DE2615229A1 - Verfahren zur herstellung und reinigung von sekretin - Google Patents

Verfahren zur herstellung und reinigung von sekretin

Info

Publication number
DE2615229A1
DE2615229A1 DE19762615229 DE2615229A DE2615229A1 DE 2615229 A1 DE2615229 A1 DE 2615229A1 DE 19762615229 DE19762615229 DE 19762615229 DE 2615229 A DE2615229 A DE 2615229A DE 2615229 A1 DE2615229 A1 DE 2615229A1
Authority
DE
Germany
Prior art keywords
leu
arg
ser
obu
secretin
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
DE19762615229
Other languages
English (en)
Other versions
DE2615229C2 (de
Inventor
Rolf Dipl Chem Dr Geiger
Wolfgang Dipl Chem Dr Koenig
Rainer Dipl Chem Dr Obermeier
Volker Dipl Chem Dr Teetz
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Hoechst AG
Original Assignee
Hoechst AG
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Hoechst AG filed Critical Hoechst AG
Priority to DE2615229A priority Critical patent/DE2615229C2/de
Priority to NL7703576A priority patent/NL7703576A/xx
Priority to IT22136/77A priority patent/IT1083868B/it
Priority to CH427777A priority patent/CH640510A5/de
Priority to US05/785,181 priority patent/US4098779A/en
Priority to IL51831A priority patent/IL51831A/xx
Priority to DK154077A priority patent/DK149045C/da
Priority to AT244777A priority patent/AT353991B/de
Priority to SE7704110A priority patent/SE430060B/xx
Priority to GB29965/79A priority patent/GB1581367A/en
Priority to CA276,027A priority patent/CA1090783A/en
Priority to GB14824/77A priority patent/GB1581366A/en
Priority to FR7710762A priority patent/FR2347337A1/fr
Priority to BE176577A priority patent/BE853431A/xx
Priority to JP3962777A priority patent/JPS52125165A/ja
Publication of DE2615229A1 publication Critical patent/DE2615229A1/de
Priority to AT271079A priority patent/AT366364B/de
Priority to IL58616A priority patent/IL58616A0/xx
Priority to DK401983A priority patent/DK149632C/da
Application granted granted Critical
Publication of DE2615229C2 publication Critical patent/DE2615229C2/de
Expired legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/575—Hormones
    • C07K14/645—Secretins

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Description

Sekretin, ein Hormon aus dem Duodenum, ist ein Heptacosipeptid der Formel
H-His-Ser-Asp-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Glu-Leu-Ser-Arg-Leu-Arg-Asp-Ser-Ala-Arg-Leu-Gln-Arg-Leu-Leu-Gln-Gly-Leu-Val-NH[tief]2.
Es stimuliert die Bicarbonatproduktion der Bauchspeicheldrüse und wird zur Pankreasfunktionsprüfung klinisch verwendet.
Bisher wurde Sekretin durch Gegenstromverteilung (J. Am. Chem. Soc. 89, 6753 (1967)) und Ionenaustauschchromatographie an SP-Sephadex C 25 (Chem. Ber. 105 (1972), Seite 2515) gereinigt. Bei der aufwendigen Gegenstromverteilung werden die sekretinhaltigen Proben anschließend mit einem sauren Austauscher ("algenic acid") verrührt und abgesaugt. Das dabei absorbierte Sekretin wird mit 0, 2 n HCl eluiert und an einem schwach basischen Austauscher die Salzsäure durch Essigsäure ausgetauscht. Es sind somit nach der Gegenstromverteilung noch zwei Ionenaustauschchromatographien für die Aufarbeitung erforderlich.
Bei der Reinigung über Ionenaustauschchromatographie an SP-Sephadex C 25 wird Sekretin-acetat, das aus Rohsekretin durch Behandeln mit einem schwach basischen Ionenaustauscher (in Acetatform) gewonnen wird, mit Ammoniumcarbonatpuffern von steigender Molarität und speziellen pH-Werten eluiert. Die Elution dauert relativ lange und die resultierenden Eluate enthalten neben Sekretin auch Ammoniumcarbonat, das durch Ansäuern mit Essigsäure in Ammoniumacetat überführt und durch mehrfache Gefriertrocknung entfernt werden muß.
Da aber Sekretin in wässrigen Lösungen stetig an biologischer Aktivität verliert, können mit den beiden vorbekannten zeitaufwendigen Reinigungsmethoden nur kleine Mengen hochwirksames Sekretin gewonnen werden, denn bei größeren Mengen wird die Verweilzeit zu lange und damit auch der Aktivitätsverlust zu groß.
Es wurde nun überraschenderweise gefunden, dass sich Sekretin als Hydrochlorid oder Hydrobromid durch Chromatographie an einem alkylierten Dextrangel reinigen lässt, wenn mit Wasser oder stark verdünnter Chlor- oder Bromwasserstoffsäure eluiert wird. Vorzugsweise nimmt man zur Elution 0,001 - 0,005 n Salzsäure oder Bromwasserstoffsäure, da in diesen Lösungen die biologische Aktivität des Sekretins nicht so schnell abnimmt wie in reinem Wasser.
Der Vorteil dieser Methode liegt darin, dass nur eine einzige einfache Reinigungsoperation notwendig ist und das Sekretin durch eine einmalige Gefriertrocknung salzfrei erhalten werden kann. Das saure Elutionsmittel kann man auch mit Aminosäuren, wie z.B.
Cystein, Alanin oder Glycin abpuffern. Selbst in diesen abgepufferten Lösungsmitteln hält sich die biologische Aktivität des Sekretins besser als in reinem Wasser. Das so gewonnene Sekretin ist jedoch mit der zugesetzten Aminosäure kontaminiert, was aber für Zubereitungsformen möglicherweise auch erwünscht sein kann.
Sekretin wurde bereits nach verschiedenen Methoden hergestellt (J. Amer. Chem. Soc. 89 (1967), Seite 6753; J. Amer. Chem. Soc. 90 (1968), Seite 4711; Chem. Ber. 105 (1072), Seite 2508; Chem. Ber. 107 (1974), Seite 215). Diese bekannten Methoden sind jedoch nicht gut dazu geeignet größere Mengen Sekretin herzustellen, da z.B. unzureichende Löslichkeit von Fragmenten die Reaktionsgeschwindigkeit bei der Peptidkupplung verzögert.
Gegenstand der Erfindung ist daher weiterhin ein Verfahren zur Herstellung von Sekretin durch Kondensation von
Z-Thr (Bu[hoch]t) -Ser (Bu[hoch]t) -Glu(OBu[hoch]t) -Leu-Ser (Bu[hoch]t) -Arg-Leu-Oh (I)
mit
H-Arg-Asp (OBu[hoch]t) -Ser (Bu[hoch]t) - Ala-Arg-Leu-Gln-Arg-Leu-Leu-Gln-Gly-Leu-Val-NH[tief]2 (II)
katalytische Hydrierung des erhaltenen Peptids
Z-Thr (Bu[hoch]t) -Ser (Bu[hoch]t) -Glu (OBu[hoch]t) -Leu-Ser (Bu[hoch]t) -Arg-Leu-Arg-Asp (OBu[hoch]t) -Ser (Bu[hoch]t) -Ala-Arg-Leu-Gln-Arg-Leu-Leu-Gln-Gly-Leu-Val-NH[tief]2 (III)
mit Palladium-Katalysator und anschließender Kondensation des erhaltenen Peptids
H-Thr (Bu[hoch]t) -Ser (Bu[hoch]t) -Glu (OBu[hoch]t) -Leu-Ser (Bu[hoch]t) -Arg-Leu-Arg-Asp (OBu[hoch]t) -Ser (Bu[hoch]t) -Ala-Arg-Leu-Gln-Arg-Leu-Leu-Gln-Gly-Leu-Val-NH[tief]2 (IV)
mit
Boc-His-Ser (Bu[hoch]t) -Asp (Obu[hoch]t) -Gly-Thr (Bu[hoch]t) -Phe-OH (V)
und Abspaltung der Schutzgruppen mit Trifluoressigsäure, das dadurch gekennzeichnet ist, dass man bei den Kondensationen die Peptidbruchstücke I und V in einem Gemisch aus Dimethylformamid und Dimethylacetamid mit 3-Hydroxy-4-oxo-3,4-dihydro-1,2,3-benzotriazin und Dicyclohexylcarbodiimid voraktiviert, wobei bei I die Gegenwart von Pyridinhydrobromid erforderlich ist, das aus I mit II erhaltene Peptid III durch Behandeln in Methanol reinigt, die katalytische Hydrierung von III in 80 bis 90 %igem wässrigem Trifluoräthanol durchführt, bei der Kondensation von IV mit V das Peptid IV in Dimethylformamid/Dimethylacetamid-Mischung vorlöst und die Abspaltung der Schutzgruppen in Gegenwart von 5 bis 20 %iger 2 - 6 n HCl oder HBr und/oder Cysteinhydrochlorid durchführt und das so erhaltene Sekretinhydrochlorid wie oben erfindungsgemäß reinigt.
Bei der Verknüpfung von I mit II wurde bis jetzt die Dicyclohexylcarbodiimid/1-Hydroxybenzotriazol (DCC/HOBt) -Methode benutzt (Chem. Ber. 107 (1974), Seite 215). Die extreme Schwerlöslichkeit der Carboxylkomponente bereitet jedoch erhebliche Schwierigkeiten. Für einen 7.7 mMol-Ansatz benötigt man 400 ml Dimethylformamid (DMF) als Lösungsmittel. Durch die große Verdünnung nimmt die Reaktionsgeschwindigkeit stark ab und man benötigt eine lange Reaktionszeit (2 Tage).
Es wurde nun überraschenderweise gefunden, dass sich die schwerlösliche Carboxylkomponente I in Gegenwart von Pyridin-hydrobromid und 3-Hydroxy-4-oxo-3,4-dihydro-benzotriazin (HOOBt) in einem Gemisch von DMF und Dimethylacetamid (DMA) gut löst. Läßt man eine der Komponenten weg, wird die Löslichkeit herabgesetzt. Dieses Verhalten ist für eine Voraktivierung des schwerlöslichen Heptapeptids mittels DCC/HOOBt ideal. Das Pyridinhydrobromid dient zur Protonierung der freien Guanidinogruppe des Arginins. Zur Lösung von 10 mMol Carboxylkomponente I werden so nur 50 ml DMF und 50 ml DMA benötigt. Die Voraktivierung benötigt 2 Stun- den. Die Aminokomponente II (10 mMol) wird ebenfalls in einem Gemisch von 50 ml DMF und 50 ml DMA gelöst. Nach zwei Stunden Kupplungszeit wird aufgearbeitet. Der Gesamtlösungsmittelverbrauch ist also 200 ml/10 mMol und die Gesamtreaktionszeit 4 Stunden.
Auch bei der letzten Kupplung, nämlich der Knüpfung von V mit IV zu Boc-His-Ser (Bu[hoch]t) -Asp (OBu[hoch]t) -Gly-Thr (Bu[hoch]t) -Phe-Thr (Bu[hoch]t) -Ser (Bu[hoch]t) -Glu (OBu[hoch]t) -Leu-Ser (Bu[hoch]t) -Arg-Leu-Arg-Asp (OBu[hoch]t) -Ser (Bu[hoch]t) -Ala-Arg-Leu-Gln-Arg-Leu-Leu-Gln-Gly-Leu-Val-NH[tief]2 ist die Voraktivierung der Carboxylkomponente mit DCC/HOOBt dem Eintopfverfahren mit DCC/HOBt (Chem. Ber. 107 (1974) Seite 215) überlegen, wobei wiederum eine Mischung von DMF und DMA als Lösungsmittel für die Aminokomponente benutzt wird. Die Reaktionszeit wird hier von 36 auf 6 Stunden verkürzt.
Das durch Kondensation von I mit II erhaltene Peptid III wurde bisher durch Auskochen mit Essigester (Chem. Ber. 107, (1974), Seite 215) oder durch Umfallen aus Methanol/Essigester (Chem. Ber. 105 (1972) Seite 2508) gereinigt. Diese Reinigungsoperationen haben verständlicherweise bei den schwer löslichen Ausgangssubstanzen keinen großen Reinigungseffekt. Überraschenderweise wurde gefunden, dass sich das Material mit Methanol auskochen lässt wobei ein starker Reinigungseffekt erzielt wird, was im Gegensatz zu der letztgenannten Literatur (Chem. Ber. 105, (1972) 2508) steht, wonach das Peptid in Methanol löslich ist.
Die katalytische Hydrierung von III zu IV wurde bisher in einer Mischung aus Methanol und DMA (143 ml/g, vgl. Chem. Ber. 107, 215) oder in 80 %iger Essigsäure (269 ml/g, Chem. Ber. 105, 2508) vorgenommen. Als besonders geeignetes Lösungsmittel für die katalytische Hydrierung erwies sich nun 80 - 90 %iges 2.2.2-Trifluoräthanol (11 ml/g). Dieses Lösungsmittel hat gegenüber Essigsäure den Vorteil, dass keine
<NichtLesbar>
stattfinden kann. In der Mischung Methanol/DMA war das mit Methanol gereinigte Produkt III praktisch nicht löslich.
Nach der katalytischen Hydrierung lässt sich das entstandene 5HBr[hoch].H-Thr (Bu[hoch]t -Ser (Bu[hoch]t) -Glu (OBu[hoch]t) -Leu-Ser (Bu[hoch]t) -Arg-Leu-Arg-Asp (OBu[hoch]t) -Ser (Bu[hoch]t) -Ala-Arg-Leu-Gln-Arg-Leu-Leu-Gln-Gly-Leu-Val-NH[tief]2 (IV) wieder durch Auskochen mit Methanol gut reinigen, obwohl nach Chem. Ber. 105 (1972), Seite 2508 das Produkt als methanollöslich beschrieben wird.
Das so hergestellte geschützte Sekretin kann wie üblich mit Trifluoressigsäure behandelt werden, wobei die Schutzgruppen des tert.-Butyl-typs abgespalten werden.
Vorteilhafter erwies sich jedoch die Abspaltung der Schutzgruppen in Trifluoressigsäure, welcher 5 - 20 % 2 - 6 n wässrige Salzsäure und/oder Cysteinhydrochlorid zugesetzt ist. Bei diesem Verfahren erhält man ein Rohsekretin mit höherer Aktivität, das sich nach dem erfindungsgemäßen Reinigungsverfahren durch Chromatographie an einem alkylierten Dextrangel leicht reinigen lässt.
Sekretin wird als Diagnostikum für die Überprüfung der exkretorischen Pankreasfunktionen und als Therapeuticum bei Ulcus duodeni verwendet.
Beispiel
Z-Thr- (Bu[hoch]t) Ser (Bu[hoch]t) -Glu (OBu[hoch]t) -Leu-Ser (Bu[hoch]t) -Arg-Leu-Arg-Asp (OBu[hoch]t) -Ser (Bu[hoch]t) -Ala-Arg-Leu-Gln-Arg-Leu-Leu-Gln-Gly-Leu-Val-NH[tief]2
Zu einer Lösung von 12 g Z-Thr (Bu[hoch]t) -Ser (Bu[hoch]t) -Glu (OBu[hoch]t) -Leu-Ser (Bu[hoch]t) -Arg-Leu-OH.2 H[tief]2O, 1,6 g Pyridin-hydrobromid und 1.63 g 3-Hydroxy-4-oxo-3.4-dihydro-1.2.3-benzotriazin in einer Mischung aus 50 ml Dimethylformamid und 50 ml Dimethylacetamid gibt man 8.4 g Dicyclohexylcarbodiimid und rührt zwei Stunden bei Raumtemperatur. Inzwischen werden 18.8 g H-Arg-Asp (OBu[hoch]t) -Ser (Bu[hoch]t) -Ala-Arg-Leu-Gln-Arg-Leu-Leu-Gln-Gly-Leu-Val-NH[tief]2.4 HBr und 5.2 ml N-Äthylmorpholin in einer Mischung von 50 ml Dimethylformamid und 50 ml Dimethylacetamid gelöst. In diese Lösung wird der Voraktivierungsansatz einfiltriert. Man rührt nun noch zwei Stunden bei Raumtemperatur nach und rührt in 3 Liter Essigester ein. Der ausgefallene Niederschlag wird abgesaugt, mit Essigester einmal aufgekocht und wieder abgesaugt. Zur weiteren Reinigung wird nun ein mal mit 200 ml Methanol aufgekocht und abgesaugt. Nun wird noch einmal mit Essigester verrührt, aufgekocht, abgekühlt, abgesaugt und getrocknet.
Ausb. 23.1 g, Schmp.: 262-265°C [kleines Alpha][hoch]20[tief]D = - 22.4° (c= 1, in 80-proz. Essigsäure)
H-Thr- (Bu[hoch]t) -Ser (Bu[hoch]t) -Glu (OBu[hoch]t) -Leu-Ser (Bu[hoch]t) -Arg-Leu-Arg-Asp (OBu[hoch]t) -Ser (Bu[hoch]t) -Ala-Arg-Leu-Gln-Arg-Leu-Leu-Gln-Gly-Leu-Val-NH[tief]2[hoch].5 HBr
6 g Z-Thr (Bu[hoch]t) -Ser (Bu[hoch]t) -Glu (OBu[hoch]t) -Leu-Ser (Bu[hoch]t) -Arg-Leu-Arg-Asp (OBu[hoch]t) -Ser (Bu[hoch]t) -Ala-Arg-Leu-Gln-Arg-Leu-Leu-GlnGly-Leu-Val- NH[tief]2 und 300 mg Pyridinhydrochlorid werden in 70 ml 80-proz. Trifluoräthanol gelöst. Man versetzt mit etwas Pd/Kohle-Katalysator und leitet Wasserstoff durch. Nach beendigter Hydrierung (kein Co[tief]2 im Abgas) wird der Katalysator abgesaugt und das Trifluoräthanol abdestilliert. Der Rückstand wird mit Essigester verrieben und abgesaugt. Zur weiteren Reinigung wird mit Methanol aufgekocht. Man lässt auf Raumtemperatur kommen und saugt ab. An- schließend wird noch einmal mit Essigester aufgekocht, gekühlt und abgesaugt. Ausb. 4.58 g, [kleines Alpha] [hoch]20[tief]D = -26.1° (c= 1, in 80-proz. Essigsäure)
Boc-His-Ser (Bu[hoch]t) -Asp (OBu[hoch]t) -Gly-Thr (Bu[hoch]t) -Phe-Thr (Bu[hoch]t) -Ser (Bu[hoch]t) Glu (OBu[hoch]t -Leu-Ser (Bu[hoch]t) -Arg-Leu-Arg-Asp (OBu[hoch]t) -Ser (Bu[hoch]t) -Ala-Arg-Leu-Gln-Arg-Leu-Leu-Gln-Gly-Leu-Val-NH[tief]2
Zu einer Lösung von 4.24 g Boc-His-Ser (Bu[hoch]t) -Asp (OBu[hoch]t) -Gly-Thr (Bu[hoch]t) -Phe-OH und 709 mg 3-Hydroxy-4-oxo-3.4-dihydro-1.2.3-benzotriazin in 17 ml Dimethylacetamid gibt man bei 0°C 2.87 g DCCI. Man rührt eine Stunde bei 0°C und eine Stunde bei Raumtemperatur. Inzwischen löst man 13.7 g H-Thr (Bu[hoch]t) -Ser (Bu[hoch]t) -Glu (OBu[hoch]t) -Leu-Ser (Bu[hoch]t) -Arg-Leu-Arg-Asp (OBu[hoch]t) -Ser (Bu[hoch]t) -Ala-Arg-Leu-Gln-Arg-Leu-Leu-Gln-Gly-Leu-Val-NH[tief]2.5HBr in einer Mischung aus 87 ml Dimethylformamid und 87 ml Dimethylacetamid zu einer gallertigen Masse. Zu dieser gallertigen Lösung gibt man 1.13 ml N-Äthylmorpholin, verdünnt mit 22 ml Dimethylacetamid und saugt den Voraktivierungsansatz dazu. Man rührt nun zwei Stunden bei Raumtemperatur. Inzwischen wird wie oben noch ein Voraktivierungsansatz bereitet, der dann wieder in den Reaktionsansatz einfiltriert wird. Man lässt nun nochmals zwei Stunden bei Raumtemperatur rühren und verrührt dann die gallertige Lösung mit 1740 ml heißen Essigester. Man lässt auf Raumtemperatur abkühlen und saugt den Niederschlag ab. Der Niederschlag wird noch einmal mit Essigester aufgekocht, abgesaugt und getrocknet. Ausbeute 17 g
Rohsekretin und Sekretinreinigung
a) 1.5 g geschütztes Sekretin und 150 mg Cysteinhydrochlorid werden in einer Mischung von 15 ml Trifluoressigsäure und 1.5 ml 4n HCl gelöst. Man lässt 30 Minuten bei Raumtemperatur stehen, engt ein, löst in Wasser und gefriertrocknet die Lösung. Ausb. 1.69 g
1.69 g Rohsekretin werden in ca 10 ml 0.001 n
<NichtLesbar>
gelöst und an einer Sephadex LH 20-Säule (200 x 4 cm) chromatographiert. Eluiert wird mit 0,001 n
<NichtLesbar>
Es werden Fraktionen zu 300 Tropfen aufgefangen. Die guten Sekretinfraktionen sind im absteigenden Ast des ersten peaks enthalten (etwa 32.-37. Fraktion). Die sekretinhaltigen Fraktionen werden vereinigt und gefriergetrocknet. Ausb. ca 400 mg. In den nachfolgenden Fraktionen können noch etwa 80 mg leicht verunreinigtes Sekretin gewonnen werden. Die Hauptfraktion zu 400 mg hatte lt. Aminosäureanalyse einen Peptidgehalt von 65 % und eine biologische Aktivität von 2600 E/mg; das entspricht einer Aktivität von 4000 E/mg Peptidbase.
Ausbeute bezogen auf geschütztes Sekretin: 22 %. Neben Salzen und Wasser enthält das so isolierte Sekretin noch etwa 5 % Cysteinhydrochlorid.
Aminosäureanalyse: Asp (2.0), Thr (1.9), Ser (3.1), Glu (3.0), Gly (2.0), Ala (1.1), Cys (0.7), Val (1.1), Leu (6.0), Phe (1.0), His (1.0), Arg (3.9)
b) 1.5 g geschütztes Sekretin werden in einer Mischung von 15 ml Trifluoressigsäure und 1.5 ml 4n HCl gelöst. Man lässt 30 Minuten bei Raumtemperatur stehen, engt ein, löst in Wasser und gefriertrocknet die Lösung. Aus. 1.328 g.
Die oben gewonnenen 1.328 g Rohsekretin werden in ca. 10 ml 0.005 n HCl gelöst und an einer sephadex
<NichtLesbar>
20-Säule (200 x 4 cm) chromatographiert. Eluiert wird mit 0.005 n HCl. Es werden Fraktionen zu 300 Tropfen aufgefangen. Die guten Sekretinfraktionen sind im aufsteigenden Ast des zweiten peaks enthalten (etwa 34 - 39. Fraktion). Die Fraktionen werden vereinigt und gefriergetrocknet. Ausb. 419 mg. In den nachfolgenden Fraktionen können weitere 296.5 mg verunreinigtes Sekretin gewonnen werden. Die Hauptfraktion zu 419 mg hatte lt. Aminosäureanalyse einen Peptidgehalt von 70 % und eine biologische Aktivität von 2600 - 2700 E/mg. Die Aminosäureanalyse entspricht der von Versuch a, enthält aber kein Cystein.

Claims (3)

1. Verfahren zur Reinigung von Sekretin, dadurch gekennzeichnet, dass man Sekretin-hydrochlorid oder -hydrobromid an einem alkylierten Dextrangel mit Wasser verdünnter wässriger Salzsäure oder Bromwasserstoffsäure als Elutionsmittel reinigt.
2. Verfahren nach Anspruch 1 dadurch gekennzeichnet, dass man die HCl- bzw. HBr-Lösungen mit bis zu äquimolaren Mengen Aminosäuren abpuffert.
3. Verfahren zur Herstellung von Sekretin durch Kondensation von
Z-Thr (Bu[hoch]t) -Ser (Bu[hoch]t) -Glu (OBu[hoch]t) -Leu-Ser (Bu[hoch]t) -Arg-Leu-OH (I)
mit
H-Arg-Asp (OBu[hoch]t) -Ser (Bu[hoch]t) -Ala-Arg-Leu-Gln-Arg-Leu-Leu-Gln-Gly-Leu-Val-NH[tief]2, (II)
katalytische Hydrierung des erhaltenen Peptids
Z-Thr (Bu[hoch]t) -Ser (Bu[hoch]t) -Glu (OBu[hoch]t) -Leu-Ser (Bu[hoch]t) -Arg-Leu-Arg-Asp (OBu[hoch]t) -Ser (Bu[hoch]t) -Ala-Arg-Leu-Gln-Arg-Leu-Leu-Gln-Gly-Leu-Val-NH[tief]2 (III)
mit Palladium-Katalysator, anschließender Kondensation des erhaltenen Peptids
H-Thr (Bu[hoch]t) -Ser (Bu[hoch]t) -Glu (OBu[hoch]t) -Leu-Ser (Bu[hoch]t) -Arg-Leu-Arg-Asp (OBu[hoch]t) -Ser (Bu[hoch]t) -Ala-Arg-Leu-Gln-Arg-Leu-Leu-Gln-Gly-Leu-Val-NH[tief]2 (IV)
mit
Boc-His-Ser (Bu[hoch]t) -Asp (OBu[hoch]t) Gly-Thr- (Bu[hoch]t) -Phe-OH (V)
durch Abspaltung der Schutzgruppen mit Trifluoressigsäure, da- durch gekennzeichnet, dass man bei den Kondensationen die Peptidbruchstücke I und V in einem Gemisch aus Dimethylformamid und Dimethylacetamid mit 3-Hydroxy-4-oxo-3,4-dihydro-1,2,3-benzotriazin und Dicyclohexylcarbodiimid voraktiviert, wobei bei I die Gegenwart von Pyridinhydrobromid erforderlich ist, das aus I mit II erhaltene Peptid III durch Behandeln in Methanol reinigt, die katalytische Hydrierung von III in 80 bis 90 %igem wässrigem Trifluoräthanol durchführt, bei der Kondensation von IV mit V das Peptid IV in Dimethylformamid/Dimethylacetamid-Mischung vorlöst und die Abspaltung der Schutzgruppen in Gegenwart von 5 bis 26 %iger 2 - 6 n HCl oder HBr und/oder Cysteinhydrochlorid durchführt und das so erhaltene Sekretinhydrochlorid gemäß Anspruch 1 reinigt.
DE2615229A 1976-04-08 1976-04-08 Verfahren zur Herstellung und Reinigung von Sekretin Expired DE2615229C2 (de)

Priority Applications (18)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE2615229A DE2615229C2 (de) 1976-04-08 1976-04-08 Verfahren zur Herstellung und Reinigung von Sekretin
NL7703576A NL7703576A (nl) 1976-04-08 1977-04-01 Werkwijze voor het bereiden en zuiveren van secretine.
IT22136/77A IT1083868B (it) 1976-04-08 1977-04-05 Processo per la preparazione e la purificazione di secretina
CH427777A CH640510A5 (de) 1976-04-08 1977-04-05 Verfahren zur herstellung und reinigung von sekretin.
IL51831A IL51831A (en) 1976-04-08 1977-04-06 Process for the purification of secretin
DK154077A DK149045C (da) 1976-04-08 1977-04-06 Fremgangsmaade til rensning af sekretin
US05/785,181 US4098779A (en) 1976-04-08 1977-04-06 Process for the purification and manufacture of secretin
GB29965/79A GB1581367A (en) 1976-04-08 1977-04-07 Secretin its production and purification
AT244777A AT353991B (de) 1976-04-08 1977-04-07 Verfahren zur reinigung von sekretin
CA276,027A CA1090783A (en) 1976-04-08 1977-04-07 Process for the purification and manufacture of secretin
GB14824/77A GB1581366A (en) 1976-04-08 1977-04-07 Secretin its purification
SE7704110A SE430060B (sv) 1976-04-08 1977-04-07 Forfarande for kromatografisk rening av sekretin
BE176577A BE853431A (fr) 1976-04-08 1977-04-08 Procede de preparation et de purification de la secretine
FR7710762A FR2347337A1 (fr) 1976-04-08 1977-04-08 Procede de preparation et de purification de la secretine
JP3962777A JPS52125165A (en) 1976-04-08 1977-04-08 Preparation of secretin and purification thereof
AT271079A AT366364B (de) 1976-04-08 1979-04-11 Verfahren zur herstellung von sekretin
IL58616A IL58616A0 (en) 1976-04-08 1979-11-02 Process for the production of secretin
DK401983A DK149632C (da) 1976-04-08 1983-09-02 Fremgangsmaade til fremstilling af sekretin

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE2615229A DE2615229C2 (de) 1976-04-08 1976-04-08 Verfahren zur Herstellung und Reinigung von Sekretin

Publications (2)

Publication Number Publication Date
DE2615229A1 true DE2615229A1 (de) 1977-12-29
DE2615229C2 DE2615229C2 (de) 1984-05-24

Family

ID=5974787

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
DE2615229A Expired DE2615229C2 (de) 1976-04-08 1976-04-08 Verfahren zur Herstellung und Reinigung von Sekretin

Country Status (14)

Country Link
US (1) US4098779A (de)
JP (1) JPS52125165A (de)
AT (1) AT353991B (de)
BE (1) BE853431A (de)
CA (1) CA1090783A (de)
CH (1) CH640510A5 (de)
DE (1) DE2615229C2 (de)
DK (1) DK149045C (de)
FR (1) FR2347337A1 (de)
GB (2) GB1581367A (de)
IL (2) IL51831A (de)
IT (1) IT1083868B (de)
NL (1) NL7703576A (de)
SE (1) SE430060B (de)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4593244A (en) * 1982-08-06 1986-06-03 Australian Wire Industries Pty. Ltd. Determination of the thickness of a coating on a highly elongated article

Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE2758578A1 (de) * 1977-12-29 1979-07-05 Hoechst Ag Stabile sekretinzubereitung, verfahren zu ihrer herstellung und ihre verwendung
DE3066483D1 (en) * 1979-06-13 1984-03-15 Hoechst Ag Pharmaceutical compositions based on secretin with enhanced and protracted activity, process for their preparation and dihydroxybenzoyl-l-tyrosine
JPS57200343A (en) * 1981-06-02 1982-12-08 Wakunaga Yakuhin Kk 27-desamidosecretin and its preparation
JPS58134998A (ja) * 1982-02-04 1983-08-11 Wakunaga Yakuhin Kk ２７−デスアミドセクレチンの製造法
JP2002501616A (ja) 1997-05-19 2002-01-15 リプリゲン コーポレーション 自閉的症候群を鑑別診断および治療する際の助けとするための方法
US6197746B1 (en) 1998-05-19 2001-03-06 Repligen Corporation Method of using secretin for treating autism

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Chem. Ber., 105, 1972, S. 2515-22 *
Chem. Ber., 107, 1974, S. 215-231 *
Helv. Chim. Acta, 59, 1976, H. 4, S. 1112-26 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4593244A (en) * 1982-08-06 1986-06-03 Australian Wire Industries Pty. Ltd. Determination of the thickness of a coating on a highly elongated article

Also Published As

Publication number Publication date
ATA244777A (de) 1979-05-15
NL7703576A (nl) 1977-10-11
DK149045C (da) 1986-06-02
GB1581367A (en) 1980-12-10
JPS6112920B2 (de) 1986-04-10
SE7704110L (sv) 1977-10-09
GB1581366A (en) 1980-12-10
IL58616A0 (en) 1980-02-29
IT1083868B (it) 1985-05-25
AT353991B (de) 1979-12-10
BE853431A (fr) 1977-10-10
IL51831A (en) 1980-05-30
IL51831A0 (en) 1977-06-30
FR2347337A1 (fr) 1977-11-04
CA1090783A (en) 1980-12-02
CH640510A5 (de) 1984-01-13
JPS52125165A (en) 1977-10-20
DE2615229C2 (de) 1984-05-24
US4098779A (en) 1978-07-04
FR2347337B1 (de) 1983-11-04
DK154077A (da) 1977-10-09
DK149045B (da) 1985-12-30
SE430060B (sv) 1983-10-17

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP0132770B1 (de) Neue Insulin-Derivate, Verfahren zu deren Herstellung und deren Verwendung sowie pharmazeutische Mittel zur Behandlung des Diabetes mellitus
DE2509783C2 (de) Decapeptidamide und Verfahren zu deren Herstellung
DE2360794C2 (de) Verfahren zur Herstellung von Peptiden
DE2435027C2 (de) Nonapeptidamide und Verfahren zu ihrer Herstellung
DE2540780A1 (de) Verfahren zum herstellen von peptiden mit einer disulfidringstruktur
DE2858718C2 (de)
WO1980002560A1 (en) Process for producing polypeptide alpha -thymosine and derivatives therefrom
EP0025897B1 (de) Neue Peptide und Verfahren zu ihrer Herstellung
EP0056951B1 (de) Verfahren zur Herstellung von Humaninsulin oder dessen Derivaten aus Schweineinsulin oder dessen Derivaten
DE2615229C2 (de) Verfahren zur Herstellung und Reinigung von Sekretin
EP0292729B1 (de) Neue Festphasen-Peptidsynthesemethoden
EP0051205A1 (de) Neues Tridekapeptid, Verfahren zu seiner Herstellung und Verwendung
JPS58140024A (ja) セクレチンの精製方法
DE2718718A1 (de) Somatostatinanaloge und zwischenprodukte hierzu
EP0003028B1 (de) Beta h-Endorphin-Analoge, diese enthaltende Präparate und deren Herstellung
AT366364B (de) Verfahren zur herstellung von sekretin
DE2124451C3 (de) Peptide und ihre Verwendung bei der Bekämpfung von Hochdruck
CH618959A5 (de)
CH640217A5 (en) Polypeptides, their preparation and pharmaceutical preparations
DE1954794B2 (de) Peptide mit adrenocorticotroper wirkung und verfahren zu ihrer herstellung
GUGLIELMI et al. Imidazolnucleoside, III. Nucleoside des 4 (5)-Aminoimidazol-5 (4)-carboxamids
DE1768814A1 (de) Neue Peptide mit ACTH-Wirkung und Verfahren zu ihrer Herstellung
DE1817285A1 (de) Verfahren zur Herstellung von adrenocorticotropem Hormon und dessen Derivaten sowie neue Derivate des adrenocorticotropen Hormons
DE2458135A1 (de) Neue tetradecapeptide, verfahren zu ihrer herstellung und sie enthaltende arzneimittel
CH494740A (de) Verfahren zur Herstellung bisher unbekannter Polypeptide

Legal Events

Date Code Title Description
8110 Request for examination paragraph 44
D2 Grant after examination
8364 No opposition during term of opposition