DE1643345B2

DE1643345B2 - Glucagonderivat und Verfahren zur Herstellung von Glucagon

Info

Publication number: DE1643345B2
Application number: DE1643345A
Authority: DE
Inventors: Gerhard Dipl.-Chem. Dr. 8000 Muenchen Wendlberger; Erich Dipl.-Chem. Dr. 8132 Tutzing Wuensch
Original assignee: Farbwerke Hoechst AG
Current assignee: Hoechst AG
Priority date: 1967-08-19
Filing date: 1967-08-19
Publication date: 1975-02-13
Also published as: NL6811541A; DK124749B; AT285834B; US3642763A; SE356294B; DE1643345A1; SE376606B; CH500167A; DE1643345C3; NO122483B

Description

Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr(tBuHOtBu)

22 23 24 25 26 27 28 29

2. Verfahren zur Herstellung von Glucagon, dadurch gekennzeichnet, daß man das Peptid der Glucagonsequenz 7 bis 29 der Formel

H-ThrdBuj-SeritBuVAsplOtBul-TyritBui-SerdBut-LysfBOCt-TyritBui-Leu-AspiOtBui-SerltBu)-

7 8 9 10 Il 12 13 14 15 16

Arg-Arg-Ala-Gln-Asp(OtBu)-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr(tBu)-OtBu (I)

17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29

mit einem Überschuß an dem Peptid der Glucagonsequenz 1—6 der Formel
AdOC-His(AdOC)-Ser(tBu)-Gln-Gly-Thr(tBu)-Phe-OH (II)

1 2 3 4 5 6

mittels Carbodiimiden in Gegenwart von N-Hydroxysuccinimid oder von N-Hydroxyphtalimid kondensiert und aus dem so erhaltenen geschützten Glucagon der Formel III die Schutzgruppen anschließend mittels Trifluoressigsäure abspaltet.

Das Proteohormon Glucagon konnte bisher syn- gar nicht zur Verfügung stehen. Somit ist eine

thetisch nicht hergestellt werden, sondern wurde aus chemische Glucagonsynthese trotz der zahlreichen

Pankreas gewonnen. Eine chemische Vollsynthese 35 Synthesestufen gegenüber der Gewinnung aus Pan-

des Glucagons, des Gegenspielers des Insulins, ist von kreas vorteilhafter, sie bedeutet für die Technik einen

großem Interesse. Sie ist auch von großer praktischer wesentlichen Fortschritt.

Bedeutung, da die aus Pankreas gewinnbaren Mengen Es wurde nun gefunden, daß man Glucagon synthe-

an Glucagon sehr gering sind. Für eine therapeutische tisch herstellen kann, indem man das Peptid der GIu-

Verwendung des Glucagons müßten solche Mengen 4° cagonsequenz 7 bis 29 der Formel
an Pankreas bearbeitet werden, wie sie praktisch

H-ThritBuJ-SeritBu^AspiOtBu^TyritBul-SerdBut-LystBOCt-TyrltBui-Leu-AspiOtBut-SerdBu)-

7 8 9 10 11 12 13 14 15 16

Arg-Arg-Ala-Gln-Asp(OtBu)-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr(tBu)-OtBu (I)

17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29

1 2 3 4 5 6

mittels Carbodiimiden in Gegenwart von N-Hydroxysuccinimid oder von N-Hydroxyphtalimid kondensiert und aus dem so erhaltenen geschützten Glucagon der Formel

AdOC-HisiAdOC^SerltBuJ-Gln-Gly-ThrttBui-Phe-ThritBu^SeritBuhAspiOtBuJ-TyrftBui-SerttBu)-

I 2 345 67 8 9 10 Il

LysiBOCl-TyrdBuJ-Leu-AspiOtBui-SerdBul-Arg-Arg-Ala-Gln-AspiOtBuJ-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-

12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26

Met-Asn-Thr(tBuMOtBu) (III)

27 28 29

die Schutzgruppen anschließend mittels Trifluoressig- Bei der Kondensation der beiden geschilderten säure abspaltet. Bruchstücke nach dem erfindungsgemäßen Verfahren Die Herstellung der als Ausgangsstoffe benötigten 6$ werden Carbodiimide verwendet, vorzugsweise be-Glucagonpeptide der Sequenzen 1 bis 6 sowie 7 bis 29 nutzt man das Dicyclohexylcarbodiimid. Das Konwird im Anschluß an die Ausführungsbeispiele be- densationsverfahren wird in üblicher Weise durchschrieben, geführt. Als Lösungsmittel werden vorzugsweise Di-

methylacetamid, Phosphorsäure- tris-dimethylamid oder N-Methylpyrrolidon oder auch ein Gemisch dieser Lösungsmittel verwendet. Man beginnt bei tiefen Temperaturen, etwa —20 bis — 10°C, und läßt im Verlauf der Reaktion unter Rühren langsam auf Zimmertemperatur kommen. Aus dem erhaltenen Reaktionsgemisch wird das Reaktionsprodukt durch teilweises Abdestillieren des oder der Lösungsmittel und Fällen mit Äther/Petroläther erhalten. Die im Überschuß eingesetzte Peptidkomponente der Sequenz 1 bis 6 läßt sich überraschenderweise selektiv mit Tetrahydrofuran aus dem amorphen Reaktionsprodukt extrahieren. Diese vorteilhafte Reinigungsmethode, die wesentlich zum Gelingen einer technisch verwertbaren Glucagonsynthese beiträgt, war nicht zu erwarten, da alle anderen in der Peptidchemie verwendeten Lösungsmittel für diese spezielle Reinigung versagten.

Die zweite Stufe des erfindungsgemäßen Verfahrens, die Abspaltung der Schutzgruppen, erfolgt mittels Trifluoressigsäure unter den üblichen Reaktionsbedingungen.

Die Kondensation zur Synthese eines biologisch aktiven Glucagons kann nicht mit beliebig gewählten Peptidbruchstücken durchgeführt werden; z. B. ist es nicht möglich, die Glucagonsequenz durch Kondensation der Peptidbruchstücke 1—8 + 9—29 nach der Azidmethode aufzubauen, obwohl sich dieses Kondensationsschema nach den in der Peptidchemie vorliegenden Erfahrungen wegen des carboxy lendständigen Serins als besonders geeignet anbot. Auch bei der erfindungsgemäß gewählten Kondensation aus den Bruchstücken 1—6 + 7—29 lassen sich die sonst in der Peptidchemie üblichen Kondensationsverfahren nicht anwenden, lediglich die geschilderte Kondensationsmethode führte zum Ziel.

Auf Grund der Bedeutung des Glucagons bei der Regulierung des Blutzuckerspiegels kann dieses Peptid in der Therapie Verwendung finden.

In den nachstehenden Beispielen werden die Aminosäuren in der üblichen Weise abgekürzt. Die Schutzgruppen bedeuten:

CH₃

BOC = CH₃-C-O-CO-CH₃

45

Z =

NPS =

NO,

ONP = — O-

CH₇-O-CO-

s —

-NO,

55

60

65 -OSU = —Ο—Ν

AdOC =

O—CO-

Hinter den Verbindungen ist in Klammern die Position der Peptide in der Glucagonsequenz angegeben.

Beispiel

a) Geschütztes Glucagon (Sequenz 1—29)

N«,N(im)-Di-adamantyloxycarbonyl-L-histidyl-

O-tert.-butyl-L-seryl-L-glutaminyl-glycyl-

O-tert.-butyl-L-threonyl-L-phenylalanyl-

O-tert.-butyl-L-threonyl-O-tert.-butyl-L-seryl-

L-asparagyl(/Mert -butylester)-O-tert.-butyl-L-tyrosyl-O-tert.-butyl-L-seryl-Nj-tert.-butyl-oxycarbonyl-

L-lysyl-O-tert.-butyl-L-tyrosyl-L-leucyl-L-asparagyl-(/Mert.-butylester)-O-tert.-butyl-

L-sery 1-L-arginyl (hydrobromid)-L-arginyl(hydrobromid)-L-alanyl-L-glutaminyl-

L-asparagyl(/Mert.-butylester)-l-phenylalanyl-

L-valyl-L-glutaminyl-L-tryptophyl-L-leucyl-

L-methionyl-L-asparaginyl-O-tert.-butyl-

L-threonin-tert.-butylester (1 —29)

1,9g H-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Tyr(tBu)-Ser(tBu) - Lys(BOC) - Tyr(tBu) - Leu - Asp(OtBu)-Ser(tBu)-Arg(HBr)-Arg(HBr)-Ala-Gln-Asp(OtBu)-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr(tBu)-OtBu HBr (7—29-Hydrobromid) und 2,36 g AdOC-His(AdOC)-Ser(tBu)-Gln-Gly-Thr(tBu)-Phe-OH (1—6) und 0,345 g N-Hydroxysuccinimid werden in 40 cm³ frisch destillierten Dimethylacetamid/Phosphorsäure-tris-dimethylamid (1:1) unter Rühren gelöst. Die erhaltene Lösung wird anschließend mit 0,07 cm³ Triäthylamin versetzt, auf -15° C abgekühlt, nach Zugabe von 0,618 g Dicyclohexylcarbodiimid 24 Stunden bei 0 bis 5°C und weitere 3 Tage bei Raumtemperatur gerührt. Danach wird zur Reaktionsmischung nochmals 0,6 g AdOC-His(AdOC)-Ser(tBu)-Gln-Gly-Thr(tBu)-Phe-OH (1—6), 0,06 g N-Hydroxysuccinimid und 0,103 g Dicyclohexylcarbodiimid zugefügt, der Ansatz weitere 2 Tage unter Rühren belassen. Man erwärmt 30 Minuten lang auf 6O⁰C, filtriert und dampft anschließend Dimethylacetamid bei 50⁰C und 10"² Torr ab; die verbleibende Lösung läßt man in 1,5 I absolutem Diäthyläther einfließen.

Nach 3stündigem Stehenlassen wird der Niederschlag abfiltriert und mit absolutem Diäthyläther sorgfältig nachgewaschen. Das erhaltene Produkt wird 3mal mit heißem Essigester und anschließend 2mal mit bidestilliertem Wasser digeriert, im Vakuum kurz getrocknet und letztlich 17 Stunden lang im Soxhlet-Apparat mit absolutem Tetrahydrofuran erschöpfend extrahiert. Nach 15stündigem Trocknen bei 8O⁰C und 10~² Torr über P₂O₅: weißes amorphes Pulver.

Ausbeute: 2,06 g (84% der Theorie). Br₂S

C₂₃₂H₃₆₇N₄₃O₅₅

Berechnet ... gefunden ....

6H₂O (4938,826):

C 56,42, H 7,74, N 12,20, O 19,76; C 55,91, H 7,39, N 12,31, O 19,61.

Aminosäureanalyse:

	His	Ser	GIu	GIy	Thr
Berechnet	1 0,87	4 3,51	3 3,06	1 0,98	3 2,77
gefunden

	Phe	Asp	Tyr	Ly₅	Leu
Berechnet	2 1,97	4 3,97	2 1,75	1 0,94	2 1,95
gefunden

	Arg	AIa	VaI	Trp	Met	NH₃
Berechnet gefunden	2 2,0	1 1,02	1 1,04	1	1 0,94	4 4,50

b) Glucagon (Sequenz 1—29)

L-Histidyl-L-seryl-L-glutaminyl-glycyl-L-threonyl-L-phenylalanyl-L-threonyl-L-seryl-L-asparagyl-

L-tyrosyl-L-seryl-L-lysyl-L-tyrosyl-L-leucyl- L-asparagyl-L-seryl-L-arginyl-L-arginyl-L-alanyl- L-glutaminyl-L-asparagyl-L-phenylalanyl-L-valyl- L-glutaminyl-L-tryptophyl-L-leucyl-L-methionyl- L-asparaginyl-L-threonm (1—29)

0,5 g AdOC - HiS(AdOC) - Ser(tBu) - GIn - GIy-Thr(tBu) - Phe - Thr(tBu) - Ser(tBu) - Asp(OtBu)-Tyr(tBu) - Ser(tBu) - Lys(BOC) - Tyr(tBu) - Leu-Asp(OtBu)- Ser(tBu) - Arg(HBr) - Arg(HBr) - AIa - GIn-Asp(OtBu) - Phe - VaI - GIn - Trp - Leu - Met - Asn-Thr(tBu)-OtBu (1—29) werden mit 10 cm³ wasserfreier Trifluoressigsäure übergössen und unter Argon-Atmosphäre 2 Stunden lang bei Raumtemperatur stehengelassen; hierbei erfolgt Lösung. Anschließend wird die Trifluoressigsäure bei möglichst tiefer Temperatur (Badtemperatur max. 15° C) im Vakuum (10~²Torr) abgezogen, der verbleibende Rückstand mit einer wäßrigen Aufschlämmung von »Dowex®4« (OH-Form) 1 Stunde lang und nach Ansäuern mit Essigsäure auf etwa pH = 4 weitere 10 Minuten gerührt. Das Filtrat vom Ionenaustauscher wird lyophilisiert; das erhaltene Material in eiskaltem Wasser aufgenommen, von wenig Unlöslichem abfiltriert und erneut lyophilisiert: weißes amorphes Pulver.

Ausbeute: 380 mg (Roh-Glucagon).

Q₅₃H₂₂₅N₄₃O₄₉S-HXH₂O.

Aminosäureanalyse:

	His	Ser	GIu	GIy	Thr
Berechnet	1 0,85	4 3,48	3 2,94	1 0,99	3 2,68
gefunden

	Arg	Phe	Asp	Tyr	Lys	Leu
Berechnet ⁵ gefunden	2 1,99	2 1,96	4 3,90	2 1,75	1 0,91	2 1,92
	AIa	VaI	Trp	Met	NH₃
ίο Berechnet gefunden	1 1,02	1 1,01	1	1 0,90	4 5,02

Herstellung der Ausgangspeptide A. Sequenz 1—6

1. Benzyloxycarbonyl-0-tert.-butyl-L-threonyl-L-phenylalanin-methylester (5—6)

Zu einer Lösung von 70 g (226 mMol) Z-Thr(tBu)-OH (5)

in 500 cm³ Dichlormethan werden bei - 5⁰C nacheinander 31,4 cm³ Triethylamin, 29 g (227 mMol) H-Phe-OME · HCl (6-Hydrochlorid) und 51 g (248 mMol) Dicyclohexylcarbodiimid zugegeben. Man rührt die Reaktionsmischung 4 Stunden bei -5⁰C und weitere 10 Stunden bei Raumtemperatur. Das Filtrat vom Dicyclohexylharnstoff wird im Vakuum eingedampft, der Rückstand zwischen Essigester und Wasser verteilt, die abgetrennte organische Phase wie üblich mit verdünnter Citronensäure-, Kaliumhydrogencarbonat-Lösung und Wasser gewaschen und über Natriumsulfat getrocknet. Nach Eindampfen im Vakuum erhält man ein Öl, das mehrere Stunden im Hochvakuum getrocknet wird. Ausbeute 80,0 g (75% der Theorie).

2. O-tert.-Butyl-L-threonyl-L-phenylalanylmethylester-hydrochlorid (5—6)

80,0 g (170 mMol)öligen Z-Thr(tBu)-Phe-OMe (5—6) in 400 cm³ Methanol werden wie üblich unter Zutropfen von n-methanolischer Salzsäure bei pH = 4 hydriert. Das Filtrat vom Katalysator wird im Vakuum eingeengt, der Rückstand aus Methanol/Di äthyläther umkristallisiert: Schmp. 162 bis 163°C; (a)f: +26,6 ±1° bzw. (a)? : +33,1° (c = 1,3; in Äthanol). Chromatog. rein in tert.-Butanol/Eisessig/ Wasser/Pyridin (30:6:24:20) bzw. tert-Butanol/Eisessig/Wasser (6:2:2). Ausbeute 59,1g (93% der Theorie).

C₁₈H₂₈N₂O₄ · HCl (372,9):

Berechnet ... C 57,98, H 7,84, N 7,51; gefunden .... C 57,79, H 7,85, N 7,31.

3. Benzyloxycarbonyl-L-glutaminylglycinmethylester (3—4)

Zu 84,0 g (0,3MoI) Z-Gm-OH (3) und 41,7 cm³ Triäthylamin in 400 cm³ Tetrahydrofuran/Acetonitril

(1:1) werden bei -15° C unter Rühren 28,6 cm³ Chlorameisensäureäthylester langsam zugetropft. Zur Reaktionsmischung fügt man 37,8 g (etwa 0,3 Mol) H-GIy-OMe HCl (4-Hydrochlorid) und 41,7 cm³ Triäthylamin in 200 cm³ Dimethylformamid, rührt 1 Stun- de bei —10° C und weitere 4 Stunden bei Raumtemperatur. Danach destilliert man die Lösungsmittel im Vakuum ab. Der Rückstand wird mit 1000 cm³ 0,5n-HCI behandelt, das gebildete feste Material

abfiltriert, anschließend mit 0,5 n-Kaliumhydrogencarbonat-Lösung digeriert, erneut auf das Filter gebracht und mit Wasser gut gewaschen. Das im Vakuum über P₂O₅ getrocknete Produkt wird letztlich aus Methanol umkristallisiert: Schmp. 174,5 bis 175,5⁵CU.,)?: - 16,2 ± 1° bzw. («)£„: - 18,8 (c = 0,8; in Äthanol); («)?: -6,6 ± 1° bzw. («|*₆: -7.7° (c = 1; in Eisessig). Ausbeute 80,3 g(76% der Theorie).

C₁₆H_nN₃O₆ (351,4):

Berechnet ... C 54,70, H 6,02. N 11,96;
gefunden .... C 54,48, H 6,11. N 11,71.

10

4. L-Glutaminyl-glycin-methylesterhydrochlorid (3—4 Hydrochlorid)

15

Eine Aufschlämmung von 88,0 g (235 mMol) Z-GIn-GIy-OMe (3—4) in 400 cm³ Methanol wird in Gegenwart von Palladiumschwarz und unter Zutropfen von n-methanolischer Salzsäure bei pH 4 12 Stunden wie üblich hydriert. Das Filtrat vom Katalysator wird im Vakuum eingedampft, der Rückstand aus absolutem Äthanol umkristallisiert: Schmp. 110 bis 113°C; («)?: +16,6±l° bzw. («)£„: +19,3 (c = 2,3; in Methanol). Ausbeute 56,3 g (94,5% der Theorie).

C₈H₁₅N₃O₄ HCl (253,7):

Berechnet ... C 37,87. H 6,36, N 16,56, Cl 13,98; gefunden .... C 37,66, H 6,32, N 16,38, Cl 13,97.

5. Benzyloxycarbonyl-O-tert.-butyl-L-seryl- * L-glutaminylglycin-methylester (2—4)

Zu 62,5 g (212 mMol) Z-Ser(tBu)-OH (2), hergestellt nach Chem. Ber. 99. 105 (1966), und 29.4 cm³ Triäthylamin in 400 cm³ Tetrahydrofuran werden bei - 10" C unter Rühren 20.2 cm³ Chlorameisensäua·- äthylester zugetropft, zur erhaltenen Lösung des asymmelrischen Anhydrids 53,6 g (212 mMol) H-GIn-GIy-OMe · HCl (3-4-Hydrochlorid) und 29.4 cm³ Triäthylamin in 300 cm³ Dimethylformamid zugegeben. Man rührt die Reaktionslösung 1 Stunde bei -10⁰C, dann 2 Stunden bei Raumtemperatur und dampft anschließend im Vakuum ein. Der erhaltene Rückstand wird mit verdünnter Citronensäurc-Lösung behandelt, das gebildete feste Produkt auf das Filter gebracht, mit Wasser säurefrei gewaschen, im Vakuum über P₂O₅ getrocknet und letztlich aus Äthanol umkristallisiert: Schmp. 185 bis 186'C; («)£-: -9,2 ±0,5° bzw. («)£,„: -10.7° (c = 1.6; in Äthanol); («)' : - 15,6 ± 1 bzw. («)£₆: - 18,9° (c = 1; in 80%iger Essigsäure), nach Trocknen bei 9O⁰C und 10~³Torr. Chromatog. rein in n-Amylalkohol/Pyridin/Wasser (35:35:30). Ausbeute 83,6 g (80% der Theorie).

C₂₃H₃₄N₄O₈ (494,6): ^5S

Berechnet ... C 55,86, H 6,93, N 11,33;
gefunden .... C 55,68, H 7,01, N 11,35.

6. Benzyloxycarbonyl-O-tert.-butyl-L-seryl-

L-glutaminyl-glycin (2—4)

32,7 g (66 mMol) Z-Ser(tBu)-Gln-Gly-OMe (2-4) in 150 cm³ Dioxan werden mit 66 cm³ n-Natronlauge wie üblich verseift. Nach Ansäuern mit 66 cm' η-Schwefelsäure wird die Lösung im Vakuum bis zur Trockene eingedampft, der Rückstand mit Aceton behandelt, wobei Natriumsulfat ungelöst bleibt. Das im Vakuum eingedampfte Filtrat hinterläßt einen

60 festen Rückstand, der aus wenig Wasser umkristallisiert wird:Schmp. 158bis 159°C(145^C);(«)?: -9,0± 1° bzw. (//),-■„: - 10,3° (c = 1,2; in Äthanol). Chromatog. rein in tert.-Butanol / Eisessig / Wasser Pyridin (30:6:24:20). Ausbeute 29.2 g (90% der Theorie).

C₂₂H₃₂N₄O₈ ·	¹Z₂H₂	,O (489.5)	6,80,	N	11,43;
Berechnet ..	C	53,98, H	6.89,	N	11,39.
gefunden ...	. C	54,06. H

7. Benzyloxycarbonyl-O-tert.-butyl-L-seryl-L-glutaminyl-glycyl-O-tert.-butyl-L-threonyl- L-phenylalanin-methylester (2—6)

Zu 42,2 g (88 mMol) Z-Ser(tBu)-Gln-Gly-OH (2—4) und 12,25 cm³ Triäthylamin in 300 cm³ Dimethylformamid werden bei -5°C 32.9 g (88 mMol) H-Thr(tBu)-Phe-OMe · HCl (5—6-Hydrochlorid), 15.2 g (132 mMol) N-Hydroxysuccinimid und 20,0 g (97 mMol) Dicyclohexylcarbodiimid gegeben. Die Reaktionsmischung wird 4 Stunden bei —5'C und 14 Stunden bei Raumtemperatur gerührt, vom ausgefallenen Dicyclohexylharnstoff abfiltriert und im Vakuum eingedampft. Der erhaltene Rückstand wird nacheinander mit 5%iger Citronensäure-bzw. 10%iger Kaliumhydrogencarbonat-Lösung digeriert, auf das Filter gebracht und sorgfältig mit Wasser gewaschen. Nach Umkristallisieren aus 70%igem Methanol: Schmp. 178.5 bis 181.5°C; («)?: +5,4 i Γ bzw. («)i;₆: +6.5° (c = 1.1; in Methanol). Chromatogr. rein in n-Heptan/n-Butanol Eisessig (3:1:1) bzw. n-Propanol Essigester/Wasser (7:1:2). Ausbeute 65 g (93% der Theorie).

C₄₀H₃₈N₆O₁₁ (798,9):

Berechnet ... C 60,13, H 7,32, N 10,52, 0 22.03; gefunden .... C 60,07. H 7,28, N 10,60. O 21,99.

8. Benzyloxycarbonyl-O-tert.-butyl-L-seryl-L-glutaminyl-glycyl-O-tert.-butyl-L-threonyl-

L-phenylalanin (2—6)

Die Lösung von 20,0 g (25 mMol) Z-Ser(tBu)-Gln-Gly-Thr(tBu)-Phe-OMe (2—6) in 40cm' Dioxan wird mit 25,5 cm³ η-Natronlauge innerhalb 30 Minuten wie üblich verseift. Nach Ansäuern mit 25,5 cm³ η-Salzsäure entfernt man das Dioxan weitgehend im Vakuum; beim Stehenlassen der Restlösung bei + 2° C tritt Kristallisiation ein. Das ausgefallene Produkt wird abfiltriert, über P₂O₅ im Vakuum getrocknet und schließlich aus Äthanol/Essigester oder Acetonitril umkristallisiert: Schmp. 155,5 bis 157'C; («)< : + 16,7 ± 1° bzw. («)& : + 19,1° (c = 1; in Methanol). Ausbeute 16,3 g (83% der Theorie).

C₃₉H₅₆N₆O₁₁ (784,9):

Berechnet ... C 59,68, H 7,19, N 10,71, O 22,42; gefunden .... C 59,67. H 7,33, N 10,62. O 22,47.

9. O-tert.-Butyl-L-seryl-L-glutaminyl-glycyl-O-tert-butyl-L-threonyl-phenylalanin (2—6)

15,7 g (2OmMoI) Z-Ser(tBu)-Gln-Gly-Thr(tBu)-Phe-OH (2—6) in 300 cm³ wäßrigem Methanol und 1 cm³ Essigsäure werden wie üblich hydrogenolytisch entacyliert. Das Filtrat vom Katalysator hinterläßt nach Eindampfen im Vakuum einen Rückstand, der aus Methanol/Propanol-2/Diäthyläther kristallisiert: («H-: +7,33 ±1° bzw. («HJ.: +9,13° (c = 0,9; in Wasser). Chromatog. rein in tert.-Butanol/Eisessig'

509 507/399

Wasser (4:1:5) bzw. Amylalkohol/Pyridin/Wasser (35:35:30). Ausbeute 10,85 g (80% der Theorie).

C₃₁H₅₀N₆O₉ + 1,5H₂O (677,8):

Berechnet ... C 54,96, H 7,86. N 12,41, O 24; gefunden .... C 54,94, H 8,07, N 12,48, O 25.

10. Nu,N(im)-Di-adamantyloxycarbonyl-L-histidin-(N-hydroxy-succinimidester) (1)

25,6 g AdOC-HiS(AdOC)-OH (1—3), hergestellt nach J. Amer. Chem. Soc. 88 (1966), S. 1988, und 7 g N-Hydroxy-succinimid in 250 cm³ Dioxan werden bei 0⁰C mit 11 g Dicyclohexylcarbodiimid versetzt. Die Reaktionsmischung wird 2 Stunden bei 0⁰C und 12 Stunden bei Raumtemperatur gerührt, nach erneutem Abkühlen auf 0°C vom abgeschiedenen Dicyclohexylhamstoff filtriert. Der nach Eindampfen des Filtrats im Vakuum erhaltene Rückstand wird mit 100 cm³ Dichlormethan behandelt, wobei geringe Mengen Dicyclohexylhamstoff ungelöst bleiben. Die erwärmte Dichlormethan-Lösung versetzt man vorsichtig mit wenig Petroläther; nach Einsetzen der Kristallisation wird mit Petroläther überschichtet und zuerst bei Raumtemperatur und anschließend bei -5°C zur Vervollständigung der Kristallisation stehengelassen. Das abfiltrierte Produkt wird im Vakuum bei 6O⁰C getrocknet: Schmp. 164,5 bis 167,5^CC (151°). Ausbeute 22,6 g. (Der erhaltene AdOC-His(AdOC)-OSU enthält noch etwas N-Hydroxy-succinimid, ist jedoch für die weitere Umsetzung genügend rein.)

11. N«,N(im)-Di-adamantyloxycarbonyl-

L-histidyl-O-tert.-butyl-L-seryl-L-glutaminyl-

glycyl-O-tert.-butyl-L-threonyl-

L-phenylalanin (1—6)

30

35

6,78 g(l mMol)H-Ser(tBu)-Gln-Gly-Thr(tBu)-Phe-OH (2—6) und 1,4 cm³ Triäthylamin in 150 cm³ Pyridin werden bei —5°C mit 9,2 g (etwa 1,5 mMol) AdOC-HiS(AdOC)-OSU(I) (Rohprodukt) versetzt; die Reaktionslösung wird 2 Stunden bei 0° C und weitere 8 Stunden bei Raumtemperatur gerührt, im Vakuum eingedampft, der Rückstand mit absolutem Diäthyläther behandelt und auf das Filter gebracht. Die Lösung des erhaltenen Produktes in 100 cm³ Methanol läßt man in 500 cm³ Wasser, das 4,3 kg Citronensäure enthält, einfließen. Die gebildete Fällung wird abfiltriert, nach sorgfältigem Waschen mit Wasser im Vakuum getrocknet und schließlich in 300 cm³ Essigester/Methanol (5:1) aufgenommen. In diese Lösung läßt man unter Rühren 100 cm³ absoluten Diäthyläther langsam einfließen. Nach mehrstündigem Stehenlassen im Kühlschrank bei -5° C wird der Niederschlag abfiltriert und im Vakuum bei 40⁰C getrocknet. Beim Umkristallisieren aus Acetonitril und Trocknen der Fällung bei 6O⁰C und 10~³ Torr erhält man das Acyl-hexapeptid mit 1 Mol Wasser und V₂ Mol Acetonitril.

C₅₉H₈₅N₉O₁₄ + H₂O + V₂CH₃CN (1182,9):
Berechnet ... C 60,92, H 7,54, N 11,25, O 20,29; gefunden .... C 60,88, H 7,61, N 11,24, O 20,09.

60

(a)l°: + 16,63 ± Γ bzw. (afö : +19,94° (c = 0,9; in Methanol). Chromatog. rein in Amylalkohol/Pyridin/Wasser (35: 35 : 30), n-Butanol/Eisessig/Wasser (6:2:2) bzw. n-Heptan/n-Butanol/Eisessig (1:2:1). Ausbeute 9,45 g (80% der Theorie).

C₅₉H₈₅N₉O₁₄ + CH₃OH (1176,4):

Berechnet ... C 61,26, H 7,63, N 10,72, O 20,40; gefunden .... C 60,90, H 7,87, N 10,87, O 20,33.

Aminosäureanalyse:	His	Ser	GIu	GIy	Th r	Phe	NHj
	1 0,96	1 0,96	1 1,0	1 1,0	1 1,0	1 0,96	1 1,21
Berechnet gefunden

B. Sequenz (7—29)

1. Να-2-Nitrophenylsulfenyl-O-tert.-butyl-L-serin-4-nitrophenylester
[NPS-Ser(tBu)-ONP] (8)

Zu 5OmMoI H-Ser(tBu)-OH in 25 cm³ Dioxan und 17 cm³ 2 η-Natronlauge tropft man unter Rühren innerhalb von 30 Minuten 55 mMol 2-Nitro-phenylsulfenylchlorid in 25 cm³ Dioxan sowie 2 n-Natronlauge unter Einhalten eines pH-Wertes von 8 zu (Verbrauch etwa 38 cm³ 2 η-Natronlauge). Die Reaktionsmischung wird 1 Stunde lang weitergerührt, nach Verdünnen mit 600 cm³ Wasser filtriert und nach Zugabe von 200 cm³ Essigester vorsichtig bei 0⁰C mit η-Schwefelsäure auf pH = 3 angesäuert. Die abgetrennte organische Phase wird zweimal mit wenig Wasser gewaschen. Zu der erhaltenen über Natriumsulfat getrockneten Essigesterlösung des NPS-O-tert.-butyl-serins wird bei 0°C unter Rühren 50 mMol 4-Nitrophenol und 50 mMol Dicyclohexylcarbodiimid zugegeben. Die Reaktionsmischung wird 1 Stunde bei 0° C und 3 Stunden bei Raumtemperatur nachgerührt, nach kurzzeitigem Abkühlen auf O⁰C vom ausgefallenen Dicyclohexylhamstoff abfiltriert und im Vakuum eingedampft. Der verbleibende Rückstand wird aus Äthanol umkristallisiert und im Vakuum über P₂O₅ getrocknet. Ausbeute 67,5% der Theorie. Schmp. 82,5 bis 83,5° C; (α)?-¹: - 116,0° bzw. («)/?,: -130,8° (c = 1; in Dimethylformamid).

C₁₉H₂₁N₃O₇S (435,3):

Berechnet ... C 52,43. H 4,86, N 9,65, S 7,35;
gefunden .... C 52,16, H 4,86, N 9,25, S 7,17.

2. L-Asparagyl(/9-tert.-butylester)-O-tert.-butyl-

L-tyrosyl-O-tert.-butyl-L-seryl-

Nj-tert.-butyloxycarbonyl-L-lysyl-O-tert.-butyl-

L-tyrosyl-L-!eucyl-asparaginsäure(/Mert.-butyl-

ester) (9—15)

200 g (141 mMol) Z-Asp(OtBu)-Tyr(tBu)-Ser(tBu)-Lys(BOC)-Tyr(tBu)-Leu-Asp(OtBu)-OH (9—15), hergestellt nach Chem. Ber. 99 (1966), S. 105, in 2000 cm³ Dimethylformamid/95%igem Methanol (1:1) und 3 cm³ Eisessig werden bei 40° C wie üblich 72 Stunden hydriert. Die Reaktionsmischung wird auf dem Wasserbad erwärmt, vom Katalysator abfiltriert und in der Kälte der Kristallisation überlassen. Das erhaltene Produkt wird mit Äthanol digeriert und im Vakuum getrocknet. Chromatog. rein in n-Amylalkohol/Pyridin/Wasser (35:35:30) bzw. in n-Butanol/Eisessig/ Wasser (6:2:2). Schmp. über 250⁰C; (a)g>: +3,5 ± 1° bzw. (α)/?β: +4,6 (c = 1,4; in 80%iger Essigsäure). Ausbeute 176,4 g (99%).

Q₆H₁₀₆N₈O₁₇
Berechnet ..
gefunden ...

IH₂O (1301,7):

. C 60,90, H 8,36, N 8,61;
. C 60,82, H 8,42, N 8,61.

Nach Trocknen bei 90⁰C und 10~³ Torr wird die wasserfreie Substanz erhalten.

C₆₆H₁₀₆N₈O₁₇ (1283,6):

Berechnet ... C 61,76, H 8,32, N 8,73; gefunden .... C 61,78, H 8,40, N 8,73.

3. Nii-Benzyloxycarbonyl-O-tert.-butyl-L-seryl-

L-asparagyl(/Mert.-butylester)-O-tert.-butyl-L-tyrosyl-0-tert.-butyl-L-seryI-Nj-tert.-butyloxy-

carbonyl-L-lysyl-0-tert.-butyl-L-tyrosyl-

L-leucyl-L-asparaginsäure(/Mert.-butylester) (8—15)

8.21 g(6,32 mMol)H-Asp(OtBu)-Tyr(tBu)-Ser(tBu)-Lys(BOC)-Tyr(tBu)-Leu-Asp(OtBu)-OH (9—15) werden in 100 cm³ Dimethylformamid mit 0,89 cm¹ Triethylamin gelöst und bei Raumtemperatur unter Rühren mit 3,42 g (8,2 mMol) Z-Ser(tBu)-ONP (8 g), hergestellt nach Chem. Ber, 99 (1966), S. 105, versetzt. Nach 48stündigem Rührenlassen wird die Reaktionsmischung mit 3,8 cm³ Eisessig versetzt, anschließend im Vakuum eingeengt. Der erhaltene Rückstand wird mit verdünnter Citronensäure-Lösung behandelt, auf das Filter gebracht und zunächst mit Wasser und dann mit Diäthyläther sorgfältig gewaschen. Nach Umkristallisieren aus 90%igem Methanol und Trocknen bei 8O⁰C und 10~³ Torr; Schmp. 208 bis 209⁰C; (α)?,": -12,8 ± 1° bzw. («£«: — 17,5^D (c = 1; in Methanol). Chromatog. rein in Amylalkohol/Pyridin/Wasser (35:35: 30) bzw. in n-Butanol/Wasser/Eisessig (6:2:2). Ausbeute 8,75 g (88%).

C₈₁H₁₂₅N₉O₂₁ ¹AH₂O (1565,5):

Berechnet ... C 62,15, H 8,08, N 8,05;

gefunden .... C 62,06, H 8,11, N 8,01. _J5

4. O-tert.-Butyl-L-seryl-L-asparagyl(/J-tert.-butylesier)-O-tert.-butyl-L-tyrosyl-0-tert.-butyl-L-seryl-

Nc-tert.-butyloxycarbonyl-L-lysyl-O-tert.-butyl-

L-tyrosyl-L-leucyl-L-asparaginsäure(/i-tert.-butylester)

(8-15)

50 g (32 mMol) Z-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Tyr(tBu)-Ser(tBu)-Lys(BOC)-Tyr(tBu)-Leu-Asp(OtBu)-OH (8—15) in 800 cm³ Dimethylformamid/95%igem Methanol (1:1) und 3 cm³ Essigsäure werden bei 45° C wie üblich hydriert. Durch kurzes Erhitzen auf dem Wasserbad wird das ausgefallene Produkt in Lösung gebracht, noch heiß vom Katalysator nitriert, das Filtrai anschließend mehrere Stunden im Kühlschrank bei — 5⁰C stehengelassen. Das abgeschiedene Material wird abgesaugt, mit Methanol gewaschen und über P₂O₅ im Vakuum getrocknet: Schmp. 250⁰C; (<ι)ί : -3,9 tl° bzw. («)&: -4,5° (c = 1; in 80%iger Essigsäure). Chromatog. rein in n-Butanol/Eisessig/ Wasser (2:2:1) bzw. in Amylalkohol/Pyridin/Wasser (35:35:30). Ausbeute 40,9 g (80%).

C₇₃H₁₁₉N₉O₁₉ · 1H₂O (1444,8):

Berechnet ... C 60,69, H 8,44, N 8,73, O 22,10; gefunden .... C 60,79, H 8,58, N 8,73, O 21,91.

5. Να-2-Nitro-phenylsulfenyl-O-tert.-butyl-L-threonin (NPS-Thr(tBu)-OH) (7)

7 g (40 mMol) H-Thr(tBu)-OH werden mit 2-Nitrophenylsulfenylchlorid wie unter B(I) beschrieben umgesetzt und aufgearbeitet. Die erhaltene Essigesterlösung wird im Vakuum, zum Schluß unter azeotroper Destillation mit Benzol, dabei tritt Kristallisation ein. Das Produkt wird nach Behandeln mit Petroläther abfiltriert, mit dem gleichen Lösungsmittel gut gewaschen und im Vakuum getrocknet. Nach Umkristallisieren aus Diäthyläther/Petroläther: F. = 112 bis 114° C; («)2>: -93,2 ± Γ bzw. («)&: -95.9° (c= 1; in Dimethylformamid). Ausbeute 12,85 g (fast quantitativ).

C₁₄H₂₀N₂O₃S (328,4):

Berechnet ... C 51,21, H 6,13, N 8,53, S 9,74; gefunden .... C 51,26, H 6,07, N 8,46, S 9,74.

6. Να-2-Nitrophenylsulfenyl-O-tert.-butyl-L-threonin-N-hydroxysuccinimid-ester

(NPS-Thr(tBu)-OSU) (7)

25 mMol NSP-Thr(tBu)-OH in 150 cm³ Essigester werden bei O⁰C unter Rühren mit 25 mMol N-Hydroxysuccinimid und 25 mMol Dicyclohexylcarbodiimid versetzt. Die Reaktionsmischung wird 1 Stunde lang bei 0° C und 3 Stunden bei Raumtemperatur nachgerührt. Nach Abfiltrieren des ausgefallenen Dicyclohexylharnstoffs wird die Lösung im Vakuum eingedampft, der erhaltene Rückstand mit Äthanol behandelt. Hierbei erfolgt zunächst Lösung und anschließend rasche Kristallisation, die durch mehrstündiges Stehenlassen im Kühlschrank vervollständigt wird. Ausbeute 91% der Theorie. Schmp. 138 bis 139,5⁰C; («)?: -52,9° bzw. («)&: -56,9° (c = 1; in Dimethylformamid).

C₁₈H₂₃N₃O₇S (425,4):

Berechnet ... C 50,82, H 5,45, N 9,87, S 7,52; gefunden .... C 50,81, H 5,46, N 9,70, S 7,58.

7. Να-2-Nitro-phenylsulfenyl-O-tert.-butyl-

L-threonyl-O-tert.-butyl-L-seryl-

L-asparagyl(/Mert.-butylester)-O-tert.-butyl-

L-tyrosyl-O-tert.-butyl-L-seryl-Nj-tert.-butyloxy-

carbonyl-L-lysyl-O-tert.-butyl-L-tyrosyl-L-leucyl-L-asparaginsäure(/y-tert.-butylester) (7—15)

11,6g (8 mMol) H-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Tyr(tBu)-Ser(tBu)-Lys(BOC)-Tyr(tBu)-Leu-Asp(OtBu)-OH (8—15) in 150 cm³ Dimethylformamid werden mit 1,12 cm³ Triäthylamin und 4,2 g (8,8 mMol) NPS-Thr(tBu)-OSU (7), hergestellt nach Beispiel B (6), versetzt, die Reaktionsmischung bei Raumtemperatur 15 Stunden lang bis zum gallertartigen Erstarren gerührt. Beim Behandeln der Masse mit 1000 cm³ verdünnter Citronensäure-Lösung (pH = 4) flockt das Produkt aus; es wird nach sorgfältigem Verreiben abfiltriert und mit Wasser gut nachgewaschen. Das noch feuchte Produkt wird in wenig heißem Methanol aufgelöst; beim Stehenlassen der Lösung über Nacht bei O⁰C scheidet sich reines, kristallines Nonapeptid-Derivat ab. Es wird abfiltriert und im Vakuum bei 10"³ Torr getrocknet: («)?: -20,8 ± 1° bzw. («)&: -23,0° (c = 0,9; in Dimethylformamid). Chromatog. rein in Amylalkohol/Pyridin/Wasser (35 : 35 :30), Chloroform/Methanol (7:3) bzw. n-Butanol/Eisessig/ Wasser (6:2:2) bzw. n-Butanol/Äthanol/Wasser (2:2:1). Ausbeute 12,4 g (89%).

C₈₇H₁₃₇N₁₁O₂₃S (1737,2):

Berechnet ... C 60,15, H 7,95, N 8,87; gefunden .... C 59,94, H 8,05, N 8,58.

Berechnet ... S 1,81, 0 21,19; gefunden .... S 1,94, O 21,43.

Aminosaureanalyse:	Thr	Ser	Asp	Tyr	Lys	Leu
	1 0,95	2 1,81	2 2,06	2 1,85	I 1,02	1 1,03
Berechnet gefunden

8. Να-2-Nitro-phenylsulfenyl-O-tert.-butyl-L-seryl-L-arginyl-(hydrobromid)-L-argjnyl-

(hydrobromid)-L-alanyl-L-glutaminyl-L-asparaginsäure(ß-tert.-butylester) (16—21)

15,8 g H- Arg(HBr) - Arg(AcOH) - Ala - GIn-Asp(OtBu)-OH (17—21), hergestellt nach Chem. Ber., 100 (1967), S. 820, in 200 cm³ Dimethylformamid werden bei -10⁰C mit 10 g NPS-Ser(tBu)-ONP versetzt. Die Reaktionslösung wird 24 Stunden bei 0° C und 40 Stunden bei Raumtemperatur gerührt, anschließend in viel Diäthyläther eingerührt. Das ausgefallene Material wird abfiltriert, in wenig Dimethylformamid gelöst und erneut in Diäthyläther eingerührt; die Prozedur wird nochmals wiederholt, das abgeschiedene Material auf das Filter gebracht und mit Essigester und Diäthyläther sorgfältig gewaschen. Nach zweimaligem Umkristallisieren aus Methanol/ Äthanol:Zersetzungspunktabl70°C;(«)/?₈: -31,1 ± Γ (c = 1; in Dimethylformamid). Chromatogr. rein in n-Butanol/Essigsäure/Wasser (6:2:2). Ausbeute 18,4 g (93% der Theorie).

C₄₁H₆₉N₁₄O₁₃+ H₂O (1096,1):

Berechnet ... C44,93, H 6,53, N 17,90;
gefunden .... C 44,97, H 6,78, N 17,54.

Berechnet ... O 20,44, Br 7,29, S 2,93;
gefunden .... O 20,39, Br 7,05, S 2,88.

9. Ν,ι-2-Nitro-phenylsulfenyl-O-tert.-butyl-

L-sery 1-L-arginy 1 (hydrobromid)-

L-arginyl(hydrobromid)-L-alanyl-L-glutaminyl-

L-asparagyl((»-tert.-butylester)-L-phenylalanyl-

L-valyl-L-glutaminyl-L-tryptophyl-L-leucyl-

L-methionyl-L-asparaginyl-O-tert.-butyl-

L-threonin-tert.-buty!ester (16—29)

35

40

45

16,5 g NPS - Ser(tBu) - Arg(HBr) - Arg - AIa - GIn-Asp(OtBu)-OH (16—21), 18,5 g H-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr(tBu)-OtBuHBr (22—29-Hydrobromid) — hergestellt aus dem freien Octapeptid (22—29), Chem. Ber., 100 (1967), S. 816, in Dimethylformamid durch Umsetzung mit der berechneten Menge 0,1 n-Bromwasserstoffsäure — und 1,73 g N-Hydroxy-succinimid in 300 cm³ Dimethylformamid werden bei -15° C mit 3,42 g Dicyclohexylcarbodiimid versetzt. Die Reaktionslösung wird 60 Stunden bei 0⁰C und 24 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Das Filtrat vom abgeschiedenen Dicyclohexylharnstoff rührt man in 2000 cm³ Essigester ein; der erhaltene Niederschlag wird abfiltriert und anschließend 2mal aus wenig Methanol/Wasser umgefällt (die gebildete Fällung wird zweckmäßig durch Zentrifugieren abgetrennt). Das so erhaltene Produkt wird letztlich durch dreimaliges Umfallen aus Dimethylformamid/Essigester/Wasser (200:2500:20 cm³) weiter gereinigt: Schmp. 230 bis 232°C (Zers.); («)o : -18,83 ± Γ bzw. (α)&: -20,80° (c = 1; in Dimethylformamid). Chromatogr. rein in Amylalkohol/ Pyridin/Wasser (35:35:30) bzw. tert.-Butanol/Essigsäure/Wasser/Pyridin (60:6:24:20). Ausbeute 24,4 g (70% der Theorie).

C₉₈H₁₅₅N₂₅O₂₄Br₂S₂ + H₂O (2309,49):

Berechnet ..
gefunden ...

C 50,57, H 6,85, N 15,16;

C 50,94, H 6,94, N 14,96.

O 17,32, Br 6,92, S 2,78;

O 17,69, Br 6,36, S 2,79.

Aminosäureanalyse:	Ser	Arg	AIa	GIu	Asp
	1 0,84	2 1,98	1 0,97	2 2,0	2 2,01
Berechnet
gefunden

	Phe	VaI	Leu	Met	Thr	NH,
Berechnet	1 1,02	1 1,03	1 1,04	1 . 1,01	1 0,96	3 3,26
gefunden

10. O-tert.-Butyl-L-seryl-L-arginyl(hydrobromid)-L-arginyl(hydrobromid)-L-alanyl-L-glutaminyl-

L-asparagyl(/Mert.-butylester)-L-phenylalanyl-

L-vaiyl-L-glutaminyl-L-tryptophyl-L-leucyl-

L-methionyl-L-asparaginyl-O-tert.-butyl-

L-threonin-tert.-butylester-hydrobromid (16—29)

11,5 g NPS-Ser(tBu)-Arg(HBr)-Arg(HBr)- AIa-Gln-Asp(OtBu)-Phe-Val-Gln-Tro-Leu-Met-Asn-Thr(tBu)-OtBu (16—29) und 13,1 g 2-Methylindol in 850cm³ Dimethylformamid/Methanol (16:1) werden unter Eiskühlung tropfenweise mit 110 cm³ 0,1 n-methanolischer Bromwasserstoffsäure versetzt. Die Reaktionsmischung wird unter weiterer Eiskühlung 2 Stunden und anschließend 5 Stunden bei Raumtemperatur nachgerührt, anschließend in viel absolutem Diäthyläther eingegossen. Der ausgefallene Niederschlag wird abfiltriert und 2mal aus Dimethylformamid/Methanol/Diäthyläther unter Zusatz von 2-Methylindol umgefällt. Das nunmehr farblose Produkt wird auf das Filter gebracht, mit absolutem Diäthyläther gewaschen und letztlich im Vakuum bei 10"³Torr getrocknet: Schmp. 216 bis 218°C (Zers.); («)?: -34,1 ± Γ bzw. (α)/ί₆: -41,1° (c=l; in 80%iger Essigsäure). Chromatogr. rein in tert.-Butanol/Essigsäure/Wasser/Pyridin (60:6:24:20); Whatman Nr. 1, aufsteigend. Ausbeute 10 g (90% der Theorie).

C₉₂H₁₅₃N₂₄O₂₂Br₃S + 3H₂O (2273,3):

Berechnet ... C 48,61, H 7,05, N 14,79;
gefunden .... C 48,93, H 7,04, N 14,76.

Berechnet ... O 17,60, Br 10,55, S 1,47;
gefunden .... O 17,57, Br 10,51, S 1,46.

Aminosäureanalyse:

	Ser	Arg	AIa	GIu	Asp
Berechnet	1 0,89	2 1,95	1 1,0	2 2,02	2 2,05
gefunden

Fortsetzung

Berechnet ..
gefunden ...

Phe

1,0

VaI

1,01

Leu

1,02

Met

0,94

Thr

0,96

3,15

"5

11. Nu-2-Nitrophenylsulfenyl-O-tert.-butyl-

L-threonyl-O-tert.-butyl-L-seryl-

L-asparagyl(/Mert.-butylester)-O-tert.-butyl-

L-tyrosyl-O-tert.-butyl-L-seryl-Nj-tert.-butyloxy-

carbonyl-L-lysyl-O-tert.-butyl-L-tyrosyl-

L-leucyl-L-asparagyl(/Mert.-butylester)-

O-tert.-butyl-L-seryl-L-arginyl(hydrobromid)-

L-arginyl(hydrobromid)-L-alanyl-L-glutaminyl-

L-asparagyl(/Mert.-butylester)-L-phenylalanyl-

L-valyl-L-glutaminyl-L-tryptophyl-L-leucyl-

L-methionyl-L-asparaginyl-0-tert.-butyl-

L-threonin-tert.-butylester (7—29)

7,32 g H-Ser(tBu)-Arg(HBr)-Arg(HBr)-Ala-Gln-Asp(OtBu) - Phe - VaI - GIn - Trp - Leu - Met - Asn-Thr(tBu)-OtBu-HBr (16—29) und 5,25 g NPS-Thr(tBu) - Ser(tBu) - Asp(OtBu) - Tyr(tBu) - Ser(tBu)-Lys(BOC)-Tyr(tBu)-Leu-Asp(OtBu)-OH (7—15) werden in 150 cm³ Dimethylacetamid unter Erwärmen und Rühren gelöst. Die auf Raumtemperatur abgekühlte Mischung wird nunmehr tropfenweise mit 0,42 cm³ Triethylamin und anschließend mit 0,52 g N-Hydroxysuccinimid, nach Abkühlen auf -10⁰C schließlich mit 0,93 g Dicyclohexylcarbodiimid unter Rühren versetzt. Das Reaktionsgemisch wird 60 Stunden bei 0⁰C und weitere 40 Stunden bei Raumtemperatur unter Magnetrührung gehalten, anschließend im Vakuum bei 10~² Torr zu einem zähen Brei eingedampft. Das nach Verrühren mit bidestilliertem Wasser erhaltene feste Material wird abfiltriert, in wenig Dimethylacetamid suspendiert und erneut mit bidestilliertem Wasser ausgefällt. Das nach sorgfältigem Waschen mit Wasser trockengesaugte Produkt wird anschließend mehrfach mit heißem Essigester digeriert, auf das Filter gebracht und mit Essigester und Diäthyläther nachgewaschen. Das so erhaltene Rohprodukt wird zur Entfernung von nicht umgesetzter Kopfkomponente (7—15) 18 Stunden mit absolutem Tetrahydrofuran und anschließend etwa 9 Stunden mit absolutem Methanol im Soxhlet extrahiert. Das so gereinigte Material wird mit Diäthyläther auf das Filter gebracht und anschließend bei 8O⁰C und I0"³ Torr 24 Stunden über P₂O₅ getrocknet: F. = ab 25O°C allmähliche Zersetzung, chromatogr. rein in tert.-Butanol/Eisessig/Wasser/Pyridin (60:6:24:20) bzw. in Amylalkohol/Pyridin/ Wasser (35:35:30). Ausbeute 7,85 g(68% der Theorie).

Berechnet
gefunden .

C 55,73, H 7,50, N 12,70;

C 55,64, H 7,44, N 12,69.

O 18,25, Br 4,14, S 1,66;

O 18,67, Br 3,78, S 1,67.

Aminosäureanalyse:

	Thr	Ser	Asp	Tyr
Berechnet .... gefunden	2 1,92	3 2,73	4 4,15	2 1.95

	Lys	Leu	Arg	AIa
Berechnet .... gefunden	I 0,94	2 2,03	2 1,97	I 1,0

	GIu	Phe	VaI	Met	NHj
IO Berechnet .	2 2.01	1 1,04	1 1,03	1 1,02	3 3.09
gefunden

12. O-tert.-Butyl-L-threonyl-0-tert.-butyl-

L-seryl-L.-asparagyl(/Mert.-butylester)-

O-tert-butyl-L-tyrosyl-O-tert.-butyl-L-seryl-

Nj-tert.-butyloxycarbonyl-L-lysyl-O-tert.-butyl-

L-tyrosyl-L-leucyl-L-asparagylf/Mert.-butylester)-

O-tert.-butyl-L-seryl-L-arginyl(hydrobromid)-

L-arginyl(hydrobromid)-L-alanyl-L-glutaminyl-

L-asparagyl(/Mert.-butylester)-L-phenylalanyl-

L-valyl-L-glutaminyl-L-tryptophyl-L-leucyl-

L-methionyl-L-asparaginyl-O-tert.-butyl-

L-threonin-tert.-butylester-hydrobromid

(7—29-Hydrobromid)

3.85 g NPS - Thr(tBu) - Ser(tBu) - Asp(OtBu)-Tyr(tBu) - Ser(tBu) - Lys(BOC) - Tyr(tBu) - Leu-Asp(OtBu)-Ser(tBu)-Arg(HBr)-Arg(HBr)-AIa-GIn-Asp(OtBu) - Phe - VaI - GIn - Trp - Leu - Met - Asn-Thr(tBu)-OtBu (7—29) und 13 g 2-Methylindol werden in etwa 500 cm³ Dimethylacetamid unter Rühren gelöst, die Mischung nach Abkühlen auf 0⁰C mit 100 cm³ eiskaltem Methanol und unter Rühren und Eiskühlung anschließend mit 2,2 cm³ 1 n-methanolischer Bromwasserstoffsäure, verdünnt mit 100 cm³ Methanol, tropfenweise versetzt. Nach 3stündigem Rühren bei 0°C und 22 Stunden bei Raumtemperatur destilliert man das Methanol im Vakuum bei 15° C Badtemperatur ab. Anschließend rührt man die verbleibende Lösung in 2800 cm³ absolutem Diäthyläther/Petroläther (25:10) ein; die gebildete Fällung wird nach mehrstündigem Stehen im Kühlschrank abfiltriert und anschließend zweimal aus Dimethylacetamid/Diäthyläther umgefällt. Nach Trocknen bei 8O⁰C und 10~³ Torr über P₂O₅: F. = ab 220⁰C allmähliche Zersetzung; («)?': +15,27 ±2° bzw. (.,)//,: + 17,36° (c = 0,6; in Dimethylacetamid/Phosphorsäure-tris-dimethylamid (9:1)). Chromatogr. rein in tert.-Butanol/Eisessig/Wasser/Pyridin (60:6:24: 20) bzw. Amylalkohol/Pyridin/Wasser (35:35:30). Ausbeute 3,4 g = 88% der Theorie.

55	Ci₇₃H₂₈₅N₃₄O₄₂	Br₃	S + 2H₂O (3821,22):	H 7,62,	N 12,58
	Berechnet ...	C	54,37,	H 7,69,	N 12,39
	gefunden	C	54,52,	Br 6,33,	S 0,85;
	Berechnet ...	O	18,43,	Br 6,28,	S 0,99.
60	gefunden	O	18,65,

Aminosäureanalyse:

	Thr	Ser	Asp	Tyr
Berechnet .... gefunden	2 1,86	3 2,72	4 3,94	■> 1,87

509507/399

Fortsetzung

	Lys	Leu	Arg	AIa
Berechnet .... gefunden	1 0,98	2 2,03	2 1,95	1 1,0

	GIu	Phe	VaI	Met	NH₃
5 Berechnet	2 1,94	1 1,03	1 1,03	1 0,97	3 3,63
gefunden

Claims

Patentansprüche:

1. Glucagon-derivat der Formel III

AdOC-HisiAdOQ-SerdBul-Gln-Gly-ThrdBut-Phe-ThritBul-SerdBu)-

I 2 3 4 5 6 7 8

AspiOtBu^TyrftBuJ-SeritBut-LysiBOCi-TyrdBut-Leu-AspiOtBul-SerdBul-Arg-Arg-Ala-Gln-AspiOtBu)-

9 10 Il 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21