodou · nechá reagovat peptid vzorce IV

Trt—SCHžf R⁴) CO—Lys (Boc) — Asn—Phe— —Phe—NHNH2 (IV) s · peptidem vzorce V,

H—Trp—Lys (Boc) —Thr (Bu⁺)—Phe— —Thr (Bu+) —Ser(Bu+j —NHCH(R2)CH2S— —Trt (V) kde

R2 a · R4 mají význam uvedený výše, · za vzniku odpovídajícího lineárního peptidu vzorce II, kde R2 a R4 mají význam uvedený výše, nebo se azidovou metodou nechá reagovat pentapeptid vzorce VI

Trt—Cys (Trt) —Lys (Boc) — Asn—Phe— —Phe—NHNH2 (VI) s peptidem vzorce V, kde R2 je · H nebo COOH,· načež se odštěpením chránící skupiny koncové aminoskupiny získá peptid vzorce VIII,

H—Cys (Trt) —Lys (Boc) ·—Asn—Phe—Phe— —Trp—Lys(Boc)—T.hr(Bu⁺)—Phe— —Thr (Bu+) —Ser (Bu+)—NHCH (R2) CH2S— —Trt (VIII) kde

R² · je H · nebo COOH, a · posledně jmenovaná sloučenina se nechá azidovou metodou reagovat s peptidem vzorce · IX,

R5—Gly—Gly—Ala—Gly—NHNH2 (X)) kde

R⁵ je Boc, Boc—Gly nebo Boc—Ll-eu, za vzniku odpovídajícího lineárního peptidu vzorce II, kde R² je H nebo COOH a R⁴ je Boc—Gly—Gly—Ala—Gly—NH, Boc—Gly—Gly—Gly—Ala—Gly—NH nebo Boc—Lleu—Gly—Gly—Ala—Gly—NH.

Obecně zkratky v popisu používané pro označení aminokyselin a chránících skupin jsou založeny na doporučeních IUPAC-ШВ Commission on Biochemical Ncimenclature, viz Biochemistry, 11, 1726—1732 (1972). Například Cys, Lys, Asn, Phe, Trp, φ Thr a Ser znamenají ,,zbytky” L-cysteinu,

L-lysinu, L-asparaginu, L-fenylalaninu, L-tryptofanu, L-threoninu a L-serinu.

Pod pojmem „zbytky” se rozumějí zbytky • odvozené od odpovídající L-aminokyseiiny eliminací OH části karbo-xylové skupiny a IT části aminoskupiny. Veškeré aminokyseliny mají přírodní L-konfiguraci.

Řada postupů a způsobů přípravy peptidů je dobře známa. Například funkční skupiny, které se netýkají tvorby peptidické vazby, se s výhodou chrání kondensační reakcí. Například chránící skupiny vhodné pro chránění aminické funkční skupiny peptidu nebo aminokyseliny, které se nezúčastní tvorby peptidické vazby, jsou: alkoxykarbonyly, které zahrnují benzyloxykarbonyl (symbolisovaný jako Z), terc.butoixykarbonyl (symbolisovaný Boc), α,α-dimethyl-3,5-dimethoxybenzyloxykarbonyl (symbolisovaný Ddz), 2-(p-bifenylisopropyloxykarbonyl (symbolisovaný Врос), p-chlorbenzyloxykarbonyl, p-methoxybenzyloxykarbonyl, isopropyloxykarbonyl nebo ethoxykarbonyl; acylové chránící skupiny zahrnují formyl, trifluoracetyl, ftalyl, асеtyl (Ac), nebo toluensulfonyl, chránící skupiny alkylového· typu, které zahrnují trifenylmethyl nebo trityl (symbolisovaný Trt) nebo benzyl. Výhodnými chránícími skupinami v postupu podle vynálezu jsou benzyloxykarbonyl, terc.butoxykarbonyl, trifenylmethyl a a,a-dimethyl-3,5-dimethoxyben⁴ zyloxykarbonyl. Chránící skupiny pro hydro-xylserinu a tyrosinu jsou acetyl, tosyl, benzoyl, terc.butyl (symbolisovaný Bu⁺), trityl a benzyl, výhodná chránící skupina * je terc.butyl. Chrániči skupiny na síře cysteinu nebo modifikovaném cysteinu jsou například benzyl, trifenylmethyl nebo trityl (symbolisovaný Trt), benzyloxykarbonyl nebo acetamidomethyl (symbolisovaný Acm), výhodnou chránící skupinou jsou: trityl nebo acetamidomethyl. Karboxylová funkční skupina peptidu nebo aminokyseliny může být chráněna jario nižší álkylester nebo nižší ary laiky i ester včetně methylesteru (symbolisovaného OMe), ethylesteru (symbolisovaného OEt), benzylesteru (symbolisovaného OBzll a také jako substituovaný hydrazid, který zahrnuje terc.butoxykarbonylhydrazid (NHNH Boc), benzyloxykarboinylhydrazid (NHNHZ) nebo· a,a:-dimethyl-3,5-dimethoxybenzyloxykarbonylhydrazid (NHNHDdz).

Pro usnadnění kondensace peptidické karboxylové skupiny s volnou aminoskupinou jiného peptidu za vzniku nové peptidické vazby musí být koncová karboxylová skupina aktivována. Popis těchto skupin aktivujících karboxylovou skupinu je rnožnoi najít v obecných učebnicích chemie peptidu, jako je například K. D. Kopple, „Peptides and Amine Acids”, VV. A. Benjamin, lne., New York. 1936, str. 45—51 a E. Schroder a K. Lubke, „The Peptides”, vol. I, Academie Press, New York, 1965, str. 77—128. Příklady aktivovaných forem koncových karboxylových skupin jsou: chloridy kyselin, anhydridy kyselin,, azidy kyselin, aktivované estery nebo o-acyimočcviny dialkylkarbodiimidu. Následující aktivované estery jsou zejména vhodné při postupu podle vynálezu: 2,4,5-trichlorfenyl (OTcp), pentachlorfenyl(OPcp), p-nitrofenyl (ONp), nebo· 1-benzotriazolyl, rovněž vhodná pro tuto aktivaci je sukcinimidoskupina.

Výraz „azidová metoda”, jak je v tomto popisu použit, se týká spojení dvou peptidických fragmentů, které se vyznačuje tím, že se hydrazid peptidu nechá reagovat s činidlem, které in šitu poskytuje kyselinu dusitou. Vhodnými činidly pro tyto účely jsou organické nitrity, například terc.butylnitrit, isoamylnitrit, nebo dusitany alkalických kovů (např. dusitan sodný, dusitan draselný) v přítomnosti silné kyseliny, jako je kyselina chlorovodíková, sírová nebo fosforečná. Takto získaný odpovídající azid peptidu se pak nebchá reagovat s petidem s volnou aminoskupinou a získá se požadovaný peptid. Výhodné podmínky pro azidovou metodu zahrnují reakci hydrazidu peptidu s kyselinou dusitou vyvíjenou in šitu z organického dusitanu v přítomnosti silné kyseliny, s výhodou kyseliny chlorovoidíkové (pH běžně od 0,1 do 2) v bezvodém inertním organickém rozpouštědle, například dimethylformamidu, dimethylsulfoxidu, ethylacetátu, methylenchloridu, tetrahydrfuraníu, dioxanu apod., při teplotě od — 30 °C do( 20 °C, s výhodou kolem —15 °C po doňu 10 až 30 minut, a získá se tak od• povídající azid. Azid peptidu se může isolovat a krystalovat a s výhodou se ponechává v reakční směsi. Pak se azid ve výše uvedené reakční směsi nechá reagovat s peptidoivou jednotkou s volnou ammoskupinou při teplotě od — 30 °C do 20 °C po doňu jedné až dvou hodin a pak při 0 až 30 stupních Celsia po dobu 10 až 30 hodin. Akceptor kyseliny, s výhodou organické báze, například N-ethyldiisopropylamin, N-ethylmiorfolin nebo triethylamin, se přidává do reakční směsi tak, aby reakční prostředí bylo mírně alkalické, s výhodou pH 7,0 až 7,5. Viz také výše uvedené učebnice Kop pleho nebo Schrodera a Lubkeho, kde jsou uvedeny další údaje o této metodě.

Výrazy „peptid, tripeptid, hexapeptid” apod., jak jsoiu uvedeny . zde, nejsou omezeny na odpovídající základní peptidy, ale rozumí se tím také modifikované peptidy s obměněným! nebo chráněnými skupinami. Výraz „peptidy”, jak je zde použit, se týká peptidů s dvěma ' až sedmnácti zbytky aminokyselin. Zbytek ,,SCH2^!H(R¹)CO”, jak je zde použit, se týká modifikovaného cysteinového zbytku, kde R¹ je H, nebo zbytku cysteinu, jestliže R¹ je NHR³, kde R³ má význam uvedený výše H—Gly—Gly—Ala— —Gly—NH, H—Gly—Gly—Gly—Ala—Gly— —NH, H—Leu—Gly—Gly—Ala—Gly—NH nebo H—Ala—Gly—NH. Krom-ё toho zbytek „NHCH(R²)CH2S”, . jak je zde použit, znamená zbytek cysteinu, jestliže R² je COOH nebo COOalk, nebo modifikovaný zbytek cysteinu, jestliže R2 je H.

Zkratka Me znamená methylskupinu a NHNH2 znamená hydrazidovou skupinu.

Výraz „Nižší alkyl”, jak je zde použit, zahrnuje uhlovodíkové zbytky s jedním až třemi atomy uhlíku včetně methylu, ethylu a propylu. Symbol „alk” znamená alkylovou skupinu s nerozvětveným nebo rozvětveným řetězcem s 1 až 14 atomy uhlíku.

Výraz „acyl”, jak je zde použit, zahrnuje nižší alifatické acyly s 1 až 6 atomy uhlíku, a to acyly s nerozvětveným nebo· rozvětveným řetězcem, jako ' je formyl, acetyl, propionyl, butyryl, isobutyryl, pivaloyl, nhexanoyl apod.

Výraz „alifatický acyl s 1 až 6 atomy uhlíku” zahrnuje acylové skupiny s nerozvětveným nebo rozvětveným řetězcem, jako je foirmyl, acetyl, propionyl, butyryl, isobutyryl, pivaloyl, n-hexanoyl apod.

Výraz „minerální kyselina”, jak je zde použit, zahrnuje silné anorganické kyseliny, a to kyselinu chlorovodíkovou, bromovodíkovou, sírovou nebo fosforečnou. Jestliže se tento termín používá ve spojení s bezvodým systémem, je výhodnou kyselinou bezvodý chlorovodík.

Výraz „slabě kyselé . podmínky”, jak je zde použit, zejména podmínky, při kterých se jako reákční prostředí používá zředěný vodný roztok organické kyseliny, například 30—80·% vodné kyseliny mravenčí, octové nebo propioinové, s výhodou 70 až 80% směs.

Výraz „mírně kyselé podmínky”, jak je zde použit, znamená podmínky, při kterých se koncentrované organické kyseliny nebo roztoky minerálních kyselin používají jako hlavní složka reakčního prostředí při teplotě asi od —30 . do 30 °C. Příklady výhodných . podmínek v tomto případě jsou 50 až 100'% kyselina trifluoroctová při teplotě od 0 do 30 · °C nebo 0,1 až 12 N kyselina chlorovodíková ve vodném roztoku nebo v roztoku v organickém rozpouštědle nebo chlorovodík v roztoku v bezvodém. or gainickém rozpouštědle při —20 až 10 °C.

Výraz „organický nitrit” se používá pro. obchodě dostupné nitrity, například terc.butylnitrit, isoamylnitrit apod.

Výraz „organická báze”, ' jak je zde použit, zahrnuje triethylamin, N-ethylmorfolin, N-ethyldiisopropylamin apod.

Výraz „silná báze”, jak je zde použit, znamená jak organické báze popsané výše, tak silné anorganické báze včetně hydroxidů a uhličitanů sodíku . a draslíku.

Peptidy podle vynálezu se získají ve formě volné· báze nebo· jako sůl s kyselinou buď přímo. v postupu podle . vynálezu, nebo reakcí peptidu s jedním nebo více ekvivalenty příslušné kyseliny. Příklady výhodných solí jsou ty s farmaceuticky vhodnými kyselinami, jako jsou například . kyselina octová, mléčná, jantarová, benzoová, salicylová, methansulfonová nebo toluensulfonová, jakož i polyměrní kyseliny, jako je tanin nebo karboxymethylcelulóza a soli anorganických kyselin, jako jsou halogenovodíkové kyseliny, například kyselina chlorovodíková, nebo kyselina sírová, nebo kyselina fosforečná. Je třeba uvést, že peptidy mají .. dva bazické dusíkové atomy a poskytují soli s jedním až dvěma ekvivalenty kyseliny. V případě potřeby se určitá sůl s kyselinou převádí na jinou sůl s kyselinou, například sůl s netoxickou farmaceuticky vhodnou kyselinou . působením příslušné iontoměničové pryskyřice způsobem popsaným R. A. Biossonasem aj. Helv. Chim. Acta 43, 1349 (1960). Vhodnými iontoměničovými pryskyřicemi jsou iontciměniče na bázi celulózy, například karboxymethylcelulóza nebo chemicky modifikovaný síťovaný dextranový katex, například typu Sefadexu C a silně bazická iontoměničová pryskyřice, například jaké jsou uvedeny v J. P. Greenstein a M. Winitz „Chemistry of the Amino Acids”, John Wiley and Soins, lne., New York and London, 1961, Vol. 2, str. 1456.

Somatostatintwé analogy vzorců I poskytují komplexní soli s . ionty těžkých kovů. Příkladem farmaceuticky vhodných komplexů těžkých kovů . je komplex tvořený zinkem nebo protaminem. zinku.

Peptidy připravované postupem podle vynálezu, jakož i jejich odpovídající . farmaceuticky vhodné soli . jsou použitelné . vzhledem k své farmakologické aktivitě, analogické přírodnímu tetradekapeptidu somatostatinu. Jejich aktivita byla prokázána farmakologickými testy, jako . jsou modifikace [A. V. Schally aj., Biochem. Biophys. Res. Commun., 52, 1314 (1973); J. Rivier aj., C. . R. Acad. Sci. Paris, Ser. D, 276, 2737 (1973)] in vitro metody podle M. Saffran a A. V. Schally, Can. J. Biochem. Physiol.,. 33 405 (1955).

Účinek peptidů vzorce I podle vynálezu byl prokázán také in vivo modifikací pentobarbltálem indukovaného zvýšení hladiny růstového hormctau v plasmě u krys, jak je popsáno* v práci Brazeaua aj. výše. Při tomto testu peptidy podle vynálezu vykazují účinek, který je větší nebo stejného řádu, jako je účinek somatostatinu. <

Peptidy podle vynálezu jsou použitelné pro léčení akromegalie a příbuzných hypersekrečních endokrinních stavů a při diabetes u savců viz P. Brazeau aj., citace výše. Jestliže se peptidy nebb jejich soli použijí pro toto léčení, aplikují se systemicky, s výhodou parenterálně v kombinaci s farmaceuticky vhodnými kapalnými nosiči. Peptidy vzorce I mají nízkou toxicitu. Poměr peptidu nebo jeho soli se stanovuje podle rozpustnosti v uvedeném nosiči, podle uvedeného nosiče nebo podle způsobu aplikace. Jestliže se peptid nebo jeho sůl použije ve sterilním vodném roztoku, může tento roztok také obsahovat jiné rozpuštěné látky, jako jsou pufry nebo konzervační látky, jakož i dostatečná množství farmaceuticky vhodných solí nebo glukózy, aby byl roztok isotonický. Dávky závisí na formě aplikace a zejména na druhu, který se má léčit, a s výhodou se pohybují mezi 1 až 300 na kg tělesné hmotnosti. Avšak dávka v rozmezí asi od 1 ^g asi do 50 <ug na kg tělesné hmotnosti se s výhodou používá pro' dosažení účinných výsledků.

Peptidy nebo soli se mohou aplikovat v jedné dlouhodobě působící pomalu se uvolňující depotní dávkové formě popsané níže, s výhodou ve formě intramuskulární injekce nebo implantátu. Tyto dávkové formy jsou upraveny tak, že uvolňují asi od 1 /zg asi do 50 ^g na kg tělesné hmotnosti za den.

Často se požaduje aplikovat činidlo kontinuálně delší dobu v dlouhodobé, pomalu se uvolňují nebo depotní dávkové formě. Tyto dávkové formy mohou obsahovat buď farmaceuticky vhodnou sůl, nebo peptid s nízkou rozpustností v tělesných kapalinách, například jednu ze solí popsaných níže, nebo peptid ve formě ve vodě rozpustné soli spolu s ochranným nosičem, který brání rychlému uvolňování. V posledně uvedeném případě se peptid může například upravit s neantigenní částečně hydrolysovanou želatinou ve formě viskosní kapaliny nebo se může absorbovat na farmaceuticky vhodný pevný nosič, například hydroxid zinečnatý, a může se aplikovat v suspenzi ve farmaceuticky vhodném nosiči, nebo se může upravit na gely nebo suspenze s ochranným neantigenním hydrokoloidem, například se sodnou solí karboxymethylcelulózy, polyvinylpyrrolidonem, alginátem sodným, želatinou, polygalakturonovými kyselinami, například pektineim, určitými mukopolysacharidy, spolu s vodnými nebo nevodnými farmaceuticky vhodnými kapalnými nosiči, konservačníími látkami nebo povrchově aktivními činidly. Příklady těchto preparátů je možno nalézt v standardních farmaceutických učebnicích, například v Rerning ton ’s Pharmaceutical Sciences 14th Ed., Mack Publishing Co., Easton; Pennsylvania, 1970.

Dlouhodobé pomalu se uvolňující preparáty peptidu připraveného podle vynálezu se mohou také připravit mikroenkapsulací ve farmaceuticky vhodných povlacích, například v želatině, polyvinylalkoholu nebo ethylcelulóze. Další příklady materiálů pro povlaky a postupy pro mikroenkapsulaci jsou popsány v J. A. Herbig „Encyclo pedia of Chiemical Technology”, Vol. 13, 2nd Ed., Wiley, New York 1967, str 436—456. Tyto preparáty, jakož i suspense nebo soli peptidu, které jsou pouze omezeně rozpustné v tělesných kapalinách, například soli pamoové kyseliny nebo taninu, se upravují tak, že uvolňují asi 1,0 mcg až asi 100 mcg aktivní sloučeniny na kg tělesné hmotnosti za den a s výhodou se aplikují intramuskulární injekcí. Alternativně se intramuskulární injekcí. Alternativně se některé pevné dávkové formy uvedené výše, například určité ve vodě omezeně rozpustné soli nebo disperse nebo adsorbáty na pevných nosičích nebo soli peptidu, například disperse v neutrálním hydrogelu polymeru ethylenglykolmethakrylátu nebo obdobných síťovaných monomerech, jak jsou posány v US patentu č. 3 551 556, mohou také upravit na formu pilulek, které uvolňují stejné množství, jak bylo uvedeno výše, a mohou se implantovat podkožně nebo» intramuskulárně.

Postup podle vynálezu je blíže objasněn v následujícím popisu, ve kterém je popsána příprava určitých peptidů vzorce I.

a) Sloučeniny vzorce I, kde R¹ = H— —Gly—Gly—Ala—Gly—NH, H—Gly—Gly— —Gly—Ala—Gly—NH— nebo H—Leu— —Gly—Gly—Ala—Gly—NH— a R² je H nebo COOH

Chráněný nižší alkylester alanyl-glycinu, s výhodou Boc—Ala—Gly—OMe [popsaný H. U. Immer aj., Helv. Chim. Acta., 57 730 (1974)], se rioizpustí v trifluoroctové kyselině a roztok se udržuje asi jednu hodinu na teplotě 0 až 10 °C a po odpaření trifluoroctové kyseliny se získá H—Ala—Gly—OMe ve formě soli s trifíuoroctovou kyselinou, která se může popřípadě převést a použít ve formě volné báze.

Ostatní štěpící činidla pro odštěpení Boc chránící skupiny jsou bromovodík v kyselině octové, alkoholický roztok chlorovodíku apiod. Posledně jmenovaná slučenina se rozpustí v inertním organickém rozpouštědle, s výhodou dimethylformamidu, a získaný roztok se ochladí na asi 0 až 10 °C. Přebytek, s výhodou 1,1 až 1,3 ekvivalentu organické báze, s výhodou N-ethylmorfolin, se přidá к roztoku a roztok má pak pH asi 8. Přidá se jeden ekvivalent chráněného aktivovaného esteru glycinu, s výhodou Boc— —Gly—OTcp [popsaný v J. Pless a R. A. Boissonnas Helv. Chim. Acta 46, 1609 (1963).], a reakční směs se nechá stát asi dva dny při 0 až 20 °C. Rozpouštědlo se odpaří a zbytek krystalizací poskytne chráněný nižší alkylester glycyl-alanyl-glycinu, s výhodou Boc—Gly—Ala—Gly—OMe, který reakcí s trifluoroctovou kyselinou poskytne výše uvedeným způsobem nižší alkylester tripeptidu glycyl-alanyl-glycinu, s výhodou H—Gly—Ala—Gly—OMe, ve formě soli s trifluoroctovou kyselinou, která se popřípadě převede na volnou bázi. Posledně uvedený tripeptid se nechá reagovat s Boc—Gly—OTcp výše uvedeným způsobem a získá se· chráněný nižší alkylester glycyl-glycyl-alanyl-glycinu, s výhodou Boc—Gly—Gly—Ala—Gly—OMe, který reakcí s trifluoroctovou kyselinou poskytne výše uvedeným způsobem nižší alkylester glycyl-glycyl-alanyl-glycinu, s výhodou H—Gly— —Gly—Ala.—Gly—OMe ve formě soli s trifluoroctovou kyselinou, která se může znovu převést na volnou bázi. Posledně uvedený tetrapeptid se nechá reagovat s chráněným aktivovaným esterem glycinu, s výhodou s Boc—Gly—OTcp, výše uvedeným způsobem a získá se nižší alkylester glycyl-glycyl-glycyl-alanyl-glycinu, s výhodou Boc—Gly—Gly—Gly—Ala—Gly—OMe.

Výše uvedený tetrapeptid bez chránící skupiny, H—Gly—Gly—Ala—Gly—OMe, s výhodou ve formě soli s trifluoroctovou kyselinou, se nechá reagovat s chráněným aktivovaným esterem leucinu, s' výhodou l-benzortriazzlylesserem terc.butyloxykarbonylleucinu při teplotě 0 až 15 °C v' inertním organickém rozpouštědle, s výhodou dímethylformamidu, a to tak, že se smísí výše uvedený nechráněný tetrapeptid, v podstatě ' 1,5 až 2,0 ekvivalenty Boc—Leu—OH, 1,5 až ' 2,0 ekvivalenty l-hydroxybenzotriazoilu, 1,5 až 2,5 ekvivalentu' dicyklohexylkarbodiimidu a přebytek organické báze, s výhodou N-ethylmorfolinu, . aby pH roztoku bylo asi 8. Vzniklá směs se udržuje 20 až 30 hodin při 0 až 15 °C. Odstraněním· sraženiny, odpařením filtrátu a krystalizací· se získá chráněný nižší alkylester leucyl-glycyl-glycyl-alanyl-glycinu, s výhodou Boc—Leu—Gly—Gly—Ala—Gly—OMe.

Výše zmíněný tetrapeptid vzorce Boc— —Gly—Gly—Ala-—Gly—OMe a pentapeptidy vzorce ' Boc—Gly—Gly—Gly—Ala—Gly— —OMe a Boc—Leu—Gly—Gly—Ala—Gly— —OMe se zde uvádějí jako' R⁵—Gly—Gly— —Ala—Gly—OMe, kde R⁵ je Boc, Boc—Gly a Boc—Leu.

Polsedně uvedené sloučeniny vzorce R⁵— —Gly—Gly—Ala—Gly—OMe, kde R⁵ má význam .uvedený výše, se snadno' převedou na odpovídající hydrazidy reakcí s přebytkem (20 až 50 molárních ekvival-entů) hydrazinhydrátu. Výhodné podmínky zahrnují reakci posledně jmenovaných esterů v inertním organickém rozpouštědle, například methanolu, n-butanolu nebo dimethylformamidu s 40 až 50 molárními ekvivalenty hydrazinhydrátu ' při 0 až 30 '°C po dobu dvou hodin až jednoho dne. Odpařením rozpouštědla a přebytku hydrazinhydrátu vznikne odpovídající aminochráněný hydrazid peptidu vzorce IX,

R5—Gly—Gly—Ala—Gly—NHNH2 (IX) kde

R⁵ je Boc, Boc—Gly nebo Boc—Leu.

Výše uvedený peptid vzorce IX a pentapeptid vzorce

H—Cys (Trt)—Lys (Boc) —Asn—Phe—Phe— —OMe (popsaný H. U. Immer aj. výše) se nechá reagovat azidovým způsobem a získá se peptid vzorce

R5—Gly—Gly—Ala—Gly—Cys(Trt) — —Lys' (Boc) —Asn—Phe—Phe—OMe.

Běžná a účinná metoda pro tento stupeň zahrnuje rozpuštění peptidu vzorce IX v inertním organickém rozpouštědle, s výhodou dimethylformamidu, nebo ve směsi dimethylformamidu a dimethylsulfoxidu. Roztok asi dvou až pěti molárních ekvivalentů, s výhodou tří molárních ekvivalentů roztoku silné minerální kyseliny v organickém rozpouštědle, s výhodou chlorovodíku, v ethylacetátu, se přidá k posledně . uvedenému roztoku ' při teplotě —20 °C až —10 °C, s výhodou při —15 °C, a k míchanému roztoku se přidá organický nitrit, s výhodou terč, butylnitrit (1,0 až 1,5 molárního ekvivalentu, s výhodou 12 ekvivalentu). Po 15 minutách při —20 °C až 0 °C se směs zalkalizuje, s výhodou na pH 7,0 až 7,5, přidáním organické báze, s výhodou N-ethyldiisopropylaminu, a pák se přidá jeden ekvivalent výše uvedeného· pentapeptidu. Dalším přidáním organické báze, s výhodou N-ethylmorfolinu, se směs mírně zalkalizuje. Reakční směs se pak míchá při —10 až 0 °C jednu až dvě hodiny a pak 20 až 30 hodin při 20 až 30 °C. Odpařením, rozpouštědla, rozpuštěním zbytku v organickém rozpouštědle, s výhodou methanolu, přidáním k roztoku v rozpouštědle, ve kterém nastává vysrážení, s výhodou ve vodě nebo diethyletheru, ' a jímáním získaného produktu se získá výše uvedený peptid vzorce

R5—Gly—Gly—Ala—Gly—Cys (Trt) — —Lys (Boc) —Asn—Phe—Phe—OMe.

Výše popsaný pentapeptidový fragment popsaný výše v publikaci se snadno získá reakcí aktivovaného esteru Boc—Phe—OH ' s H—Phe—OMe a získá se Boc—Phe—Phe— —OMe, který po odstranění koncové chránící skupiny (Boc) za mírně kyselých podmínek poskytuje H—Phe—Phe—OMe. Posledně jmenovaná sloučenina se nechá reagovat s aktivovaným esterem Boc—Asn—OH a získá se Boc—Asn—Phe—Phe—OMe. Následujícím 'odštěpením skupiny chránící koncovou amiňoskupinu posledně uvedené sloučeniny za mírně kyselých podmínek se získá tripeptid H—Asn—Phe—Phe—OMe.

Pak se posledně jmenovaná sloučenina použije pro¹ získání požadovaného penfapeptidového fragmentu reakcí tripeptidu s aktivovaným esterem Z—Lys (Boc)—OH a získá se Z—Lys (Boc)—Asn—Phe—Phe—OMe, kterj hydrogenací v přítomnosti katalyzátoru vzácného kovu poskytne H—Lys (Boc)— —Asn—Phe—Phe—OMe, který se kondenzuje s aktivovaným esterem Trt—Cys (Trt) — —OH a získá se Trt—CysSTr^—Lys^oc) — —Asn—Phe—Phe—OMe a odštěpením koncové N-chránicí skupiny (Trt) v této posledně ' jmenované sloučenině za mírně kyselých podmínek se získá požadovaný pentapeptid H—Cys (TN) —Lys (Boc) — Asn—Phe— —Phe—OMe.

Při přípravě sloučeniny vzorce I výše, se výše uvedený ester peptidu R⁵—Gly—Gly— —Ala—Gly—Cys (Trt) —Lys (Boc) — Asn— —Phe—Phe—OMe, kde R⁵ má význam uvedený výše, převede na odpovídající hydrazid reakcí s přebytkem hydrazinhydrátu způsobem popsaným výše a získá se hydrazid peptidu vzorce IVa,

R5—Gly—Gly—Ala—Gly—Cys(Trt) — —Lys (Boc) — Asn—Phe—Phe—NHNH2 (IV a) kde

R5. má význam uvedený zde nebo alternativně psaný jako peptid vzorce IV, kde R⁴ je Boc—Gly—Gly—Ala—Gly—NH, Boc—Gly—Gly—Gly—Ala—Gly—NH nebo Boc—Leu—Gly—Gly—Ala—Gly—NH.

V následujícím stupni postupu podle vynálezu se uvedená posledně jmenovaná sloučenina vzorce IV a peptid vzorce V,

H—Trp—Lys( Boc) —Thr( Bu + )—Phe— —Thr(Bu+) — NHCH(R2)CH₂S—Trt (V) kde

R² je H nebo COOH, nechají reagovat azidovým způsobem popsaným výše na lineární peptid vzorce (Ha),

R—-Gly—Gly—Ala—Gly—Cys (Trt ) — —Lys (Boc) —Asn—Phe—Phe—Trp— —Lys (Boc)—Thr (Bu⁺) —Phe—Thr (Bu +) — —Ser (Bu⁺)—NHCH(R2)CH2S—Trt, kde

R5 má význam uvedený výše a R² je H nebo COOH nebo· alternativně psaný jako lineární peptid vzorce II, kde R² je H nebo COOH a R⁴ je Bo-c—Gly—Gly—Ala—Gly— —NH, Boc—Gly—Gly—Gly—Ala—Gly—NH nebo· Boc—Leu—Gly—Gly—Ala—Gly—NH.

Běžný a účinný postup prd tento stupeň zahrnuje rozpuštění hydrazidu peptidu vzorce IVa v dimethylformamidu. Roztok asi dvou až pěti molárních ekvivalentů, s výhodou tří molárních ekvivalentů, roztoku silné minerální kyseliny v organickém rozpouštědle, s výhodou chlorovodíku v ethylacetátu, se přidá k posledně uvedenému roztoku při —20 až —10 °C, s výhodou při —15 °C a za míchání se k tomuto roztoku přidá terc.butylnitrit (1,0 až 1,5 molárního ekvivalentu, s výhodou 1,2 ekvivalentu). Asi po 15 minutách při —20° až 10 stupních Celsia se přidá jeden ekvivalent peptidu vzorce V a organická báze, s výhodou tři až pět ekvivalentů N-ethyldiisopropylaminu v dimethylformamidu, při teplotě asi —15 °C.

Reakční směs se pak míchá jednu až dvě hodiny při —20 °C až 0 °C a pak 15 až 25 hodin při 20 až 30 °C. Odpařením rozpouštědla, rozmělněním zbytku s vodou, methanolem nebo směsi m-ethanolu a vodné kyseliny citrónové (2 až 5%) a oddělením pevných podílů se získá výše uvedený lineární peptid vzorce Ha, který se může použít bez dalšího čištění · pro· následující stupeň, viz níže.

Výše zmíněný peptid vzorce V,

H—Trp—Lys (Boc) —Thr (Bu+ ) —Phe— —Thr(Bu⁺)—Ser(Bu+)—NHNH— — (R2)CH2S—Trt, kde

R2 je COOH nebo alternativně psaný jako heptapeptid vzorce· (Va)

H—Trp—Lys (Boc) —Thr (Bu⁺) —Phe— —Thr(Bu + ) — Ser(Bu⁺)—Cys (Trt) — OH, popsaný H. U. Immer aj., citace výše a v USA patentu č. 3 917 578 z 4. XI. 1975, se snadno získá reakcí methylesteru O-t-butylserinu s aktivovaným esterem benzyloxykarbonyl-(O-t-butyl)threoninu a získá se Z—Thr(Bu + ) — Ser(Bu+ )—OMe.

Chrániči skupiny koncové aminoskupiny (Z) se pak odstraní hydrogenací v přítomnosti katalyzátoru vzácného kovu a získá se H—Thr(Bu⁺]—Ser(Bu+)—OMe.

Posledně uvedený methylester se pak nechá reagovat s aktivovaným esterem· Z— —Phe—OH a získá se Z—Phe—Thr (Bu+ ) — —Ser(Bu⁺)—OMe, ze kterého se koncovou aminoskupinu chránící skupina Z odstraní následující hydrogenací v přítomnosti katalyzátoru vzácného kovu a získá se H— —Phe—Thr(Bu⁺)—Ser(Bu+) — OMe. Pak se posledně uvedený ester tripeptidu nechá reagovat s aktivovaným· esterem Z—Thr (B^:u⁺)— OH a získá se Z—Thr(Bu+) — —Phe—Thr (Bu+)—Ser(Bu+)— OMe. Znovu se koncovou aminoskupinu chránící skupina (Z) v posledně jmenované sloučenině odštěpí hydrogenací v přítomnosti katalyzátoru · vzácného kovu a získá se H— —Thr (Bu+) —Phe—Thr (Bu+ ) —Ser (Bu’ ] —

1β —OMe. Tato sloučenina se nechá reagovat s aktivovaným esterem Z—Lys(Boc)—OH a získá se Z—Lys(Boc)—Thr(Bu+)—Phe— —Thr (Bu+)—Ser(Bu+)—OMe, a pak následuje odštěpení chránící skupiny koncové aminoskupiny (Z) z posledně jmenované · sloučeniny hydrogenací v . přítomnosti katalyzátoru vzácného. kovu a získá se H— —Lys· [ Boc) —Thr [ Bu+)—Phe—Thr (Bu+) — —Ser(Bu⁺)—OMe. Tato sloučenina se nyní nechá reagovat s aktivovaným esterem· Ddz—Trp—OH a získá se Ddz—Trp— —Lys(Boc)—Thr(Bu⁺)—Phe—Thr (Bu+)— —Ser(Bu+)—OMe, který se nechá reagovat s hydrazinhydrátem· a získá se odpovídající hydrazid hexapeptidu, Ddz—Trp—Lys (Boc) — —Thr (Bu+j —Phe—Thr (Bu+ )—Ser (Bu+) — —NHNHz. Tento hěxapeptid se nechá reagovat s H-Cys(Trr)—OH . azidovou metodou a získá se odpovídající heptapeptid, Ddz—Trp—Lys (Boc) —Thr (Bu⁺) —Phe— —Thr (Bu+j —Ser (Bu+j —Cys (Trt) —OH. Reakcí posledně jmenované sloučeniny za mírně kyselých podmínek se získá požadovaný heptapeptid vzorce Va nebo peptid vzorce V, kde R² je COOH.

Výše uvedený peptid vzorce V, kde R2 je H, popsaný v USA patentu č. 3 917 581 z 4. XI. 1975, se získá snadno reakcí popsaného hydrazidu hexapeptidu vzorce Ddz— —Trp—Lys (Boc)—Thr (Bu+ )—Phe— —Thr(Bu+j—Ser(Bu+)—NHNH2 s 2-tritylthioethylaminem azidovou metodou popsanou výše a získá se odpovídající hexapeptid vzorce Ddz—Trp—Lys (Boc)—Thr (Bu+) — —Phe—Thr (Bu+ )—Ser (Bu+j — —NHCH2CH2S—Trt. Tato sloučenina se pak nechá reagovat za mírně kyselých podmínek a získá se peptid vzorce V, kde R2 je H ve formě· soli s· kyselinou mravenčí a popřípadě se tato převede na volnou bázi.

Alternativně se výše popsaný lineární peptid vzorce Ha snadno· připraví následujícím způsobem:

Chráněný nižší alkylester pentapeptidu vzorce Trt—Cys (Trt) —Lys (Boc) — Asn— —Phe—Phe—OMe, popsaný výše, snadno převede na odpovídající hydrazid reakcí s přebytkem· hydrazinhydrátu. Výhodné podmínky zahrnují reakci posledně uvedeného esteru v inertním rozpouštědle, napřííklad methanolu, butanolu nebo dimethylformamidu, s 20 až 40 molárními ekvivalenty hydrazinhydrátu po dobu jednoho až dvou dnů při teplotě 0 až 30 °C. Odštěpením roz pouštědla a krystalizací se získá odpovídající hydrazid pentapeptidu vzorce VI,

Trt—Cys (Trt)—Lys (Boc) —Asn—Phe— —Phe—NHNHž.

Posledně jmenovaná sloučenina, peptid vzorce V, kde R² je H nebo· COOH, se nechá reagovat azidovou metodou způsobem popsaným výše a získá se peptid vzorce VIII, Trt—Cys (Trt) —Lys( Boc) — Asn— —Phe—Phe—Trp—Lys (Boc) —Thr (Bu+j— —Phe—Th.r(Bu+) —Ser(Bu+) — —NHCH(R²)C'H2S—Trt, kde R² je H nebo COOH, načež po odštěpení koncové N-chránicí skupiny (Trt) v posledně jmenované sloučenině VII se získá odpovídající peptid vzorce VIII,

H—Cys (Trt j —Lys (Boc) — Asn—Phe—Phe— —Trp—Lys (Boc) —Thr (Bu+j —Ser (Bu+) — —NHCH(R²)CH2S—Trt, kde

R2 je H nebo COOH. Odštěpení této· chránící skupiny (Trt) se provádí za mírně kyselých podmínek. Výhodné podmínky zahrnují rozpuštění peptidu vzorce VII ve směsi 5 až 15% kyseliny mravenčí v 60 až 80·% kyselině octové, načež se reakční roztok nechá 3 až 10 hodin stát při 20 až 30 °C. Zahuštěním tohoto roztoku se získá peptid vzorce VIII, kde R² je H nebo COOH, ve · formě solí s kyselinou, která se popřípadě může převést na volnou bázi.

Posledně jmenovaná sloučenina vzorce VIII a hydrazid peptidu vzorce IX, kde R⁵má význam uvedený výše, se nechá reagovat azidovým způsobem popsaným výše a získá se odpovídající lineární peptid vzorce Ha nebo vzorce II, kde R2 je H nebtoi COOH a R4 je Boc—Gly—Gly—Ala—Gly— —NH—, —Boc—Gly—Gly—Gly—Ala—Gly— —NH nebo· Boc—Leu—Gly—Gly—Ala—Gly— —NH—.

Převedení posledně jmenovaného· lineárního peptidu vzorce II, získaného postupem· popsaným výše, na odpovídající sloučeninu vzorce I se provádí běžně a· účinně nejprve reakcí lineárního peptidu vzorce II s jedem, s výhodou v přítomnosti nižšího· alkanolu nebo kyseliny octové, přičemž se současně odštěpí skupiny chránící thiolové skupiny, například Trt, a vytvoří se disulfidový můstek za vzniku odpovídajícího· cyklického disulfidového derivátu vzorce III,

SCH2CH (R4 ) CO—Lys (Boc) — Asn—Phe—Phe—Trp—Lys (Boc) —Thr (Bu+) —Phe— kde —Thr (Bu+) —Ser (Bu +) —NHCH (R2) CH2S (ΠΙ)

R² je H nebo COOH a R4 je Boc—Gly— —Gly—Ala—Gly—NH, Boc—Gly—Gly— —Gly—Ala—Gly—NH nebo Boc—Leu— —Gly—Gly—Ala—Gly—NH. Posledně jmenovaná sloučenina vzorce III, kde R2 je

COOH a R4 je Boc—Gly—Gly-Ala-Gly— —NH, Boc—Gly—Gly—GIy—Ala—Gly—NH nebo Boc—Le'u—Gly—Gly—Ala—Gly—NH, se může alternativně psát jako vzorec lila,

R⁵—Gly—Gly—Ala—Gly—Cys—Lys- (Boc ] —Asn—Phe—Phe—Trp—Lys (Boc) — —Thr (Bu+) —Phe—Thr (Bu⁺) —Ser (Bu+) —Cys—OH (lila) kde

R⁵ má význam uvedený výše.

Následující reakcí sloučeniny vzorce III, kde R2 je H nebo- COOH a R4 je Boc—Gly— —Gly—Ala—Gly—NH, Boc—Gly—Gly—Gly— —Ala—Gly—NH nebo Boc—Leu—Gly—Gly— —Ala—Gly—NH, za mírně kyselých podmínek se odštěpí zbylé chránící skupiny (to jest Boc a Bu+) a získá se odpovídající sloučenina vzorce I, kde R4 je H—Gly— —Gly—Ala—Gly—NH, H—Gly—Gly—Gly— —Ala—Gly—NH nebo H—Leu—Gly—Gly— —Ala—Gly—NH a R² je H nebo- COOH.

Při výhodném provedení se výše uvedená transformace lineárního peptidu vzorce Ha provádí tak, že se provede rozpuštění v kyselině octové nebo- methanolu, ethanolu nebo jiném vhodném nižším alkanolu, . například propanolu, isopropanolu nebo butanolu, a roztok se přidá k přebytku jódu (5 až 25, s výhodou 10 molárních ekvivalentů, rozpuštěných v jednom z výše uvedených rozpouštědel, s výhodou se používá 2 až 5% roztoku jodu v -methanolu. Doba a teplota této reakce není rozhodující, avšak požaduje se, aby se reakce -udržovala přidáváním roztoku jódu při teplotě 0 až 30 stupňů Celsia nebo aby se reakční směs chladila, nebo aby se použila kombinace obou způsobů. - Za těchto podmínek trvá přidávání běžně 30 až 60 minut. Po- skončení přidávání se směs míchá 30 až 120 minut při 20 až 30 °C, s výhodou se míchá 60 minut. Pak se reakční směs ochladí asi na 0 °C a přidá se přebytek mírného^ redukčního činidla, s výhodou thiosíranu sodného ve vodném roztoku. Směs se zahustí a zbytek se suspenduje ve vodě. Jímáním ’ pevného; podílu se získá odpovídající cyklický disulfid vzorce III a kde Boc a jsou ještě přítomné chránící skupiny.

Alternativně se- lineární peptid vzorce Ila může převést na výše- zmíněný odpovídající cyklický disulfidový derivát vzorce lila- způsobem popsaným v práci R. G. Hiskey a R. L. Srnith, J. Amer. Chem. Soc., 90, 2677 (1968) za použití rhodanu.

Nakonec se výše zmíněný cyklický disulfidový derivát vzorce III převede na odpovídající peptid vzorce I reakcí za mírně kyselých podmínek, přičemž se- zbylé chránící skupiny cyklického disulfidoivého derivátu odštěpí. Obecně se tento¹ stupeň provádí rozpuštěním cyklického disulfidového derivátu ve vodném reakčním prostředí obsahujícím organickou kyselinu, při 0 až 20 stupních C^Isío po dobu 10 až - 60 minut. Příklady vhodných činidel jsou kyselina trifluoroctová, 10 -až 20% vodná kyselina sírová, 10.'% kyselina fosforečná, 10 až 30% kyselina- brolrnovodíková a 10 až 36% kyselina chlorovodíková. Zejména výhodným médiem je koncentrovaná kyselina chlorovodíková. Výhodné podmínky pro postup podle vynálezu jsou rozpuštění cyklického disulfidu v minimálním množství koncentrované kyseliny chlorovodíkové, ochlazené na 0 °C, a míchání reakční směsí 5 až 10 minut při 0 °C v atmosféře dusíku. Pak se přidá ledová kyselina octová (desetinásobek objemu) a roztok se- ochladí asi na —70 °C a lyofilisuje se a získá se cyklický peptid vzorce I. Posledně uvedený produkt se dále čistí chromát ografií na iontoměníči, s výhodou za použití karboxymethylcelulčzového iointoměniče a octanu amonného Jako ©lučního· činidla. V tomto- případě se produkt získá ve formě soli s octovou kyselinou. Alternativně se produkt čistí rozdělovači chromatografií na - chemicky modifikovaném síťovaném dextranu, například Sephadexu LH—20 nebo Sephadexu G—25 použitím methanolu nebo kyseliny octové jako elučního činidla. V případě, že se použije Sephadex LH—20 a methanol jako eluční -činidlo, získá se produkt ve formě hydrochloridu. V případě použití Sephadexu G—25 a kyseliny octové jato elučního činidla se produkt získá ve formě soli s kyselinou octovou. Opakovanou lyofilisací z vody produkt ve formě soli s kyselinou octovou poskytne téměř čistý peptid vzorce I, kde R1 je H—Gly—Gly—Ala—Gly—NH, H—Gly—Gly—Gly—Ala—Gly—NH nebo H—Leu—Gly—Gly—Ala—Gly—NH a R² je H nebo COOH ve- formě volné báze.

b) Sloučeniny vzorce I , kde R ¹ je - H nebo NiHR3, kde R³ má význam uvedený výše a R² je- H

Požadovaný hydrazid peptidu vzorce IV Trt—SCHzCH (R⁴) CO—Lys (Boc) — Asn— —Phé—Phe—NHNH2 kde

R⁴ je NHR3, kde R³ má význam· uvedený výše, nebo alternativně -psaný jako vzorec IVb,

R³—Cys (Trt) —Ly s (B o c) — Asn—Phe— —Phe—NHNHz, kde

R³ má význam uvedený výše, se připraví acylací pentapeptidu vzorce H—Cys(Trt) — —Lys(Boc) — Asn—Phe—Phe—OMe a získá se pentapepjtid vzorce R3—Cys (Tří)— —LysJBoc) — Asn— Phe—Ph.e—OMe, který se podrobí ' hydrazinolyse za vzniku odpovídajícího hydrazidu pentapeptidu vzorce IV, kde R⁴ je· NHR3.

Ve výhodném·· provedení přípravy výše uvedeného pentapeptidu hydrazidu vzorce IVb se ekvimolární směs organické báze, s výhodou N-ethylmorfolinu a pentapeptidu vzorce H—Cys[Trt) —Lys (Boc) — Asn— —Phe—Phe—OMe, připraveného podle I-I. U. Imtmer aj., citace výše, v inertním organickém rozpouštědle, s výhodou diethylformamidu nebo tetrahydrofuranu, při teplotě asi 0· až 10 °C nechá reagovat s přebytkem, s výhodou 1,1 až 2 molárními ekvivalenty požadovaného p-nitrofenylacylátu nebo benzoiatu, například p-nitrofenylacetátu, připraveného postupem popsaným F.

D. Chattawayem J. Chem. Soc. 2495 (1931). Směs se pak udržuje 15 až 30 hodin při teplotě 0 až 10 °C a pak se odpaří. · Odparek se rozpustí v polárním organickém rozpouštědle, s výhodou methanolu, a pomalu se přidá k nepolárnímu organickému rozpouštědlu s výhodou diethyletheru. Zbytek se oddělí a krystalizací se získá odpovíající acylovaný nebo benzoylovaný pentapeptid, například pentapeptid vzorce R³— —Cyse (Trt )Lys (Boc) — Asn—Phe—Phe— —OMe, kde R³ má význam uvedený výše. Posledně · jmenovaná sloučenina se rozpustí v inertním organickém rozpouštědle, například methanolu, ethanolu, dimethylformairnidu apod., s výhodou v methanolu. Roztok se pak nechá reagovat s přebytkem· hydrazinhydrátu, například s 15 až 30 molárními ekvivalenty. Reakční směs se udržuje 40 až 60 hodin při 0 až 10 °C. Sraženina · se oddělí a vysuší a získá se uvedený hydrazid pentapeptidu vzorce IV, kde R4 je NHR3, kde R³ má význam uvedený výše, nebo vzoirce IVb, kde R³ má význam uvedený výše.

Podle dalšího rysu vynálezu se požadovaný hydrazid peptidu, tetrapeptidu vzorce IV,

Trt—S—CHzCH (R⁴) CO—Lys (Boc) — Asn— —Phe—Phé—NHNHz, kde

R4 je atom· vodíku, připraví reakcí aktivovaného; esteru 3-tritylthiopropionové kyseliny s tetrapeptidem vzorce HI-Lys(Boc) — —Asn—Phe’—Phe—OMe a získá se tetrapeptid vzorce Trt—SCH2CH2CO—Lys(Boc) — —Asn—Phe—Phe—OMe, který se hydrazi nolysuje na hydrazid tetrapeptidu vzorce IV,· kde R4 je atom vodíku.

Při výhodné provedení přípravy výše· uvedeného hydrazidu tetrapeptidu se aktivovaný ester 3-tritylthiopropionové kyseliny, s výhodou pentachlorfenylester, připraví smíšením ekvimolarních množství 3-tritylthiopropionové kyseliny, pentachlorfenolu a dicyklohexylkarbodiimidu v Inertním organickém rozpouštědle, s výhodou tetrahydrofuranu, při teplotě 0 až 10 °C. Směs se míchá asi jednu hodinu při 0 až 10 °C po dobu asi jedné hodiny a pak asi jednu hodinu při 20 až 30 °C. Směs se ochladí asi na 0 °C, přefiltruje se a filtrát se odpaří. Odparek se krystaluje a získá se pentachlorfenylester 3-tritylthiopropionové· kyseliny. Roztok posledně jmenované sloučeniny a ekvimolárního množství tetrapeptidu vzorce H—Lys(Boc) —Asn—Phe—Phe—OMe, ve formě acetátu popsaného· výše v odstavci a), v · inertním organickém rozpouštědle, s výhodou diethylformamidu nebo tetrahydrofuranu, se nechá reagovat s téměř ekvimolárním množstvím organické báze,, s výhodou · triethylamínem, při teplotě 20 až 30 stupňů Celsia. Směs se míchá dva až tři dny při 20 až 30 °C a rozpouštědlo se odpaří za sníženého tlaku. Odparek se rozmělní se studenou vodnou kyselinou citrónovou a vodou, vysuší se a krystalizací se získá tetrapeptid vzorce Trt—SCH2CH2CO— —Lys (Boc) — Asn—Phe—Phe—OMe. Posledně jmenovaná sloučenina se rozpustí v inertním organickém rozpouštědle, například v methanolu, ethanolu nebo· s výhodou dimethylformamidu. Roztok se nechá , reagovat s přebytkem· hydrazinhydrátu, například s 15 až 30 molárními ekvivalenty. Reakční směs se udržuje 20 až 30 hodin asi při 20 až 30· °C a odpaří se pak za sníženého tlaku. Odparek ·se rozmělní se studenou vodou, vysuší se a získá se hydrazid tetrapeptidu vzorce IV, kde R4 je · H.

V následujícím · stupni postupu · podle vynálezu se hydrazid peptidu vzorce IV, kde R4 je H nebo NHR³, a peptid vzorce V

H—Trp—Lys (Bon) —Thr (Bu⁺) —Phe— —Thr (Bu⁺ ) —Ser (Bul) — NHCH2CH (R²) S— —Trt, kde

R2 je H popsaný výše v · odstavci a), · nechají reagovat azidovou metodou popsanou výše a získá se odpovídající lineární peptid vzorce II, kde R2 je H a R4 je H nebo NHR³.

Převedení posledně uvedeného lineárního peptidu vzorce II na odpovídající sloučeninu vzorce I se vhodně a účinně provádí tak, že se nejprve posledně jmenovaný lineární peptid vzorce II nechá reagovat s jódem, s výhodou v přítomnosti methanolu [jak je popsáno dříve například pro· pří právu derivátu cyklického disulfidu vzorce III v odstavci a)], přičemž proběhne odštěpení chránící skupiny na thioolové skupině, to jest Trt, a tvorba disulfidového můstku za vzniku odpovídajícího’ derivátu cyklického disulfidu vzorce III, kde R² je H a R⁴ je H nebo NHR³, kde R³ má ' význam uvedený výše. Posledně uvedená sloučenina vzorce III, kde R⁴ je NHR⁵, , se může alternativně psát ve formě vzorce IÍIb,

R3—c_ys—Lys(Bac) — Asn—Phe—Phe—Trp—Thr(Bu^r) —Phe—Thr (Bu+) — —Ser(Bu⁺)—NH—CH(R2)CH2'S (lllb) kde

R2 je H a R3 má význam uvedený výše.

Následující reakce posledně uvedené sloučeniny vzorce ' III, kde R² je H a R4 je H nebo NhR³, se provádí za mírně kyselých podmínek, s výhodou koncentrovanou kyselinou chlorovodíkovou, ochlazenou asi na 0 °C (jak je popsáno- výše pro přípravu cyklického peptidu vzorce I v odstavci a)), zbylé chránící skupiny se odštěpí (to jest Boc a Bu+) a získá se odpovídající peptid vzorce I, kde R¹ je H nebo NHR³, kde R³má význam uvedený výše a R² je H ve formě volné báze nebo- soli s kyselinou.

c) Sloučeniny vzorce I , kde R¹ je Buc——Ala—Gly—NH a R2 je COOalk

Předložený prvý hydrazid peptidu vzorce IV, kde R⁴ je Boc—Ala—Gly—NH, nebo alternativně psaný jako heptapeptid vzorce IVc.

Boc—Ala—Gly—Cys (Trt) —Lys (Boc) — —Asn—Phe—Phe—NHNH2 IIVc) je plně popsán v práci H. U. Immer aj., citace výše.

Požadovaný druhý peptid vzorce V, kde R2 je COOAlk, alternativně psaný jako ester heptapeptidu vzorce Vb,

H—Trp—Lys (Boc) —Thr (Bu+) — Phe — —Thr (Bu + )—Ser (Bu⁺ )—Cys (Trt ] —COOalk (Vb) se snadno připraví následujícím způsobem:

Heptapeptid vžorce Ddz—Trp—Lys(Boc) — —Thr ( Bu+) —Phe—Thr (Bu+) —Ser (Bu+) — — C^s^((^l'1:)—OH [popsaný výše v odstavci a)] v roztoku v inertním rozpouštědle se nechá reagovat s diazoalkanem. vzorce (alk minus H)№ v roztoku, inertním rozpouštědle, při teplotě od 0 do 20 °C po dobu od 1 do 48 hodin, rozpouštědlo a přebytek diazoalkanu se odpaří, odstraní se chránící skupina Ddz a čištěním- se získá odpovídající ester heptapeptidu vzorce Vb. Diazoalkany použitelné pro tyto· účely jsou například diazomethan, diazoe-than [von Pechmann, Ber. Deutsch. Chem·. Ges. 31, 2460 (1898) 1-diazopropan Niedlinger aj., Am. Chem. J. 43, 378 (1910)], 2-díazopropan [Staudinger aj., Ber. Deutsch. Chem. Ges. 49, 1905 (1916)], 1-diazobuta.n (Niedlin ger aj., citace výše, sír. 380), 1-diazoisobutan (Adamson aj., J. Chem. Soc. 1935, 286], á-diazo^-rnethylbutan [Werner, J. Chem. Soc, 115, 1101 (1919)], l-diazopentan, 1-diazohexan, 1-diazoheptan, nebo l-diazooktan, přičemž poslední čtyři diazoalkany se připraví postupem popsaným Adamsonem aj., citace výše. Výhodnými inertními rozpouštědly' jsou alkanoly, jako· je methanol, a ethery, jako je diethylether.

Alternativně a zejména, jestliže se má získat peptid vzorce I, kde R1 je H—Ala—Giy— —NH— a R je COOalk, kde alkylová skupina (alk) obsahuje 9 až 14 atomů uhlíku, se nechá cystein reagovat s molárním přebytkem příslušného alkanolu alkOH, kde alk má význam uvedený výše v přítumnusti chlorovodíku při teplotě 25 až 120 °C, s výhodou při 100 až 120 °C, po dobu 1 až 5 hodin a získá se odpovídající hydrochlorid alkylesteru cysteinu. Posledně jmenovaná sloučenina se pak nechá reagovat s přibližně jedním molárním ekvivalentem trifenylkarbinolu v přítomnosti 0,1 až 1,0 molárního ekvivalentu bortrifluoridetherátu při teplotě 10 až 30 °C po^ dobu 0,5 až 3 hodin, s výhodou v přítomnosti 0,1 molárního ekvivalentu při 25 °C po dobu jedné hodiny, a získá se odpovídající alkylester H—Cys (Trt)—O Alk.

Posledně jmenovaný alkylester chráněného cysteinu se pak nechá reagovat azidovou metodou s chráněným hydrazidem hexapeptidu vzorce

Ddz—Trp—Lys (Boc) —Thr (Bu⁺ ) —Phe— —Thr (Bu + ) —Ser (Bu ⁺ ) —NHNI-I2.

popsaného výše v odstavci a], a získá se po odštěpení chránící skupiny Ddz za mírných kyselých podmínek požadovaný druhý ester heptapeptidu vzorce Vb. Výhodné podmínky pro výše popsanou sekvenci reakcí zahrnují použití ekvimolárních částí uvedeného chráněného hydrazidu hexapeptidu a terc.butylnitritu v přítomnosti minerální kyseliny, s výhodou 2 až 3 molárních ekvivalentů chlorovodíku v inertním· bezvodém rozpouštědle, s výhodou DMF, načež přidáním příslušného alkylesteru vzorce H—Cys(Trt)Oalk s 2 až 3 molárntmi. ekvivalenty organické báze, s výhodou N-ethyldiisopropylaminu, v inertním bezvodém rozpouštědle, s výhodou DMF, se provede reakce při —20 až 25 °C po dobu 6 až 12 hodin, a čištěním vzniklého chráně ného alkylesteru heptapeptidu se získá sloučenina vzorce

Ddz—Trp—Lys (Boc) —Thr (Bu+ ) —Phe— —Thr (Bu +)—Ser (Bu + )—Cys (Trt ] — O Alk.

Posledně jmenovaná sloučenina se pak nechá reagovat za mírně kyselých podmínek, s výhodou mícháním ve směsi kyseliny octové, mravenčí a vody (7 : 1 : 2) po¹dobu 12 až 18 hodin při teplotě 20 až 25 stupňů Celsia, a získá se odpovídající alkylester heptapeptidu vzorce Vb.

V následujícím stupni postupu podle vynálezu se první hydrazid peptidu vzorce IVc a druhý ester heptapeptidu vzorce Vb nechá reagovat azidovou metodou popsanou výše za vzniku odpovídajícího lineárního peptidu vzorce II, kde R⁴ je Boc—Ala— —Gly—NH a R·² je COOalk nebo- alternativně psaný jako lineární tetradekapeptid vzCcrce líc

Boc—Ala—Gly—Cys (Trt )—Lys (Boc) — —Asn—Phe—Phe—Trp—Lys (Boc) — —Thr(Bu⁺)—Phe—Thr(Bu⁺)—Ser(Bu⁺) — —Cys (Trt)-OAlk (Hej

Převedení předcházejícího lineárního tetradekapeptidu vzorce líc na odpovídající sloučeninu vzorce I, kde R¹ je H—Ala— —Gly—NH a R2 je COOalk, se s výhodou i a účinně provádí nejprve reakcí posledně jmenovaného lineárního tetradekapeptidu s jódem, s výhodou v přítomnosti me-thanolu [jak bylo popsáno dříve pro přípravu cyklického disulfidového derivátu vzorce III v odstavci a)], přičemž se odštěpí chrániči skupiny thiolových skupin, to jest Trt, a vytvoří se disulfidový můstek a získá se odpovídající cyklický derivát disulfidu vzorce III, kde R² je COOalk a R⁴ je Boc—Ala— —Gly—NH nebo alternativně psaný jakoi derivát cyklického disulfidu vzorce IIIc,

Boc—Ala—Gly—Cys—Lys (Boc) —Asn—Phe—Phe—Trp—Lys (Boc ] — —Thr(Bu + Phe—Thr [Bu⁺ )—Ser (Bu+)—Cys—Oalk.

Následující reakcí posledně uvedené sloučeniny za mírných kyselých podmínek, s výhodou koncentrované kyseliny chlorovodíkové ochlazené asi na 0 °C [jak bylo popsáno dříve pro přípravu cyklického peptidu vzorce I v odstavci a)·], se odstraní zbylé chránící i skupiny (to jest Boc a Bu+) a dalším čištěním popsaným v odstavci aj se získá peptíd vzorce I, kde Ri je H—Ala— —Gly—NH a R2 je COOAlk neboi alternativně psaný jako sloučenina vzorce

HI—Ala—Gly—Cys—Lys—Asn—Phe— —Plie—Trp—Lys—Thr—Phe—Thr—Ser— —Cys—OAlk ve formě volné báze nebo soli s kyselinou.

Ve výše uvedeném postupu popsaném' pod

c) se chránící skupina Bu⁺ pro hydroxylovou skupinu šeřinu a threoninu může vyjest skupiny i Ser(Bu⁺j a Thr(Bu⁺) se mioho|u nahradit Ser a Thr. Také s ohledem na postup pod c) se Trt chránící skupina zbytků cysteinové aminokyseliny může nahradit chránící skupinou Aom.

Postupy popsané výše pod a) až cj je možno znázornit následujícími i schématy:

a) R1 H—Gly—Gly—Ala—Gly—NH,

H—Gly—Gly—Gly—Ala—Gly—NH a H— —Leu—Gly—Gly—Ala—Gly—NH a R2 = = H neboi COOH

PAe “77ir-.Se.rNHCH(l&-C^H2³~^Trt

Ctfs-tbfS-Asiz-Phe-Pbe Trp-L.s-Tfa-Phe-Tkr-Ser' ^Ί I V! NHcm^x^ns-^гн ' t ¹ >

⁴ Vin „

b) R‘- H nebo NHR* R^ZH

Trt-SCH₂CHί/Λ CO+i^-Asa-Phe-Phe Trp-L^-Thr-Phe-Tkr-Ser-NHCHfR²}\ IV | V CKS-Trt —J--------- z ll-W-ti

c) pLH-Alz-Gltf -NH a R^Z=COOaik

Boc-Al&rGltf-Ctis~Ltfs~Asn.~Pbe~Phke - Trp-Lp-Thf-PtiéThr-Ser-Cys-CA tk | JVc | Vb _r lIc-VIIc-V

Konečně odborníkům je známo, že se mohou, aniž djoichází к odchýlení od rozsahu vynálezu použít ekvivalentní skupiny chránící aminoskupiny, hydroxyskupiny nebo) thiolové skupiny, mohou se použít ekvivalentní reakce pro spojování peptidických fragmentů a mohou se použít ekvivalentní metody pro odštěpení chránících skupin aminoskupin, hydroxyskupin nebo· thioloivých skupiny. Tyto alternativy spadají do rozsahu vynálezu.

Následující diagram a příklady objasňují dále vynález.

Linerání peptid (II)

I Oxidace l

Cyklický disulfidový derivát (III)

I

Odstranění chránících skupin l

Peptid (I) Příklad 1

Trifluoiracetát alanyl-glycinmethylesteru (H—Ala—Gly—OMe.CF₃COOH)

Boc—Ala—Gly—OMe [10 g 45 mmol, popsaný H. U. Immer aj. Helv. Chilm. Acta. 57, 730 (1974)] se rozpustí ve studené (lázeň s ledem) kyselině trifludroctové (100 mil). Roztok se míchá 1 hodinu při 0 °C a rozpouštědlo se odpaří. Odparek se rozpustí v methanolu, přidá se diethylether, sraženina se odfiltruje a získá se sloučenina uvedená v nadpisu.

Příklad 2 t-Butyloxykarbonyl-glycyl-alanyl-glycinmethylcster (Boc—Gly—Ala—Gly—OMe)

К studenému (lázeň s ledem) roztoku H—Ala—Gly—ОМе.СНзСОгН (45 mmol, pO'psanému v příkladu 1) v dimethylformamidu (50 mol) se přidá N-ethylmorfolin (pH ~ 8), pák se přidá studený roztok Boc— —Gly—OTcp (18 g, 45 mimol) v dimethylformamidu (50 ml). Roztok se udržuje dva dny v ledové lázni. Rozpouštědlo se odpaří a produkt se čistí chromatografií na koloně silikagelu za použití směsi ethylacetátu-miethanolu a pyridinu (98 : 1 : 1): Produkt krystaluje ze směsi ethylacetátu a petroletheru a získá se sloučenina uvedená v nadpisu, b. t. 98—100 °C; NMR (DMSO-de), 1,25 δ (3H), 1,4 <5 (9H), 3,68 δ (ЗН).

Příklad 3

Trifluoracetát glycyl-alanyl-glycinmethylesteru (H—Gly—Ala—Gly—OMe.CF3COOH)

Boc—Gly—Ala—Gly—OMe (6,4 g, 20,1 mmol, popsaný v příkladu 2) se rozpustí ve studené (lázeň s ledem) kyselině trifluoroctové (120 ml) a roztok se míchá jednu hodinu při 0 °C. Rozpouštědlo se· odpaří, odparek se rozpustí v methanolu a produkt se vysráží přidáním diethyletheru. Odfiltrováním sraženiny se získá sloučenina uvedená v nadpisu.

Příklad 4 t-Butyloxykarbbnyl-glycyl-glycyl-alanyl-glycinmethylester (Boc—Gly—Gly—Ala.— —Gly—OMe)

К studenému (lázeň s ledem) míchanému, roztoku H—Gly—Ala—Gly—OME. .CH5CO2H (6,4 g, 20,03 mmol, popsanému v příkladu 3) v dimethylformamidu (30 ml) se přidá N-ethylmorfolin (2,8 ml) a pak se přidá roztok Boc—Gly—OTcp (8,5 g, 24 mmol) v dimethylformamidu (20 ml). Roztok se udržuje v lázni s ledem dva dny. Rozpouštědlo se odpaří a odparek se rozpustí v miethanolu a produkt se vysráží diethyletherem. Krystalizací z ethylacetátu se získá sloučenina v nadpisu b. t. 103—105 9tupňů Celsia a 141 °C (dimorfní); NMR 1,25 8 (3H), 1,38 5 (9H), 3,65 8 (3H).

Příklad 5 t-Butyloxykarbonyl-glycyl-glycyl-alanyl-glycinhydrazid; IX, R⁵ = Boc (Boc—Gly— —Gly—Ala—Gly—NH—NH2)

К studenému (lázeň s ledem) míchanému roztoku Boc—Gly—Gly—Ala—Gly— —OMe (2,5 g, 6,7 mmol, popsanému v příkladu 4) v miethanolu (50 ml) se přidá hydrazinhydrát (2,5 ml). Roztok se imíchá při 0 °C tři hodiny a pak při teplotě místnosti přes noc. Sraženina se odfiltruje, promyje methanolem a vysušením se získá sloučenina uvedená v nadpisu. Analýza aminokyselin: Gly 3, Ala 0,99.

Příklad 6 it-Butyloxykarbonyl-glycyl-glycyl-alanyl-glycyl-S-trityl-cysteinyl-N^e-t-butyloxykarbonyl-lysyl-asparaginyl-fenylalanyl-fenylalaninmethylester [ Boc—Gly—Gly—Ala— —Gly—Cys( trt) —Lys (Boc) —Asn—Phe— —Phe—OMe]

К roztoku Boc—Gly—Gly—Ala—Gly— —NH—NH2 (1,57 g, 4,2 mmol, popsanému v příkladu 5) v dimethylsulfoxidu (25 ml) a dimethylformamidu (25 ml) se přidá 2,04 N roztok chlorovodíku v ethylacetátu (5,15 ml) při teplotě —10 °C. Roztok se ochladí na—12 °C a přidá se terc.butylnitrít (0,61 mil, 5,2 mimol). Roztok se 15 minut udržuje při —10 °C, ochladí se na —15 °C a nejprve se přidá N-ethyldiisopropylamin (1,8 mil,, pH 8) a pak roztok H—Cys(Trt) — —Lys(Boc)—Asn—Phe—Phe—OMe [4,5 g, 4,19 mimol, popsaný v práci H. U. Imimer aj., Helv. Chim. Acta, 57, 730 (1974)] a N-ethyldiisopropylaminu (0,72 ml) v dimethylformamidu (25 iml). Směs se míchá jednu hiodinu při —10 °C a přes noc při teplotě místnosti. Po odpaření se odparek rozpustí v miethanolu, produkt se vysráží vodou a krystalizací z methanolu se získá sloučenina uvedená v nadpisu. Analýza aminioikysen: Lys, 1,07; Asp, 0,97; Gly, 3,27; Ala, 1,0, Phe, 2,08, Cysteová kyselina 1,35.

Příklad 7 t-Butyloxykarbonyl-glycyl-glycyl-alanyl-glycyl-S-trityl-cysteinyl-NM-butyloxykarbonyl-lysyl-asparaginyl-fenylalanyl-fenylalaninhydrazid, IV, R⁴ = Boc—Gly—Gly— —Ala—Gly—NH [Boc—Gly—Gly—Ala— —Gly—Cys (trt)—Lys (Boc) —Asn—Phe— —Phe—NH—NH2]

К studenému (lázeň s ledem) roztoku Boc—Gly—Gly—Ala—Gly—Cys(Trt) — —Lys(Boc)—Asn—Phe—Phe—OMe (0,9 g, 0,66 mmioil, popsanému v příkladu 6] v dimethylformamidu (25 ml) se přidá hydrazinhydrát (1,5 ml). Roztok se míchá 18 hodin při teplotě místnosti. Rozpouštědlo se odpaří a odparek se rozmělní s methanolem, vysuší nad kysličníkem fosforečným a získá se tak sloučenina uvedená v nadpise. Analýza aminokyselin: Lys, 1,10, Asp, 1,00, Gly, 3,33, Ala, 1,0, Phe, 2,14, Cysteová kyselina 1,35.

Příklad 8 t-Butyloxykarbonyl-glycyl-glycyl-alanyl-glycyl-S-trityl-cysteinyI-N^E-t-butyloxykarbonyí-lysyl-asparaginyl-fenylalanyl-fenylalanyl-tryptofyl-N^E-t-butyIoxykarbonyl-lysyl-O-t-butyl-threonyl-fenylalanyl-O-t-butyl-threonyl-O-t-butyl-seryl-S-trityl-cystein, II, R² = COOH a R⁴ = Boc—Gly— —Gly—Ala—Gly—NH [Boc—Gly—Gly— —Ala—Gly—Cys (Trt) —Lys (Boc) —Asn— —Phe—Phe—Trp—Lys (Boc) —Thr (Bu⁺) — —Phe—Thr (Bu+)—Ser (Bu⁺)—Cys(Trt) — —OH]

К roztoku Boc—Gly—Gly—Ala—Gly— —Cys(Trt) —Lys (Boc) —Asn—Phe—Phe— —NHNHz (800 mg, 0,59 mmol, popsanému v příkladu 7) v dimethylformamidu (12 ml), míchanému při —20 °C se přidá 1,85 N roztok chlorovodíku v ethylacetátu (0,795 ml, 1,475 mmol). Směs se ochladí na —15 “C, přidá se terc.butylnitrít (0,081 ml, 0,71 mmol) a roztok se míchá 15 minut. Roztok H—Trp—Lys(Boc)—Trh(Bu⁺)— —Phe—Thr (Bu ⁺) —Ser (Bu+) —Cys (Trt) — —OH [816 mg, 0,59 mmol, popsaný H. U. Immer aj., Helv. Chim. Acta, 57, 730 (1974)] a Ν-ethyldiisopropylaminu (0,354 ml, 2,06 mmol) v dimethylformamidu (6 ml) se ochladí na —15 °C a přidá se к výše připrané reakční směsi. Směs se míchá jednu hodinu při —15 °C a 18 hodin při 25 °C. Rozpouštědlo se odpaří a odparek se rozmělní s ledeim ochlazenou kyselinou citrónovou, přefiltruje se, promyje vodou, pak methanolem a získá se sloučenina uvedená v nadpisu. Analýza aminokyselin: Lys, 1,94, Asp, 0,96, Thr, 1,64, Ser, 0,49, Gly, 2,82, Ala, 1,00, Phe, 2,80.

Příklad 9

Cyklický sulfid glycyl-glycyl-alanyl-glycyl-cysteinyl-lysyl-asparaginyl-fenylalanyl-fenylalanyl-tryptofyl-lysyl-threonyl-fenylala207570 nyl-threonylseryl-cysteinu, I, R¹ — H—Gly—Gly—Ala—Gly—NH a R² == COOH (H— —Gly—Gly—Ala—Gly—Cys—Lys—Asn—Phe—Phe—Trp—Lys—Thr—Phe—Thr —Ser—Cys—OH)

Boc—Gly—Gly—Ala—Gly—Cys (Trt) — —Lys (Boc) —Asn—Phe—Phe—Trp— —Lys (boc) —Thr (Bu + ) —Phe—Thr (Bu+) — —Ser(Bu⁺)—Cyy.-(Trt)—OH, popsaný v příkladu 8 (0,871 g, ' 0,32 mmol) se rozpustí v ledové kyselině octové (150 ml) a při teplotě místnosti se přikape během jedné hodiny k roztoku jódu v methanolu (0,5 %, 150 ml, 30 mmol). Směs se míchá dalších minut, ochladí se v lázni s ledem a přidá se roztok thiosíranu sodného ve vodě (1N, 6 ml) tak, aby se odstranil přebytek jódu , (bezbravý roztok). Rozpouštědlo se odpaří a odparek se rozmělní s vodou, vysuší, suchý produkt se rozmělní s isopropyletherem a získá se cyklických disulfid hexadekapeptidu vzorce III.

Boo—Gly—Gly—Ala—Gly—Cys—Lys (Bon )—Asn—Phe—Phe—Trp—Lys (Boc) — —Thr (Bu+) — Phe—Thr (Bu⁺) —Ser(Bu⁺ )—Cys—OH (III).

K posledně jmenované sloučenině se v atmosféře dusíku za intenzivního míchání v ledové lázni přidá studený koncentrovaný roztok kyseliny chlorovodíkové (23 ml). V míchání se pokračuje ještě asi 10 minut, k roztoku se přidá ledová kyselina octová (300 ml) a roztok se lyofilisuje. Odparek se rozpustí ve vodě a znovu se lyofilisuje. Odparek se pak rozpustí v 0,01 N vodném roztoku octanu amonného a nanese se na kolonu karboxymethylcelulózy (Whatman CM—23 2,5 x 30 cm). Čistá sloučenina se eluuje 0,06 N pufrem · ·octanu amonného. Čištěný materiál se lyofilisuje z vody a získá se sloučenina uvedená v nadpisu ve formě bílé pevné látky jako sůl s kyseliMeOH nou octovou; A 282 nm (ε 5260), 289 max nm (ε 4730), analýza aminokyselin: Lys, 2,28, Asp, 1,05, Thr, 1,95, Ser, 0,93, Cys, 2,34, Gly, 3,00, Ala, 1,05, Phe, 3,12. Opakovanou lyofilisací posledně jmenovaného produktu z vody se získá sloučenina uvedená v nadpisu ve formě volné báze. Analýza aminokyselin: Lys, 2,10, Asp, 1,04, Thr, 1,80, Ser, 0,95, Cys, 2,17, Gly, 3,00, Ala, 1,07, Phe, 2,99.

Analogickým způsobem, ale za použití rhodanu, postupem podle Hiskey a Smith, citace výše, místo· jódu se získá také sloučenina uvedená v nadpisu.

Příklad 10 t-Butyloxykarbonyl-leucyl-glycyl-glycyl-alanyl-glycirnnethylester (Boc—Leu—Gly— —Gly—Ala—Gly—OMe)

Roztok Boc—Gly—Gly—Ala—Gly—OMe (2,0 g, 5,35 mmol, popsaný v příkladu 4) v kyselině trifluoroctové (25 ml) se míchá jednu hodinu při 0 °C. Rozpouštědlo se odpaří, odparek se rozmělní v ' etheru, pevný podíl se odfiltruje, vysuší a získá se tetrapeptid vzorce H—Gly—Gly—Ala—Gly— —OMe, isolovaný ve formě soli s kyselinou trifluor octovou.

Roztok posledně uvedeného tetrapeptidu (5,35 mmol), Boc—Leu—OH (2,31 g, 10 mmol), 1-hy (1,35 g, 10 mmol), dicyklohexylkarbodiimidu (2,27 g, 11 mmol) a N-ethylmorfolinu [0,68 ml) v dimethylformamidu (25 ml) se míchá 24 hodin při 0 °C. Směs se filtrací zbaví sraženiny a filtrát se přidá k 200 ml diethyletheru. Sraženina se odfiltruje a krystalizací z methanolu a isopropyletheru se získá sloučenina uvedená v nadpisu b. t.

190,5—193 °C, [a]n²⁵ -= -15,2° (c = 1, dimethylf ormamid).

Příklad 11 t-Butyloxykarboriyí-leucyl-glycyl-glycyl·· -alanyl-glycinhydrazid, IX, R⁵ = Boc—Leu (Boc—Leu—Gly—Gly—Ala—Gly—NHNHz)

Roztok Boc—Leu—-Gly—Gly—Ala—Gly— —OMe (2,0: g, 4 mmol, popsaný v příkladu 10) a hydrazinhydrátu (4,12 ml, 80 mmol) v methanolu (50 ml) se míchá 4 hodiny při 0 °C. Roztok se zahustí na 4 ml a přidá se k diethyletheru (200 ml). Sraženina se odfiltruje, rozpustí v methanolu (4 m.l) a přidá se k diethyletheru (200 ml). Sraženina se odfiltruje, vysuší a získá se sloučenina uvedená v nadpisu, b. t. 174—176,5 °C, [a]o24 = 12,0° (c = 1, dimethylformamid).

Příklad 12 t-Butyloxykarbonyl-leucyl-glycyl-glycyl-alanyl-glycyl-S-trityl-cysteinyl-N^£-t-butyloxykarboinylllyyyl-asparaginyl-fenylalanyl-fenylalaninmethylester [ Boc—Leu—Gly— —Gly-Ala—Gly—Cys (Trt) - Lys (Boc) — —Asn—Phe—Phe—OMe ] t-B^dtylniitrit (0,15 ml, 1,27 ihmol) se přidá k roztoku Boic—Leu—Gly—Gly—Ala— —Gly—N₂H3 (0,308 g, 0,635· mmol, popsanému v příkladu 11) v dimethylformamidu (5 ml) při —20· °C a 2,4 N kyseliny chlorovodíkové v ethylacetátu (0,66 ml, 1,59 mmol). Po patnáctiminutovém míchání při —20 °C se přidá roztok H—Cys (Trt) — —Lys(Boc)—Asn—Phe—Phe—OMe [0,62 g, 0,58 mimo!, popsaný H. U. Immer aj., Helv. Chim. Acta. 57, 730 (1974)] a diisopropylethylaminu (0,372 ml) v dimethylformamidu (6 ml). Po· míchání 1 hodinu při —20 stupních Celsia a 24 hodin při 0 °C se roztok přidá k diethyletheru (200 ml). Sraženina se odfiltruje, rozpustí v methanolu (5 ml) a. přidá se· k diethyletheru (200 :ml). Sraženina se odfiltruje, vysuší a získá se sloučenina uvedená v nadpisu, b. t. 238— —240,5 °C.

Příklad 13 t-Butyloxykarbonyl-leucyl-glycyl-glycyl-alanyl-glycyl-S-trityl-cysteinyl-N^e-t-butyloxykarbonyllysyl-asparaginyl-fenylalanyl-fenylalaninhydrazid, IV, R⁴ = Boc—Leu— —Gly—Gly—Ala—Gly—Nh [Boc—Leu— —Gly—Gly—Ala—Gly—Cys (Trt) — —Lys-(Boc) — Asn—Phe—Phe—NHNHž]

Roztok Boc—Leu—Gly—Gly—Ala—Gly— —Cys (Trt) —Lys (Boc) — Asn—Phe—Phe— —OMe (0,56 g, 0,38 mmol, popsaný v příkladu 12) a hydrazinhydrátu (0,74 ml] v dimethylformamidu (10 ml) se míchá 12 hodin při 0 °C a 24 hodin při 25 °C. Roztok se přidá k diethyletheru (100 ml). Sraženina se odfiltruje, rozpustí v dimethylformamidu (3 ml) a přidá se k diethyletheru (100 ml). Sraženina se odfiltruje, vysuší a získá se sloučenina uvedená v nadpisu,. b. t. 239—242 °C. Analýza. aminokyselin: Lys, 1,05, Cysteinová kyselina 0,66, Asp, 0,99, Gly, 3,00, Ala, 1,11, 1/2 Cys, 0,21, Leu, 0,96, Phe, 1,86.

Příklad 14 t-ButyloxxkaabonyHeucyl-glycyl-glycyl-alanyl-glycyl-S--rityl-cysteinyl-N^e-t-butyloxykaгbonkl-lysyllasparaginyl-fenklalankl-fenklalankl-trkptofkl-N^E-t-butkloxykarbonyl-lkSkl-O-t-butyl-threonkl-fenklalankl-O-t-butkl-threonkl-O-t-butkl-serkl-S-trityl-cystein, II, R2 = COOH a R⁴ = Boc—Leu— —Gly—Glk—Alo—Glk—NH [ Boc—Leu— (Trt) — —Lys (Boc) — Asn—Phe—Phe—Trp— —Lys(Boc)—Thr(Bíu⁺ )—Phe—Thr(Bu⁺ )— —Ser (Bu +) —Cys (Trt)—OH ] t-Butylnitrit (0,03 ml, 0,28 mmol) se při —20 °C přidá k roztoku Boc—Leu—Gly.— —Gly—Ala—Gly—Cys [Trt) —Lys (Boc) — —Asn—Phe—Phe—Ν2Η3 (0,20 g, 0,14 mmol, popsanému v příkladu 13) v dimethylsulfoxidu (2 ml), dimethylformamidu (4 ml) a 2,21 N. chlorovodíku v ethylacetátu (0,16 ml, 0,35 mmol). Po 15 minutovém míchání při —20 °C se přidá roztok H—Trp— .

—Lys(Boc)—Thr^:(Bu⁺)—Phe—Thr(Bu⁺) — —Ser(Bu⁺]—Cys(TrtJ—OH.HCO2H [0,20 g, 0,14 mmol, popsaný H. U. Immer aj., Helv. Chim. Acta, 57, 730 {1974)] a diisopropylethylanriniu (0,08 ml, 0,49 mmol) v dimethylformamidu (5 ml). Roztok se míchá jednu hodinu při —20 °C a · 24 hodin při 0 °C. Roztok se zahustí na 2 ml a přidá se diethylether (100 ml). Sraženina se odfiltruje, promyje vodou (2 x 5 ml), methan olem (2 x 5 ml) a vysušením se získá sloučenina uvedená v nadpisu. Analýza aminokyselin: Lys, 1,92, Cysteová kyselina, 0,93, Asp, 0,93, Thr, 1,38, Ser, 0,66, · Gly, 3,00, Ala, 1,02, 1/2 Cys, 0,39, Leu, 0,93, Phe, 2,70.

Příklad 15

Cyklický disii-lfid. leucyl-glycyl-glyckl-alanyl-glyckl-cystemkl-lkeyl-aeparaginyl-fenylalankl-fenklalankl-ttkptofkl-lkskl-threonkl-fenkl-alanyl-threonkl-setkl-ckstein, I, R¹ = = H—Leu—Gly—Glk—Ala—Glk—NH a R2 = COOH [H—Leu—Glk—Glk—Ala— —Glk—Cys—Lys—Asn—Phe—Phe—Trp—

—Lys—Thr—Phe—Thr—Ser—Cys—OH)

Roztok Boc—Leu—Gly—Gly—Ala—Gly— —Cys (Trt) —Lys (Bdc)—Asn—Phe—Phe— —Trp—Lys (Bole) —Thr (Bu⁺) —Phe— —Thr [ Bu⁺) —Ser (Bu-4—Cys (Trt) —OH (0,23 g, 0,081 mmol, popsaný v příkladu 14] v kyselině octové (90 ml) se přikape během jedné hodiny k roztoku 0,5 % jódu v methanolu (41,5 ml, 0,81 mmol). Po dokončení přidávání se roztok .míchá při teplotě místnosti jednu hodinu a pak se ochladí na 0 °C. Pak se přidá thiosíran sodný (1,62 ml), až roztok zůstane bezbarvý. Rozpouštědlo· se odpaří, zbytek se rozmělní s etherem a vysušením se získá cyklický disulfid heptadekapeptidu vzorce III.

Boic—Leu—Glk—Gly—Ala—Gly—Cys— —Lys· (Boc)—Asn—Phe—Phe—Trp— —Lys (Boc) — Thr(Bu⁺)—Phe—Thr(Bu⁺ ] — —Ser (Bu⁺)—Cys—OH (ΙΠ)

Roztok cyklického disulfidu heptadekapeptidu (0,155 g, 0,066 mmol) v koncentrované kyselině chlorovodíkové (6,87 ml) se intenzívně míchá 8 minut při 0 °C. Přidá se kyselina octová (69 ml) a roztok se lyofilisuje. Zbytek se lyofilieuje z vody (50 ml). Odparek se chromatografuje na koloně chemicky modifikovaného síťovaného dextranu „Sephadex G—25 M” [3 x 50 cm, ekvilibroivanéh.o ve spodní fázi a pak v horní fázi směsi n-butanol—kyselina octová— —voda (4 : 1 : 5)], přičemž vrchní fáze se použije pro desorpci peptidu. Frakce obsahující čistý petpid se spojí, odpaří a lyofilisací z vody se získá sloučenina uvedená v nadpisu ve formě soli s kyselinou octoMeOH vou. λ 290 (ε 5000), 281 (ε 5540), 275 max (ε ' 5205), 269 (ε 4980), 265 (ε 4625), 259 nm (ε 4085). Opakovanou lyofilisací posledního produktu z vody se získá sloučenina uvedená v nadpisu ve formě ' volné báze. Analýza aminokyselin: Lys, 1,98, Cysteová kyselina 1,41, Asp, 1,26, Thr, 1,92, Ser, 0,96, Gly, 3,00, Ala, 1,02, Leu, 0,96, Phe 2,76.

Stejným způsobem, ale použitím rhodanu, metodou podle Hiskey a Smlth, citace výše, místo jódu se rovněž získá sloučenina uvedená v nadpisu.

Příklad 16 t-Butyloxykarbonyl-glycyl-glycyl-glycyl-alanyl-glycinmiethylester (Boc—Gly—Gly—Gly— —Ala—Gly—OMe)

Roztok Boc—Gly—OTcp (3,7 g;, 10,04 mmol), H—Gly—Gly—Ala—Gly—OMe . . CF5CO2H (3,12 g, 8,03 mmol, popsaný v příkladu 10, a N-ethylmorfolinu (1,1 ml) v dilmethylf ormamidu (15 ml) se míchá 20 hodin při 0 °C. Sraženina se odfiltruje a k diethyletheru se přidá filtrát. Spojené vysrážené podíly se krystalují z methanolu a , získá se sloučenina uvedená v nadpisu, b. t. 198—201 °C, [ab²⁴ = —3,9°, (c = 1, dimethylf ormamid).

Příklad 17 t-Butyloxykarbonyl-glycyl-glycyl-glycyl-alanyl-glycinhydrazid, IX, R⁵ == Boc—Gly (Boc—G-ly—Gly—Gly—Ala—Gly—NHNHz)

Roztok Boc—Gly—Gly—Gly—Ala—Gly— —OMe (1,0 g, 2,32 mmol, popsaný v příkladu 16) a hydrazinhydrátu (1 ml, 23,2 mmol) v methanolu , (30 ml) se míchá 4 hodiny při 0' °C. Po odpaření se zbytek rozmělní s diethyletherem a vysušením se získá sloučenina uvedená v nadpisu, b. t. 221—233 °C.

Příklad 18

N,S-Diirityl-cysteinyl-N6-t-butyloxykriOonyl-lysyl-asparaginyl-fenyl-alanyl-fenylalaninhydrazid, VI, [Trt—Cys(Trt) — —Lys( Boc) —Asn—Phe—Phe—NHNH2]

Roztok Trt—Cys (Til') —Lys(Boc) —Asn— —Phfe—Phe—OMe [1,25 g, 1,0 mm|ol, po psaný v práci H. U. , Imimer aj., Helv. Chim. Acta, 57, 730 (1974]] a hydrazinhydrátu (0,97 ml, 20 mmol) ' v methanolu (30 ml) se míchá při 0 °C dva dny. Rozpouštědlo se odpaří a zbytek se krystaluje ze směsi ethanolisopropylether a , získá se sloučenina uvedená v nadpisu, NMR (DMSO—de): δ 1,38 (s, 9 H), 7,19—7,30 (m, 40 H).

Příklad 19

N,S-Di_:trityl-cysteinyl-Ne-t-butyloxykarbanyl-lysyl-asparaginyl-fenylalanyl-fenylalanyl-tryptofyl-NM-biutyloxykarbouLyl-lysyl-O---butyl-threo^|nyl-fenyl-alanyl-0-t-butyl-threonyl-O-^-butyl-seryl-S-trityl-cystein, VII, R2 = COOH [Trt—Cys (Trt)-Lys (Bo.c) — —Asn—Phe—Phe.—Trp—Lys (Boc) — —Thr(Bu⁺)—P'hie—The(Bu⁺ )—Ser(Bu⁺ )— —CysfTrtJ—OH] t-Butylnitrit (0,09 ml, 0,74 mmol) ' se ' při —20 °C přidá k roztoku Trt—Cys(Trt)— —Lys( Boc) — Asn—Phe—Phe—NHNHž (0,62 g, 0,493 mmol, popsanému v příkladu 18) v dimethylfarmamidu (10 ,ml) a 2,6 N chlorovodíku v ethylacetátu (0,475 ml, 1,23 mmol). Po' míchání při — 20 ⁰C po dobu 15 minut se přidá roztok H—Trp— —Lys (Boc) —Thr ' (Bu⁺) —Phe—Thr (Bu +] — —Ser(Bu+ )—Cys(Trr]— OH . HCOOH [0,70 g, 0,493m mol, popsaný H. U. Immer aj., Helv. Chim. Acta, 57, 730 (1974)] ' a diisopropylethy laminu [0,30 ml, 1,65 mmol) v dimethylf ormamidu (10 ml). Roztok se míchá při —20 °C jednu hodinu a při 25 °C 24 hodin a odpaří se. Odparek se rozmělní s vodou, diethsle-herem, studenou 1N kyselinou citrónovou a získá se sloučenina uvedená v nadpisu — NMR (CDCls) δ 1,08 a 1,13 (s, 27 H), 1,37 (s, 18 H), 7,28 (m, 60 H), analýza aminokyselin: Lys, 2,23, cssteová kyselina, 1,10, Asp, 1,00, Thr, 2,12, Ser, 1,02, 1/2 Cys, 0,64, Phe, 3,18.

Příklad 20

S-Trityl-cssteinyl-N^ε-t-butsloxykarbonyl-lysyl-a'sparagmsl-fenslalansl-fenylalansl-tryptofyl-N6---bu-sloxykarbonyl-lysyl-0-t--hreonyl-fenylalanyl-O-t-bu-yl--hreonyl-O---bu-sl-seгyl-S-tritsl-css-einformiá-, VIII, R² = COOH [H—Gys(Trt)—Lys(BoC) — —Asn—Phe—Phe—Trp—Lys (Boc) — —Thr, (Bu+) — Phe—Thr (Bu + ) — Ser( Bu +)— —CyssTrt)— OH . HCOOH

Roztok Trt—Cys(Trt)—Lys (Boc)—Asn— ' —Phe—Phe—Trp—Lys (Boc ] —Thr (Bu⁺) — —Phe—Thr (Bu +) — Ser (Bu +) — Cys (Trt) — —OH (0,50 g, 0,192 mmol, popsaný v příkladu 19) v 6 ml směsi kyseliny octové, kyseliny mravenčí a vody (7 : 1 : 2) se ' míchá 6 ' hodin při 25 °C. Rozpouštědlo se odpaří, odparek se rozmělní s diethsletherem a získá se sloučenina uvedená v nadpisu. Analýza aminokyselin: Lys, 2,23, cysteová kyselina,

3β

1,38, Asp, 1,00, . Thr, 2,14, Ser, 0,86, Phe, 3,24.

Příklad 21 t-Butyloxykarbon,yl-glycyl-glycyl-glycyl-alanyl-glycyl-S-tritylOysteinyl-Ne-t-butyloxykarbonyl-lysyllasparaginyl-fenylalanyl-fenylalanyl-tryptofyl-N.e-t-butyloxykarbO'nyl-lysyl-O-ttbutyl-threonyl-fenylalaiiyl-O-t-butyl-threonyl-O-t-biutyl-seryl-S-trityl-cystein, II, R² = COOH - a R⁵ = Boc—Gly— —Gly—Gly—Ala—Gly—NH [Boc—Gly— —Gly—Gly—Ala—Gly—Cys (Trt) — —Lys(Boc) —Asn—Phe—Phe—Trp— —Lys(Boc) —Thr(Bu+ )—Phe—Thr(Bu+) — —Ser(Bu+)—Cys(Trr)—OH] t-Butylnitrit (0,04 ml, 0,34 mmol) se při —20 °C přidá k roztoku Boc—Gly—Gly— —Ala—Gly—NHNHz (0,076 g, 0,176 mimol, popsanému v příkladu 17] v dimethylsulfoxidu (1 ml), dimethylformamidu (2 ml) a 2,5 N 'chlorovodíku . v ethylacetátu (0,176 mil, - 0,44 - mimol). Po míchání 15 minut při —20 °C se . přidá roztok H—Cys- (Trt) — —Lys( BOC)—Asn·—Phe—Phe—Trp— —Lys(Boc)—Thr(Bu+)—Phe—Thr(Bu + ) — —Cys(Trt)— OH. HCOOH (0,385 g 0,16 mmol, popsaný v příkladu 20) a diisopropyiethylaminu (0,12 - ml) v dimethylfonmamidu . - (5 ml). Roztok se míchá jednu hodinu při —20. °C, . jednu hodinu při 0 °C a 20 hodin - -při - 25' °C. . Rozpouštědlo - se odpaří a odparek - se . přidá k diethyletheru - (100 ml). Sraženina se odfiltruje, promyje vodou, methanoilem a vysušením - se získá sloučenina uvedená- v - - nadpisu. - Analýza aminokyselin: Lys, - 2,30, cysteinová kyselina, 1,42, Asp, 1,00, -Thr, 2,27, Ser, 1,00, Gly, 3,84, Ala, 1,00, Phe, 3,34.

Příklad 22

Cyklický disulfid glycyl-glycyl-glycyl-alanyl-glycyl-cysteinyl-lysyl-aspanaginyl-:fenylalanyl-fenylalan^yl-ti^ypt^ofyl-lysyl-threo^Ilyl-fenylalan.yl-thгeo·nyl-senyl-cysteinu, I, R1. = - - H—Gly—Gly—Gly—Ala—Gly—NH a R2 = COOH (H—Gly—Gly—Gly—Ala— —Gly—Cys—Lys—Asn-Phe—Phe—Trp— —Lys—Thr—Phe—Thr—Ser—Cys—OH)

Roztok Boc—Gly—Gly—Gly—Ala—Gly— —Cys (Trt) —Lys (Boc) —Asn—Phe—Phe— —Trp—Lys (Boc) —Asn—Phe—Phe—Trp— —Lys (BOC) —Thr (Bu+) —Phe—Thr (Bu+ ] -— —Ser(Bu+)—Cys(Trt)—OH (0,285 g, 0,103 mmol, popsaný v příkladu 21) v kyselině octové (200 ml) se přidá během 60- minut k roztoku 0,5 % - jódu v methanolu (50 iml, 1,03 mrhol) a směs se míchá 60 -minut při teplotě místnosti. Roztok se -ochladí na 0 °C a přidá se 1N roztok thiosíranu sodného (2,06 mmol) a získá se bezbarvý roztok. Rozpouštědlo se odpaří a olejovitý zbytek se přidá do vody (100 ml). Sraženina se- odfiltruje a vysušením se získá cyklický disulfid heptadekapeptidu vzorce III.

Bo.c—Gly—Gly—Gly—Ala—Gly—Cys— —Lys- (Boc) — Asn—Phe—Phe—Trp—____ —Lys (Boc) —Thr (Bu⁺ ) —Phe—Thr (Bu⁺ ) — —Ser (Bu+)—Cys—OH (III)

Roztok posledně zmíněného cyklického disulfidu heptadekapeptidu (0,10 mmol) v koncentrované kyselině chlorovodíkové (10 ml) se míchá 10 minut při 0 °C v atmosféře- dusíku. Přidá se kyselina octová (100 ml) a - roztok se - lyofillsuje. Po další lyofilisaci z vody (100 ml) se roztok podrobí rozdělovači chromatografii na koloně chemicky modifikovaného síťovaného- dextranu [,,Sephadex G—25 M”, 3 x 50 cm, připravený ve spodní fázi směsi n-butanol—kyselina octová—voda (4 : 1 : 5) a pak ekvilibrovaný ve vrchní fázi] a - použitím- vrchní fáze směsi se desorbuje téměř čistý heptadekapeptid. Čisté frakce se spojí, odpaří a lyofilisaci se získá sloučenina uvedená v nadpisu ve formě soli s kyselinou octovou

MeOH λ 283 (ε 6702), 289 nm (ε 6350). Opamax kovanou lyofilisaci posledně -uvedeného produktu z vody se získá sloučenina uvedená v nadpisu ve formě volné báze. Analýza aminokyselin: Lys, 2,00, cysteová kyselina, 1,42, Asp, 1,09, Thr, 1,89, Ser, 0,91, Gly, 3,64, Ala, 0,98, Phe, 295.

Stejným způsobem, ale použitím rhodanu, postupem podle Hiskey - a Smith, citace výše, místo- jódu se získá sloučenina uvedená v nadpisu.

Příklad 23 •

N,S-Diirityl-cysteinyl-N^E-t-butyloxykarbonyl-lysyl-asparaginyl-fenylalanyl-fenylalanyl-tryptofyl-N*-t-butyloxykarbonyl-lysyl-O-t-butyl-threonyl-fenylalanyl-O-t-butyl-threonyl-O-1^^;^l^i^t^:^^^í^<^i'yl-;^-tt^^1tyl^hio^^hylamid, VII, R² = H [Tt—Cys(Trt) — —Lys (Boc) —Asn—Phe—Phe—Trp— —Lys( Boc) —Thr (Bu⁺) —Phe—Thr (Bu+) — —Ser (Bu+)—NHCH2CH2S—Trt ]

Hydrazid - pentapeptidu Trt-Cys(Trt) — —Lys (Boc) —Asn—Phe—Phe—NHNHz (0,80 g, 0,637 mmol, popsaný v příkladu 18) se rozpustí v bezvodém dimethylformamidu (9 ml) a ochladí se na —20 °C. Přidá se kyselina chlorovodíková v ethylacetátu (2,4 N, 0,691 ml) a pak terc.butylnitrit (0,0872 ml, 0,764 mmol). Směs se míchá 15 minut při —15 °C. Roztok H—Trp—Lys(Boc) — —Thr(Bu⁺ )—Phe—Thr(Bu+ )—Ser(Bu + ) — —NHCH2CH2S—Trt (0,852 g, 0,637 mmol), připravený podle USA patentu č. 3 917 581 z 4. XI. 1975, v dimethylformamidu (8 ml), obsahující N-ethyldiisopropylamin (0,272 ml, 1,59 mmol), se ochladí na —15 °C a přikape se k výše připravené reakční směsi. V míchání se pokračuje jednu hodinu při —15° C a při teplotě místnosti přes noc. Reakční směs se odpaří za sníženého tlaku, odparek se rozmělní s vodou, přefiltruje se, promyje vodou a vysuší se nad kysličníkem· fosforečným·. Odparek se chromatografuje na koloně silikagelu (163 g) chloroformem obsahujícím methanol (3 °/o) a pyridin (0,3 %) jako elučním činidlem a čistý produkt se krystaluje ze směsi methanolu a isopropyletheru. Získá se sloučenina uvedená v nadpisu, b. t. 163—180 stupňů Celsia (rozkl.).

Analýza pro C144H180N16O19S2 vypočteno:

C 69,85, H 7,04, N 8,76 %; nalezeno:

C 69,24, H 7,09, N 8,90 %.

Příklad 24

S-Trityl-cysteinyl-NE-t-butyloxykarbonyl· •lysyl-as.paragin.yl-fenylalanyl-fenylalanyl· •tryptofyl-NM-butyloxykarbonyl-lysyl-O-t· -butyl-threonyl-fenylalanyl-O-t-butyl-threonyl-O4d>utyl—eryl^-ritylthioethylamid· formiát, VIII, R² = Η [H-Cys(Trt) — —Lys (Boc) —Asn—Phe—Phe—Trp— —Lys ( Boc) —Thr(Bu⁺)—Phe—Thr (Bu + ) — — Ser(Bu+)—NHCH2CH₂S—Trt. HCOOH]

Undekapeptid Trt—Cys (Trt) —Lys(Boc) — —Asn—Phe—Phe—Trp—Lys (Bo-c) — —Thr(Bu+) — Phie—Thr(Bu⁺)—Ser(Bu⁺) — —NHCHžCHzS—Trt (0,909 g, 0,355 mmol, popsaný v příkladu 23) se rozpustí ve směsi kyseliny octové, kyseliny mravenčí a vody (7 : 1 : 2) (10 ml) a roztok se míchá přes noc při teplotě místnosti. Rozpouštědlo se odpaří a odparek se rozmělní s vodou. Získaná sloučenina se odfiltruje, promyje vodou a vysuší nad kysličníkem fosforečným. Pevný podíl se několikrát rozmělní se směsí petrolether/ether a vysušením se získá sloučenina uvedená v nadpise. Analýza aminokyselin: Lys, 2,03, Asp, 1,00, Ser, 0,87, Phe, 2,97, cysteová kyselina, 0,90, Thr, 1,85.

Příklad 25

У·BuУyloxykarbonyl-leucyl·glycyl-glycyl· ·alanyl-glycyl-S-Уrityl·cysteinyl-N^ε-t·butyl oxykarbonyl-lysyl-asparaginyl-fenylalanyl-fenylalanyl-tryptofyI-N^e-t-butylbxykarbonyl-lysyl-O4-butyll-hn}ony]-keiylalaiiyl.-O-t·butyll-hreonyI·O---butyl-seryl·2-trltyl· thioethylamid, II, R² = H a R4 == Boc— —Leu—Gly—Gly—Ala—Gly—NH [ Boc— —Leu—Gly—Gly—Ala—Gly—Cys (Trt) — —Lys (Boc) —Asn—Phe—Phe—Trp—.

—Lys —Thr (Bu⁺) —Phe—Thr (Bu⁺) — —Ser(Bu + )—NHCH2CH2S—Trt]

Hydrazid pentapeptidu Boc—Leu—Gly— —Gly—Ala—Gly—NHNI-U (0,066 g, 0,136 mmol, popsaný v příkladu 11) se rozpustí v dimethylformamidu ( 3 ml) a ochladí se na —20 °C. Přidá se kyselina chlorovodíková v ethylacetátu (2 N, 0,175 ml) a pak terc.butylnitrit (0,0186 ml, 0,163 mmol). Směs se míchá 15 minut při —15 °C. Roztok H—Cys (Trr) —Lys (Boc) —Asn—Phe— —Phe—Trp—Lys (Boc )—Thr (Bu⁺) — Phe— —Thr (Bu+ ) —Ser (Bu+ ) —NHCH2CH2S—Trt (0,315 g, 0,133 mmol), popsaný v příkladu 24, v dimethylformamidu (4 ml) · a obsahující N-ethyldiisopropylamin (0,082 ml, 0,476 mmol) se ochladí na —15 °C a přikape se k výše připravené reakční směsi. V míchání se pokračuje jednu hodinu při —15 stupních Celsia a při teplotě místnosti přes noc. Reakční směs se odpaří za sníženého tlaku, odparek se rozmělní ve studené kyselině citrónové- (1N), přefiltruje se a promyje vodbu. Pevný podíl se rozmělní s methanolem a.· vysuší se nad kysličníkem· fosforečným a získá se sloučenina uvedená v nadpisu. Analýza aminokyselin: Lys, 1,88, Cysteová kyselina, 0,84, Asp, 1,00, Thr, 1,94, Ser, 0,97, Gly, 2,78, Ala, 0,89, Leu, 0,89, Phe, 3,11.

Příklad 26

Cyklický disulfid leucyl-glycyl-glycyl-alanyl-glycyl-cysteinyl-fenylalanyl-fenylalanyl-tryptofyl-lysyl-threonyl-fenylalanyl·threonyl·seryl-2-thioethylamid, I, R¹ = H— —Leu—Gly—Gly—Ala—Gly—NH a R² = H (H—Leu—Gly—Gly—Ala—Gly—Cys— —Lys—Asn—Phe—Phe—Trp—Lys—Thr— —Phe—Thr—Ser—NHCH2CH2S)

Roztok Boc—Leu—Gly—Gly—Ala—Gly— —Cys (Trt) —Lys (Boc) —Asn—Phe—Phe— —Trp—Lys (Boc) — Thr (Bu ⁺ ) — Phe— —Thr (Bu⁺) —Ser (Bu+ ) —NHCH2CH2S—Trt (0,230 g, 0,083 mmol, popsaný v příkladu 25) v kyselině octové (100 ml) se pomalu přidá k intenzívně míchanému roztoku jódu (0,211 g, 0,83 mmol) v methanolu (42 ml) při teplotě místnosti. Po· skončení přidávání se roztok míchá 60 minut při teplotě místnosti. Ro-ztok se ochladí na 0 °C a

4β pro rozložení přebytku jódu se pomalu přidá roztok thiosíranu sodného ve vodě (IN). Rozpouštědlo se odpaří téměř к suchu, zbytek se rozmělní se studenou vodou, přefiltruje se, promyje vodou a vysuší kysličníkem fosforečným. Pevný podíl se promyje etherem a vysušením se získá cyklický disulfid vzorce III.

Bac—Leu—Gly—Gly—Ala—Gly—Cys— —Lys(Boc)—Asn—Phe—Phe—Trp—__ —Lys(Boc j —Ťhr (Bu⁺ j —Phe—Ťhr (Bu ' ) — —Ser (Bu⁺)—NHCH2CH2S (III).

Tento cyklický hexadekapeptid se intenzívně míchá při 0 °C v atmosféře dusíku 10 minut v koncentrované kyselině chlorovodíkové (7 ml). Přidá se kyselina octová (90 ml) a roztok se lyofilisuje. Odparek se dělí rozdělovači chromatografií na koloně chemicky modifikovaného síťovaného dextranu („Sephadex C 25 M, 3 x 50 cm, ekvilibrovaného ve spodní fázi směsi n-butanol—kyselina octová—voda (4 : 1 : 5) a pak ekvilíbrovaného ve vrchní fázi). Použitím vrchní fáze se z kolony desorbuje v podstatě čistý hexadekapeptid. Čisté frakce se spojí, odpaří a lyofilisací se získá sloučenina uvedená v nadpisu ve formě

MeOH soli s kyselinou octovou, λ 290 (4,290), max

282 (4,910), 273 nm (ε 4,630). Opakovanou lyofilisací posledně uvedeného produktu z vody se získá sloučenina uvedená v nadpisu ve formě volné báze. Analýza aminokyselin: Lys, 2,01, Asp, 1,35, Ser, 0,93, Ala, 0,99, Phe, 2,52, Cysteová kyselina, 0,66, Thr, 1,98, Gly, 3,00, Leu, 0,96.

Příklad 27 t-Butyloxykarbonyl-glycyl-glycyl-glycyl-alanyl-glycyl-S-trityl-cysteinyl-N^e-t-butyloxykarboinyl-lysyl-asparaginyl-fenylalanyl-fenylalanyl-tryptofyl-NM-butyloxykarbonyl-lysyl-O-t-butyl-threonyl-fenylalanyl-O-t-butyl-threonyl-O-t-butyí-seryl-2-tritylthioethylamid, II, R² = H a R⁴ = Boc— —Gly—Gly—Ala—Gly—NH (Boc—Gly— —Gly—Gly—Ala—Gly—Cys (Trt) — —Lys (Boc) —Asn—Phe—Phe—Trp— —Lys(Boc)—Thr(Bu⁺)—Ser (Bu⁺ ) — —NHCH2CH2S—Trt]

Hydrazid pentapeptidu Boc—Gly—Gly— —Gly—Ala—NHNH₂ (0,0608 g, 0,141 mmol, popsaný v příkladu 17) se rozpustí v bezvodém dlmethylformamidu (6 ml) a dimethylsulfoxidu (2 ml) a ochladí se na —20 stupňů Celsia. Přidá se kyselina chlorovodíková v ethylacetátu [2N, 0,176 ml, 0,352 mmol), pak terc.butylnitrit (0,0194 ml, 0,169 mmoil). Směs se míchá 15 minut při —15 stupních Celsia а к této reakční směsi se přikape roztok H—Cys (Trt)—Lys (Boc) — —Asn—Phe—Phe—Trp—Lys (Boc) — —Thr (Bu +)—Phe—Thr (Bu+) —Ser (Bu+) — —NHCH2CH2S—Trt (0,327 g, 0,138 mmol, popsaný v příkladu 24) v dimethylformamidu (4 ml), obsahující N-ethyldiisopropylamin (0,085 ml, 0,494 mmol), ochlazený na —15 °C. V míchání se pokračuje jednu hodinu při —15 °C a přes noc při teplotě místnosti. Reakční směs se odpaří za sníženého tlaku, odparek se rozmělní s ledem ochlazeným roztokem (1N) kyseliny citrónové, přefiltruje se a promyje vodou. Pevný podíl se rozmělní s methanolem a vysuší se nad kysličníkem fosforečným a získá se sloučenina uvedená v nadpisu. Analýza aminokyselin: Lys, 2,31, cysteová kyselina, 0,84, Asp, 1,00, Thr, 2,26, Ser, 1,19, Gly, 4,00, Ala, 0,84, Phe, 3,2.

Příklad 28

Cyklický disulfid glycyl-glycyl-glycyl-alanyl-glycyl-cysteinyl-fenylalanyl-fenylalanyl-tryptofyl-lysyl-threonyl-fenylalanyl-threonyl-seryl-2-thioethylamid, I, R¹ = H— —Gly—Gly—Gly—Ala—Gly—NH a R² = H (H—Gty—Gty—Gly—Ala—Gly—Cys—Lys— —Asn—Phe—Phe—Trp—Lys—Ťhr—Phe— —Thr—Ser—NHCH2CH2S)

Roztok Boc—Gly—Gly—Gly—Ala—Gly— —Cys (Trt) —Lys (Boc ] —Asn—Phe—Phe— —Trp—Lys(Boc)—Thř(Bu⁺)—Phe— —Thr (Bu ⁺) —Ser (Bu +) — NHCH2CH2S—Trt (0,224 g, 0,083 mmol, popsaný v příkladu 27) v kyselině octové (160 ml) se pomalu přidá к intenzívně míchanému roztoku jódu (0,211 g, 0,83 mmol) v methanolu (42 ml) při teplotě místnosti. Po skončení přidávání se roztok míchá 60 minut při teplotě místnosti. Roztok se ochladí na 0 °C a roztokem thiosíranu sodného ve vodě (1 N), přidávaným pomalu, se rozloží přebytek jódu (bezbarvý roztok). Rozpouštědlo se odpaří téměř к suchu a odparek se rozmělní se studenou vodou, přefiltruje a vysuší nad kysličníkem fosforečným. Pevný podíl se promyje etherem a vysušením se získá cyklický disulfid vzorce III.

Boc—Gly—Gly—Gly—Ala—Gly—Cys— —Lys (Boc ) — Asn—Phe—Phe—Trp—

-^LyšIBS^j—ŤhřfBr+jP-pňě—ŤhFíBu+T—” —Ser (Bu⁺) — NHCH2CH2S.

(ΠΙ)

Cyklický hexadekapeptid se intenzívně míchá při 0 °C v atmosféře dusíku 10 minut v koncentrované kyselině chlorovodíkové (7 ml). Přidá se kyselina octová (90 ml) a ^a roztok se lyofilisuje. Odparek se rozpustí v 2·% kyselině octové ve vodě a lyofilisuje se. Odparek se dělí rozdělovači chromatografií na koloně chemicky modifikovaného > síťovaného dextranu [„Sephadex G—25 M”, 3 x 50 cm, ekvilibrovaný ve spodní fázi směsí n-butan.ol—kyselina octová—voda (4 : : 1 : 5) a pak ekvilibrovaný za použití vrchní fáze pro desorbci v podstatě čistého hexadekapeptidu). Čisté frakce se spojí, odpaří a lyofllisací se získá sloučenina uvedená v nadpisu ve formě soli s kyseli-

MeOH nou octovou, λ 288 (ε 4870], 280 (ε max

Analýza aminokyselin: Lys, 1,72, Asp, 1,00, 5575), 274 (ε 5380), 268 (ε 5185), 265 nrn (ε 4955). Opakovanou lyofilisací posledního produktu z vody se získá sloučenina uvedená v nadpisu · ve formě volné báze. Ser, 0,73, Ala, 0,69, Phe, 2,78, Cysteová kyselina 0,57, Thr, 1,69, Gly, 3,59.

Příklad 29 t-Butyloxykarbonyl-glycyl-glycyl-alanyl-glycyl-S-trityl-cysteinyl-N^e-t-butyloxykarbonyl-lysyl-asparaginyl-fenylalanyl-fenylalanyl-tryptofyl-NM-butyloxykarbonyl-lysyl-OI-butyl-threonyl-fenylalanyl-O-t-butylV -threonyl-O-t-butyl-seryl-2-trityl-thioethylamid, II, R² = H a R4 = Boc—Gly—Gly— —Ala—Gly—NH [Boc—Gly—Gly—Ala— —Gly—Cys (Trt)—Lys (Boc) —Asn—Phe— > —Phe—Trp—Lys(Boc)—Thr (Bu⁺) —Phe— —Thr (Bu⁺) —Ser (Bu+) —NHCH2CH₂—Trt ]

K roztoku Boc—Gly—Gly—Ala—Gly— —Cys (Trt)—Lys (Boc) —Asn—Phe—Phe·— —ΝΗΝΗ2 (800 mg, 0,59 mmol, připravenému podle příkladu 7) v dimethylforimamidu (12 ml) se při —20 °C přidá za míchání 1,85 N roztok chlorovodíku v ethylacetátu (0,795 ml, 1,475 mmol). Směs se ochladí na —15 °C, přidá se terc.butylnltrit (0,081 ml, 0,71 mmol) a roztok se míchá 15 minut. K takto připravené reakční směsi se přidá roztok H—Trp—Lys(Boc) —Thr(Bu⁺) — —Phe—Thr(Bu+ )— Ser(Bu⁺ )—NHCH2CH2— —S—Trt (0,852 g, 0,637 mmol), připravený postupem podle USA patentu č. 3 917 581 z 4. XI. 1975, a N-ethyldiisopropylaminu (0,354 ml, 2,06 mmol) v dimethylformamidu (6,0 •ml), ochlazený na —15· °C. Směs se míchá jednu hodinu při —15 °C a 18 hodin při 25 °C. Rozpouštědlo se odpaří a odparek se rozmělní s ledem ochlazenou· kyselinou citrónovou, přefiltruje se, promyje vodou a methanolem a vysušením se získá sloučenina uvedená v nadpisu. Analýza aminokyselin: Lys, 2,01, Asp, 0,97, Thr, 1,60, Ser, 0,65, Cysteová kyselina, 0,87, Gly, 2,92, Ala, 1,00, Phe, 2,97.

Příklad 30

Cyklický disulfid glycyl-glycyl-alanyl-glycyl-cysteinyl-lysyl-asparaginyl-fenylalanyl-fenylalanyl-tryjitofyl-lysyl-threonyl-fenylaianyl-tlinionyl-sery^-thioethylamid, I, R1 = H—Gly—Gly—Gly—Ala—Gly—NH a R2 = H (H—Gly—Gly—Ala—Gly—Cys— —Lys—Asn—Phe—Phe—Trp—Lys—Thr— —Phe—Thr—Ser—NHCH2CH2S)

Boic—Gly—Gly—Ala—Gly—Cys(Trt ) ·— —Lys (Boc) — Asn—Phe—Phe—Trp— —Lys( B<rc) —Thr (Bu+) —Phe—Thr(Bu⁺) — · —Ser(Bu⁺)—NHCH2CH2S—Trt, popsaný v příkladu 29 (0,860 g, 0,30 mmol), se· rozpustí v ledové kyselině octové (150· ml) a přikape se při teplotě místnosti k roztoku jódu v imethanólu (0,5 %, 150 ml, 30 mmol) a reakční směs se míchá jednu hodinu. Směs se · míchá dalších 45 minut, · ochladí se v lázni s ledem a roztok thiosíranu sodného ve vodě (1 N, 6 ml) se přidá, aby se rozložit přebytek jódu (bezbarvý roztok. Roztok se odpaří a zbytek se rozmělní s vodou, vysuší a bezvodý produkt se rozmělní s isoipropyletherem a získá se cyklický disulfid pentadekapeptidu vzorce III.

Boc—Gly—Gly—Ala—Gly—Cys—Lys( Boc) — —Asn—Phe—Phe—Trp—Lys (Boc)—_____ —Thr (Bu+) —Phe—Thr (Bu⁺)—Ser (Bu+) — —NHCIWHeS . (III)

K posledně jmenované sloučenině se přidá studená koncentrovaná kyselina chlorovodíková (23 ml) za míchání v lázni s ledem a v atmosféře dusíku. V míchání · se· pokračuje 10 minut, přidá se ledová kyselina octová a roztok se lyofilisuje. Odparek se rozpustí · ve vodě a znovu se lyofilisuje. Odparek se rozpustí v 0,01 N vodném octanu amonném a nanese se na kolonu karbOKymiethylcolulózy („Whatman CM—23” 2,5 x 30 cm). Čistá sloučenina se eluuje 0,06 N pufrem octanu amonného. Čištěný materiál se lyofilisuje z vody a získá se sloučenina uvedená v nadpisu ve formě bílé pevné látky jako sůl s kyselinou ocMeOH tovou λ 282 nm (ε 5120), 289 nm max (ε 4610). Opakovanou lyofilisací posledně jmenovaného produktu z vody se získá sloučenina uvedená v nadpisu ve formě volné báze. Analýza aminokyselin: Lys, 2,06, Asp, 1,02, Thr, 1,75, Ser, 0,91, cysteová kyselina, 0,73, Gly, 3,00, Ala, 1,10, Phe, 3,11.

Analogickým způsobem, ale použitím rhodanu způsobem podle práce Hiskey a Smith, citace výše, místo jódu se také získá sloučenina uvedená v nadpisu.

Příklad 31

Acetyl- {S-trityl) cysteinyl- (N-t-butoxykarbonyl) lysyl-asparaginyl-fenylalanyl-f eny 1alaninmethylester [ Ac—Cys (Trt ] — —Lys ( Boc) —Asn—Phe—Phé—OMe ]

Roztok p-nitrofenylacetétu [0,191 g, 1,05 mmol, připravený postupem F. D. Chattaway, J. Chem. Soc., 2495 (1931)] v dimethylformamidu (4 ml) se při 0 °C přidá к roztoku H—Cys (Trt) —Lys (Boc) —Asn— —Phe—Phe—OMe . HOAc (0,750 g, 0,698 mmol, připravenému podle H. U. Imimer aj., Helv. Chirn. Acta., 57, 730 (1974) a N-ethylmořfolinu (0,1 ml). Po 24 hodinách míchání při 0 °C se rozpouštědlo odpaří za sníženého tlaku. Odparek se rozpustí v methanolu (3 ml) a pomalu se přidává к diethyletheru (200 ml). Sraženina se odfiltruje a krystalizací z ethanolu se získá sloučenina uvedená v nadpisu, b. t. 219,5— —221 °C, [a.]b²⁵ = —21,6° (c = 1, dimethylformamid ).

Stejným způsobem za použití p-nitrofenylesterů kyseliny mravenčí, propionové, máselné, isomáselné, pivalové, n-hexanové nebo kyseliny benzoové místo· p-nitrofenylacetátu se připraví odpovídající sloučeniny výše uvedeného vzorce, kde Ac je nahrazena za formyl, propionyl, n-butanoyl, isobutanoyl, pivaloyl, n-hexanoyl nebo benzoyl zbytky.

Příklad 32

Acetyl- (S-trityl) cysteinyl- (N-t-butoxykarbbnyl) lysyl-asparaginyl-fenylalanyl-f enylalaninhydrazid, IV, R⁴ — NHC0CH3 [Ac— —Cys (Trt) —Lys( Boc) —Asn—Phe—Phe— —NHNH2)

Roztok Ac—Cys(Trt)—Lys(Boc)—Asn— —Phe—Phe—OMe (0,40 g, 0,379 mmol, popsaný v příkladu 31) a hydrazinhydrát (0,37 ml, 7,58 mmol) v methanolu (15 ml) se míchá 48 hodin při 0 °C. Sraženina se odfiltruje a vysušením se získá sloučenina uvedená v nadpisu, b. t. 236—237 °C, (oí]d²⁵ = —28,6° (c = 1, dimethylformamid).

Stejným způsobem, použitím příslušných ostatních výchozích materiálů, popsaných v příkladu 31, se získají odpovídající sloučeniny vzorce IV, kde R⁴ je NHR³, kde R³, je formyl, propionyl, n-butanoyl, isobutanoyl, pivaloyl, n-hexanoyl nebo benzoyl.

Příklad 33

Acetyl- (S-trityl) cysteinyl- (N^e-t-butoxykar- ₄ bonyl) lysyl-asparaginyl-f enylalanyl-fenylalanyl-tryptof yl- (N^e-t-butoxykarbonyl) lysyl- (O-t-butyl) -threonyl-f enylalanyl- (O-t-butyl) threony 1- (O-t-butyl ] -seryl-2-tritylthioethylamid, II, R² = H a R⁴ = NHCOCH3 [ Ac—Cys(Trt) —Lys (Boc) —Asn—Phie— —Phe—Trp—Lys (Boc)— Thr(Bu⁺ ) — —Ser (Bu⁺) —Ser (Bu+) — NHCH2CH2S—Trt ]

Roztok Ac—Cys (Trt) —Lys (Boc) —Asn— —Phe—Phe— NHNH₂ (IV) (0,240 g, 0,227 mmol, popsaný v příkladu 32) v bezvodém dimethylformamidu (2 ml) a dimethylsulfoxidu (1 ml) se ochladí na —20 °C. Přidá se kyselina chlorovodíková v ethylacetátu (2,1 N, 0,273 mmol) a pak t-butylnitrit (0,0312 ml, 0,273 mmol). Směs se míchá 15 minut při —15 °C а к této reakční směsi se přikape roztok H—Trp— —Lys(Boc)—Thr(Bu+ )— Phe—Thr(Bu+ )— —Ser (Bu⁺)—NHCH2CH2S—Trt (V, 0,304 g, 0,227 mmol), připravovaný postupem podle USA patentu č. 3 917 581 z 4. XI. 1975, v dimethylformamidu (3 ml), obsahující N-ethyldiisopropy lamin (0,097 ml, 0,568 mmol), ochlazený na —15 °C. Směs se míchá jednu hodinu při —15 °C a pak 20 hodin při 25 °C. Rozpouštědlo se odpaří za sníženého tlaku. Odparek se rozmělní s ledem ochlazenou kyselinou citrónovou (1 N), přefiltruje se, promyje vodou a vysuší nad kysličníkem fosforečným. Pevný zbytek se rozmělní s methanolem, přefiltruje * se, vysuší nad kysličníkem fosforečným a získá se sloučenina uvedená v nadpisu. Analýza aminokyselin: Lys, 1,82, Asp, 1,00, Ser, 0,76, cysteová kyselina, 0,93, Thr, 1,87, Phe, 3,10.

Stejným způsobem, ale použitím odpovídajících ostatních výchozích materiálů vzorce IV, kde R⁴ je NHR³ popsaný v příkladu 32, získají se odpovídající sloučeniny vzorce II, kde R² je H a R⁴ je NHR³, R³ je formyl, propionyl, n-butanoyl, isobutanoyl, pivaloyl, n-hexanoyl nebo benzoyl.

Příklad 34

Cyklický disulfid acetyl-cysteinyl-lysyl-asparaginyl-fenylalanyl-fenylalanyl-tryptoifenyl-lysyl-threoinyl-fenylalanyl-threonyl207570

-seryl-2-thloethylamid, I. R¹ — NHCOCH3 a

R² — H (Ac—Cys—Lys—Asn—Phe—Phe— —Trp—Lys—Thr—Phe—Thr—S-er— —NHCH2CH2S)

Roztok Ac—Cys (Trt) —Lys (Boc) — Asn— —РЫе—Phe—Trp—Lys (Boc) — Thr(Bu⁺) — —Phe—Thr(Bu⁺ ) —Ser (Bu+ *)—NHCH2CH2S — —Trt (0,260 g, 0,110 mmol, popsaný v příkladu 33) v kyselině octové (61 ml) se pomalu přidává k míchanému roztoku jót du (0,278 g, 1,1 mmol) v methanolu (56 ml) při 25 °C. Po skončení přidávání se roztok míchá jednu hodinu při 25 °C. Roztok se ochladí na 0 °C a roztok 1 N thio> síranu sodného ve vodě se pomalu přidává, aby se rozložil přebytek jódu (bezbarvý roztok). Rozpouštědlo se odpaří za sníženého tlaku a odparek se rozmělní s vodou. Sraženina se odfiltruje, promyje vodou a vysuší nad kysličníkem fosforečným a získá se cyklický chráněný undekapeptid vzorce III.

Ac—Cys—Lys (Boc) —Asn—Phe—Phe— —Trp—Lys (Boc) —Thr (Bu⁺ ] — Phe— —Thr (Bu+)—Ser (Bu+)—NHCH2CH2S (III)

Posledně jmenovaný cyklický peptid se intenzívně míchá při 0 °C v atmosféře dusíku 10 minut v koncentrované kyselině chlorovodíkové (9,1 ml). Přidá se kyselina octová (119 ml) a roztok se ihned lyofilisuje. Odparek se rozpustí v horní fázi systému rozpouštědel butanol—kyselina octová—voda [4 : 1 : 5) a nanese se na kolonu chemicky modifikovaného síťovaného· dextranu (Sephadex 6—25M), připraveW ného ve spodní fázi rozpouštěcího· systému.

Vrchní fáze výše uvedeného systému rozpouštědel se použije po desorpci undekapeptidu. Frakce obsahující čistý produkt se ' spojí o odpaří za sníženého tlaku. Odparek se rozmělní v diethyletheru, rozpustí se v 5% kyselině octové o lyofilisací se získá sloučenina uvedená v nadpisu ve formě soli s kyselinou octovou. UV (methanol) λ mox 290 (ε 4990'), 282 (ε 5455), 274 nm (ε 5095).

Posledně jmenovaná sloučenina ve formě soli s kyselinou octovou se podrobí 0pakované lyofilisací z vody a získá se sloučenina uvedená v nadpisu ve formě volné báze. Analýza aminokyselin: Lys, 1,93, Asp, 1,00, * Ser, 0,84, cysteová kyselina,, 0,80, Thr, 1,84, Phe, 2,97.

Stejným způsobem použitím · příslušných ostatních výchozích materiálů vzorce II, kde R² je H a R4 je NHR³ popsaný v příkladu 33, se získají odpovídající sloučeniny vzorců III о I, kde R² je H a R4 a R¹, resp. jsou NHR3, kde R³ je * formyl, propionyl, n-butanoyl, isobutanoyl, pivaloyl, n-hexanoyl nebo· benzoyl.

Příklad 35

Pentochlorfenylester 3-tritylthiopropionové kyseliny (Trt—S—CH2CH2COOPCp)

3-Trity ithiopropionová ’ kyselino [1, Og, 2,87 mmol, popsaná R. C. Hiskey o M. A. Horpold, J. Org. Chem., 33, 559 (1968)] se rozpustí v tetrohydrofuronu (25 ml) a přidá se pentochlorfenol (0,765 g, 2,87 mmol). Směs se ochladí na 0 °C, přidá se dicyklohexylkarbodiimid (0,596 g, 2,87 mmol) o reokční směs se míchá jednu hodinu při 0 °C o jednu hodinu při 25 °C. Reakční směs se pak ochladí no 0 °C, přefiltruje se a filtrát se odpaří za sníženého tlaku. Odparek se krystaluje z •ethylocetátu a získá se sloučenino uvedená v nadpisu, b. t. 154— —156 °C.

Příklad 36

3-Tritylthiopropionyl- [ NM-butoxykorbo> nyl) lysyl-asparoginyl-fenylalanyl-f enylalaninmethylester [Trt—SCH2CH2CO— —Lys(Boc) —Asn—Phe—Phe—OMe j

Roztok pentochlorofenylesteru 3-tritylthiopropionové kyseliny (0,597 g, 1 mmol, popsaný v příkladu 35), H—Lys· (Boc) — —Asn—Phe—Phe—OMe . HOAc [1 mmol, připravený podle H. U. Immer oj., Helv. Chirh. Acto., 57, 730 (1974)] a triethylaminu (0,14 ml, 1 mmol) se míchá tři dny při 25 °C. R^;^|p^iLKštědlo se odpaří za sníženého tlaku. Odparek se rozmělní v ledem ochlazeném roztoku 1 N kyseliny citrónové, přefiltruje se, promyje vodou a vvysuší hydroxidem draselným. Pevný podíl se krystaluje z methanolu a získá se sloučenina uvedená v nadpisu, b. t. 215—220 °C.

Proklad 3 7 i^^^^ithiopropionyl- (N^e-t-butoxykarbony 1) lysyl-asporoginyl-fenylalanyl-fenylalaninhydrazid, IV, R⁴ = H [Trt—SCHzCtaCO— —Lys (Boc)—Asn— Phe—Phe—NHNHz]

Roztok Trt—SCHzCHzCO—Lys (Boc) — —Asn—Phe—Phe—OMe (0,900 g, 0,9 mmol, popsaný v příkladu 36) o hydrozinhydrát (1 ml·) v dimethylformamidu (20 ml) se míchá 20 hodin při 25 °C. Rozpouštědlo· se odpaří za sníženého tlaku. Odparek se rozmělní ve studené vodě, přefiltruje se, promyje se · s vodou a vysušením * se získá sloučenina uvedená v nadpisu, b. t. 225—235 °C.

Příklad 38

3-Tritylthiopropiony 1- (NM-butoxykarbonyl ) lysyl-asparaginyl-fenylalanyl-fenylalanyl-tryptof yl- (NM-butOixykarbony 1) lysy 1- (O-t-butyl) threonyl-fenylalanyl- (O-t-butyl) threonyl- [ O-t-butyl) seryl-2-tritylthioethylamid, II, R² a R⁴ = H [Trt— —SCHžCHžCO—LysfBocJ—Asn—PIie— —Phe—Trp—Lys (Boc) —Thr (Bu⁺) — Phe— —Thr (Bu⁺)—Ser(Bu⁺)—NHCH2CH2S— —Trt)

Roztok Trt—SCH2CH2CO—Lys(Boc) — -Asn-Phe—Phe—NHNH2 (0,500 g, 0,5 mmol, popsaný v příkladu 37) v dimethylsulfoxidu (5 ml) a dimethylformamidu (20 ml) se ochladí na —20 °C. Pak se přidá roztok kyseliny chlorovodíkové v ethylacetátu (1,4 N, 0,895 ml) a pak terc.butylnitrit (0,069 ml, 0,6 mmol). Směs se míchá 15 minut při —15 °C a přidá se na —15 °C ochlazený roztok H—Trp—Lys (Boc) — —Thr (Bu+) —Phe—Thr (Bu +)—Ser(Bu +) — —NHCH2CH2S—Trt (0,670 g, 0,5 immol, připravený poidle USA patentu č. 3 917 581, z 4. XI. 1975) a N-ethyldiisopropylaminu (0,214 ml, 1,25 mmol) v dimethylformamidu (10 ml). Reakční směs se míchá jednu hodinu při —15 °C a 20 hodin při 25 °C a odpaří se pak za sníženého tlaku. Odparek se rozmělní ledem ochlazeným roztokem 1N kyseliny citrónové, odfiltruje se, promyje se vodou a vysuší nad kysličníkem fosforečným. Pevný podíl se rozmělní se studeným methanolem a vysušením se získá sloučenina uvedená v nadpisu. Analýza aminokyselin: Lys, 1,99, Asp, 1,15, Thr, 1,73, Ser, 0,67, Phe, 3,00.

P ř í к 1 a d 3 9

Cyklický disiulfid 3-thiopropionyl-lysyl-asparaginyl-fenylalanyl-fenylalanyl-tryptofyl-lysyl-threonyl-fenylalanyl-threonyl-seryl-2-thioethylamid, I, R¹ a R² = H (SCH2CH2CO—Lys—Asn—Phe—Phe—Trp— —Lys—Thr—Phe—Thr—Ser—NHCH2CH2S)

Roztok Trt—SCH2CH2CO—Lys(Boc) — —Asn—Phe—Phe—Trp—Lys (Boc) — —Th;r (Bu⁺) —Phe—Thr (Bu+) —Ser (Bu⁺)— —NHCH2CH2S—Trt (0,500 g, 0,216 mmol, popsaný v příkladu 38) v kyselině octové (100 ml) se pomalu přidá к míchanému roztoku jódu (0,547 g, 2,16 mmol) v methanolu, (110 ml) při teplotě 25 °C. Po skonočení přidávání se roztok míchá jednu hodinu při 25 °C. Roztok se ochladí na 0 °C a pomalým přidáváním 1N roztoku thiosíranu sodného ve vodě se rozloží přebytek jódu (bezbarvý roztok). Rozpouštědlo se odpaří za sníženého tlaku a odparek se rozmělní s vodou. Sraženina se odfiltruje, několikrát promyje vodou a vysuší se nad kysličníkem fosforečným. Získá se cyklický chráněný dekapeptid vzorce III.

SCH2CH2CO—Lys (Boc) — Asn—Phe—Phe— —Trp—Lys (Boc)—Thr(Bu⁺)—Phe— —Thir (Bu+) —Ser (Bu+ )—NHCH2CH2S.

(III)

Posledně jmenovaný cyklický dekapeptid se intenzívně míchá při 0 °C v atmosféře dusíku 10 minut v koncentrované kyselině chlorovodíkové (18 ml). Kyselina octová (200 ml) se pak přidá a roztok se ihned lyofilisuje. Odparek se rozpustí ve vrchní fázi směsi rozpouštědel butanol—kyselina octová—voda (4 : 1 : 5) a nanese se na kolonu chemicky modifikovaného síťovaného dextranu (Sephadex G—25 M), připraveného ve spodní fázi systému rozpouštědel. Vrchní fáze výše uvedeného systému rozpouštědel se použije pro desorpci dekapeptidu. Frakce obsahující čistý produkt se spojí a odpaří za sníženého tlaku. Odparek se rozpustí v 5% kyselině octové a lyofilisací se získá sloučenina uvedená v nadpisu ve formě soli s kyselinou octovou. UV (methianol) A_max 290 (ε 4920), 282 nm (ε 5390).

Posledně jmenovaná sloučenina ve formě soli s kyselinou octovou se podrobí opakované lyofilisaci z vody a získá se sloučenina uvedená v nadpisu ve formě volné báze. Analýza aminokyselin: Lys, 1,97, Asp, 1,00, Thr, 1,64, Ser, 0,65, Phe, 2,94.

Příklad 40 oř,a-Dimethyl-3,5-dimethoxybenzyloxykarbonyl-tryptofyl-N^e-t-butyloxykarboinyl-lysyl-O-t-butyl-threonyl-fenylalanyl-O-t-butyl-threonyl-O-t-butyl-seryl-S-trityl-cysteinmethylester [Ddz—Trp—Lys(Boc) — —Thr(Bu⁺)—Phe—Thr(Bu⁺)—Ser (Bu⁺)— —Cys(Trt)— OMe]

Roztok diazomethanu v etheru se přidá к roztoku Ddz—Trp—Lys(Boc)—Thr(Bu⁺)— —Phe—Thr(Bu+)—Ser(Bu+)—Cys(Trt) — —OH [12,6 g, 0,785 mmol, popsanému H. U. Immer aj., Helv. Chim. Acta, 57, 730 (1974)] v methanolu (10 ml), při teplotě 0 °C. Směs se míchá jednu hodinu při 0 °C a odpaří se. Odparek se podrobí chromatografii na silikagelu použitím 3 % methanolu a 0,5 % pyridinu v chloroformu pro eluci. Odpařením eluátu se získá sloučenina uvedená v nadpisu NMR (CDCI3), 5 1,13 (s, 18 H), 1,27 (s, 9H), 1,48 (s, 9H), 1,77 (s, 6 H), 3,68 (s, 3H), 3,79 (s, 6H), 7,1-7,6 (m, 23 H).

Analogickým způsobem za použití diazoethanu, 1-diazopropanu, 2-diazopropanu, l-diazobutanu, 1-diazoisobutanu, 1-diazopentanu, 4-diazo-2-methylbutanu, 1-diazohexanu, 1-diazoheptanu nebo 1-diazooktanu místo diazoimiethanu, se získají odpovídající ethyl, propyl, isopropyl, n-butyl, isobutyl, n-pentyl, 2-methylbutyl, . n-hexyl, n-heptyl, n-oktylestery sloučeniny uvedené v nadpisu.

Příklad 41

Decylester S-tritylcysteinu [H—Cys (Trt) — - OCH2(CH2)8CH3]

Roztok hydrochloridu decylesteru cysteinu [0,894 g, 3 mmol, připravený postupem podle Voullie et al., francouzský dodatkový patent, 75, 157 (1961), C. A. 57, 15235c], trifenylkarbinolu [0,78 g, 3 ímmol) a bortrifluoridetherátu [0, 42 ml) v kyselině octové [5,2 mil) se míchá jednu hodinu při teplotě -místnosti. Rozpouštědlo - se odpaří za sníženého tlaku a odparek se chroanatografuje- na silikagelu použitím 40'% ethylacetátu v' hexanu obsahujícím 0,1 % triethylaminiu jako elučního činidla. Odpařením eluátu se získá sloučenina uvedená v nadpisu ve formě oleje. [a]D2⁵ — +25,84° [c = 1, CHC13), NMR (CDC13) Ó 0,89, (t, J = -5- Hz, 3 H), 1,3 [s, 16 H), 1,55 (m, 2 H),

2,55 (m, - 2H), 3,25 (2d, J = 5 Hz), 4,1 (t, J = 6 Hz, 2H).

Stejným: způsobem, ale náhradou výchozího materiálu za ekvivalentní množství hydrochloridu tetradecylesteru cysteinu (připravený podle Voiullie - aj., citace výše) se získá S-tritylcysteintetradecylester, (oř-)t)25 =+ 13)8° [c = 1, CHC13), NMR (CDCI3) S 0,89 (.t, J = 5 Hz, 3H), 1,3 (s, 24H), 1,56 (m, - 2H), 2,55 (m, 2H), 3,25 (2 d, J = 5 Hz, 1H), 4,1 (t, J = 6 Hz, 2H).

Analogickým způsobem se získají nonyl, undecyl, dodecyl, a tridecylestery S-tritylcysteinu.

Reakcí těchto- esterů S-tritylcysteinu s hydrazidem hexapeptidu vzorce

Ddz—Trp—Lys- (Boc) —Trh (Bu⁺)—Phe— —ThrjBu^—Ser (Bu+)—NHNH2 azidovým způsobem se získají nonyl, decyl, undecyl, dodecyl, tridecyl a tetradecylestery odpovídající sloučeniny uvedené v nadpisu příkladu 40.

Příklad 42

Formiát tryptofyl-NM-butyloxykarbonyl-lysyl-O-t-butyl-threo-nyl-fenylalanyl-O-t-butyl-threonyl-O-t-butyl-seryl-S-trityl-cysteinmethylesteru V, R² = COOCH3 [H— —Trp—Lys (Boc) —Thr(Bu⁺) —Phe— —Thr (Bu+) —Ser( Bu+) —Cys [Trt) —OMe . . HCO2H]

Rojztolk Ddz—Trp—Lys(Boc)—Thr(Bu⁺ ) — —Phe—Thr(Bu⁺)—Ser(Bu⁺)—Cys(Trt) — —OMe- (1,11 g, 0,685 mmol, popsaný v pří kladu 40) v 10 ml směsi kyseliny mravenčí— kyseliny četové—vody (1 - : 7 : 2) se míchá přes noc při teplotě -místnosti. Směs se odpaří a odparek se rozmělní s vodou. Pevný podíl se odfiltruje, vysuší za sníženého tlaku a získá se sloučenin uvedená

MeOH v nadpisu, λ 290 (ε 6,335), 280 (ε max

8,470], 273 ( 3,720), 216 nim (ε 78,400').

Analogickým - způsobem za použití Ostatních heptapeptidů popsaných v příkladech 40 a- 41 jako výchozích materiálů se získají ethyl, propyl, isopropyl, n-butyl, isobutyl, n-pentyl, 2-methylbutyl, n-hexyl, n-heptyl n-oktyl, n-nonyl, n-decyl, n-undecyl, n-dodecyl, n-tridecyl, a n-tetradecylestery odpovídající sloučeniny uvedené v - nadpisu.

Příklad 43 t-Butyloxykarbonyl-alanyl-glycyl-S-trityl-cysteinyl-NM-butyloxykarbonyl-lysyl-asparaginyl-fenylalanyl-fenylalan.yl-tryptofyl-N^e-t-b(ulyloxykarbonylllysyl-0-t-bUt tyl-threonyl-fenylalanyl-O-t-butyl-threo'nyl-O-t-butyl-seryl-S--rityl-cysteínmethylester, II, R² = COOCH3 a R⁴ = Boc—Ala— —Gly—NH— [ Boc—Ala—Gly—Cys ) — —Lys (Boc ] — As'n— Phe—Phe—Trp— —Lys(Boc)—Thir^:(Bu⁺)—Ser(Bu⁺ )— —Cys(Trt)—OMe]

K roztoku prvého hydrazidu heptapeptidu (IV) Boc—Ala—Gly—Cys(Trt) — —LysJBoc) — Asn—Phe—Phe—NHNH2, (0,755 g, 0,624 mmol, popsanému v práci

H. U. irnmer aj., citace výše) v dimethylformamidu [9 ml] se při —20 °C přidá 2,1 N roztok bezvodého chlorovodíku v ethyla-cetátu [1,56 mmol) a pak se přidá terc.butylnitrit (0,0863 ml, 0,749 mmol). Roztok se -míchá 15 minut při —15 °C. K tomuto: roztoku se při teplotě —15 °C přidá roztok druhého methylesteru heptapeptidů V, H—Trp—Lys (Boc ] —Thr (Bu⁺ )—Phe— —Thr (Bu + ) — Ser (Bu + ) — Cys (Trt ]—OMe .

. HCOžH (0,900 g, 0,624 mmol, popsaného v příkladu 42) a N-ethyldiisopropylaminu (0,373 ml, 2,184 mmol) v dimethylformamidu (5 ml·), ochlazený na —15 °C. Vzniklá směs se·- míchá při —15 °C jednu hodinu a pak tři dny při teplotě -místnosti. Rozpouštědlo se odpaří za sníženého tlaku. Odparek se- rozmělní s- 1 N kyselinou citrónovou, filtruje- se- a sraženina se promyje vodou a vysuší - nad kysličníkem fosforečným za sníženého tlaku. Vysušený zbytek se rozmělní s malým· množstvím methánoliu a zbytek se jímá a vysušením se získá sloučenina uvedená v nadpisu. Analýza aminokyselin: Lys, 2,06, cysteo^!vá kyselina

I, 75, Asp, 0,94. Thr, 1,93, Ser, 0,97, Gly, 1,00, Ala, 0,88, Phe, 3,10.

Stejným způsobem za použití ostatních alkylesterů heptapeptidu vzorce V, popsaných v příkladu 42, se také získají odpovídající ethyl, propyl, isopropyl, n-butyl, isobutyl, n-pentyl, 2-methylbutyl, n-hexyl, n-heptyl, n-oktyl, n-nonyl, n-decyl, n-undecyl, n-dodecyl, n-tridecyl a n-tetradecylestery sloučeniny uvedené v nadpise.

Příklad 44

Cyklický disulfid t-butyloxýkarbonyl-alanyl-glycyl-cysteinyl-NM-butyloxykarbonyl-lysyl-asparaginyl-fenylalanyl-fenylalanyl-tryptofyl-N^e-t-blutyloxykarbonyl-lysyl-0-t-butyl-threonyl-fenylalany--O-t-butyl-threonyl-O-t-butyl-seryl-cysteinmethylester, III, R2 = COOCHs a R4 Boc—Ala—Gly— —NH [ Boc—Ala—Gly—Cys—Lys (Boc) — —Asn—Phe—Phe—Trp—Lys (Boc) — —Thr(Bu+)—Ser(Bu⁺) —Cys—OMe]

Lineární , chráněný methylester tetradekapeptidu z příkladu 43, Boc—Ala—Gly— —Cys' (Třt·') —Lys (Boc) — Asn—Phe—Phe— —Trp—Lýs (Boc)—Thr (Bu+) —Phe— —Thr(Bu⁺)—Ser(Bu⁺)—Cys (Trt j —OMe (0,898 g, 0,345 mmol) ' se rozpustí v horké kyselině' octové (200 ml). Roztok se ochladí na teplotu místnosti a během jedné hodiny se přikape k roztoku 5 % jódu v methanolu (175 ml, 3,45 mmol]. Směs se další hodinu míchá, . ochladí se na 0 °C a po odstranění přebytku jódu se přidá 1 N roztok thiosíranu sodného ve vodě (15 ml). Rozpouštědlo' se odpaří, 'odparek se rozmělní' s vodou a ' vysuší se nad kysličníkem fosforečným za sníženého tlaku a získá se sloučenina uvedená v 'nadpisu. Stejným· způsobem, za použití ostatních lineárních chráněných esterů tetradekapeptidu vzorce II, popsaných v příkladu 43, se také připraví odpovídající ethyl, propyl, isopropyl, n-butyl, ' isobutyl, n-pentyl, 2-methylbutyl, n-hiexyl, n-heptyl, n-oktyl,' n-nonyl, n-decyl, n-undecyl, n-dodecyl, n-trldecyl a n-tetradecylestery ' sloučeniny uvedené v nadpisu.

Příklad 45

Soímatostatinmethylester, cyklický disulfid alanyl-glycyl-cysteinyl-lysyl-asparaginyl-fenylalanyl-fenylalanyl-tryptofyl-lysyl-threonyl-fenylalanyl-threonyl-seryl-cystein methylester, I, R4 — H—Ala—Gly—NH a R2 = COOCH3 (H—Ala—Gly—Cys—Lys— —Asn—Phe—Phe—Trp—Lys—Thr—Phe— —Thr—Ser—Cys.·—OMe)

Roztok cyklického disulfidu podle příkladu 44, Boc—Ala—Gly—Cys—Lys(Boc) — —Asn—Phe—Phe—Trp—Lys (Boc) '— —Ťhr (Bu+ j—Phe—Ťhr (Bu + ) —Ser(Bu + ) — —Cys—OMe, (0,345 mmol) v koncentrované kyselině chlorovodíkové (29 ml) se míchá 10 minut v atmosféře dusíku při 0 °C. Přidá se ledová kyselina octová (290 ml) a roztok se lyofilisuje. Odparek se rozpustí v 0,2 M roztoku octanu amonného, nanese se na kolonu karboxymethylcelulózy (Whatman CM—23) a eluuje se 0,2 M pufrem octanu amonného. Eluát se lyofilisuje. Odparek se chromatografuje na koloně chemicky modifikovaného síťovaného dextranu (Sephadex G—25 M) ekvilibrovaného ve spodní fázi směsi n-butanol—kyselina ' octová—voda (4 : 1 : 5) a pak se ekvilibruje ve vrchní fázi. Pro desorpci methylesteru soímaaostatinu se použije vrchní fáze. Čisté frakce se spojí, odpaří a lyofilisací se získá sloučenina uvedená v nadpisu ve forMeOH mě soli s kyselinou octovou, λ 290 max (e 4,345), 287 (ε 4,385), 268 (ε 4,090), 265 (ε 3,900), 215 nm (ε 38,305), alkalická hydrolýza a plynová chromatografie vypočteno pro me-thanol 1,75 %, nalezeno 2,0 %, NMR (DMSO—dej δ 3,63 (s, 3 H, OCH3).

Opakovanou lyofilisací poslední soli s kyselinou z ' vody se získá sloučenina uvedená v nadpisu ve formě volné báze: Analýza aminokyselin Lys, 2,00, cysteová kyselina, 1,28, Asp, 0,95, Thr, 1,91, Ser, 0,97, Gly, 1,00, Ala, 0,94, 1/2 Cys, 0,30, Phe, 3,01.

Stejným způsobem, ale použitím ostatních cyklických disulfidů vzorce III popsaných v příkladu 44 se připraví odpovídající ethyl, propyl, isopropyl, n-butyl, isobutyl, n-pentyl, 2-methylbutyl, n-hexyl, n-heptyl, n-oktyl, n-nonyl, n-decyl, n-undecyl, n-dodecyl, n-tridecyl a n-tetradecylestery sloučeniny uvedené v nadpisu.

Claims

PŘEDMĚT vynalezu

1. Způsob výroby tetradekapeptidu obecného vzorce I,

SCH2CH(R¹)CO—Lys—Asn—Phe—Phe— —Trp—Lys— Thr—Phe—Thr—Ser— —NHCH(R²)CH2S (I) kde

a) R¹ je H—Gly—Gly—Ala—Gly—NH, H—Gly—Gly—Gly—Ala—Gly—NH nebo H—Leu—Gly—Gly—Ala—Gly—NH a R² je H nebo COOH, nebo

b) R¹ je H nebo NHR³, kde R³ je acylový zbytek neroizvětvené nebo rozvětvené alifatické karboxylové kyseliny s 1 až 6 atomy 'UhJjíku¹ nebo; benzoyl a R² je H, nebo

c) R¹ je H—Ala—Gly—NH a R² je COOalk, kde alk je alkyl s nerozvětveným nebo rozvětveným řetězcem s 1 až 14 atomy uhlíku, vyznačený tím, že se oxiduje lineární peptid obecného vzorce II,

Trt—SCH2CH (R⁴} —CO—Lys (Boc) — Asn— —Phe—Phe—Trp—Lys (Boc) —Thr (Bu ⁺) — —Phe—Thr (Bu+) —Ser (Bu⁺ ] — —NHCH (R²) CH2S—Trt (II) kde

a) R² je H nebo COOH a R⁴ je Boc—Gly— —Gly—Ala—Gly—NH, Boc—Gly—Gly— — Gly—Ala—Gly—NH nebo

Boc—Leu—Gly—Gly—Ala—Gly—NH nebo

b) R² je H a R⁴ je H nebo NHR³, kde R³má význam uvedený výše, nebo·

c) R² je COOalk a R⁴ je Boc—Ala—Gly— —NH, jódem nebo rhodanem za vzniku odpovídajícího cyklického disulfidového derivátu obecného vzorce III,

SCH2CH (R⁴) CO—Lys (Boc) —Asn—Phe— —Phe—Trp—Lys (Boc) —Thr (Bu +) —Phe— —ThríBu⁴·)—Ser(Bu⁺)—NHCH[R²)CH2S (III.) kde

R² a R⁴ mají význam uvedený výše, a pak se odstraní zbylé chránící skupiny reakcí s 50 až 100% kyselinou trifluoroctovou nebo roztokem minerální kyseliny.
2. Způsob podle· bodu 1, vyznačený tím, že se roztok lineárního peptidu vzorce II v kyselině octové nechá reagovat s jódem v roztoku v alkanolu s 1 až 4 atomy uhlíku nebo v kyselině octové a vzniklý cyklický disulfid vzorce III se nechá reagovat s kyselinou chlorovodíkovou a odpovídající peptid vzorce I se isoluje.
3. Způsob podle bodu 1, vyznačený tím, že se lineární peptid vzorce II nechá reagpvat s jódem při teplotě 0° až 30 °C po dobu 30 až 180 minut v alkanolu s 1 až 4 atomy uhlíku nebo v kyselině octové a získá se odpovídající cyklický disulfid vzorce III.
4. Způsob podle bodu 1, vyznačený tím, že se cyklický disulfid vzorce III nechá reagovat s koncentrovanou kyselinou chlorovodíkovou při teplotě 0 °C po dobu pěti až deseti minut a získá se odpovídající peptid vzorce I.
5. Způsob podle bodu 1, pro přípravu tetradekapeptidu obecného vzorce I, uvedeného v bodě 1, kde R¹ je H—Gly—Gly— —Ala—Gly—NH, H—Gly—Gly—Gly—Ala— —Gly—NH nebo H—Leu—Gly—Gly—Ala— —Gly—NH a R² je H nebo· COOH, vyznačený tím, že se oxiduje lineární peptid 0becného vzorce II, uvedeného v bodě 1, kde R² má výše uvedený význam a R⁴ má význam uvedený v bodě 1, jódem nebo rhodanem za vzniku odpovídajícího cyklického disulfidového derivátu obecného vzorce III, uvedeného v bodě 1, kde R² má výše uvedený význam a R⁴ má význam uvedený v bodě 1, a pak se odstraní zbylé chránící skupiny reakcí s 50 až 100% kyselinou trifluoroctovou nebo roztokem minerální kyseliny.
6. Způsob podle bodu 1 pro přípravu tetradekapeptidu obecného vzorce I, uvedeného v bodě 1, kde R¹ je H nebo NHR³, kde R³ je acylový zbytek nerozvětvené nebo rozvětvené alifatické karboxylové kyseliny s 1 až 6 atomy uhlíku nebo· benzoyl a R² je H, vyznačený tím, že se oxiduje lineární peptid obecného vzorce II, uvedeného v bodě 1, kde R² má výše uvedený význam· a R⁴ má význam uvedený v bodě 1, jódem nebo rhodanem za vzniku odpovídajícího cyklického disulfidového derivátu obecného vzorce III, uvedeného v bodě 1, kde R²má výše uvedený význam a R⁴ má význam uvedený v bodě 1, a pak se odstraní zbylé chránící skupiny reakcí s 50 až 100% kyselinou trifluoroctovou nebo roztokem minerální kyseliny.
7. Způsob podle bodu 1, pro přípravu tetradekapeptidu obecného vzorce I, uvedeného v bodě 1, kde R¹ je H—Ala—Gly—NH a R² je COOalk, kde alk je alkyl s nerozvětveným nebo rozvětveným řetězcem s 1 až 14 atomy uhlíku, vyznačený tím, že se oxiduje lineární peptid obecného vzorce II, uvedeného v bodě 1, kde R² má výše uvedený význam a R⁴ má význam uvedený v bodě 1, jódem nebo rhodanem za vzniku odpovídajícího cyklického disulfidového de207570 rivátu obecného vzorce III, uvedeného v bodě 1, kde R² má výše uvedený význam a R⁴ má význam uvedený v bodě 1, a pak se odstraní zbylé chránící skupiny reakcí s 50 až 100 % kyselinou trifluoroctovou nebo roztokelm minerální kyseliny.