CH622287A5 - Method for the determination of thrombin or of enzymes which cleave the substrates in the same way as thrombin, and use of the method - Google Patents
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Description
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung von Thrombin und solchen Enzymen, die Substrate in der gleichen Weise spalten wie Thrombin. Bei dem erfindungs-gemässen Verfahren wird das Material, in dem die Enzyme bestimmt werden sollen, mit einem neuen chromogenen Substrat zusammengebracht, wobei durch die enzymatische Hydrolyse aus dem Substrat ein den chromogenen Rest tragendes Amin abgespaltet wird, das sich in seinem Absorptionsspektrum von dem des chromogenen Substrates unterscheidet. Die Menge an gebildetem Hydrolyseprodukt ist proportional zur Menge an Enzym, die in dem getesteten Material anwesend ist, sodass sich das erfindungsgemässe Verfahren auch zur quantitativen Bestimmung der fraglichen Enzyme eignet. The present invention relates to a method for the determination of thrombin and those enzymes which cleave substrates in the same way as thrombin. In the method according to the invention, the material in which the enzymes are to be determined is brought together with a new chromogenic substrate, an enzymatic hydrolysis cleaving from the substrate an amine carrying the chromogenic residue, the absorption spectrum of which differs from that of the chromogenic substrate differs. The amount of hydrolysis product formed is proportional to the amount of enzyme which is present in the material tested, so that the method according to the invention is also suitable for the quantitative determination of the enzymes in question.
Die beim erfindungsgemässen Verfahren eingesetzten Substrate sind besonders geeignet, um eine quantitative Bestimmung von Thrombin durchzuführen oder um Reaktionen zu studieren, bei den Thrombin entweder gebildet, oder gehemmt oder konsumiert wird, oder auch um Faktoren zu bestimmen, die einen Einfluss auf solche Reaktionen nehmen oder an derartigen Reaktionen teilnehmen. Dementsprechend kann das erfindungsgemässe Verfahren auch zur Bestimmung von Antithrombin, Prothrombin und Heparin herangezogen werden. The substrates used in the method according to the invention are particularly suitable for carrying out a quantitative determination of thrombin or for studying reactions in which thrombin is either formed or inhibited or consumed, or also for determining factors which influence such reactions or participate in such reactions. Accordingly, the method according to the invention can also be used to determine antithrombin, prothrombin and heparin.
Synthetische Substrate, die in Verfahren zur Bestimmung von Enzymen eingesetzt werden, haben grosse Vorteile im Vergleich zu natürlichen Substraten, vorausgesetzt dass sie bestimmte Bedingungen erfüllen, zu denen gehören: eine grosse Empfindlichkeit oder Sensitivität gegenüber dem fraglichen Enzym, dass sie gegenüber dem fraglichen Enzym spezifisch sind und eine gute Löslichkeit in Wasser oder biologischen Testflüssigkeiten aufweisen und dass ferner mindestens eines der Ab-spaltungsprodukte leicht feststellbar ist. Synthetic substrates that are used in methods for the determination of enzymes have great advantages compared to natural substrates, provided that they meet certain conditions, which include: a high sensitivity or sensitivity to the enzyme in question, that they are specific to the enzyme in question are and have good solubility in water or biological test liquids and that at least one of the cleavage products is also easily detectable.
Eines der am besten geeigneten bisher bekannten Substrate zur Bestimmung von Thrombin ist in der schwedischen Patentschrift Nr. 380 257 beschrieben, und dieses Substrat besteht aus einem chromogenen Tripeptid-Derivat der folgenden Formel A One of the most suitable previously known substrates for the determination of thrombin is described in Swedish Patent No. 380 257 and this substrate consists of a chromogenic tripeptide derivative of the following formula A.
abgespaltet wird, die sich bezüglich ihres Absorptionsspektrums von dem Substrat der Formel I unterscheidet, und wobei die Menge an gebildetem Hydrolyseprodukt proportional zur Menge an in dem Material anwesendem Enzym ist. is split off, which differs in its absorption spectrum from the substrate of formula I, and wherein the amount of hydrolysis product formed is proportional to the amount of enzyme present in the material.
2. Verfahren nach Patentanspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man ein Substrat oder ein Salz desselben verwendet, in welchem der chromogene Rest R2 ein Nitrophenylrest, ein Naphthylrest, ein Nitronaphthylrest, ein Methoxynaphthylrest, ein Chinolylrest oder ein Nitrochinolylrest ist. 2. The method according to claim 1, characterized in that one uses a substrate or a salt thereof, in which the chromogenic radical R2 is a nitrophenyl radical, a naphthyl radical, a nitronaphthyl radical, a methoxynaphthyl radical, a quinolyl radical or a nitroquinolyl radical.
3. Verfahren nach Patentanspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass man ein Substrat oder ein Salz des Substrates der Formel I verwendet, in welchem der Rest R2 der p-Nitrophenyl-rest ist. 3. The method according to claim 2, characterized in that one uses a substrate or a salt of the substrate of formula I, in which the radical R2 is the p-nitrophenyl radical.
4. Verfahren nach Patentanspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man eine quantitative Bestimmung des Enzymes durchführt. 4. The method according to claim 1, characterized in that one carries out a quantitative determination of the enzyme.
5. Verfahren nach Patentanspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass man eine quantitative Bestimmung von Thrombin in einem System durchführt, in dem Thrombin gebildet oder verbraucht wird, oder die Bildung von Thrombin gehemmt wird. 5. The method according to claim 4, characterized in that one carries out a quantitative determination of thrombin in a system in which thrombin is formed or consumed, or the formation of thrombin is inhibited.
6. Anwendung des Verfahrens gemäss Patentanspruch 5 zur Bestimmung von Faktoren, die einen Einfluss auf solche Reak- 6. Application of the method according to claim 5 for the determination of factors which have an influence on such reac-
Bz-Phe-Val-Arg-pNA (S-2160) Bz-Phe-Val-Arg-pNA (S-2160)
(A) (A)
Die in dieser Formel für die fraglichen Aminosäuren verwendeten Abkürzungen werden in der Folge noch tabellarisch zusam-50 mengestellt. The abbreviations used in this formula for the amino acids in question are subsequently summarized in a table.
Das chromogene Substrat der Formel A bestitzt eine grosse Empfindlichkeit gegenüber Thrombin und es gibt bei der enzy-matischen Hydrolyse als chromophores Produkt das p-Nitroani-55 lin, das mit «pNA» in der Formel abgekürzt wird. Das p-Nitro-anilin kann spektrophotometrisch leicht bestimmt werden. Das Enzymsubstrat der Formel A, welches auch die Bezeichnung S-2160 aufweist, ist bezüglich seiner Verwendung jedoch Einschränkungen unterworfen, und zwar aufgrund seiner relativ 60 geringen Löslichkeit, die bei 1 mg/ml liegt. Diese geringe Löslichkeit führt zu dem Nachteil, dass man sehr nahe an der Sättigungsgrenze für dieses Substrat arbeiten muss, um in dem System eine befriedigende Konzentration an dem Substrat zu erreichen. Bei der Enzymbestimmung in verschiedenen biologi-(,5 sehen Systemen kann eine Ausfällung des Substrates selbst stattfinden, oder es kann ein Niederschlag entstehen, der eine Kombination aus Protein plus Substrat enthält. Diese Ausfällungen führen zu falschen Werten bei der photometrischen The chromogenic substrate of formula A has a high sensitivity to thrombin and there is p-nitroani-55 lin as a chromophoric product in enzymatic hydrolysis, which is abbreviated to «pNA» in the formula. The p-nitro-aniline can be easily determined spectrophotometrically. The enzyme substrate of formula A, which also has the designation S-2160, is, however, subject to restrictions with regard to its use, owing to its relatively low solubility, which is 1 mg / ml. This low solubility leads to the disadvantage that one has to work very close to the saturation limit for this substrate in order to achieve a satisfactory concentration on the substrate in the system. When enzymes are determined in various biological systems, (5 see systems) precipitation of the substrate itself can take place or precipitation can occur that contains a combination of protein and substrate. These precipitations lead to incorrect values in the photometric
3 3rd
622 287 622 287
Bestimmung, und dementsprechend auch zu falschen Werten bezüglich der Enzymbestimmung. Determination, and accordingly also wrong values regarding the enzyme determination.
Das Enzymsubstrat der Formel A, mit der Bezeichnung S-2160 wird wesentlich besser löslich, wenn in ihm die Benzoyl-gruppe durch ein Wasserstoffatom ersetzt wird, sodass dieses weitere Substrat dann die folgende Formel B The enzyme substrate of formula A, designated S-2160, becomes much more soluble if the benzoyl group in it is replaced by a hydrogen atom, so that this further substrate then has the following formula B
NH,-C H-CO NH, -C H-CO
H-Phe-Val-Arg-pNA H-Phe-Val-Arg-pNA
(b) (b)
aufweist. having.
In dem Substrat der Formel B führt die nunmehr freie m protonisierte Aminogruppe bei dem Rest des Phenylalanines zu einer Erhöhung der Löslichkeit, es wird jedoch der Nachteil in Kauf genommen, dass auch die Geschwindigkeit, mit der Thrombin das fragliche Substrat spaltet, wesentlich vermindert wird, und zwar, wie aus der Tabelle I zu ersehen ist, etwa um das 15 Dreissigfache. Ausserdem kann das fragliche Substrat in einer biologischen Testlösung in unerwünschter Weise von der endständigen Aminogruppe her, durch Aminopeptidasen zersetzt werden. In the substrate of the formula B, the now free m protonized amino group in the remainder of the phenylalanine leads to an increase in solubility, but the disadvantage is accepted that the rate at which thrombin cleaves the substrate in question is also considerably reduced. namely, as can be seen from Table I, around 15 thirty times. In addition, the substrate in question can be undesirably decomposed from the terminal amino group in a biological test solution by aminopeptidases.
Es wurde nun festgestellt, dass ein neues Substrat erhalten 2» werden kann, das durch Modifizierung des Produktes der Formel B erhalten wird, und zwar indem man in der Formel B die Aminosäure Valin durch eine cyclische Iminosäure ersetzt, und zwar durch 2-Azetidin-Carbonsäure (Aze), durch Prolin (Pro) oder durch Pipecolin-säure (Pip) und indem man ferner das 25 endständige L-Phenylalanin (L-Phe) durch D-Phenylalanin (D-Phe) ersetzt. Wie erwartet wurde, sind die so erhaltenen Substrate noch immer sehr gut löslich, überraschenderweise ist jedoch ihre Aktivität gegenüber Thrombin nicht vermindert, sondern anstatt dessen etwa 30-50-mal höher als die Aktivität 30 für die entsprechenden Substrate, die ausschliesslich aus L-Aminosäuren aufgebaut sind (es sei auf Tabelle I hingewiesen). Ausserdem sind die neuen Substrate um etwa 400% It has now been found that a new substrate can be obtained which is obtained by modifying the product of formula B by replacing the amino acid valine in formula B with a cyclic imino acid, namely with 2-azetidine Carboxylic acid (Aze), by proline (Pro) or by pipecolinic acid (Pip) and by also replacing the terminal L-phenylalanine (L-Phe) with D-phenylalanine (D-Phe). As expected, the substrates obtained in this way are still very soluble, but surprisingly their activity towards thrombin is not reduced, but instead about 30-50 times higher than activity 30 for the corresponding substrates, which consist exclusively of L-amino acids are constructed (please refer to Table I). In addition, the new substrates are around 400%
stärker aktiv als das Substrat der Formel A mit der Bezeichnung S-2160. 35 more active than the substrate of formula A with the designation S-2160. 35
Die endständigen D-Aminosäuren mit freier Aminogrup-pierung verhindert in den beim erfindungsgemässen Verfahren einzusetzenden Substraten ferner, dass ein nicht erwünschter Angriff von Aminopeptidasen an dem Substrat stattfindet, weil diese Enzyme gegenüber L-Aminosäuren spezifisch sind. 40 The terminal D-amino acids with free amino grouping also prevents in the substrates to be used in the method according to the invention that an undesired attack of aminopeptidases takes place on the substrate because these enzymes are specific for L-amino acids. 40
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist daher ein Verfahren zur Bestimmung von Thrombin, bzw. Enzymen, die Substrate in der gleichen Weise spalten wie Thrombin, das dadurch gekennzeichnet ist, dass man das Material, in dem die Enzyme bestimmt werden sollen, mit einem Substrat der folgen- 45 den Formel I The present invention therefore relates to a method for determining thrombin or enzymes which cleave substrates in the same way as thrombin, which is characterized in that the material in which the enzymes are to be determined is followed by a substrate - 45 Formula I
D-NH2-C H-CO-N - C H-CO-NH-C H-CO-NH-R, D-NH2-C H-CO-N - C H-CO-NH-C H-CO-NH-R,
in der D-Form vorliegt, is in the D-shape,
oder einem Salz des Substrates der Formel I zusammenbringt, wobei aus dem Substrat durch die enzymatische Hydrolyse eine Verbindung der Formel II or a salt of the substrate of the formula I, a compound of the formula II being obtained from the substrate by the enzymatic hydrolysis
r2-nh2 r2-nh2
(ii) (ii)
CH2-(CH2)n CH2- (CH2) n
(ch2)3) (ch2) 3)
I I.
nh nh
A A
h2n nh h2n nh
(I) (I)
in welcher in which
Rj ein Wasserstoffatom oder eine Hydroxygruppe ist, n 1,2 oder 3 ist, Rj is a hydrogen atom or a hydroxy group, n is 1, 2 or 3,
R2 einen chromogenen Rest darstellt, und D veranschaulicht, dass der endständige Aminosäurerest der Formel abgespaltet wird, die sich bezüglich ihres Absorptionsspektrums von dem Substrat der Formel I unterscheidet, und wobei die Menge an gebildetem Hydrolyseprodukt proportional zur Menge an in dem Material anwesenden Enzym ist. R2 represents a chromogenic residue, and D illustrates that the terminal amino acid residue of the formula is different, which differs in its absorption spectrum from the substrate of formula I, and the amount of hydrolysis product formed is proportional to the amount of enzyme present in the material.
In bevorzugten, beim erfindungsgemässen Verfahren eingesetzten Substraten der Formel I ist der chromogene Rest R2 ein Nitrophenylrest, insbesondere der p-Nitrophenylrest, ein Naph-thylrest, ein Nitronaphthylrest, ein Methoxynaphthylrest, ein Chinolylrest oder ein Nitrochinolylrest. In preferred substrates of formula I used in the process according to the invention, the chromogenic radical R2 is a nitrophenyl radical, in particular the p-nitrophenyl radical, a naphthyl radical, a nitronaphthyl radical, a methoxynaphthyl radical, a quinolyl radical or a nitroquinolyl radical.
Das erfindungsgemässe Verfahren kann zur quantitativen Bestimmung der Enzyme herangezogen werden. So kann beispielsweise eine quantitative Bestimmung von Thrombin in einem System durchgeführt werden, in welchem Thrombin gebildet oder verbraucht wird, oder in welchem die Bildung von Thrombin gehemmt wird. The method according to the invention can be used for the quantitative determination of the enzymes. For example, a quantitative determination of thrombin can be carried out in a system in which thrombin is produced or consumed, or in which the formation of thrombin is inhibited.
Dieses Verfahren zur quantitativen Bestimmung von Thrombin kann erfindungsgemäss auch angewandt werden um solche Faktoren zu bestimmen, die einen Einfluss auf solche Reaktionen nehmen, oder an solchen Reaktionen teilnehmen, bei welchen Thrombin entweder gebildet oder verbraucht, oder die Bildung von Thrombin gehemmt wird. Beispiele für durch diese Anwendung in dem System bestimmbare Faktoren, die den Einfluss auf die fraglichen Reaktionen nehmen oder an den Reaktionen teilnehmen, sind Anti-thrombin, Pro-thrombin oder Heparin. This method for the quantitative determination of thrombin can also be used according to the invention to determine those factors which have an influence on such reactions, or participate in those reactions in which thrombin is either formed or consumed, or the formation of thrombin is inhibited. Examples of factors which can be determined by this application in the system and which influence or participate in the reactions in question are anti-thrombin, pro-thrombin or heparin.
Zur Herstellung der neuen, beim erfindungsgemässen Verfahren einzusetzenden chromogenen Substrates der Formel I können übliche Schutzgruppen und Kupplungsverfahren angewandt werden, wobei alle diese Verfahrensweisen für den Fachmann auf dem Gebiete der Peptid-Chemie geläufig sind. Conventional protective groups and coupling processes can be used to produce the new chromogenic substrates of the formula I to be used in the process according to the invention, all of these processes being familiar to the person skilled in the field of peptide chemistry.
Als a-Aminoschutzgruppe kann die Carboxybenzoxy- oder die t-Bütyloxycarbonyl-Gruppe mit Vorteil eingesetzt werden, oder jede beliebige Schutzgruppe, die ähnlich aufgebaut ist wie die erwähnten Gruppen, wie z.B. die p-Methoxy-, p-Nitro- oder p-Methoxyphenylazo-carbobenzoxy-Gruppe. The carboxybenzoxy or t-butyloxycarbonyl group can advantageously be used as the a-amino protective group, or any protective group which is structured similarly to the groups mentioned, e.g. the p-methoxy, p-nitro or p-methoxyphenylazo-carbobenzoxy group.
Als Schutzgruppe für die ô-Guanidino-Gruppe des Arginy-les ist es vorteilhaft, eine Protonisierung zu verwenden oder eine N02-Gruppe oder eine p-Toluolsulfonyl-Gruppe. As a protecting group for the ô-guanidino group of arginy-les, it is advantageous to use a protonization or a NO 2 group or a p-toluenesulfonyl group.
Zum Schutz der Hydroxygruppe des Tyrosines kann vorteilhafterweise die t-Butylgruppe oder der Benzylrest verwendet werden. The t-butyl group or the benzyl radical can advantageously be used to protect the hydroxyl group of the tyrosine.
Als abspaltbare Schutzgruppe für die Carboxylgruppe sind beispielsweise die entsprechenden Methylester, Äthylester oder Benzylester geeignet. The corresponding methyl esters, ethyl esters or benzyl esters, for example, are suitable as a removable protecting group for the carboxyl group.
Die Kupplung zwischen zwei Aminosäuren oder einem Di-peptid und einer Aminosäure wird durch Aktivierung der a-Carboxygruppe erreicht. Diese aktivierten Derivate können entweder isoliert werden oder sie können in situ hergestellt The coupling between two amino acids or a dipeptide and an amino acid is achieved by activating the a-carboxy group. These activated derivatives can either be isolated or they can be prepared in situ
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werden und können beispielsweise die entsprechenden p-Nitro-phenyl-, Trichlorphenyl-, Pentachlorphenyl- oder N-Hydroxy-succinimidester oder symmetrische oder asymmetrische Anhydride, Säureazide oder N-Hydroxybenzotriazol-ester sein. and can be, for example, the corresponding p-nitro-phenyl, trichlorophenyl, pentachlorophenyl or N-hydroxy-succinimide esters or symmetrical or asymmetrical anhydrides, acid azides or N-hydroxybenzotriazole esters.
Das Prinzip des Herstellungsverfahrens kann eine stufenweise Kupplung der Aminosäuren an die Arginylgruppierung mit endständigem Kohlenstoffatom sein, wobei an diesen Argi-nylrest entweder die chromophore Gruppierung angekuppelt sein kann, die dann in diesem Fall bereits als Schutzgruppe für die Carbonsäuregruppierung des Arginylrestes wirkt, oder das eingesetzte Arginyl kann eine abspaltbare Carbonsäureschutzgruppe aufweisen, und der chromophore Rest wird dann an das geschützte Tripeptid-Derivat angekuppelt. Andererseits ist es auch möglich, das Dipeptid-Fragment mit endständigem Stickstoffatom selbst herzustellen, und dieses dann an den Arginyl-rest anzukuppeln, wobei dieser entweder bereits die chromophore Gruppe tragen kann oder frei von dieser chromophoren Gruppe sein kann, wie dies vorhin erläutert wurde. The principle of the production process can be a step-wise coupling of the amino acids to the arginyl group with a terminal carbon atom, it being possible for either the chromophoric group to be coupled to this arginyl group, which in this case then already acts as a protective group for the carboxylic acid grouping of the arginyl group, or the one used Arginyl can have a removable carboxylic acid protecting group, and the chromophore residue is then coupled to the protected tripeptide derivative. On the other hand, it is also possible to produce the dipeptide fragment with a terminal nitrogen atom itself, and then to couple it to the arginyl residue, which may either already carry the chromophoric group or may be free of this chromophoric group, as was explained above.
Unabhängig von dem gewählten Herstellungsprinzip kann eine Reinigung der Zwischenprodukte und der Endprodukte durch Gelfiltrationchromatographie geeignet sein, denn dadurch wird eine rasche synthetische Arbeit ermöglicht, und es werden maximale Ausbeuten erzielt. Regardless of the manufacturing principle chosen, purification of the intermediates and the end products by gel filtration chromatography can be suitable, since this enables rapid synthetic work and maximum yields are achieved.
Die Dünnschichtchromatographie wurde teilweise anhand von Eluaten durchgeführt, die aus der Gelfiltrationschromatographie stammten, und teilweise anhand von Eindampfungs-rückständen und getrockneten Endprodukten und Zwischenprodukten. Thin layer chromatography was carried out partly using eluates derived from gel filtration chromatography and partly using evaporation residues and dried end products and intermediates.
In der vorliegenden Beschreibung werden die in der folgenden Tabelle zusammengestellten Abkürzungen verwendet. The abbreviations summarized in the following table are used in the present description.
Abkürzung Substanz Abbreviation substance
Aminosäuren Falls nicht ausdrücklich andere Angaben gemacht werden, handelt es sich immer um die L-Formen der Aminosäure. Amino acids Unless expressly stated otherwise, it is always the L-form of the amino acid.
Arg Arginin Arg arginine
Aze 2-Azetidin-carbonsäure Aze 2-azetidine carboxylic acid
Phe Phenylalanin Phe phenylalanine
Pip Pipecolinsäure Pip pipecolic acid
Pro Prolin- Per proline
Val Valin Val valine
AcOH Essigsäure AcOH acetic acid
Bz Benzoyl Bz benzoyl
Cbo Carbobenzoxy- Cbo carbobenzoxy
DMF Dimethylformamid DMF dimethylformamide
Et3N Triäthylamin Et3N triethylamine
EtOAc Essigsäureäthylester EtOAc ethyl acetate
HMPTA N,N,N' ,N',N",N" -Hexamethylphosphorsäure-triamid HMPTA N, N, N ', N', N ", N" -hexamethylphosphoric acid triamide
GPC Gelfiltrationschromatographie GPC gel filtration chromatography
MeOH Methanol MeOH methanol
-OpNP p-Nitrophenoxy -OpNP p-nitrophenoxy
-pNA p-Nitroanilin -pNA p-nitroaniline
TLC Dünnschichtchromatographie TLC thin layer chromatography
Dünnschichtchromatographie Thin layer chromatography
Zur Durchführung der Dünnschichtchromatographie wurden hergestellte Galsplatten verwendet, deren Absorptionsmittel das Silicagel F254 war. Die zur Durchführung der Dünn-schichtchromatogramme verwendeten Lösungsmittel waren die folgenden, wobei die Mengenverhältnisse immer auf das Volumen bezogen sind: Gals plates, the absorbent of which was silica gel F254, were used to carry out thin-layer chromatography. The solvents used to carry out the thin-layer chromatograms were as follows, the proportions always based on the volume:
Lösungsmittel-System Pt Chloroform: Methanol = 9:1 Solvent system Pt chloroform: methanol = 9: 1
Lösungsmittel-System A n-Butanol:Essigsäure:Wasser = 3:2:1 Solvent system A n-butanol: acetic acid: water = 3: 2: 1
Nach der Durchführung der Dünnschichtchromatographie wird die Platte im Ultraviolettlicht (Wellenlänge 254 nm) betrachtet, und man entwickelt sie anschliessend nach üblichen Arbeitsverfahren unter Verwendung eines Chlor/o-toluidin-reagens. Wenn in der vorliegenden Beschreibung gesagt wird, «dass das Produkt nach der Dünnschichtchromatographie homogen ist» dann bedeutet dies, dass die Dünnschichtchromatographie unter Verwendung einer Menge von (i durchgeführt wurde. RrWerte, die angegeben sind, sind diejenigen Werte, die von getrennten chromatographischen Verfahren herrühren. After the thin layer chromatography has been carried out, the plate is viewed in ultraviolet light (wavelength 254 nm), and it is then developed by customary working methods using a chlorine / o-toluidine reagent. When it is said in the present specification "that the product is homogeneous after thin layer chromatography" it means that thin layer chromatography was performed using an amount of (i. Rr values that are given are those values obtained by separate chromatographic methods come from.
Das Gel Sephadex(R) G-15, das zur Durchführung der Gelfiltration verwendet wird, ist ein vernetztes Dextran-Gel. The Sephadex (R) G-15 gel used to perform gel filtration is a cross-linked dextran gel.
Das Gel Sephadex^ LH-20 ist ein hydroxypropyliertes vernetztes Dextran-Gel. The gel Sephadex ^ LH-20 is a hydroxypropylated cross-linked dextran gel.
Der Ionenaustauscher Sephadex^ QAE-25 der verwendet wird, ist ein vernetztes Dextran-Gel mit Diäthyl-(2-hydroxy-propyl)-amino-äthyl als funktioneller Gruppe. The ion exchanger Sephadex ^ QAE-25 which is used is a cross-linked dextran gel with diethyl- (2-hydroxy-propyl) -amino-ethyl as a functional group.
Alle diese Gele stammen von der Firma Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Schweden. All of these gels are from Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Sweden.
Beschreibung der Herstellungsverfahren Description of manufacturing processes
I. Herstellung von Cbo-Arg(NO?)pNA I. Preparation of Cbo-Arg (NO?) PNA
35,3 g (10 mMol) an trockenem Cbo-Arg(N02)-OH werden in 200 ml trockenem, frisch destilliertem HMPTA bei Zimmertemperatur gelöst, und dann setzt man 10,1 g (100 mMol) an Triäthylamin und 24,6 g (150 mMol) an p-Nitrophenyliso-cyanat zu, wobei man rührt und unter feuchtigkeitsfreien Bedingungen arbeitet. Nach einer Reaktionszeit von 24 Stunden wird die Lösung in 21 einer 2%igen Natriumbicarbonatlösung unter Rühren eingegossen. Der gebildete Niederschlag wird durch Filtration entfernt, und mit 2%iger Natriumbicarbonatlösung, mit Wasser, mit 0,5 normaler wässriger Salzsäure und mit Wasser gewaschen, und schliesslich getrocknet. Das erhaltene Rohprodukt wird mit warmem Methanol extrahiert und schwer lösliche Nebenprodukte werden abfiltriert. Das Filtrat wird durch Chromatographie auf einer Säule gereinigt, die mit Se-phadex(R) LH-20 gefüllt ist, welches in Methanol quellen gelassen wurde, und man eluiert ebenfalls mit Methanol. 35.3 g (10 mmol) of dry Cbo-Arg (NO2) -OH are dissolved in 200 ml of dry, freshly distilled HMPTA at room temperature, and then 10.1 g (100 mmol) of triethylamine and 24.6 g are added (150 mmol) of p-nitrophenyl isocyanate, while stirring and working under moisture-free conditions. After a reaction time of 24 hours, the solution is poured into 21% 2% sodium bicarbonate solution with stirring. The precipitate formed is removed by filtration and washed with 2% sodium bicarbonate solution, with water, with 0.5 normal aqueous hydrochloric acid and with water, and finally dried. The crude product obtained is extracted with warm methanol and sparingly soluble by-products are filtered off. The filtrate is purified by chromatography on a column filled with Se-phadex (R) LH-20 which has been swollen in methanol and also eluted with methanol.
Die erzielte Ausbeute beträgt 29,8 g, entsprechend 63 % der theoretischen Ausbeute. Das Produkt ist nach der Dünnschichtchromatographie im Lösungsmittel Pi rein und besitzt einen Rr Wert von 0,34. The yield achieved is 29.8 g, corresponding to 63% of the theoretical yield. The product is pure after thin layer chromatography in the solvent Pi and has an Rr value of 0.34.
Die optische Drehung beträgt The optical rotation is
[a] p +20,5° (c, 1,9, DMF) [a] p + 20.5 ° (c, 1.9, DMF)
II. Herstellung von Cbo-Pro-Arg(NQ7)-pNA II. Preparation of Cbo-Pro-Arg (NQ7) pNA
4,8 g (10 mMol) an dem Cbo-Arg(N02)-pNA werden in 25 ml an trockener Essigsäure aufgeschlämmt und dann gibt man 15 ml an 5,6 normaler Bromwasserstoffsäure in Essigsäure zu. Man lässt 50 Minuten lang bei Zimmertemperatur reagieren und giesst dann die Lösung unter heftigem Rühren in 300 ml trockenen Äther ein. Die Ätherphase wird von dem so erhaltenen Niederschlag abgesaugt, und der Niederschlag wird mit 2 Portionen von je 100 ml Äther gewaschen. Man erhält dabei das Hbr • H-Arg(N02)-pNA das in Vakuum über Natronlauge bei 40° C während 16 Stunden getrocknet wird. Dieses Produkt wird dann anschliessend in 25 ml Dimethylformamid aufgelöst, und die Lösung wird auf —10° C abgekühlt. Dann gibt man Triäthylamin in einer ausreichenden Menge zu, damit ein feuchtes pH-Papier, das unmittelbar über der Oberfläche der Lösung gehalten wird, eine schwach basische Reaktion liefert. Im allgemeinen werden dazu 1,9 ml benötigt. Es fällt dabei das Hydro-bromidsalz des Triäthylamines aus, und dieses wird durch Abfiltrieren entfernt, und man gibt dann zu dem Filtrat 4,1 g (11 mMol) an Cbo-Pro-OpNP zu. Nach einer weiteren Stunde werden 0,7 ml an Triäthylamin zugesetzt und ebenfalls nach 4 Stunden. Dann lässt man die Lösung sich auf Zimmertempera- 4.8 g (10 mmol) of the Cbo-Arg (NO2) pNA are slurried in 25 ml of dry acetic acid and then 15 ml of 5.6 normal hydrobromic acid in acetic acid are added. The mixture is left to react at room temperature for 50 minutes and then the solution is poured into 300 ml of dry ether with vigorous stirring. The ether phase is suctioned off from the precipitate thus obtained, and the precipitate is washed with 2 portions of 100 ml of ether each. This gives the Hbr • H-Arg (N02) -pNA which is dried in vacuo over sodium hydroxide solution at 40 ° C. for 16 hours. This product is then dissolved in 25 ml of dimethylformamide and the solution is cooled to -10 ° C. A sufficient amount of triethylamine is then added so that a moist pH paper held immediately above the surface of the solution will give a weakly basic reaction. In general, 1.9 ml are required. The hydrobromide salt of the triethylamine precipitates, and this is removed by filtration, and 4.1 g (11 mmol) of Cbo-Pro-OpNP are then added to the filtrate. After a further hour, 0.7 ml of triethylamine are added and also after 4 hours. Then the solution is left at room temperature
4 4th
5 5
lü lü
15 15
20 20th
25 25th
30 30th
35 35
40 40
45 45
50 50
55 55
60 60
(<5 (<5
5 5
622 287 622 287
tur über Nacht erwärmen. Es soll vermieden werden, dass eine zu grosse Menge an Cbo-Pro-OpNP als Verunreinigung im Endprodukt vorliegt, weil dieses Produkt bei der Durchführung der Gelfiltrationschromatographie ähnliche Eluationsvolumina in dem angewandten chromatographischen System aufweist wie ? das Endprodukt, und deshalb setzt man 0,5 ml (5 mMol) an n-Butylamin zu. Nach 30 Minuten werden 10 mMole an verdünnter Salzsäure zugegeben, und die Reaktionslösung wird auf einem Rotationsverdampfer eingedampft, der Rückstand wird mit mehreren Portionen Wasser gerührt, das durch Dekantieren hi entfernt wird. Der Rückstand wird dann in Methanol aufgelöst, und auf einer Säule, die mit Sephadex(R) LH-20 gefüllt ist, Warm the door overnight. It should be avoided that an excessive amount of Cbo-Pro-OpNP is present as an impurity in the end product because this product has similar elution volumes in the chromatographic system used when performing gel filtration chromatography as? the final product, and therefore 0.5 ml (5 mmol) of n-butylamine is added. After 30 minutes, 10 mmoles of dilute hydrochloric acid are added and the reaction solution is evaporated on a rotary evaporator, the residue is stirred with several portions of water, which is removed by decanting. The residue is then dissolved in methanol and on a column filled with Sephadex (R) LH-20
welches in Methanol quellen gelassen wurde, Chromatographien, wobei man als Eluationsmittel Methanol verwendet. Das so erhaltene Produkt ist nach der dünnschichtchromatographi- i 5 sehen Analyse homogen. which was swelled in methanol, chromatography using methanol as eluent. The product obtained in this way is homogeneous after thin-layer chromatography analysis.
Die Ausbeute betrug 5,5 g, entsprechend 96% der Theorie. The yield was 5.5 g, corresponding to 96% of theory.
Die Dünnschichtchromatographie, ausgeführt in dem Lösungsmittelsystem Pj lieferte einen RrWert von 0,28. Thin layer chromatography, carried out in the solvent system Pj, gave an Rr value of 0.28.
Die optische Drehung war 20 The optical rotation was 20
24 24th
V. Herstellung von Cbo-D-Phe-Pip-Arg(NO?)-pNA V. Preparation of Cbo-D-Phe-Pip-Arg (NO?) - pNA
Das Herstellungsverfahren wird nach der Methode IV durchgeführt. The manufacturing process is carried out according to Method IV.
Die Ausbeute betrug 2,6 g, entsprechend 70% der Theorie. Das Produkt war nach der Dünnschichtchromatographie, ausgeführt unter Verwendung des Lösungsmittelsystemes Pls homogen und besass einen Rf-Wert von 0,44. The yield was 2.6 g, corresponding to 70% of theory. After thin layer chromatography, carried out using the Pls solvent system, the product was homogeneous and had an Rf value of 0.44.
Die optische Drehung war wie folgt: The optical rotation was as follows:
24 24th
[a] _ —38,4° (c 1,0, Dimethylformamid). [a] _ -38.4 ° (c 1.0, dimethylformamide).
[a] p -33,0° (c 1,0, DMF) [a] p -33.0 ° (c 1.0, DMF)
III. Herstellung von Cbo-Pip-Arg(NO?)-pNA III. Preparation of Cbo-Pip-Arg (NO?) - pNA
Die Herstellung wird nach dem Verfahren II durchgeführt. 25 The production is carried out according to method II. 25th
Die Ausbeute beträgt 5,1 g, entsprechend 86% der Theorie. Das erhaltene Produkt ist nach der Dünnschichtchromatographie, unter Verwendung des Lösungsmittels Pb homogen und besitzt einen Rf-Wert von 0,30. 30 The yield is 5.1 g, corresponding to 86% of theory. The product obtained is homogeneous after thin layer chromatography using the solvent Pb and has an Rf value of 0.30. 30th
Die optische Drehung beträgt The optical rotation is
D D
VI. Herstellung von Cbo-Phe-Pro-Arg (NO?)-pNA VI. Preparation of Cbo-Phe-Pro-Arg (NO?) PNA
Das Herstellungsverfahren wurde wie unter IV erläutert durchgeführt. The manufacturing process was carried out as explained under IV.
Die Ausbeute betrug 2,9 g, entsprechend 80% der Theorie. Das Produkt war gemäss einer Dünnschichtchromatographie, ausgeführt in dem Lösungsmittelsystem Pj, homogen und besass einen RrWert von 0,38. The yield was 2.9 g, corresponding to 80% of theory. The product was homogeneous according to thin layer chromatography, carried out in the solvent system Pj, and had an Rr value of 0.38.
Die optische Drehung war wie folgt: The optical rotation was as follows:
24 24th
[a] D —39,2° (c 1,0, Dimethylformamid) [a] D -39.2 ° (c 1.0, dimethylformamide)
VII. Herstellung von Cbo-D-Phe-Pro-Arg(N07)-pNA VII. Preparation of Cbo-D-Phe-Pro-Arg (N07) -pNA
Das Herstellungsverfahren wurde wie unter IV beschrieben durchgeführt. The manufacturing process was carried out as described under IV.
Die Ausbeute betrug 3,1 g, entsprechend 86% der Theorie. Das Produkt war gemäss einer Dünnschichtchromatographie, ausgeführt in dem Lösungsmittelsystem P1; homogen und besass einen RrWert von 0,46. The yield was 3.1 g, corresponding to 86% of theory. The product was according to thin layer chromatography, carried out in the solvent system P1; homogeneous and had an Rr value of 0.46.
Die optische Darstellung war wie folgt: The visual representation was as follows:
[a] ™ -26,2° [a] ™ -26.2 °
(c 1,0, Dimethylformamid) (c 1.0, dimethylformamide)
IV. Herstellung von Cbo-Phe-Pip-Arg(NO?)-pNA IV. Preparation of Cbo-Phe-Pip-Arg (NO?) - pNA
2,9 g (5 mMol) Cbo-Pip-Arg(N02)-pNA werden decarbo-benzoxyliert indem man Bromwasserstoffsäure in Essigsäure verwendet, und man fällt dann aus und wäscht mit Äther und trocknet, wie dies unter II beschrieben ist. 2.9 g (5 mmol) of Cbo-Pip-Arg (N02) -pNA are decarbo-benzoxylated using hydrobromic acid in acetic acid, and then it precipitates and is washed with ether and dried as described under II.
Das erhaltene HBr ■ H-Pip-Arg(N02)-pNA wird dann in 15 ml Dimethylformamid gelöst. Die Lösung wird auf —10° C abgekühlt, unter Verwendung von 0,9 ml an Triäthylamin basisch gemacht und filtriert. Dann setzt man 3,0 g (7,15 mMol) an Cbo-Phe-OpNP zu und anschliessend 0,65 g (5 mMol) an N-Hydroxybenzotriazol als Katalsator. Nach einer Stunde werden weitere 0,35 ml an Triäthylamin zugegeben, und das gleiche Arbeitsverfahren wird nach 4 Stunden wiederholt. Man lässt die Reaktionslösung sich über Nacht auf Zimmertemperatur erwärmen. Die Lösung wird dann zur Trockene, unter Verwendung eines Rotationsverdampfers, eingedampft. Der Rückstand wird in Essigsäureäthylester gelöst und mit einer 2%igen Natriumbicarbonatlösung und Wasser behandelt, und dann dampft man die organische Schicht ein. Der erhaltene Rückstand wird dann in Methanol gelöst, und man chromatographiert unter Verwendung einer Säure, die mit Sephadex(R) LH-20, welches in Methanol quellen gelassen wurde, gefüllt ist, wobei man mit Methanol eluiert. The HBr · H-Pip-Arg (NO2) -pNA obtained is then dissolved in 15 ml of dimethylformamide. The solution is cooled to -10 ° C, basified using 0.9 ml of triethylamine and filtered. Then 3.0 g (7.15 mmol) of Cbo-Phe-OpNP are added and then 0.65 g (5 mmol) of N-hydroxybenzotriazole as a catalyst. After an hour an additional 0.35 ml of triethylamine is added and the same procedure is repeated after 4 hours. The reaction solution is allowed to warm to room temperature overnight. The solution is then evaporated to dryness using a rotary evaporator. The residue is dissolved in ethyl acetate and treated with a 2% sodium bicarbonate solution and water, and then the organic layer is evaporated. The residue obtained is then dissolved in methanol and chromatographed using an acid filled with Sephadex (R) LH-20 which has been swollen in methanol, eluting with methanol.
Das erhaltene Produkt ist gemäss der Dünnschichtchromatographie homogen. The product obtained is homogeneous according to thin layer chromatography.
Die erzielte Ausbeute betrug 2,7 g, entsprechend 73% der Theorie. The yield achieved was 2.7 g, corresponding to 73% of theory.
Die Dünnschichtchromatographie, ausgeführt in dem Lösungsmittel Pj lieferte einen Rf-Wert von 0,35. Thin layer chromatography, carried out in the solvent Pj, gave an Rf value of 0.35.
Die optische Drehung war wie folgt: The optical rotation was as follows:
M d -32,9° M d -32.9 °
(c 1,0, Dimethylformamid). (c 1.0, dimethylformamide).
24 24th
[a] —6,2° (c 1,0, Dimethylformamid) [a] -6.2 ° (c 1.0, dimethylformamide)
35 VIII. Herstellung von H-D-Phe-Pro-Arg-pNA • 2HC1 35 VIII. Preparation of H-D-Phe-Pro-Arg-pNA • 2HC1
175 mg (0,246 mMol) an Cbo-D-Phe-Pro-Arg(N02)-pNA wurden von den Schutzgruppen befreit, indem man das Produkt mit 5 ml trockenem Fluorwasserstoff in Anwesenheit von 0,3 ml Anisol in einer Apparatur nach Sakakibara, die zur Durchfüh-40 rung dieses Verfahrens geeignet ist, umsetzte, wobei die Umsetzung während 60 Minuten bei 0° C durchgeführt wurde. Sobald die Reaktion abgeschlossen war, und sobald die gesamte Menge an Fluorwasserstoffsäure abdestilliert war, wurde das Produkt gereinigt, indem man es in zwei Stufen einem Ionenaustausch 45 unterwarf: 175 mg (0.246 mmol) of Cbo-D-Phe-Pro-Arg (NO2) -pNA were released from the protective groups by washing the product with 5 ml of dry hydrogen fluoride in the presence of 0.3 ml of anisole in a Sakakibara apparatus, which is suitable for carrying out this process, the reaction being carried out at 0 ° C. for 60 minutes. Once the reaction was complete, and once all of the hydrofluoric acid had distilled off, the product was purified by subjecting it to ion exchange 45 in two stages:
a) Gelfiltrationschromatographie auf einer Säule, die mit Sephadex(R) G-15, das in 33 % Essigsäure in Wasser quellen gelassen wurde, gefüllt war. Das gleiche Medium wurde zum Auflösen des Produktes und zur Durchführung der Elution a) Gel filtration chromatography on a column filled with Sephadex (R) G-15 which was swollen in 33% acetic acid in water. The same medium was used to dissolve the product and perform the elution
50 herangezogen. Das reine Produkt wird aus der wässrigen Essigsäurelösung durch Gefriertrocknung gewonnen. 50 used. The pure product is obtained from the aqueous acetic acid solution by freeze drying.
b) Ionenaustausch auf einer Säule, die mit Sephadex(R) QAE-25 in der Chloridform, welche in einer Mischung aus 95 Volumina Methanol und 5 Volumina Wasser quellen gelassen b) Ion exchange on a column made with Sephadex (R) QAE-25 in the chloride form, which swelled in a mixture of 95 volumes of methanol and 5 volumes of water
55 wurde, gefüllt war. Das gleiche Medium wurde verwendet, um das Material aufzulösen und auch zur Durchführung der Elution. Das reine Produkt wurde aus dem Wasser durch Gefriertrocknung gewonnen. 55 was filled. The same medium was used to dissolve the material and also to carry out the elution. The pure product was obtained from the water by freeze drying.
Die Ausbeute betrug 120 mg, entsprechend 80% der m> Theorie. The yield was 120 mg, corresponding to 80% of theory.
Das Produkt war gemäss einer Dünnschichtchromatographie, unter Verwendung des Lösungsmittelsystems A, homogen und besass einen Rf-Wert von 0,29. The product was homogeneous according to thin layer chromatography using solvent system A and had an Rf value of 0.29.
Der Chloridgehalt betrug 11,23 % (theoretischer Wert: f* 11,6%). Die optische Drehung war The chloride content was 11.23% (theoretical value: f * 11.6%). The optical rotation was
24 24th
[a] D —122° (c 0,5,. .50%igewässrige Essigsäure). [a] D -122 ° (c 0.5, .50% aqueous acetic acid).
622 287 622 287
6 6
IX. Herstellung von H-Phe-Pro-Arg-pNA • 2HC1 IX. Preparation of H-Phe-Pro-Arg-pNA • 2HC1
Das Herstellungsverfahren wurde gemäss VIII durchgeführt. The manufacturing process was carried out according to VIII.
Die Ausbeute betrugt 71 % der Theorie. The yield was 71% of theory.
Gemäss einer Dünnschichtchromatographie, durchgeführt mit dem Lösungsmittelsystem A, war das Produkt homogen und besass einen Rf-Wert von 0,22. According to thin layer chromatography, carried out with solvent system A, the product was homogeneous and had an Rf value of 0.22.
Der Chloridgehalt betrug 11,0 Gew. -%, wobei der theoretische Wert 11,6% ist. Die optische Drehung war wie folgt: The chloride content was 11.0% by weight, the theoretical value being 11.6%. The optical rotation was as follows:
24 24th
[a] —73,6° (c 0,5,50%ige wässrige Essigsäure). [a] -73.6 ° (c 0.5.50% aqueous acetic acid).
X. Herstellung von H-D-Phe-Pip-Arg-pNA • 2HC1 X. Preparation of H-D-Phe-Pip-Arg-pNA • 2HC1
Das Herstellungsverfahren wurde gemäss VIII durchgeführt. The manufacturing process was carried out according to VIII.
Die Ausbeute betrug 72% der Theorie. The yield was 72% of theory.
Das Produkt war gemäss einer Dünnschichtchromatographie, durchgeführt in dem Lösungsmittelsystem A, homogen und besass einen RrWert von 0,44. The product was homogeneous according to thin layer chromatography, carried out in solvent system A, and had an Rr value of 0.44.
Der Chloridgehalt betrug 11,4 Gew.-% (theoretischer Wert: 11,3%). Die optische Drehung war wie folgt: The chloride content was 11.4% by weight (theoretical value: 11.3%). The optical rotation was as follows:
24 24th
[a] —109° (c 0,4, 50%ige wässrige Essigsäure). [a] -109 ° (c 0.4, 50% aqueous acetic acid).
XI. Herstellung von H-Phe-Pip-Arg-pNA • 2HC1 Die Herstellung wurde gemäss VII durchgeführt. Die Ausbeute betrugt 55 % der Theorie. XI. Preparation of H-Phe-Pip-Arg-pNA • 2HC1 The preparation was carried out in accordance with VII. The yield was 55% of theory.
Das Produkt war gemäss einer Dünnschichtchromatographie, ausgeführt unter Verwendung des Lösungsmittelsystems A, homogen und zeigte einen Rf-Wert von 0,41. The product was homogeneous by thin layer chromatography, performed using solvent system A, and showed an Rf of 0.41.
Der Chloridgehalt betrug 11,3 Gew.-% (theoretischer Wert: 11,3 Gew.-%). Die optische Drehung war wie folgt: The chloride content was 11.3% by weight (theoretical value: 11.3% by weight). The optical rotation was as follows:
24 24th
[a] j-j —80,3° (cO,5, 50%ige wässrige Essigsäure). [a] j-j -80.3 ° (cO, 5.5% aqueous acetic acid).
XII. Herstellung von Cbo-D-Tyr(OBzl)-Pip-Arg(NQ,)-pNA Die Herstellung wurde gemäss IV durchgeführt. XII. Preparation of Cbo-D-Tyr (OBzl) -Pip-Arg (NQ,) - pNA The preparation was carried out according to IV.
Die Ausbeute betrug 3,2 g, entsprechend 75 % der Theorie. Das Produkt war, gemäss einer Dünnschichtchromatographie, ausgeführt in dem Lösungsmittelsystem Pls homogen und besass einen Rf-Wert von 0,50. The yield was 3.2 g, corresponding to 75% of theory. According to thin layer chromatography, the product was homogeneous in the Pls solvent system and had an Rf value of 0.50.
XIII. Herstellung von H-D-Tyr-Pip-Arg-pNA Die Herstellung erfolgte gemäss VIII. XIII. Preparation of H-D-Tyr-Pip-Arg-pNA The preparation was carried out according to VIII.
Die Ausbeute betrug 68 % der Theorie. The yield was 68% of theory.
Das Produkt war gemäss einer Dünnschichtchromatographie, ausgeführt in dem Lösungsmittelsystem P1; homogen und besass einen Rf-Wert von 0,44. The product was according to thin layer chromatography, carried out in the solvent system P1; homogeneous and had an Rf value of 0.44.
Der Chloridgehalt betrug 10,8 Gew.-% (theoretischer Wert 11,1 Gew.-%). The chloride content was 10.8% by weight (theoretical value 11.1% by weight).
Die optische Drehung war The optical rotation was
24 24th
[a] D -75,2° (c 0,5,50% ige wässrige Essigsäure). [a] D -75.2 ° (c 0.5.50% aqueous acetic acid).
XIV. Herstellung von Cbo-Aze-Arg(NQ9)-pNA Die Herstellung wurde gemäss II durchgeführt. XIV. Preparation of Cbo-Aze-Arg (NQ9) -pNA The preparation was carried out in accordance with II.
Die Ausbeute betrug 4,2 g, entsprechend 75 % der Theorie. The yield was 4.2 g, corresponding to 75% of theory.
Das Produkt war gemäss einer Dünnschichtchromatographie, ausgeführt in dem Lösungsmittelsystem Pj, homogen und besass einen Rf-Wert von 0,27. The product was homogeneous according to thin layer chromatography, carried out in the solvent system Pj, and had an Rf value of 0.27.
XV. Herstellung von Cbo-D-Phe-Aze-Arg(NO?)-pNA Die Herstellung wurde gemäss IV durchgeführt. XV. Preparation of Cbo-D-Phe-Aze-Arg (NO?) - pNA The preparation was carried out according to IV.
Die Ausbeute betrug 2,4 g, entsprechend 69 % der Theorie. Das erhaltene Produkt war gemäss einer Dünnschichtchromatographie, ausgeführt in dem Lösungsmittelsystem Pl5 homogen und besass einen Rf-Wert von 0,47. The yield was 2.4 g, corresponding to 69% of theory. The product obtained was homogeneous according to thin layer chromatography, carried out in the solvent system Pl5 and had an Rf value of 0.47.
XVI. Herstellung von H-D-Phe-Aze-Arg-pNA • 2HC1 Die Herstellung wurde gemäss VIII durchgeführt. Die Ausbeute betrug 71 % der Theorie. XVI. Preparation of H-D-Phe-Aze-Arg-pNA • 2HC1 The preparation was carried out according to VIII. The yield was 71% of theory.
Das Produkt war gemäss einer Dünnschichtchromatographie, ausgeführt in dem Lösungsmittelsystem A, homogen und besass einen Rf-Wert von 0,21. The product was homogeneous according to thin-layer chromatography, carried out in solvent system A, and had an Rf value of 0.21.
Der Chloridgehalt betrug 11,6 Gew.-% (theoretischer Wert: 11,9 Gew.-%). The chloride content was 11.6% by weight (theoretical value: 11.9% by weight).
Die optische Drehung betrug The optical rotation was
24 24th
[a] —130° (c 0,5,50%igeEssigsäure). [a] -130 ° (c 0.5.50% acetic acid).
XVII. Herstellung von Cbo-Arg(NCM-ßNA XVII. Production of Cbo-Arg (NCM-ßNA
7,2 g (20 mMol) an trockenem Cbo-Arg(N02)-OH werden in 400 ml Tetrahydrofuran (THF) gelöst. Dann setzt man 2,0 g (20 mMol) an Triäthylamin zu, worauf dann die Lösung auf —10° C, unter Einhaltung von vollständig feuchtigkeitsfreien Bedingungen gekühlt wird. Dann setzt man 2,7 g (20 mMol) an Chlorameisensäure-isobutylester gelöst in 20 ml THF zu der gekühlten Lösung während 10 Minuten zu. Anschliessend werden während weiteren 10 Minuten 144 g (20 mMol) an ß-Naphthylamin zugegeben. Dann lässt man die Reaktionsmischung sich auf Zimmertemperatur erwärmen und belässt sie bei dieser Temperatur während 24 Stunden. Anschliessend wird die Reaktionsmischung in Vakuum zur Trockene eingedampft, und 3- bis 5mal mit destilliertem Wasser, 3- bis 5mal mit einer 5 %igen Natriumbicarbonatlösung und dann wieder 3- bis 5mal mit destilliertem Wasser behandelt und anschliessend im Vakuum getrocknet. Das erhaltene Produkt wird in Methanol aufgelöst, auf einer Säule chromatographiert, die mit Sephadex^ LH-20, welches in Methanol quellen gelassen wurde, gefüllt ist, und man eluiert mit Methanol. Das erhaltene Produkt ist gemäss einer Dünnschichtchromatographie, ausgeführt in dem Lösungsmittelsystem Pj, homogen. 7.2 g (20 mmol) of dry Cbo-Arg (NO2) -OH are dissolved in 400 ml of tetrahydrofuran (THF). 2.0 g (20 mmol) of triethylamine are then added, and the solution is then cooled to -10 ° C. while maintaining completely moisture-free conditions. Then 2.7 g (20 mmol) of isobutyl chloroformate dissolved in 20 ml THF are added to the cooled solution over 10 minutes. 144 g (20 mmol) of β-naphthylamine are then added over a further 10 minutes. The reaction mixture is then allowed to warm to room temperature and is left at that temperature for 24 hours. The reaction mixture is then evaporated to dryness in vacuo, and treated 3 to 5 times with distilled water, 3 to 5 times with a 5% sodium bicarbonate solution and then again 3 to 5 times with distilled water and then dried in vacuo. The product obtained is dissolved in methanol, chromatographed on a column filled with Sephadex® LH-20 which has been swollen in methanol and eluted with methanol. The product obtained is homogeneous according to thin layer chromatography, carried out in the solvent system Pj.
Die Ausbeute beträgt 8,1 g, entsprechend 84% der Theorie. The yield is 8.1 g, corresponding to 84% of theory.
Gemäss einer Dünnschichtchromatographie, ausgeführt in dem Lösungsmittelsystem Pl5 ist das Produkt homogen und besitzt einen Rf-Wert von 0,40. According to thin layer chromatography, carried out in the solvent system Pl5, the product is homogeneous and has an Rf value of 0.40.
Die optische Drehung beträgt The optical rotation is
[a] ^ +7,4° (c 1,0, Dimethylformamid). [a] ^ + 7.4 ° (c 1.0, dimethylformamide).
XVIII. Herstellung von Cbo-Pip-Arg(NQ7)-ßNA XVIII. Preparation of Cbo-Pip-Arg (NQ7) -ßNA
Das Herstellungsverfahren wird gemäss II durchgeführt. Die Ausbeute beträgt 4,8 g, entsprechend 82% der Theorie. Das Produkt ist gemäss einer Dünnschichtchromatographie, ausgeführt in dem Lösungsmittelsystem P1; homogen und besitzt einen RrWert von 0,36. The manufacturing process is carried out according to II. The yield is 4.8 g, corresponding to 82% of theory. The product is according to thin layer chromatography, carried out in the solvent system P1; homogeneous and has an Rr value of 0.36.
XIX. Herstellung von Cbo-D-Phe-Pip-Arg(NO->)-ßNA Das Herstellungsverfahren wird gemäss IV durchgeführt. Die Ausbeute betrugt 2,6 g, entsprechend 71 % der Theorie. Das Produkt ist gemäss einer Dünnschichtchromatographie, XIX. Production of Cbo-D-Phe-Pip-Arg (NO ->) - ßNA The production process is carried out according to IV. The yield was 2.6 g, corresponding to 71% of theory. The product is according to thin layer chromatography,
unter Verwendung des Lösungsmittelsystems Pl5 homogen und besitzt einen RrWert von 0,48. using the solvent system Pl5 homogeneous and has an Rr value of 0.48.
XX. Herstellung von H-D-Phe-Pip-Arg-ßNA • 2HC1 Die Herstellung wird gemäss VIII durchgeführt. Die Ausbeute betrug 68 % der Theorie. XX. Preparation of H-D-Phe-Pip-Arg-ßNA • 2HC1 The preparation is carried out according to VIII. The yield was 68% of theory.
Das Produkt ist gemäss einer Dünnschichtchromatographie, ausgeführt in dem Lösungsmittelsystem A, homogen und besitzt einen RrWert von 0,44, According to thin layer chromatography, carried out in solvent system A, the product is homogeneous and has an Rr value of 0.44.
Der Chloridgehalt beträgt 11,2 Gew.-% (theoretischer Wert: 11,3 Gew.-%). The chloride content is 11.2% by weight (theoretical value: 11.3% by weight).
Die optische Drehung beträgt 24 The optical rotation is 24
[a] D —105° (c 0,5, 50%ige wässrige Essigsäure). [a] D -105 ° (c 0.5, 50% aqueous acetic acid).
5 5
10 10th
15 15
20 20th
25 25th
30 30th
35 35
40 40
45 45
50 50
55 55
60 60
65 65
7 7
622 287 622 287
XXI. Herstellung von Cbo-Arg(NO,)-ßNA (4-OMe) XXI. Production of Cbo-Arg (NO,) - ßNA (4-OMe)
Das Herstellungsverfahren wurde gemäss XVII durchgeführt. The manufacturing process was carried out in accordance with XVII.
Die Ausbeute betrug 7,1 g, entsprechend 70% der Theorie. Das Produkt ist gemäss einer Dünnschichtchromatographie, 5 ausgeführt in dem Lösungsmittelsystem Pj, homogen und besitzt einen Rf-Wert von 0,42. The yield was 7.1 g, corresponding to 70% of theory. The product is homogeneous according to thin-layer chromatography, 5 carried out in the solvent system Pj, and has an Rf value of 0.42.
XXII. Herstellung von Cbo-Pip-Arg(NQ7)-ßNA (4-OMe) Das Herstellungsverfahren wurde gemäss II durchgeführt. Die Ausbeute betrugt 4,9 g, entsprechend 79% der Theorie. Das Produkt ist gemäss einer Dünnschichtchromatographie, XXII. Production of Cbo-Pip-Arg (NQ7) -ßNA (4-OMe) The production process was carried out according to II. The yield was 4.9 g, corresponding to 79% of theory. The product is according to thin layer chromatography,
ausgeführt in dem Lösungsmittelsystem Pj, homogen und besitzt einen Rf-Wert von 0,38. carried out in the solvent system Pj, homogeneous and has an Rf value of 0.38.
XXIII. Herstellung von Cbo-D-Phe-Pip-Arg(NO?)-ßNA (4- ,, OMe) XXIII. Production of Cbo-D-Phe-Pip-Arg (NO?) - ßNA (4- ,, OMe)
Das Herstellungsverfahren wird gemäss IV durchgeführt. Die Ausbeute beträgt 2,7 g, entsprechend 70% der Theorie Das Produkt ist gemäss einer Dünnschichtchromatographie, ausgeführt in dem Lösungsmittelsystem P!, homogen und be- 20 sitzt einen Rf-Wert von 0,51. The manufacturing process is carried out according to IV. The yield is 2.7 g, corresponding to 70% of theory. The product is, according to thin-layer chromatography, carried out in the solvent system P !, homogeneous and has an Rf value of 0.51.
XXIV. Herstellung von H-D-Phe-Pip-Arg-ßNA (4-OMe) 2HC1 XXIV. Preparation of H-D-Phe-Pip-Arg-ßNA (4-OMe) 2HC1
Die Herstellung wird gemäss VIII durchgeführt. The production is carried out according to VIII.
Die Ausbeute beträgt 64 % der Theorie. 25 The yield is 64% of theory. 25th
Das Produkt ist gemäss einer Dünnschichtchromatographie, ausgeführt in dem Lösungsmittelsystem A, homogen und besitzt einen Rt-Wert von 0,44. The product is homogeneous according to thin layer chromatography, carried out in solvent system A, and has an Rt value of 0.44.
Der Chloridgehalt beträgt 10,4 Gew.-% (theoretischer Wert: 10,7 Gew.-%). 30 The chloride content is 10.4% by weight (theoretical value: 10.7% by weight). 30th
Die optische Drehung ist The optical rotation is
24 24th
24 24th
[a] j-j —102° (c 0,5,50%ige wässrige Essigsäure). [a] j-j -102 ° (c 0.5.50% aqueous acetic acid).
Bestimmung von Thrombin, unter Verwendung der chromogenen Substrate. Determination of thrombin using the chromogenic substrates.
Die nach den vorangegangenen Beispielen hergestellten Those made according to the previous examples
35 35
Substrate wurden zur Bestimmung von Thrombin verwendet, wobei das untenstehende Arbeitsverfahren durchgeführt wurde. Substrates were used to determine thrombin using the procedure below.
Das Prinzip des Bestimmungsverfahrens beruht auf der Tatsache, dass das Produkt, das durch die enzymatische Hydrolyse des Substrates gebildet wird, ein Ultraviolettspektrum aufweist, das sich wesentlich von demjenigen des Substrates unterscheidet. So hat das gemäss Beispiel X hergestellte Substrat der Formel H-D-Phe-Pip-Arg-pNA ein Absorptionsmaximum bei 315 nm und einen molaren Extinktionskoeffizienten von 12.500. Bei einer Wellenlänge von 405 nm hat die Absorption des Substrates fast vollständig aufgehört. Während der enzyma-tischen Hydrolyse des Substrates wird p-Nitroanilin abgespalten, und dieses hat ein Absorptionsmaximum bei einer Wellenlänge von 380 nm, und einen molaren Extinktionskoeffizienten von 13.200. Bei einer Wellenlänge von 405 nm hat jedoch der molare Extinktionskoeffizient nur auf 9.620 abgenommen. Durch die spektrophotometrische Bestimmung bei einer Wellenlänge von 405 nm ist es daher möglich leicht die Menge an gebildetem p-Nitroanilin festzustellen. Diese Menge ist dem Ausmass der enzymatischen Hydrolyse proportional, und dieses ist wieder durch die aktive Menge an Thrombin bestimmt. Für andere erfindungsgemäss einzusetzende Substrate existieren im wesentlichen identische Bedingungen, und aus diesem Grunde wurden ständig die spektroskopischen Bestimmungen bei einer Wellenlänge von 405 nm durchgeführt. The principle of the determination method is based on the fact that the product which is formed by the enzymatic hydrolysis of the substrate has an ultraviolet spectrum which differs significantly from that of the substrate. The substrate of the formula H-D-Phe-Pip-Arg-pNA prepared according to Example X has an absorption maximum at 315 nm and a molar extinction coefficient of 12,500. At a wavelength of 405 nm, the absorption of the substrate has almost completely stopped. During the enzymatic hydrolysis of the substrate, p-nitroaniline is split off, and this has an absorption maximum at a wavelength of 380 nm and a molar extinction coefficient of 13,200. At a wavelength of 405 nm, however, the molar extinction coefficient only decreased to 9,620. The spectrophotometric determination at a wavelength of 405 nm therefore makes it possible to easily determine the amount of p-nitroaniline formed. This amount is proportional to the extent of the enzymatic hydrolysis, and this is again determined by the active amount of thrombin. Essentially identical conditions exist for other substrates to be used according to the invention, and for this reason the spectroscopic determinations were continuously carried out at a wavelength of 405 nm.
Die folgende Tabelle I zeigt einen Vergleich der relativen Reaktionsgeschwindigkeiten zwischen dem bereits bekannten Thrombin-Substrat der Formel A, mit der Bezeichnung S-2160, dem entsprechenden nicht benzoylierten Substrat und beim erfindungsgemässen Verfahren zu verwendenden Substraten. Aus dieser Tabelle sieht man klar, dass die erfindungsgemäss zu verwendenden Substrate überlegen sind. Sie reagieren 4mal rascher mit dem Thrombin als das beste bisher bekannte Substrat der Formel A, mit der Bezeichnung S-2160. Ausserdem sind die erfindungsgemäss zu verwendenden Substrate in Wasser etwa lOmal besser löslich als das Substrat mit der Bezeichnung S-2160. The following Table I shows a comparison of the relative reaction rates between the already known thrombin substrate of the formula A, with the designation S-2160, the corresponding non-benzoylated substrate and substrates to be used in the process according to the invention. This table clearly shows that the substrates to be used according to the invention are superior. They react 4 times faster with thrombin than the best known substrate of formula A, known as S-2160. In addition, the substrates to be used according to the invention are about 10 times more soluble in water than the substrate with the designation S-2160.
Tabelle I Table I
Substrat Substrate
Bezeichnung designation
Formel formula
Rei. Reaktions Rei. Reaction
Löslichkeit solubility
geschwindigkeit in Wasser in speed in water in
mg/ml mg / ml
A (S-2160) A (S-2160)
Bz-Phe-V al- Arg-pNA Bz-Phe-V al-Arg-pNA
100 100
0.1 0.1
B B
H-Phe-Val-Arg-pNA H-Phe-Val-Arg-pNA
3 3rd
1 1
IX IX
H-Phe-Pro-Arg-pNA H-Phe-Pro-Arg-pNA
15 15
1 1
VIII VIII
H-D-Phe-Pro-Arg-pNA H-D-Phe-Pro-Arg-pNA
400 400
3 3rd
XI XI
H-Phe-Pip-Arg-pNA H-Phe-Pip-Arg-pNA
9 9
1 1
X X
H-D-Phe-Pip-Arg-pNA H-D-Phe-Pip-Arg-pNA
420 420
3 3rd
Die in der Tabelle I angegebenen relativen Reaktionsgeschwindigkeiten beziehen sich auf die Reaktion zwischen Thrombin (0,4 NIH/ml) und Substrat bei einer Substratkonzentration von 0,1 |xmol/ml. The relative reaction rates given in Table I relate to the reaction between thrombin (0.4 NIH / ml) and substrate at a substrate concentration of 0.1 | xmol / ml.
C C.
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