CH640510A5 - Verfahren zur herstellung und reinigung von sekretin. - Google Patents

Description

Gegenstand der Erfindung ist daher weiterhin ein Verfahren zur Herstellung von gereinigtem Sekretin unter Anwendung des Verfahrens gemäss Anspruch 1 durch Kondensation von

Z-Thr(But)-Ser(But)-Glu(OBut)-Leu-Ser(But)-Arg-

-Leu-OH (I)

mit

H-Arg-Asp(OBut)-Ser(But)-Ala-Arg-Leu-Gln-Arg-

-Leu-Leu-Gln-Gly-Leu-V al-NH2 (II),

katalytische Hydrierung des erhaltenen Peptids

Z-Thr(But)-Ser(But)-GIu(OBut)-Leu-Ser(But)-Arg--Leu-Arg-Asp(OBut)-Ser(But)-Ala-Arg-Leu-Gln--Arg-Leu-Leu-Gln-Gly-Leu-Val-NH2 (III)

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io

15

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25

30

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mit Palladium-Katalysator und anschliessender Kondensation des erhaltenen Peptids

H-Thr(But)-Ser(But)-Glu(OBut)-Leu-Ser(But)-Arg-

-Leu-Arg-AspCOBuO-SerCBu'J-Ala-Arg-Leu-Gln-

-Arg-Leu-Leu-Gln-Gly-Leu-Val-NH2 (IV)

mit

Boc-His-Ser(But)-Asp(OBut)-Gly-Thr(But)-Phe-OH

Abspaltung der Schutzgruppen mit Trifluoressigsäure und Reinigung des so erhaltenen Sekretinhydrochlorids oder -hy-drobromids gemäss Anspruch 1, das dadurch gekennzeichnet ist, dass man bei den Kondensationen die Peptidbruch-stücke I und V in einem Gemisch aus Dimethylformamid und Dimethylacetamid mit 3-Hydroxy-4-oxo-3,4-dihydro--1,2,3-benzotriazin und Dicyclohexylcarbodiimid voraktiviert, wobei bei I die Gegenwart von Pyridinhydrobromid erforderlich ist und bei V Dimethylformamid fehlen kann, das aus I mit II erhaltene Peptid III durch Behandeln in Methanol reinigt, die katalytische Hydrierung von III in 80 bis 90%igem wässrigem Trifluoräthanol durchgeführt, bei der Kondensation von IV mit V das Peptid IV in Dimethyl-formamid'/Dimethylacetamid-Mischung vorlöst und die Abspaltung der Schutzgruppen in Gegenwart von 5 bis 20%iger 2-6 n HCl oder HBr und/oder Cysteinhydrochlorid durchführt. Die Abkürzung Z ist allgemein bekannt und bedeutet den Benzyloxycarbonyl-Rest, siehe z.B. H. Beyer, Lehrbuch der organischen Chemie, Seite 732, S. Hirzel Verlag Stuttgart, 1973. Bei der Verknüpfung von I mit II wurde bis jetzt die Dicyclohexylcarbodiimid/1-Hydroxybenzotriazol (DCC/HOBt)-Methode benutzt [Chem. Ber. 107 (1974),

Seite 215]. Die extreme Schwerlöslichkeit der Carboxyl-komponente bereitet jedoch erhebliche Schwierigkeiten. Für einen 7,7 mMol-Ansatz benötigt man 400 ml Dimethylformamid (DMF) als Lösungsmittel. Durch die grosse Verdünnung nimmt die Reaktionsgeschwindigkeit stark ab und man benötigt eine lange Reaktionszeit (2 Tage).

Es wurde nun überraschenderweise gefunden, dass sich die schwerlösliche Carboxylkomponente I in Gegenwart von Pyridin-hydrobromid und 3-Hydroxy-4-oxo-3,4-dihydro--benzotriazin (HOOBt) in einem Gemisch von DMF und Dimethylacetamid (DMA) gut löst. Lässt man eine der Komponenten weg, wird die Löslichkeit herabgesetzt. Dieses Verhalten ist für eine Voraktivierung des schwerlöslichen Heptapeptids mittels DCC/HOOBt ideal. Das Pyridinhydrobromid dient zur Protonierung der freien Guanidino-gruppe des Arginins. Zur Lösung von 10 mMol Carboxylkomponente I werden so nur 50 ml DMF und 50 ml DMA benötigt. Die Voraktivierung benötigt in der Regel 2 Stunden. Die Aminokomponente II (10 mMol) wird in der Regel ebenfalls in einem Gemisch von 50 ml DMF und 50 ml DMA gelöst. Nach 2 Stunden Kupplungszeit wird im allgemeinen aufgearbeitet. Der Gesamtlösungsmittelverbrauch ist also 200 ml/10 mMol und die Gesamtreaktionszeit 4 Stunden.

Auch bei der letzten Kupplung, nämlich der Knüpfung von V mit IV zu Boc-His-Ser(But)-Asp(OBut)-Gly-Thr(But)--Phe-Thr(But)-Ser(But)-GIu(OBut)-Leu-Ser(But)-Arg-Leu--Arg-Asp(OBut)-Ser(But)-Ala-Arg-Leu-Gln-Arg-Leu-Gln-Gly--Leu-Val-NH2 ist die Voraktivierung der Carboxylkomponente mit DCC/HOOBt dem Eintopfverfahren mit DCC/HOBt [Chem. Ber. 107 (1974) Seite 215] überlegen, wobei wiederum eine Mischung von DMF und DMA als Lösungsmittel für die Aminokomponente benutzt wird. Die Reaktionszeit wird hier im allgemeinen von 36 auf 6 Stunden verkürzt.

Das durch Kondensation von I mit II erhaltene Peptid

III wurde bisher durch Auskochen mit Essigester [Chem. Ber. 107, (1974), Seite 215] oder durch Umfällen aus Methanol/Essigester [Chem. Ber. 105 (1972) Seite 2508] gereinigt. Diese Reinigungsoperationen haben verständlicher-5 weise bei den schwer löslichen Ausgangssubstanzen keinen grossen Reinigungseffekt. Überraschenderweise wurde gefunden, dass sich das Material mit Methanol auskochen lässt wobei ein starker Reinigungseffekt erzielt wird, was im Gegensatz zu der letztgenannten Literatur [Chem. Ber. io 105, (1972) 2508] steht, wonach das Peptid in Methanol löslich ist.

Die katalytische Hydrierung von III zu IV wurde bisher in einer Mischung aus Methanol und DMA (143 ml/g, vgl. Chem. Ber. 107, 215) oder in 80%iger Essigsäure (269 ml/g, 15 Chem. Ber. 105, 2508) vorgenommen. Als besonders geeignetes Lösungsmittel für die katalytische Hydrierung erwies sich nun 80-90%iges 2.2,2-Trifluoräthanol (11 ml/g). Dieses Lösungsmittel hat gegenüber Essigsäure den Vorteil, dass keine Acetylierung stattfinden kann. In der Mischung 20 Methanol/DMA war das mit Methanol gereinigte Produkt III praktisch nicht löslich.

Nach der katalytischen Hydrierung lässt sich das entstandene 5 HBr. H-Thr(But)-Ser(But)-Glu(OBut)-Leu-Ser(But)--Arg-Leu-Arg-AsptOBu^-SerCBuO-Ala-Arg-Leu-Gln-Arg-25 -Leu-Leu-Gln-Gly-Leu-Val-NH2 (IV) wieder durch Auskochen mit Methanol gut reinigen, obwohl nach Chem. Ber. 105, (1972), Seite 2508 das Produkt als methanollöslich beschrieben wird.

Das so hergestellte geschützte Sekretin kann wie üblich 30 mit Trifluoressigsäure behandelt werden, wobei die Schutzgruppen des tert.-Butyl-typs abgespalten werden.

Vorteilhafter erwies sich jedoch die Abspaltung der Schutzgruppen in Trifluoressigsäure, welcher 5-20 % 2-6 n wässrige Salzsäure oder Bromwasserstoffsäure und/oder 35 Cysteinhydrochlorid zugesetzt ist. Bei diesem Verfahren erhält man ein Rohsekretin mit höherer Aktivität, das nach dem erfindungsgemässen Reinigungsverfahren durch Chromatographie an einem alkylierten Dextrangel gereinigt wird.

Sekretin wird als Diagnosticum für die Überprüfung der 40 exkretorischen Pankreasfunktionen und als Therapeuticum bei Ulcus duodeni verwendet.

Beispiel

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Z-Thr-(But)-Ser(But)-Glu(OBut)-Leu-Ser(But )-Arg-Leu-Arg--Asp( OBut)-Ser(But)-A Ia-Arg-Leu-Gln-Arg-Leu-Leu-Gln--Gly-Leu-Val-NH2

Zu einer Lösung von 12 g Z-Thr(But)-Ser(But)-Glu-50 (OBut)-Leu-Ser(But)-Arg-Leu-OH. 2 H20, 1.6 g Pyridin-hydrobromid und 1,63 g 3-Hydroxy-4-oxo-3,4-dihydro-l,2,3--benzotriazin in einer Mischung aus 50 ml Dimethylformamid und 50 ml Dimethylacetamid gibt man 8,4 g Dicyclohexylcarbodiimid und rührt zwei Stunden bei Raumtempe-55 ratur. Inzwischen werden 18,8 g H-Arg-Asp(OBut)-Ser(But)-- Ala-Arg-Leu-Gln-Arg-Leu-Leu-Gln-Gly-Leu-V al-NH2. 4 HBr und 5,2 ml N-Äthylmorpholin in einer Mischung von 50 ml Dimethylformamid und 50 ml Dimethylacetamid gelöst. In diese Lösung wird der Voraktivierungsansatz ein-60 filtriert. Man rührt nun noch zwei Stunden bei Raumtemperatur nach und rührt in 3 Liter Essigester ein. Der ausgefallene Niederschlag wird abgesaugt, mit Essigester einmal aufgekocht und wieder abgesaugt. Zur weiteren Reinigung wird nun einmal mit 200 ml Methanol aufgekocht 65 und abgesaugt. Nun wird noch einmal mit Essigester verrührt, aufgekocht, abgekühlt, abgesaugt und getrocknet.

Ausbeute 23,1 g, Schmp.: 262-265°C [a]D20 = —22,4° (c = 1, in 80-proz. Essigsäure).

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H-T hr-fB^Ì-SerfBu* )-Glu(OBu* j-Leu-SerfBu1)-Arg-Leu-Arg--AspfOButj-SerfButj-Ala-Arg-Leu-Gln-Arg-Leu-Leu-Gln--Glu-Leu-Val-NH2 . 5 HBr

6 g Z-Thr(But)-Ser(But)-Glu(OBut)-Leu-Ser(But-Arg--Leu-Arg-Asp(OBut)-Ser(But)-Ala-Arg-Leu-Gln-Arg-Leu-Leu--GIn-GIy-Leu-Val-NH2 und 300 mg Pyridinhydrochlorid werden in 70 ml 80-proz. Trifluoräthanol gelöst. Man versetzt mit etwas Pd/Kohle-Katalysator und leitet Wasserstoff durch. Nach beendigter Hydrierung (kein C02 im Abgas)

wird der Katalysator abgesaugt und das Trifluoräthanol abdestilliert. Der Rückstand wird mit Essigester verrieben und abgesaugt. Zur weiteren Reinigung wird mit Methanol aufgekocht. Man lässt auf Raumtemperatur kommen und saugt ab. Anschliessend wird noch einmal mit Essigester aufgekocht, gekühlt und abgesaugt. Ausb. 4,58 g, [a]D20 = —26,1° (c = 1, in 80-proz. Essigsäure).

Boc-His-Ser(Bui)-A sp(OBu*)-Gly-Thr(Bu t)-Phe-Thr(Bu *)--SerfBu1 ^GlufOB^i-Leu-SerfBu*)-Arg-Leu-Arg-Asp(OBul )--SerfButj-A la-Arg-Leu-Gln-Arg-Leu-Leu-Gln-Gly-Leu-Val--NH2

Zu einer Lösung von 4,24 g Boc-His-Ser(But)-Asp(OBut)--Gly-Thr(But)-Phe-OH und 709 mg 3-Hydroxy-4-oxo-3,4--dihydro-1.2,3-benzotriazin in 17 ml Dimethylacetamid gibt man bei 0°C 2,87 g DCCI. Man rührt eine Stunde bei 0°C und eine Stunde bei Raumtemperatur. Inzwischen löst man 13,7 g H-Thr(But)-Ser(But)-Glu(OBut)-Leu-Ser(But)-Arg-Leu--Arg-Asp(OBut)-Ser(But)-Ala-Arg-Leu-Gln-Arg-Leu-Leu-Gln--Gly-Leu-Val-NH2. 5 HBr in einer Mischung aus 87 ml Dimethylformamid und 87 ml Dimethylacetamid zu einer gallertigen Masse. Zu dieser gallertigen Lösung gibt man 1,13 ml N-Äthylmorpholin, verdünnt mit 22 ml Dimethylacetamid und saugt den Voraktivierungsansatz dazu. Man rührt nun zwei Stunden bei Raumtemperatur. Inzwischen wird wie oben noch ein Voraktivierungsansatz bereitet, der dann wieder in den Reaktionsansatz einfiltriert wird. Man lässt nun nochmals zwei Stunden bei Raumtemperatur rühren und verrührt dann die gallertige Lösung mit 1740 ml heissen Essigester. Man lässt auf Raumtemperatur abkühlen und saugt den Niederschlag ab. Der Niederschlag wird noch einmal mit Essigester aufgekocht, abgesaugt und getrocknet. Ausbeute 17 g.

Rohsekretin und Sekretinreinigung a) 1,5 g geschütztes Sekretin und 150 mg Cysteinhydrochlorid werden in einer Mischung von 15 ml Trifluoressig- ' säure und 1,5 ml 4 n HCl gelöst. Man lässt 30 Minuten bei

5 Raumtemperatur stehen, engt ein, löst in Wasser und gefriertrocknet die Lösung. Ausbeute 1,69 g.

1,69 g Rohsekretin werden, in ca. 10 ml 0,001 n Cys . HCl-Lösung gelöst und an einer Sephadex® LH 20-Säule (200 X 4 cm) chromatographiert. Eluiert wird mit 0,001 n io Cys . HCl-Lösung. Es werden Fraktionen zu 300 Tropfen aufgefangen. Die guten Sekretinfraktionen sind im absteigenden Ast des ersten peaks enthalten (etwa 32.-37. Fraktion). Die sekretinhaltigen Fraktionen werden vereinigt und gerfriergetrocknet. Ausb. ca. 400 mg. In den nachfolgenden 15 Fraktionen können noch etwa 80 mg leicht verunreinigtes Sekretin gewonnen werden. Die Hauptfraktion zu 400 mg hatte lt. Aminosäureanalyse einen Peptidgehalt von 65 % und eine biologische Aktivität von 2600 E/mg; das entspricht einer Aktivität von 4000 E/mg Peptidbase. 20 Ausbeute bezogen auf geschütztes Sekretin: 22%. Neben Salzen und Wasser enthält das so isolierte Sekretin noch etwa 5% Cysteinhydrochlorid.

Aminosäureanalyse: Asp (2,0), Thr (1,9), Ser (3,1), Glu (3,0), Gly (2,0), Ala (1,1), Cys (0,7), Val (1,1), Leu (6,0), 25 Phe (1,0), His (1,0), Arg (3,9).

b) 1,5 g geschütztes Sekretin werden in einer Mischung von 15 ml Trifluoressigsäure und 1,5 ml 4 n HCl gelöst. Man lässt 30 Minuten bei Raumtemperatur stehen, engt ein, löst in Wasser und gefriertrocknet die Lösung. Ausb. 1,328 g.

30 Die oben gewonnenen 1,328 g Rohsekretin werden in ca. 10 ml 0,005 n HCl gelöst und an einer Sephadex® LH 20-Säule (200 X 4 cm) chromatographiert. Eluiert wird mit 0,005 n HCl. Es werden Fraktionen zu 300 Tropfen aufgefangen. Die guten Sekretinfraktionen sind am aufsteigenden 35 Ast des zweiten peaks enthalten (etwa 34.-39. Fraktion). Die Fraktionen werden vereinigt und gefriergetrocknet. Ausb. 419 mg. In den nachfolgenden Fraktionen können weitere 296,5 mg verunreinigtes Sekretin gewonnen werden. Die Hauptfraktion zu 419 mg hatte lt. Aminosäureanalyse einen 40 Peptidgehalt von 70% und eine biologische Aktivität von 2600-2700 E/mg. Die Aminosäureanlyse entspricht der von Versuch a, enthält aber kein Cystein.

v

Claims (3)

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1. Verfahren zur Reinigung von Sekretin, dadurch gekennzeichnet, dass man Sekretin in Sekretinhydrochlorid oder -hydrobromid überführt und dieses an einem alkylierten Dextrangel mit Wasser, verdünnter wässriger Salzsäure oder Bromwasserstoffsäure als Elutionsmittel reinigt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man die HCl- bzw. HBr-Lösungen mit bis zu äquimo-laren Mengen Aminosäuren abpuffert.

2

PATENTANSPRÜCHE

3. Verfahren zur Herstellung von gereinigtem Sekretin, unter Anwendung des Verfahrens gemäss Anspruch 1 durch Kondensation von

Z-ThrtBu'J-SetfBuO-GluCOBu^-Leu-SerCBuO-Arg-

-Leu-OH (I)

mit

H-Arg-Asp(OBut)-Ser(But)-Ala-Arg-Leu-Gln-Arg-

-Leu-Leu-Gln-Gly-Leu-V al-NH2 (II),

katalytische Hydrierung des erhaltenen Peptids

Z-Thr(But)-Ser(But)-Glu(OBut)-Leu-Ser(But)-Arg--Leu-Arg-Asp(OBut)-Ser(But)-Ala-Arg-Leu-Gln--Arg-Leu-Leu-Gln-Gly-Leu-Val-NH2 (III)

mit Palladium-Katalysator, anschliessender Kondensation des erhaltenen Peptids

H-Thr(But)-Ser(But)-Glu(OBut)-Leu-Ser(But)-Arg--Leu-Arg-AspCOBu'J-SertBu^-Ala-Arg-Leu-Gln-- Arg-Leu-Leu-Gln-Gly-Leu-V al-NH2 (IV)

mit

Boc-His-Ser(But)-Asp(OBut)-Gly-Thr(But)-Phe-OH (V),

Abspaltung der Schutzgruppen mit Trifluoressigsäure und Reinigen des so erhaltenen Sekretinhydrochlorids oder -hy-drobromids gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet,

dass man bei den Kondensationen die Peptidbruchstücke I und V in einem Gemisch aus Dimethylformamid und Di-methylacetamid mit 3-Hydroxy-4-oxo-3,4-dihydro-l,2.3--benzotriazin und Dicyclohexylcarbodiimid voraktiviert, wobei bei I die Gegenwart von Pyridinhydrobromid erforderlich ist und bei V Dimethylformamid fehlen kann, das aus I mit II erhaltene Peptid III durch Behandeln in Methanol reinigt, die kataly tische Hydrierung von III in 80- bis 90%-igem wässrigem Trifluoräthanol durchführt, bei der Kondensation von IV mit V das Peptid IV in Dimethylformamid/ Dimethylacetamid-Mischung vorlöst und die Abspaltung der Schutzgruppen in Gegenwart von 5- bis 20%iger 2 bis 6 n HCl oder HBr und/oder Cysteinhydrochlorid durchführt.

Sekretin, ein Hormon aus dem Duodenum, ist ein Hepta-cosipeptid der Formel

H-His-Ser-Asp-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Glu-Leu-Ser-

-Arg-Leu-Arg-Asp-Ser-Ala-Arg-Leu-Gln-Arg-Leu-

-Leu-Gln-Gly-Leu-V al-NH,.

Es stimuliert die Bicarbonatproduktion der Bauchspeicheldrüse und wird zur Pankreasfunktionsprüfung klinisch verwendet.

Bisher wurde Sekretin durch Gegenstromverteilung [J. Am. Chem. Soc. 89, 6753 (1967)] und Ionenaustauseh-

chromatographie an SP-Sephadex C 25 [Chem. Ber. 105 (1972), Seite 2515] gereinigt. Bei der aufwendigen Gegenstromverteilung werden die sekretinhaltigen Proben anschliessend mit einem sauren Austauscher («algenic acid») verrührt und abgesaugt. Das dabei absorbierte Sekretin wird mit 0,2 n HCl eluiert und an einem schwach basischen Austauscher die Salzsäure durch Essigsäure ausgetauscht. Es sind somit nach der Gegenstromverteilung noch zwei Ionen-austauschchromatographien für die Aufarbeitung erforderlich.

Bei der Reinigung über Ionenaustauschchromatographie an SP-Sephadex C 25 wird Sekretin-acetat, das aus Rohse-kretin durch Behandeln mit einem schwach basischen Ionenaustauscher (in Acetatform) gewonnen wird, mit Ammo-niumcarbonatpuffern von steigender Molarität und speziellen pH-Werten eluiert. Die Elution dauert relativ lange und die resultierenden Eluate enthalten neben Sekretin auch Ammo-niumcarbonat, das durch Ansäuern mit Essigsäure in Am-moniumacetat überführt und durch mehrfache Gefriertrocknung entfernt werden muss.

Da aber Sekretin in wässrigen Lösungen stetig an biologischer Aktivität verliert, können mit den beiden vorbekannten zeitaufwendigen Reinigungsmethoden nur kleine Mengen hochwirksames Sekretin gewonnen werden, denn bei grösseren Mengen wird die Verweilzeit zu lange und damit auch der Aktivitätsverlust zu gross.

Es wurde nun überraschenderweise gefunden, dass sich Sekretin als Hydrochlorid oder Hydrobromid durch Chromatographie an einem alkylierten Dextrangel reinigen lässt, wenn mit Wasser oder stark verdünnter Chlor- oder Bromwasserstoffsäure eluiert wird. Vorzugsweise nimmt man zur Elution 0,001-0,005 n Salzsäure oder Bromwasserstoffsäure, da in diesen Lösungen die biologische Aktivität des Sekretins nicht so schnell abnimmt wie in reinem Wasser.

Der Vorteil dieser Methode liegt darin, dass nur eine einzige einfache Reinigungsoperation notwendig ist und das Sekretin durch eine einmalige Gefriertrocknung salzfrei erhalten werden kann. Das saure Elutionsmittel kann man auch mit Aminosäuren, wie z B. Cystein, Alanin oder Glycin abpuffern. Selbst in diesen abgepufferten Lösungsmitteln hält sich die biologische Aktivität des Sekretins besser als in reinem Wasser. Das so gewonnene Sekretin ist jedoch mit der zugesetzten Aminosäure kontaminiert, was aber für Zubereitungsformen möglicherweise auch erwünscht sein kann.

Sekretin wurde bereits nach verschiedenen Methoden hergestellt [J. Amer. Chem. Soc. 89 (1967), Seite 6753; J. Amer. Chem. Soc. 90 (1968), Seite 4711; Chem. Ber. 105 (1072), Seite 2508; Chem. Ber. 107 (1974), Seite 215]. Diese bekannten Methoden sind jedoch nicht gut dazu geeignet grössere Mengen Sekretin herzustellen, da z.B. unzureichende Löslichkeit von Fragmenten die Reaktionsgeschwindigkeit bei der Peptidkupplung verzögert.