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Sekretin, ein Hormon aus dem Duodenum, ist ein Heptacosapeptid der Formel
H-His-Ser-Asp-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Glu-Leu-Ser-Arg-Leu-Arg- - Asp-Ser-Ala-Arg-Leu-Gln-Arg-Leu-Leu-Gln.-Gly-Leu-Val-NHa.
Es stimuliert die Bicarbonatproduktion der Bauchspeicheldrüse und wird zur Pankreasfunktionsprüfung klinisch verwendet.
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schwindigkeit bei der Peptidkupplung verzögert.
Gegenstand der Erfindung ist daher ein Verfahren zur Herstellung von Sekretin durch Kondensation von Z-Thr (But)-Ser (Bu )-Glu (OBu )-Leu-Ser (Bu*')-Arg-Leu-OH (I) mit
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mit
Boc-His-Ser (But)-Asp (OBut)-Gly-Thr (But)-Phe-OH (V) und durch Abspaltung der Schutzgruppen mit Trifluoressigsäure, das dadurch gekennzeichnet ist, dass man bei den Kondensationen die Peptidbruchstücke (I) und (V) in einem Gemisch aus Dimethylformamid und Dimethylacetamid mit 3-Hydroxy-4-oxo-3, 4-dihydro-1, 2, 3-benzotriazin und Dicyclohexylcarbodiimid voraktiviert, wobei bei (I) die Gegenwart von Pyridinhydrobromid erforderlich ist, das aus (I) mit (II) erhaltene Peptid (III) durch Behandeln in Methanol reinigt, die katalytische Hydrierung von (III) in 80-bis 90% igem wässerigem Trifluoräthanol durchführt,
bei der Kondensation von (IV) mit (V) das Peptid (IV) in Dimethylformamid/Dimethylacetamid-Mischung vorlöst und die Abspaltung der Schutzgruppen in Gegenwart von 5 bis 20% 2 - 6n Hel oder HBr und/oder Cysteinhydrochlorid durchführt und das so erhaltene Sekretinhydrochlorid oder-hydrobromid an einem alkylierten Dextrangel mit Wasser, verdünnter wässeriger Salzsäure oder Bromwasserstoffsäure als Elutionsmittel reinigt.
Bei der Verknüpfung von (I) mit (II) wurde bis jetzt die Dicyclohexylcarbodiimid/1-Hydroben- zotriazol (DCC/HOBt)-Methode benutzt [Chem. Ber. 107 (1974), Seite 215]. Die extreme Schwerlöslichkeit der Carboxylkomponente bereitet jedoch erhebliche Schwierigkeiten. Für einen 7, 7 mMol-Ansatz benötigt man 400 ml Dimethylformamid (DMF) als Lösungsmittel. Durch die grosse Verdünnung nimmt die Reaktionsgeschwindigkeit stark ab und man benötigt eine lange Reaktionszeit (Z Tage).
Es wurde nun überraschenderweise gefunden, dass sich die schwerlösliche Carboxylkomponente (I) in Gegenwart von Pyridin-hydrobromid und 3-Hydroxy-4-oxo-3, 4-dihydro-benzotriazin (HOOBt) in einem Gemisch von DMF und Dimethylacetamid (DMA) gut löst. Lässt man eine der Komponenten
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weg, wird die Löslichkeit herabgesetzt. Dieses Verhalten ist für eine Voraktivierung des schwerlöslichen Heptapeptids mittels DCC/HOOBt ideal. Das Pyridinhydrobromid dient zur Protonierung der freien Guanidinogruppe des Arginins. Zur Lösung von 10 mMol Carboxylkomponente (I) werden so nur 50 ml DMF und 50 ml DMA benötigt. Die Voraktivierung benötigt 2 h. Die Aminokomponente (II) (10 mMol) wird ebenfalls in einem Gemisch von 50 ml DMF und 50 ml DMA gelöst. Nach 2 h. Kupplungszeit wird aufgearbeitet.
Der Gesamtlösungsmittelverbrauch ist also 200 ml/10 mMol und die Gesamtreaktionszeit 4 h.
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mit DCC/HOOBt dem Eintopfverfahren mit DCC/HOBt [Chem. Ber. 107 (1974) Seite 215] überlegen, wobei wieder eine Mischung von DMF und DMA als Lösungsmittel für die Aminokomponente benutzt wird.
Die Reaktionszeit wird hier von 36 auf 6 h verkürzt.
Das durch Kondensation von (I) mit (II) erhaltene Peptid (III) wurde bisher durch Auskochen mit Essigester [Chem. Ber. 107 (1974), Seite 215] oder durch Umfällen aus Methanol/Essigester [Chem.
Ber. 10. 5 (1972) Seite 2508] gereinigt. Diese Reinigungsoperationen haben verständlicherweise bei den schwer löslichen Ausgangssubstanzen keinen grossen Reinigungseffekt. Überraschenderweise wurde gefunden, dass sich das Material mit Methanol auskochen lässt, wobei ein starker Reinigungseffekt erzielt wird, was im Gegensatz zu der letztgenannten Literatur [Chem. Ber. 105 (1972), 2508] steht, wonach das Peptid in Methanol löslich ist.
Die katalytische Hydrierung von (III) zu (IV) wurde bisher in einer Mischung aus Methanol und DMA (143 ml/g, vgl. Chem. Ber. 107,215) oder in 80%iger Essigsäure (269 ml/g, Chem. Ber.
105,2508) vorgenommen. Als besonders geeignetes Lösungsmittel für die katalytische Hydrierung erwies sich nun 80-bis 90% iges 2, 2, 2-Trifluoräthanol (11 ml/g). Dieses Lösungsmittel hat gegenüber Essigsäure den Vorteil, dass keine Acetylierung stattfinden kann. In der Mischung Methanol/DMA war das mit Methanol gereinigte Produkt (III) praktisch nicht löslich.
Nach der katalytischen Hydrierung lässt sich das entstandene 5HBr. H-Thr (But) -Ser (But) - -Glu (OBu)-Leu-Ser (Bu )-Arg-Leu-Arg-Asp (OBu )-Ser (Bu)-Ala-Arg-Leu-Gln-Arg-Leu-Leu-Gln-Gly-Leu-Val- - NH : (IV) wieder durch Auskochen mit Methanol gut reinigen, obwohl nach Chem. Ber. 105 (1972), Seite 2508 das Produkt als methanollöslich beschrieben wird.
Das so hergestellte geschützte Sekretin kann wie üblich mit Trifluoressigsäure behandelt werden, wobei die Schutzgruppen des tert. Butyl-typs abgespalten werden.
Vorteilhafter erwies sich jedoch die Abspaltung der Schutzgruppen in Trifluoressigsäure, welcher 5 bis 20% 2 - 6n wässerige Salzsäure und/oder Cysteinhydrochlorid zugesetzt ist. Bei diesem Verfahren erhält man ein Rohsekretin mit höherer Aktivität, das sich nach dem erfindungsgemässen Reinigungsverfahren durch Chromatographie an einem alkylierten Dextrangel leicht reinigen lässt.
Sekretin wird als Diagnosticum für die Überprüfung der exkretorischen Pankreasfunktionen und als Therapeuticum bei Ulcus duodeni verwendet.
Beispiel :
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(Bu- Arg-Leu-Leu-Gln-Gly-Leu-Val-NHa
Zu einer Lösung von 12 g Z-Thr(But)-Ser(But)-Glu(OBut)-Leu-Ser(But)-Arg-Leu-OH.2 H20, 1,6 g Pyridin-hydrobromid und 1, 63 g'3-Hydroxy-4-oxo-3, 4-dihydro-1, 2, 3-benzotriazin in einer Mischung aus 50 ml Dimethylformamid und 50 ml Dimethylacetamid gibt man 8, 4 g Dicyclohexylcarbodiimid und rührt 2 h bei Raumtemperatur. Inzwischen werden 18, 8 g H-Arg-Asp(OBu)-Ser(Bu)-Ala-Arg-Leu- - Gln-Arg-Leu-Leu-Gln-Gly-Leu-Val-NH : t. 4HBrund5, 2ml. N-Äthylmorpholin in einer Mischung von 50 ml Dimethylacetamid gelöst. In diese Lösung wird der Voraktivierungsansatz einfiltriert. Man rührt nun noch 2 h bei Raumtemperatur nach und rührt in 3 1 Essigester ein.
Der ausgefallene Niederschlag wird abgesaugt, mit Essigester einmal aufgekocht und wieder abgesaugt. Zur weiteren Reinigung wird nun einmal mit 200 ml Methanol aufgekocht und abgesaugt. Nun wird noch einmal mit Essigester verrührt, aufgekocht, abgekühlt, abgesaugt und getrocknet.
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Nach beendigter Hydrierung (kein COa im Abgas) wird der Katalysator abgesaugt und das Trifluor- äthanol abdestilliert. Der Rückstand wird mit Essigester verrieben und abgesaugt. Zur weiteren Reinigung wird mit Methanol aufgekocht. Man lässt auf Raumtemperatur kommen und saugt ab. Anschliessend wird noch einmal mit Essigester aufgekocht, gekühlt und abgesaugt.
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4, 58 g ; [a]Ö = -26, 1"- Gly-Leu-val-NH . S HBr in einer Mischung aus 87 ml Dimethylformamid und 87 ml Dimethylacetamid zu einer gallertigen Masse.
Zu dieser gallertigen Lösung gibt man 1, 13 ml N-Äthylmorpholin, verdünnt mit 22 ml Dimethylacetamid und saugt den Voraktivierungsansatz dazu. Man rührt nun 2 h bei Raumtemperatur. Inzwischen wird wie oben noch ein Voraktivierungsansatz bereitet, der dann wieder in den Reaktionsansatz einfiltriert wird. Man lässt nun nochmals 2 h bei Raumtemperatur rühren und verrührt dann die gallertige Lösung mit 1740 ml heissen Essigester. Man lässt auf Raumtemperatur abkühlen und saugt den Niederschlag ab. Der Niederschlag wird noch einmal mit Essigester aufgekocht, abgesaugt und getrocknet.
Ausb. : 17 g.
Rohsekretin und Sekretinreinigung a) 1, 5 g geschütztes Sekretin und 150 ml Cysteinhydrochiorid werden in einer Mischung von 15 ml Trifluoressigsäure und 1, 5 ml 4n HCI gelöst. Man lässt 30 min bei Raumtempera- tur stehen, engt ein, löst in Wasser und gefriertrocknet die Lösung.
Ausb. : 1, 69 g.
1, 69 g Rohsekretin werden in zirka 10 ml O. OOln Cys. Hel-Lösung gelöst und an einer
Säule aus einem alkylierten Dextrangel (Sephadex LH 20) (200 x 4 cm) chromatographiert.
Eluiert wird mit O. OOln Cys. HCl-Lösung. Es werden Fraktionen zu 300 Tropfen aufgefan- gen. Die guten Sekretinfraktionen sind im absteigenden Ast des ersten peaks enthalten (etwa 32. bis 37. Fraktion). Die sekretinhaltigen Fraktionen werden vereinigt und gefrier- getrocknet.
Ausb. : zirka 400 mg.
In den nachfolgenden Fraktionen können noch etwa 80 mg leicht verunreinigtes Sekretin gewonnen werden. Die Hauptfraktion zu 400 mg hatte lt. Aminosäureanalyse einen Peptid- gehalt von 65% und eine biologische Aktivität von 2600 E/mg ; das entspricht einer Aktivi- tät von 4000 E/mg Peptidase.
Ausbeute bezogen auf geschütztes Sekretin : 22%.
Neben Salzen und Wasser enthält das so isolierte Sekretin noch etwa 5% Cysteinhydro- chlorid.
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Cys (0, 7), Val (1, 1), Leu (6, 0), Phe (1, 0), His (1, 0), Arg (3, 9). b) 1, 5 g geschütztes Sekretin werden in einer Mischung von 15 ml Trifluoressigsäure und 1, 5 ml 4n Hel gelöst. Man lässt 30 min bei Raumtemperatur stehen, engt ein, löst in
Wasser und gefriertrocknet die'Lösung.
Ausb. : 1, 328 g.
Die oben gewonnenen 1, 328 g Rohsekretin werden in zirka 10 ml 0,005n HCl gelöst und an einer Sephadex LH 20-Säule (200 x 4 cm) chromatographiert. Eluiert wird mit O, 005n Hel.
Es werden Fraktionen zu 300 Tropfen aufgefangen. Die guten Sekretinfraktionen sind
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im aufsteigenden Ast des zweiten peaks enthalten (etwa 34. bis 39. Fraktion). Die Frak- tionen werden vereinigt und gefriergetrocknet.
Ausb. : 419 mg.
In den nachfolgenden Fraktionen können weitere 296, 5 mg verunreinigtes Sekretin gewon- nen werden. Die Hauptfraktion zu 419 mg hatte lt. Aminosäureanalyse einen Peptidgehalt von 70% und eine biologische Aktivität von 2600 bis 2700 E/mg. Die Aminosäureanalyse entspricht der von Versuch a), enthält aber kein Cystein.