DE2458135A1 - Neue tetradecapeptide, verfahren zu ihrer herstellung und sie enthaltende arzneimittel - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft das Tetradecapeptid Somatostatin und Derivate davon. Insbesondere betrifft die Erfindung Somatostatin und Derivate davon, deren lineare reduzierte Form, ein Verfahren zur Herstellung der Verbindungen, Zwischenprodukte für das Herstellungsverfahren und die daraus

hergestellten Mittel.

Der Name "Somatostatin" wurde für den Faktor vorgeschlagen, der in Hypothalamusextrakten gefunden -wird und der die Sekretion des Wachstumshormons (Somatotropin) inhibiert. Die Struktur dieses Faktors wurde von P. Brazeau et al.,

609824/1010

2 4 b 8 '! 3 5

M/15

Science, 179, 77 (1973) ermittelt und als die nachfolgende Tetradecapeptidstruktur.beschrieben:

1 .2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 H-Ma-Gly-Cys-Lys-Asn-Phe-Phe-Trp-Lys-Thr-Phe-Thr-Ser-Cys-OH I- ■ _ _ I

Die hier für die verschiedenen Aminosäuren verwendeten Abkürzungen sind . .

AIa: Alanin;

Asn: Asparagin;

Cys: Cystein;

GIy: Glycin;

Lys: Lysin;

Phe: Phenylalanin;

Ser: Serin;

Thr: Threonin und

Trp: Tryptophan.

Die Zahlen beziehen sich auf die Position der Aminosäuren im Tetradecapeptid.

Die Konstitution des Tetradecapeptids Somatostatin wurde durch Synthese bestätigt; vergl. beispielsweise D. Sarantakis und W.A.McKinley, Biochem.Biophys.Res.Comm., 54 234 (1973) und J.Rivier, et al., C.R.Acad.Sci. (Paris), Ser.D, 276, 2737 (1973). Alle in der Struktur des natürlichen Somatostatins eingebauten Aminosäuren gehören der L-Serie an.

Die lineare Form von Somatostatin, die anstelle einer Disulfidbrücke zwei Sulfhydrylgruppen aufweist, wurde kürzlich von J.E.F.Rivier, J.Amer.Chem.Soc., 96, 2986 (1974) herstellt. Er berichtet, daß die lineare Form genauso wirk-

- 2 509824/1010

M/15

sam ist wie Somatostatin, und zwar in bezug auf die Fähigkeit der zwei Verbindungen, die Sekretionsrate des Wachstumshormons durch Hypophysenzellen der Ratte in Monolayer-Gewebekulturen zu inhibieren.

Die wichtige physiologische Aktivität von Somatostatin macht sie zu einer bedeutsamen Verbindung■für die klinische Pharmakologie bezüglich der■Behandlung von Akromegalie und der Lenkung juveniler Diabetes. Vergl. z.B. K.Lundbaek et al., Lancet, 2, 131 (1970) und R. Guillemin in "Chemistry and Biology of Peptides", J.Meienhofer, Ed., 3rd American Peptide Symposium, Boston 1972, Ann Arbor Science Publications, Ann Arbor, Mich., 1972. Wie es jedoch bei vielen natürlich auftretenden Verbindungen tierischer Herkunft der Fall ist, ist die Isolierung und Reinigung dieses Tetradecapeptids aus natürlichen Quellen außerordentlich mühsam und teuer. Daher besteht ein Bedürfnis für eine ausführbare Synthese für dieses Tetradecapeptid, die dieses Material für medizinische Anwendungen liefert. Bislang gehörten zu Versuchen in dieser Richtung die Synthese dieses Materials durch Festphasentechniken; vergl. beispielsweise P.Brazeau et al., obiges Zitat. Jedoch sind solche Techniken auf große Ansätze zur Herstellung von Molekülen der Größe von Somatostatin nicht ohne weiteres übertragbar. Wenn diese Technik auf Moleküle dieser Größe angewendet wird, tritt darüberhinaus eine Kontamination durch verstümmelte und fehlerhafte Sequenzen auf, wodurch sich als Ergebnis eine wesentliche Komplizierung bei der Reinigung des Produkts ergibt. Darüberhinaus erfordern Festphasentechniken, daß die sekundären Funktionen, beispielsweise SH, NH₂ oder OH, durch sehr stabile Gruppen geschützt werden, die am Ende unter scharfen Bedingungen entfernt werden müssen, .wobei diese Bedingungen für das Somatostatinmolekül schädlich sind.

Im Hinblick auf die den Festphasentechniken eigenen Schwierigkeiten ist es offensichtlich, daß ein Verfahren "zur Synthese

- 3 509824/1010

M/15

von Somatostatin und aktiver Derivate davon, bezogen auf die klassischere Methodologie der organischen Chemie wünschenswerter und fortschrittlich wäre.

Wie zuvor festgestellt, wurde kürzlich eine derartige Synthese für Somatostatin von D. Sarantakis und W.A. McKinley, obiges Zitat, berichtet. Jedoch enthält dieser Bericht keinerlei Hinweis auf die Durchführbarkeit der Synthese. Darüberhinaus ist festzustellen, daß die Synthese eine sehr stabile Schutzgruppe verwendet, deren Entfernung scharfe Bedingungen erfordert.

Erst kürzlich wurde ein Polypeptid berichtet, das vom natürlichen Hormon verschieden ist und in seiner linearen Form vorliegt und das somatostatinartige Aktivität besitzt. . D. Sarantakis et al., Biochem. Biophys. Res. Comm., 55, 538 (1973) berichteten die Synthese des Somatostatinanalogen [AIa ' ]-Somatostatin, durch Festphasenmethoden. Jedoch zeigte dieses Analogon eine sehr geringe Menge an Aktivität, die ungefähr 0,01 % der Wirksamkeit von Somatostatin beträgt.

Im Hinblick auf das Bedürfnis nach einer durchführbaren Synthese des Tetradecapeptids Somatostatin offenbart die vorliegende Erfindung ein neues, durchführbares Verfahren zur Herstellung in großem Maßstab dieses Tetradecapeptids und Derivaten davon, die die Aktivität des natürlichen Hormons behalten. Darüberhinaus besitzt das vorliegende Verfahren die zusätzlichen Vorteile, daß es von leicht zugänglichen Materialien ausgeht, schädliche Reaktionsteilnehmer vermeidet, leicht durchgeführt v/erden kann und leicht entfernbare Schutzgruppen verwendet.

Die erfindungsgemäßen Tetradecapeptide sind durch die Formeln I und Ia dargestellt, wobei Formel I die erfindungsge-

- 4 -509824/1010

M/15 563

mäßen zyklischen Tetradecapeptide und Formel Ia die lineare reduzierte Form der Tetradecapeptide darstellen.

0 B²

CH^CIK-Gly-Cys-Lys-Asn-Phe-Phe-Ti^-Lys-Thr-Phs-Thr-Ser-NHCHCHoS

³ II

CD

0
CH

₃CHC-Gly-Cys-Lys-Asn-Phe-Phe-Trp-Lys-Thr-Phe-Thr-Ser-NHCHCH2SH R¹ R²

(la)

1 2

worin R für Wasserstoff oder Amino steht>und R Wasserstoff

oder Carboxyl darstellt.

1 2

Formel I, -worin R für Amino steht und R Carboxyl bedeutet, stellt die Struktur von Somatostatin dar, und die entsprechende Formel Ia stellt die lineare Form von Somatostatin dar. Somatostatin und seine lineare Form, Derivate davon, worin eine der Lys-Gruppen, d.h. die L-Lys-Gruppe, durch eine D-Lys-Gruppe ersetzt ist, stellen zusammen mit den übrigen Tetradecapeptiden der Formeln I und Ia die erfindungsgemäßen Tetradecapeptide dar.

Ebenfalls eingeschlossen in der Erfindung sind die pharmazeutisch verträglichen Salze der Verbindungen der Formeln Ϊ und Ia.

Die erfindungsgemäßen Tetradecapeptide werden durch ein Verfahren hergestellt, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man:

gemäß der Azidkupplungsmethode ein erstes Heptapeptidderivat

- 5 509824/1010

M/15 563

Io

der Formel

0
CH^CHC-Gly-Cys-Lys-Asn-Phe-Phe-NHNHp

R . α Boc

worin R für Wasserstoff oder Boc-NH- steht und α die Bedeutung Acm oder Trt besitzt, mit einem zweiten Heptapeptidderivat der Formel .

R²

H-Trp-Lys-Thr-Phe-Thr-Ser-NHCHC^-S-ß

¹¹ Ί ^!2 ^:. Boc γ YY

2 '

worin R die hier angegebenen Bedeutungen besitzt, ß für Acm

1 2
oder Trt steht und γ, γ und γ entweder alle Wasserstoff-

oder alle Bu bedeuten (d.h. wenn γ Wasserstoff darstellt,

12 t

müssen γ und γ Wasserstoff bedeuten und wenn γ Bu dar-

1 2 t
stellt, müssen γ und γ Bu bedeuten), umsetzt, wobei man

das entsprechende lineare Tetradecapeptidderivat der Formel

CtUCHC-Gly-Cys-Lys-Asn-Phe- Phe- Trp-Lys-Thr-Phe-Thr-Ser- NHCHCH₉ R^ α Boc Boc γ YY R

2 3 12

worin R , R , α, ß, γ, γ und γ die hier angegebenen Bedeutungen besitzen, erhält, gefolgt von Oxydieren des linearen Tetradecapeptidderivats mit Jod oder Thiocyan, wobei man das entsprechende zyklische Disulfidderivat der Formel

12 0 Boc Boc γ γ γ R

CH^CHC-Gly-Cys-Lys-Asn-Phe-Phe-Trp -Lys-Thr-Phe- Thr-Ser-NHCHCHp '3 I I

R³ I sJ

- 6 50 9 824/1010

<s M/15 563

erhält und anschließendes Entfernen aller verbleibender Schutzgruppen unter mäßig sauren Bedingungen, wobei man das entsprechende Tetradecapeptid der Formel I erhält; oder gefolgt durch Unterwerfen des linearen Tetradecapeptidderivats einer Behandlung entweder mit Quecksilber-II-acetat, Quecksilber-II-chlorid, Silberacetat oder Silbernitrat, um die Sulfhydrylschutzgruppen selektiv zu entfernen, wobei man das Quecksilber-II- oder Disilbersalz des entsprechenden Disulfhydrylderivats erhält; das zuletzt genannte Salz durch Behandeln mit Schwefelwasserstoff in sein entsprechendes' freies Disulfhydrylderivat überführt, das zuletzt genannte Derivat durch Behandeln mit Sauerstoff, 1,2-Dijodäthan, Natriumoder Kaliumhexacyanoferrat-III oder Jod oxydiert, wobei man das entsprechende zyklische Di-sulfidderivat erhält und die verbleibenden Schutzgruppen unter mäßig sauren Bedingungen entfernt, wobei man das-gewünschte Tetradeeapeptid der Formel I erhält. Alternativ wird das zyklische Disulfidderivat zum entsprechenden freien Disulfhydrylderivat durch Mittel reduziert,.von denen bekannt ist, daß sie bekannte zyklische Disulfide zu ihren entsprechenden Disulfhydrylderivaten reduzieren.

Bezüglich des Verfahrens zur Herstellung des Tetradecapeptid-

1 derivats der Formeln I und Ia, worin R "Wasserstoff bedeu-

2 ' 1

tet und R Wasserstoff oder Carboxyl darstellt, oder R für

2
Amino und R für Wasserstoff stehen, sind die bevorzugten Ausgangsmaterialien und Zwischenprodukte diejenigen,. 'die den ; Ausgangsmaterialien und Zwischenprodukten, worin R Viasserstoff oder Carboxyl bedeutet und R Wasserstoff oder Boc-NH- darstellt, α und ß jeweils Trt bedeuten und γ,

1 2 t

γ und γ jeweils Bu darstellen, und zwar unter der Voraus-

2 ^

setzung, daß wenn R Wasserstoff bedeutet, -R für Wasser-

2 "^

stoff oder Boc-NH- steht und wenn R für Carboxyl steht, R·^

Wasserstoff bedeutet, entsprechen.

50 9 8 24/101 Q

Μ/15

Ein v/eiterer Aspekt der Erfindung betrifft die Entfernung aller Schutzgruppen aus dem zuvor genannten linearen Tetradecapeptidderivat oder den zuvor genannten Disulfhydrylderivateη unter mäßig sauren Bedingungen, wobei man die lineare reduzierte Form des erfindungsgemäßen Tetradecapeptids der Formel Ia

0
CHjCH-C-Gly-Cys-Lys-Asn-Phe.-Phe-Trp-Lys-Thr-Phe-Thr-Ser-NHCHCH^SH

R¹ R²

1 2

erhält, worin R und R die hier angegebenen· Bedeutungen besitzen.

Die zuletzt genannte Verbindung erhält man auch durch direkte Reduktion des zyklischen Tetradecapeptids der Formel I durch Mittel, von denen bekannt ist, daß sie bei der Reduktion bekannter zyklischer Disulfide zu ihren entsprechenden Disulfhydrylderivaten wirksam sind. Gewünschtenfalls wird die reduzierte Form der zyklischen Tetradecapeptidderivate durch eines der obigen Oxydationsmittel in das entsprechende Derivat der Formel I überführt.

Aus Gründen der Klarheit sind die zuvor genannten Umwandlungen im anliegenden Fließdiagramm zusammengestellt.

Im allgemeinen fußen die hier verwendeten Abkürzungen zur Bezeichnung der Aminosäuren und der Schutzgruppen auf Empfehlungen der IUPAC-IUB Commission on Biochemical Nomenclature; vergl. J.Biol.Chem., 241, 2491 (1966). Beispielsweise stellt Boc die Aminoschutzgruppe t-Butyloxycarbonyl dar, Z steht für Benzyloxycarbonyl, Trt bedeutet Trityl, Np steht für p-Nitrophenyl, Tcp bedeutet 2,4,5-Trichlorphenyl, Bu* steht für t-Butyl und Ddz

- 8 50982 4/1010

. . ■ fl M/15 563

bedeutet α^α-Dimethyl-3,5-dimethoxybenzylo:xycarbonyl. Die Abkürzung "Acm" wird hier verwendet, um die Thiolschutzgruppe Acetamidomethyl zu bezeichnen. Die Abkürzung "Chb" wird hier verwendet, um die Aminoschutzgruppe a-P-henyl-S-chlor-Z-hydroxybenzyliden zu bezeichnen; vergl. A. Hope und B. Halpern, Tetrahedron Letters, 2261 (1972). Die Abkürzung "Me" wird hier verwendet, um eine Methylgruppe darzustellen.

Die -Begriffe "Peptid, Polypeptid, Tripeptid, Hexapeptid und dergleichen", die hier verwendet werden, sind nicht auf die diesbezüglichen zugrundeliegenden Peptide beschränkt, sondern sie werden auch unter Bezugnahme auf modifizierte Derivate und Derivate der zugrundeliegenden oder modifizierten Peptide mit funktionalisierten oder schützenden Gruppen verwendet. Wenn beispielsweise eine Carboxyl- oder eine Aminogruppe eines Tetradecapeptids entfernt wird, so wird das entstehende modifizierte Peptid immer noch als Tetradecapeptid oder Tetradecapeptidderivat bezeichnet.

Alle hier beschriebenen Aminosäuren gehören der L-Serie an, falls nichts anderes angegeben.

Der hier verwendete Begriff "niedriges Alkyl" umfaßt Kohlenwasserstoffreste mit 1 bis 3 Kohlenstoffatomen, und hierzu gehören Methyl, Äthyl und Propyl.

Der hier verwendete Begriff "Mineralsäure" betrifft die starken anorganischen Säuren und umfaßt Chlorwasserstoffsäure,- · Bromwasserstoffsäure, Schwefelsäure, Phosphorsäure und dergleichen. Wenn dieser Begriff in Verbindung mit einem wasserfreien System verwendet wird, ist Chlorwasserstoff die bevorzugte Mineralsäure.

- 9 509824/1010

M/15

Der hier verwendete Begriff "mild-saure Bedingungen" betrifft Bedingungen, bei denen eine verdünnte wäßrige Lösung einer organischen Säure, beispielsweise 30 bis 90 %, vorzugsweise 70 bis 80 %, wäßrige Ameisensäure, Essigsäure oder Propionsäure, oder 1 bis 10 % wäßrige Trifluoressigsäure, die Hauptkomponente des Reaktionsmediums darstellen.

Der hier verwendete Begriff "mäßig saure Bedingungen" betrifft Bedingungen, bei denen konzentrierte organische Säuren oder wäßrige Lösungen der Mineralsäuren als Hauptkomponente des Reaktionsmediums bei Temperaturen verwendet werden, die im Bereich von ungefähr -30⁰C bis 30⁰C liegen. Zu Beispielen bevorzugter Bedingungen gehören in diesem Fall die Verwendung von wasserfreier Trifluoressigsäure bei 0° bis 30⁰C oder von 2 bis 12n Chlorwasserstoffsäure bei -20° bis 10⁰C.

Der Begriff "organisches Nitrit" umfaßt die im Handel erhältlichen Alkylnitrite, beispielsweise t-Butylnitrit, Isoamylnitrit und dergleichen.

Der hier verwendete Begriff "organische Ba3e" umfaßt Triethylamin, N-Äthylmorpholin, N-Methylpiperidin, Pyridin, N-Äthyldiisopropylamin und dergleichen.

Der hier verwendete Begriff "starke Base" betrifft sowohl organische Basen, wie oben beschrieben, als auch starke anorganische Basen, einschließlich der Hydroxyde und Carbonate von Natrium und Kalium.

Der hier verwendete Begriff "aktivierter Ester" betrifft carboxylaktivierende Gruppen, die in der Peptidchemie verwendet werden, um eine leichte Kondensation der Peptidcarboxylgruppe mit einer freien Aminogruppe eines anderen Pep-

- 10 -

509824/1010

η Μ/15 563

tids zu fördern. Beschreibungen dieser carboxylaktivierenden Gruppen sind in allgemeinen -Büchern der Peptidchemie zu finden, und zwar beispielsweise in K.D. Kopple, "Peptides and Amino Acids", W.A. Benjamin, Inc., New York, 1966, Seiten 50 bis 51 und E. Schröder und K. Lübke "The Peptides", Band L, Academic Press, New York, 1965,'Seiten 77 bis 128. Die nachfolgenden carboxylaktivierenden Gruppen haben sich als besonders geeignet·beim erfindungsgemäßen Verfahren erwiesen: 2,4,5-Trichlorphenyl, Pentachlorphenyl, p-Nitrophenyl, Succinimido und 1-Benzotriazolyl.

Der hier verwendete Begriff "Azidmethode" bezieht sich auf die Methode der Kupplung zweier Peptidfragmente, die die Reaktion eines Aminosäurehydrazids mit einer geeigneten geschützten Aminogruppe mit einem organischen Nitrit, üblicherweise t-Butyl- oder Isoamylnitrit, umfaßt, wobei man das entsprechende Azid erhält, das dann mit einer Aminosäure mit einer freien Aminogruppe umgesetzt wird, wobei man das gewünschte Peptid erhält.

Bevorzugte Bedingungen bei der Azidmethode zur Kupplung umfaßen die Reaktion des Aminosäurehydrazids mit dem organischen Nitrit in Gegenwart einer Mineralsäure in einem wasserfreien inerten organischen Lösungsmittel, beispielsweise Dimethylformamid, Äthylacetat, Methylendichlorid, Tetrahydrofuran und dergleichen bei -30° bis 20⁰C, vorzugsweise bei ungefähr -15°C, während 10 bis 60 Minuten, wobei man das entsprechende Azid erhält, Alkalischmachen der erhaltenen Mischung durch Zugabe einer starken Base, vorzugsweise einer organischen Base, beispielsweise N-Athyldiisopropylamin, N-Äthylmorpholin oder Triäthylamin und anschließendes Umsetzen des Azids in der Mischung mit der Peptideinheit, die die freie Aminogruppe aufweist, bei Temperaturen im Bereich von -30⁰C bis 20⁰C während ungefähr 1 Stunde und anschließend

- 11 50 9 824/1010

M/15

bei 0° bis 30°C während 10 bis 24 Stunden. Vergl. auch die oben genannten Bücher von Kopple und Schröder und LUbke für weitere Beschreibungen dieser Methode.

Die erfindungsgemäßen Tetradecapeptide, einschließlich der zyklischen und der linearen reduzierten Formen, werden in Form eines Säureadditionssalzes entweder direkt aus dem erfindungsgemäßen Verfahren oder durch Umsetzung des Tetradecapeptidderivats mit einem oder mehr Äquivalenten der geeigneten Säure erhalten. Zu Beispielen von Salzen gehören die mit organischen Säuren, beispielsweise Essigsäure, Milchsäure, Bernsteinsäure, Benzoesäure, Salicylsäure, Methansulf onsäure oder Toluolsulfonsäure, sowie .polymere Säuren, wie Tanninsäure oder Carboxymethylcellulose, und Salze mit anorganischen Säuren, wie Halogenwasserstoffsäuren, beispielsweise Chlorwasserstoffsäure oder Schwefelsäure oder Phosphorsäure. Es ist zu bemerken, daß die Tetradecapeptidderivate zwei oder drei basische Stickstoffe aufweisen, die zu Additionssalzen mit einem und bis zu möglicherweise drei Äquivalenten Säure führen. Gewünschtenfalls wird ein bestimmtes Säureadditionssalz in ein anderes Säureadditionssalz, beispielsweise ein Salz mit einer pharmazeutisch verträglichen Säure, durch Behandeln mit dem geeigneten Ionenaus tauscher harz auf die durch R.A. Boissonnas et al., HeIv. Chim. Acta, 43, 1349 (1960) beschriebene Weise überführt. Geeignete Ionenaustauscherharze sind Kationenaustauscher auf Cellulosebasis, beispielsweise Carboxymethylcellulose oder chemisch modifizierte, vernetzte Dextrankationenaustauscher, beispielsweise die des Typs Sephadex C und stark basische Anionenaustauscherharze, beispielsweise die in J.P. Greenstein und M. Winitz "Chemistry of the Amino Acids", John Wiley and Sons, Inc, New York und London, 1961, Band 2, Seite 1456, aufgeführten Harze.

- 12 -

509824/1010

Μ/15 563

Die erfindungsgemäßen Tetradecapeptide bilden auch Additionssalze mit geeigneten pharmazeutisch verträglichen anorganischen und organischen Basen. In diesem Falle v/erden das zyklische oder lineare reduzierte Tetradecapeptidderivat in ausgezeichneter Ausbeute in die entsprechenden pharmazeutisch verträglichen Salze durch Neutralisation des Tetradecapeptidderivats mit der geeigneten anorganischen oder organischen Base überführt. Zu geeigneten anorganischen Basen zur Bildung dieser Salze gehören beispielsweise die Hydroxyde, Carbonate, Bicarbonate oder Alkoxyde der Alkalimetalle oder Erdalkalimetalle, beispielsweise Natrium, Kalium, Magnesium, Kalzium und dergleichen. Zu geeigneten organischen Basen gehören die nachfolgenden Amine: niedrige Mono-, Di- und Trialkylamine, deren Alkylreste bis zu 3 Kohlenstoffatome aufweisen, wie Methylamin, Dirnethylamin,' Trimethylamin, Äthylamin, Di- und Triethylamin, Methyläthylamin, und dergleichen; Mono-, Di- und Tr!alkanolamine, deren Alkanolreste bis zu drei Kohlenstoff atome aufweisen, wie Mono-, Di- und Triäthanolamin; Alkylendiamine, die bis zu 6 Kohlenstoffatome aufweisen, wie Hexamethylendiamin; cyclische gesättigte oder ungesättigte Basen, die bis zu 6 Kohlenstoffatome enthalten, wie Pyrrolidin, Piperidin, Morpholin, Piperazln und deren N-Alkyl- und N-Hydroxyalkylderivate, wie N-Methylmorpholin und N-(2-Hydroxyäthyl)-piperidin.

Die erfindungsgemäßen Tetradecapeptide ergeben mit Schwermetallionen komplexe Salze. Ein Beispiel eines pharmazeutisch verträglichen Schwermetallkomplexes ist ein Komplex, der mit Zink oder mit Zinkprotamin gebildet ist.

Die beim erfindungsgemäßen Verfahren hergestellten Tetradecapeptide der Formeln I und Ia und deren entsprechende pharmazeutisch verträgliche Salze sind wertvoll, 'da sie die pharmakologische Aktivität des natürlichen Tetradecapeptids

- 13 509824/1010

M/15 563

Somatostatin besitzen. Ihre Aktivität wird bei pharmakologischen Untersuchlangen, wie einer Modifikation [A.V.Schally, et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 52, 1314 (1973); J. Rivier, et al., CR. Acad.Sci. (Paris), Ser.D. 276, 2737 (1973)] der in vitro-Methode von M. Saffran und A.V. Schally Can. J. Biochem. Physiol., 33, 405 (1955) leicht gezeigt.

Wenn beispielsweise das Tetradecapeptid der Formel I, worin

1 2

R für Amino und R für Carboxyl stehen (Somatostatin) bezüglich seiner inhibierenden Wirkung auf die Freisetzung des Wachstumshormons (GH) in vitro aus isolierten Rattenhypophysen gemäß dieser Modifikation untersucht Avird, v/erden die nachfolgenden Ergebnisse, ausgedrückt als prozentuale Verhältnisse von Medium GH in der zweiten Stunde zu Medium GH in der ersten Stude, erhalten:

Probe Dosis '% Kontrolle + SE

Kontrolle - 119,9-5,0

Somatostatin* 0,01 γ/ml 78,9 - 5,9 (p<0,0i)

Somatostatin* 0,1 γ/ml 64,5 - 4,8 (p<0,0i)

^Hergestellt nach dem erfindungsgemäßen Verfahren.

Die Aktivität der erfindungsgemäßen Tetradecapeptide wird auch in vivo in einer Modifikation der durch pentobarbitalinduzierten Zunahme des Hormonspiegels beim Plasmawachstum in der Ratte wie durch Brazeau et al., oben zitiert, beschrieben, gezeigt. Bei dieser Untersuchung zeigen die erfindungsgemäßen Tetradecapeptide eine Aktivitätshöhe, die in derselben Größenordnung wie die von Somatostatin liegt.

- 14 509824/1010

IS

M/15 563

Die erfindungsgemäßen Tetradecapeptide können zur Behandlung von Akromegalie und anderen hypersekretorischen endokrinen Zuständen und bei der Behandlung von Diabetikern verwendet werden. Vergl. beispielsweise P. Brazeau, et al., obiges Zitat. Wenn das Tetradecapeptidderivat oder ein Salz davon bei einer solchen Behandlung oder Betreuung verwendet wird, wird es systemisch, vorzugsweise parenteral, in Verbindung mit einer pharmazeutisch verträglichen Flüssigkeit oder einem festen Träger verabreicht. Der Anteil des Tetradecapeptids oder des Salzes davon wird durch.seine Löslichkeit im vorgegebenen Träger, den vorgegebenem Träger, den gewählten Verabreichungsweg und durch die übliche biologische Praxis bestimmt. Bei parenteraler Verabreichung an Tiere wird das Tetradecapeptid oder ein Salz davon in einer sterilen wäßrigen Lösung verwendet, die auch andere gelöste Stoffe, wie Puffer oder Konservierungsmittel, sowie eine ausreichende Menge pharmazeutisch verträglicher Salze oder Glukose enthält, um die Lösung isotonisch zu machen. Die Dosierung variiert mit der Form der Verabreichung und mit der besonderen Tierart,, die zu behandeln ist und wird vorzugsweise bei einer Menge von 5 γ "bis 300 γ/kg Körpergewicht gehalten. Jedoch wird besonders bevorzugt eine Dosierungshöhe im Bereich von ungefähr 10 γ bis ungefähr 50 γ/kg Körpergewicht verwendet, um wirksame Ergebnisse zu erzielen.

Das Tetradecapeptid oder ein Salz davon kann auch in einer der lang wirksamen, Retart-(slow-release) oder Depot-Dosierungsformen, die unten beschrieben sind, verabreicht v/erden, vorzugsweise durch intramuskuläre Injektion oder durch Implantieren. Solche Dosierungsformen sind ausgelegt, um ungefähr 0,5 γ bis ungefähr 50 γ/kg Körpergewicht/Tag freizusetzen.

- 15 -

509824/ 1010

M/15 563

Es ist oft wünschenswert, das Mittel kontinuierlich über längere Zeiträume hinweg in lange wirksamen Retart- oder Depot-Dosierungsformen zu verabreichen. Solche Dosierungsformen können entweder ein pharmazeutisch verträgliches Salz des Mittels mit einem geringen Löslichkeitsgrad in Körperfluiden, beispielsweise eines der nachstehend beschriebenen Salze, enthalten, oder sie können das Mittel in Form eines wasserlöslichen Salzes zusammen mit einem Schutzträger enthalten, der ein schnelles Freisetzen verhindert. In dem zuletzt genannten Fall kann das Mittel beispielsweise mit einer nicht-antigenen, teilweise hydrolysierten Gelatine in Form einer viskosen Flüssigkeit formuliert werden, oder das Mittel kann an einem pharmazeutisch verträglichen festen Träger, beispielsweise Zinkhydroxyd, absorbiert sein und es kann in Suspension in einem pharmazeutisch verträglichen flüssigen Träger verabreicht werden, oder das Mittel kann in Gels oder Suspensionen mit einem schützenden, nicht-antigenen Hydrokolloid, beispielsweise Natriumcarboxymethylcellulose, Polyvinylpyrrolidon, Natriumalginat, Gelatine, Polygalacturonsäuren, beispielsweise Pectin, oder bestimmten Mucopolysacchariden, zusammen mit wäßrigen oder nicht-wäßrigen pharmazeutisch verträglichen flüssigen Trägern, Schutzmitteln oder oberflächenaktiven Mitteln verabreicht werden. Beispiele für solche Formulierungen findet man in pharmazeutischen Standardtexten, beispielsweise in Remingtons Pharmaceutical Sciences, 14.Ausgabe, Mack Publishing Co., Easton, Pennsylvania, 1970. Langwirksame Retart-Präparationen des nach dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellten Mittels können auch durch Mikroeinkapselung in einen pharmazeutisch verträglichen Überzug, beispielsweise Gelatine, Polyvinylalkohol oder Äthylcellulose, erhalten werden. Weitere Beispiele für Überzugsmaterialien und für die zur Mikroeinkapselung gebrauchten Verfahren sind von J.A. Herbig in "Encyclopedia of Chemical Technology", Band 1J5» 2.Ausgabe, Wiley, New York 1967, Seiten 436 bis 456, beschrieben. Solche Formulierungen

- 16 509824/1010

M/15 563

sowie Suspensionen von Salzen des Mittels, die in Körperfluiden nur mäßig löslich sind, sind ausgelegt, um ungefähr 5,0 γ. bis ungefähr 100 γ der aktiven Verbindung pro Kilogramm Körpergewicht/Tag freizusetzen und sie werden vorzugsweise durch intramuskuläre Injektion verabreicht. Alternativ können einige der oben aufgeführten festen Dosierungsformen, beispielsweise bestimmte, in Wasser mäßig lösliche Salze, oder Dispersionen in oder Adsorbate auf festen Trägern von Salzen des Mittels, beispielsweise Dispersionen in einem neutralen Hydrogel eines Polymeren von Äthylenglykol-methacrylat oder ähnlicher vernetzter Monomerer, wie in der US-PS 3 551 556 beschrieben, auch in Form von Pellets formuliert werden, die ungefähr dieselben Mengen wie oben angegeben, freisetzen und die subkutan oder intramuskulär implantiert werden können.

Aus Gründen der Einfachheit und Klarheit wird in der nachfolgenden Diskussion die einzelne Peptideinheit (d.h. Aminosäure) bisweilen mit einer Zahl bezeichnet, die sich auf die Position bezieht, in der die bestimmte Aminosäure in der Sequenz der Aminosäuren auftritt, wie dies in der Formel für das Tetradecapeptid'somatostatin, oben, erläutert ist. Es ist zu bemerken, daß bei einigen der Derivate und Zwischenprodukte hierfür eine funktioneile Gruppe einer der Aminosäurebestandteile fehlen kann; in solchen Fällen wird jedoch das Nummerierungssystem nicht geändert.

Das erfindungsgemäße Verfahren wird durch die nachfolgenden Ausführungsformen erläutert, in denen spezifische Tetradecapeptide hergestellt werden:

5098 2 4/1010

M/15 563 (a) Tetradecapeptide I und Ia (R¹ = NH₂ und R² = COOH)

Aus Gründen der Einfachheit wird das Verfahren für das obige Tetradecapeptid in der anliegenden Figur 1 erläutert.

Erstes Heptapeptid

■5

Das diesbezügliche erste Heptapeptidderivat, worin R für Boc-NH- steht und α die Bedeutungen Acm oder Trt besitzt, wird hergestellt, indem man ein Dipeptid (Fragment 1-2) und ein Pentapeptid (Fragment 3-7) herstellt und anschliessend die beiden Fragmente kuppelt.

Insbesondere wird das Fragment 1-2 hergestellt, indem man einen aktivierten Ester von Boc-Ala-OH mit einem niedrigen Alkylester von Glycin, vorzugsweise H-GIy-OMe, umsetzt, wobei man den entsprechenden niedrigen Alkylester von Boc-AIa-Gly-OH erhält, der wiederum hydrolysiert wird, wobei man seine entsprechende Säure Boc-Ala-Gly-OH erhält. Die zuletzt genannte Dipeptidsäure wird dann in einen entsprechenden aktivierten Ester (Fragment 1-2) für die nachfolgende Kupplung mit dem Fragment 3-7 überführt.

In einer bevorzugten Ausfuhrungsform wird das Dipeptidfragment 1-2 hergestellt, indem man t-Butyloxycarbonylalanin [Boc-Ala-OH, beschrieben von G,¥. Anderson und A.C. McGregor, J. Amer. Chem. Soc, 79, 6180 (1957)] mit im wesentlichen einem molaren Äquivalent 1-Hydroxybenzotriazol in einem inerten organischen Lösungsmittel, vorzugsweise Dimethylformamid (DMF) oder Tetrahydrofuran (THF) in Gegenwart von Dicyclohexylcarbodiimid (DCC, 1 bis 1,6 molare Äquivalente) bei -20 bis 10⁰C, vorzugsweise O⁰C, während ungefähr einer Stunde, anschließend bei 20 bis 30⁰C während ungefähr einer Stunde zur Reaktion bringt. Auf diese Weise erhäl«t man den

- 18 509824/1010

Μ/15 563

entsprechenden aktivierten Ester, d.h. den 1-Benzotriazolylester von Boc-Ala-OH. Diese zuletzt genannte Verbindung wird dann mit ungefähr 1 molaren Äquivalent Glycinmethylesterhydrochlorid in Gegenwart von 1 bis 1,5 molaren Äquivalenten einer organischen Base in einem inerten organischen Lösungsmittel, vorzugsweise DMF, bei 20 bis 30⁰C während 10 bis 24 Stunden kondensiert, wobei man Boc-Ala-Gly-OMe erhält. Die zuletzt genannte■Verbindung wird dann hydrolysierenden Bedingungen unterworfen, um die entsprechende Säure Boc-Ala-Gly-QH zu erhalten. Bevorzugte hydrolysierende Bedingungen bestehen darin, daß man Boc-Ala-Gly-OMe der Wirkung einer Base, beispielsweise einem Überschuß von Natrium- oder Kaliumhydroxyd, in Gegenwart von ausreichenden Mengen Wasser unterwirft, um die Hydrolyse des Esters zu bewirken. Die Hydrolyse wird in einem inerten organischen Lösungsmittel, beispielsweise Methanol, Äthanol oder Methoxyäthanol, durchgeführt. Unter diesen Bedingungen ist die Hydrolyse normalerweise innerhalb von 1 bis-2 Std. bei Temperaturen von 0 bis 50⁰C, vorzugsweise 20 bis 3O⁰C, vollendet. Anschließend wird Boc-Ala-Gly-OH in den entsprechenden aktivierten Ester Boc-Ala-Gly-OTcp (d.h. das gewünschte Dipeptid-Fragment 1-2) durch Kondensieren von im wesentlichen äquimolaren Mengen der zuletzt genannten Säure und 2,4,5-Trichlorphenol in Gegenwart von 1,0 bis 1,25 molaren Äquivalenten DCC,in einem inerten organischen Lösungsmittel, beispielsweise Äthylacetat oder THF, bei -20 bis 20⁰C während 2 bis 4 Std. und anschliessend bei 0 bis 20⁰C während 10 bis 24 Std., überführt.

Was das Pentapeptid-Fragment 3-7 anbetrifft, so wird dieses Pentapeptid hergestellt, indem man einen aktivierten Ester von Boc-Phe-OH mit einem niedrigen Alkylester von Phenylalanin, vorzugsweise H-Phe-OMe, umsetzt, wobei man den niedrigen Alkylester des Dipeptids, Boc-Phe-Phe-OH, erhält, der nach Entfernen der terminalen Schutzgruppe (Boc) unter mäßig sauren Be-

- 19 5 0 9 8 2 A / 1 0 1 0

dingungen den niedrigen Alkylester von Phenylalanylphenylalanin, vorzugsweise H-Phe-Phe-OMe, ergibt. Die zuletzt genannte Verbindung wird wiederum mit einem aktivierten Ester von Boc-Asn-OH umgesetzt, wobei man den entsprechenden niedrigen Alkylester von Boc-Asn-Phe-Phe-OH, vorzugsweise Boc-Asn-Phe-Phe-OMe, erhält. Anschließendes Entfernen der terminalen Aminoschutzgruppe der zuletzt genannten Verbindung unter mäßig sauren Bedingungen ergibt den entsprechenden niedrigen Alkylester von Asparaginylphenyl-alanylphenylalanin, vorzugsweise H-Asn~Phe-Phe-OMe (d.h. ein Tripeptid mit den Peptid-Einheiten 5-7).

Anschließend wird das Tripeptid verwendet/ um das gewünschte Pentapeptid-Fragment 3-7 zu erhalten, indem man das zuletzt genannte Tripeptid mit einem aktivierten Ester von Z-Lys-ÖH

Boc

umsetzt, wobei man den entsprechenden niedrigen Alkylester von Z-Lys-Asn-Phe-Phe-OH, vorzugsweise Z-Lys-Asn-Phe-Phe-OMe,

J I

Boc Boc

erhält, die zuletzt genannte Verbindung in Gegenwart eines Edelmetallkatalysators hydriert, wobei man einen niedrigen Alkylester von H-Lys-Asn-Phe-Phe-OH, vorzugsweise

Boc
H-Lys-Asn-Phe-Phe-OMe, erhält, die zuletzt genannte Verbin-

Boc λ

d dung mit einem aktivierten Ester von ^^ Cys-OH, worin α

für Acm oder Trt steht und cT Wasserstoff bedeutet und <S für Trt oder c/" und 6 zusammen für Chb= stehen, kondensiert, wobei man einen niedrigen Alkylester von ^c ^Cys-Lvs-Asn-Phe-Phe-OH, vorzugsweise ^ nc Boc

T 1 a Boc

^Cys-Lys-Asn-Phe-Phe-OMe, erhält, worin a,cfundcf¹ die obi-

- 20 509824/ 1010

. M/15 56.3

gen Bedeutungen besitzen, und die terminale N-schützende Gruppe (Trt oder Chb=) der zuletzt genannten Verbindung unter mild-sauren Bedingungen entfernt, wobei man das gewünschte Pentapeptid-Frägment 3-7 erhält.

In einer bevorzugten Ausfuhrungsform zur Herstellung des obigen Pentapeptidfragments 3-7 wird das von G.R. Pettit et al., Can. J. Chem., 45, I56I (I967) beschriebene Ausgangsmaterial Boc-Phe-OH in seinen entsprechenden aktivierten 1-Benzotriazolylester überführt, indem man das Ausgangsmaterial mit im wesentlichen 1 molaren Äquivalent 1-Hydroxybenzotriazol in einem inerten organischen Lösungsmittel, vorzugsweise DMF oder THF in Gegenwart von DCC (1,0 bis 1,3 molare Äquivalente) bei -20 bis 10⁰C, vorzugsweise O⁰C während 30 Min. bis 4 Std. und anschließend bei 20 bis 30⁰C während einer v/eiteren Stunde behandelt.

Der aktivierte Ester, d.h. der 1-Benzotriazolylester von Boc-Phe-OH wird anschließend mit Phenylalanin-methylesterhydrochlorid (1,0 bis 1,2 molare Äquivalente) in Gegenwart von 1 bis 1,5 molaren Äquivalenten einer organischen Base in einem inerten organischen Lösungsmittel, vorzugsweise DME bei 0 bis 30⁰C während 10 bis 24 Std. kondensiert, wobei man Boc-Phe-Phe-OMe erhält.

In einer Modifikation der zuvor beschriebenen Arbeitsweise wird der aktivierte Ester in der Reaktionsmischung wie oben beschrieben gebildet, die Bildung wird jedoch in Gegenwart des geeigneten Aminosäurederivats, beispielsweise im vorliegenden Falle Phenylalaninraethylester, gebildet, wodurch der aktivierte Ester unmittelbar mit der terminalen Aminogruppe des Aminosäurederivats kondensiert, wobei man das gewünschte Kupplungsprodukt erhält.

- 21 509824/1010

M/15 563

Anschließend wird Boc-Phe-Phe-OMe in konzentrierter Trifluoressigsäure gelöst und die Lösung wird während ungefähr 1 Std. bei 0 bis 10⁰C gehalten, gefolgt von Eindampfen der Trifluoressigsäure, wobei" man H-Phe-Phe-OMe in Form seines Säureadditionssalzes mit Trifluoressigsäure erhält. Obgleich das zuletzt genannte Salz in sein entsprechendes freies Peptid durch Standardmethoden überführt werden kann, ist es zweckmäßig, das Salz direkt zu der nachfolgenden Kondensationsreaktionsmischung zusammen mit einer Menge an organischer Base, die ausreicht, um den Trifluoressigsaureanteil des Salzes zu kompensieren, zuzugeben. In gleicher Weise gilt die letztere Überlegung auch, wenn eine gesättigte Lösung von Chlorwasserstoff verwendet v/ird, um die Entschützungsreaktion durchzuführen. Die^e letztere Überlegung·gilt für alle Entschützungsreaktionen der vorliegenden Offenbarung, die eine Entfernung der Schutzgruppen unter mäßig oder mild-sauren Bedingungen umfassen.

In der anschließenden Kondensationsreaktion wird H-Phe-Phe-OMe in Form seines Trifluoressigsäureadditionssalzes in DMF gelöst und die erhaltene Lösung wird auf ungefähr 0 bis 10⁰C gekühlt. Ein Überschuß, vorzugsweise 1,1 bis 1,3 molare Äquivalente an N-Äthylmorpholin wird zu der Lösung zugesetzt; die Lösung weist nun einen pH von ungefähr 8 auf. Im wesentlichen ein Äquivalent t-Butyloxy~ carbonyl-asparagin-2,4,5-trichlorphenylester, beschrieben von J.Pless und R.A. Boissonnas, HeIv. Chim. Acta, 4jS, 16O9 (1963) wird zugesetzt und die Reaktionsmischung wird 3 oder 4 Tage bei O⁰C gehalten, wobei man Boc-Asn-Phe-Phe-OMe erhalt, das bei Behandlung mit Trifluoressigsäure auf die zuvor genannte Weise das Tripeptid H-Asn-Phe-Phe-OMe liefert, das die Peptideinheiten 5-7 aufweist, wobei das Tripeptid in Form seines Trifluoressigsäureadditionssalzes vorliegt.

- 22 -509824/1010

• γ Μ/15

Die .weitere Umwandlung des Tripeptide wird durchgeführt, indem man das zuletzt genannte Trifluoressigsäureadditionssalz in DMF löst. Bei ungefähr O⁰C wird die Lösung mit einem Überschuß, vorzugsweise 1,1 bis 1,3 molaren Äquivalenten,N-Äthylmorpholin behandelt. Auf diese Weise wird der pH der Mischung zwischen pH 7-8, vorzugsweise ungefähr pH 8, gehalten. Die letztere Lösung wird nun mit 1 bis 1,2 molaren Äquivalenten · N^-Benzyloxycarbonyl-P^.-t-butyloxycarbonyl-lysin-p-nitrophenylester, Z-Lys-ONp, beschrieben von E. Sandrin und

Boc

R.A. Boissonnas, HeIv. Chim. Acta, 46, 1637 (1963), behandelt und die erhaltene Mischung wird mehrere Tage, vorzugsweise ungefähr- 2 Tage, bei O⁰C gehalten. Eindampfen des Lösungsmittels und Umkristallisation aus Methanol ergibt anschließend Z-Lys-Asn-Phe-Phe-OMe. Hydrieren der zuletzt genannten Ver-

3oc .

bindung in Gegenwart eines Edelmetallkatalysators, ergibt auf einfache Weise H-Lys-Asn-Phe-Phe-OMe.

Boc

Zu bevorzugten Edelmetallkatalysatoren zur Ausführung der obigen und anderer Hydrierungen beim'erfindungsgemäßen Verfahren gehören die aus Palladium und Platin, zum Beispiel 5 % Pd-C oder 5 % Pt-C; die Hydrierung als solche wird in einem inerten organischen Lösungsmittel, beispielsweise Essigsäure, Methanol, Äthylacetat und dergleichen durchgeführt.

IDn vorliegenden Fall wird die Hydrierung vorzugsweise mit 5 % Pd-C in Er..;)ii7säure durchgeführt, wodurch das Hydrierungsprodukt H-Lys-Arm-Phe-Phe-OMe durch Abtrennen des Katalysa-

3oc

tors aus der Reaktionsmischung und Eindampfen des Lösungsmittels in Form seines Essigsäureadditionssalzes erhalten wird.

- 23 -

509824/1010

M/15 563

Für die nächste Stufe wird der aktivierte Ester der Formel

^ ">Cys-OH, ν α

N-(a-Phenyl-5-chlor-2-hydroxybenzyliden)~S-acetamidomethylcystein, wie folgt hergestellt:

Äquimolare Mengen an S-Acetamidomethylcystein, beschrieben von D.F. Veber et al., J. Amer. Chem. Soc., 94, 5456 (1972), und 5-Chlor-2~hydroxy-benzophenon v/erden in einer Lösung von Tetramethylammoniumliydroxyd in Methanol gelöst und die Mischung wird 24 Std. bei Raumtemperatur gerührt. Anschliessend wird die Mischung filtriert und eingedampft. Den Rückstand verr'eibt man mit Eis/W asser und das'feste, unumgesetzte Benzophenon wird durch Filtrieren entfernt. Das Filtrat wird mit Zitronensäure sauer gemacht. Die Mischung extrahiert man mit Äthylacetat. Der Extrakt wird mit Wasser gewaschen und getrocknet. Eine äquimolare' Menge an Dicyclohexylamin in Ätl^lacetat wird zugegeben und man erhält kristallines N-(«-Phenyl-5-chlor-2-hydroxy-benzyliden)-S-acetamidomethylcystein in Form seines Additionssalzes mit Dicyclohexylamin. Das Salz wird in Wasser suspendiert. Die wäßrige Lösung macht man mit Zitronensäure sauer (pH 4) und extrahiert mit Äthylacetat. Den Extrakt wäscht man mit Wasser und trocknet über wasserfreiem Magnesiumsulfat bei 0 bis 10 C. Das Lösungsmittel wird eingedampft, wobei man N-(a-Phenyl-5-chlor-2-hydroxybenzyliden)-S-acetamidomethylcystein (Chb=Cys-OH) erhält.
Acm

Die zuletzt genannte Säure wird anschließend in den entsprechenden aktivierten 1-Benzotriazolylester auf dieselbe Weise wie zuvor beschrieben oder wie für andere derartige aktivierte Ester beschrieben, überführt.

- 24 509824/1010

SfT 24

Man sollte im Auge behalten, daß an diesem Punkt des Verfahrens andere geeignete Säuren der Formel

J^Cys-OH

anstelle von M-(a-Phenyl-5-chlor-2-hydroxybenzyliden)-S-acetamidomethylcystein, verwendet v/erden können. Zu solchen anderen Säuren gehören das entsprechende S-Tritylderivat der zuletzt genannten Säure, N-Trityl-S-acetamidomethylcystein und N,S-Ditritylcystein.

In der nächsten Stufe wird der zuletzt genannte aktivierte Ester von Chb=Cys-OH mit im wesentlichen einem molaren Äqui-Acm

valent an H-Lys-Asn-Phe-Phe-OMe, das oben beschrieben wurde,

t
Boc

in einem inerten organischen Lösungsmittel, beispielsweise DMF, kondensiert, wobei man Chb=Cys~Lys~.Asn-Phe-Phe~OMe er-

Acm Boc

hält. Die Kondensation wird vorzugsweise ausgeführt, indem man H-Lys-Asn-Phe-Phe-OMe in Form seines Essigsäureadditions-

salzes in Gegenwart einer ausreichenden Menge einer organischen Base, beispielsweise N-Äthylmorpholin, verwendet, um den pH der Kondensationsmischung zwischen pH 7 und pH 8 zu halten. Vorzugsweise wird das N-Äthylmorpholin zur Mischung des aktivierten Esters und des Acetatsalzes in der DMF-Lösung bei O⁰C bis 1O°C zugegeben und anschließend wird die Mischung 10 bis 24 Stunden bei 20 bis 30⁰C gerührt.

Anschließend wird die terminale Aminoschutzgruppe des Kondensats Chb=Cys-Lys-Asn-Phe-Phe-OMe entfernt, wobei man das ge-

I t

Acm Boc ■

- 25 -

509824/1010

M/15 563

wünschte Pentapeptidfragment 3-7 der. Formel H-Cys-Lys-Asn-Phe-Phe-OMe erhält. Die Entfernung dieser

• τ ι

Acm Boc

Schutzgruppe wird"unter mild-sauren Bedingungen leicht durchgeführt. Zu bevorzugten Bedingungen gehören Auflösen des Kondensats in 70 bis 80 % Essigsäure und Stehenlassen der Lösung während 2 bis 24 Std. bei 20 bis 45⁰C. Konzentrieren der Lösung liefert das Pentapeptid H-Cys-Lys-Asn-Phe-Phe-OMe

t I

Acm Boc

in Form seines Essigsäureadditionssalzes. An diesem Punkt des bevorzugten Verfahrens wird der zuvor genannte aktivierte Ester Boc-Ala-Gly-OTcp (Dipeptidfragment 1-2) mit dem vorstehenden Pentapeptid H-Cys»-Lys-Asn-Phe-Phe_rOMe (Pentapeptid-

Acm Boc
fragment 3-7) kondensiert, wobei man Boc-Ala-Gly-Cys-Lys-Asn-

Acm Boc

Phe-Phe-OMe erhält. Zu bevorzugten Bedingungen für diese vorliegende Kondensation gehören Auflösen des Essigsäureadditionssalzes des Pentapeptids in einem inerten organischen Lösungsmittel, vorzugsweise DMF und Zugeben einer ausreichenden Menge an organischer Base, vorzugsweise N-Äthylmorpholin, bei 0 bis 10⁰C, um den pH der Mischung zwischen pH 7 und pH 8 zu halten. Ungefähr 1,0 bis 1,25 molare Äquivalente an Boc-Ala-Gly-OTcp im inerten organischen Lösungsmittel werden dann zu der zuletzt genannten Lösung zugegeben und die erhaltene Mischung wird 1 bis 3 Tage bei 0 bis 10⁰C gehalten. Anschließend wird der Heptapeptidester, Boc-Ala-Gly-Cys-Lys-Asn-Phe-Phe-OMe aus der Reaktionsmischung

t t
Acm Boc

isoliert.

Die zuletzt genannte Verbindung wird leicht in das entsprechende erste Heptapeptid gemäß der vorliegenden Erfindung- überführt, indem man mit einem Überschuß (20 bis 50 molaren Äqui-

- 26 509824/1010

M/15 563

valentcn) Hydrazinhydrat zur Otnsetzung bringt. Zu bevorzugten· Bedingungen gehören Behandeln der zuletzt genannten Verbindung in einem inerten organischen Lösungsmittel, beispiels weise Methanol oder Dimethylsulfoxyd, mit 30 bis 40 molaren Äquivalenten Hydrazinhydrat bei 0 bis 10⁰C während ungefähr 1/2 bis 1 Std., anschließendes Halten der Lösung während 6 Std. bis 4 oder 5 Tage bei 20 .bis 30⁰C. Anschließende Zugabe von liasser zur Reaktionsmischung ergibt das gewünschte erste Heptapeptid der Formel Boc-Ala-Gly-Cys-Lys-Asn-Phe-Phe-NHNH₉. ' Acm Boc

Alternativ erhält man das gewünschte erste Heptapeptid in ähnlicher Ti eise wie durch die vorstehende Arbeitsweise, wenn man - wie oben bemerkt - das N-(a-Phenyl-5-chlor-2-hydroxybenzyliden)-S-acetamidomethy!cystein durch eine geeignete Säure der Formel

Cy s-OH

worin cc für Trityl steht, ersetzt. Eine bevorzugte Ausführungsform des zuletzt genannten Falles beinhaltet einen Ersatz durch NjS-Ditrltylcystein, beschrieben von G. Amiard et al., Bull. Soc. Chim. Fr., 698 (1956).

Bei einer alternativen spezifischen Ausführungsform wird •insbesondere der entsprechende aktivierte 1-Benzotriazolylester von NjS-Ditritylcystein, hergestellt auf dieselbe Weise wie oben für andere derartige aktivierte Ester beschrieben, mit dem zuvor genannten Essigsäureadditionssalz von H-Li⁷^s-Asn-Phe-Phe-OMe kondensiert, wobei man das Pentapeptid

Trt-Cys-Lys-Asn-Phe-Phe-OMe erhält. Bei dieser-Kondensation Trt Boc ■

- 27 -

5 0 9 8 2 4/1010

M/15 563

bevorzugte Bedingungen sind dieselben wie die zuvor für die ähnliche Kondensation dieses Essigsäureadditionssalzes mit dem aktivierten Ester von Chb=Cys-OH beschriebenen Bedingun-

Acm

gen. Behandeln des zuletzt genannten Pentapeptids unter mild-sauren Bedingungen, wie oben beschrieben, wobei man 70 bis 80 % Essigsäure verwendet, führt auf leichte Weise zum entsprechenden Pentapeptid H-Cys-Lys-Asn-Phe-Phe-OMe.

Trt Boc

Die zuletzt genannte Verbindung wird anschließend mit dem aktivierten Ester Boc-Ala-Gly-OTcp auf dieselbe Weise wie zuvor für die Kondensation von H-Cys-Lys-Asn-Phe-Phe-OMe

I I

Acm Boc

mit demselben aktivierten Ester (d.h. dem Dipeptidfragment 1-2) beschrieben, kondensiert, wobei man Boc-Ala-Gly-Cys-Lys-Asn-Phe-Phe-OMe erhält. Die anschlies-

Trt Boc

sende Reaktion der zuletzt genannten Verbindung mit Hydrazinhydrat unter denselben Bedingungen der vorherigen Reaktion mit Hydrazinhydrat, liefert das gewünschte erste Heptapeptid der Formel Boc-Ala-Gly-Cys-Lys-Asn-Phe-Phe-NHN^.

Trt Boc

Zweites Heptapeptid

Eine praktische und bequeme Herstellung für das zweite Heptapeptid, worin R für COOH steht, ß die Bedeutungen Acm oder

1 2
Trt besitzt und γ, γ und γ " entweder alle Wasserstoff oder alle Bu (Fragment 8-14) bedeuten, wird erreicht, indem man ein Hexapeptid mit einer geschützten Aminogruppe (Fragment 8-13) herstellt, dieses mit S-Acetamidomethylcystein (H-Cys-OH) oder S-Tritylcystein (H-Cys-OH) kuppelt und die

I t

Acm Trt

terminale aminoschützende Gruppe entfernt.

- 28 -509824/10 10

M/15 563

Insbesondere wird das Hexapeptid hergestellt, indem man einen niedrigen Alkylester des Serinderivats der Formel H-Ser-OH,

'2

2 t ^Y

worin γ für Wasserstoff oder Bu steht, vorzugsweise den Serinmethylester (H-Ser-OMe) oder 0-t-Butylserinmethylester (H-Ser-OMe) mit einem aktivierten Ester von Benzyloxycarbonyl

threonin (Z-Thr-OH) oder Benzyloxycarbonyl-(O-t-butyl)-threonin (Z-Thr-OH) umsetzt, wobei man den entsprechenden niedrigen

Alkylester des Dipeptide der Formel Z-Thr-Ser-OH, vorzugswei-

I₁ I₂

γ γ

1 2 se Z-Thr-Ser-OMe, erhält, wobei γ und γ jeweils Wasserstoff

«1 «2

γ γ

oder jeweils Bu bedeuten. Die terminale Aminoschutzgruppe (Z) der zuletzt genannten Verbindung wird durch Hydrieren in Gegenwart eines Edelmetallkatalysators entfernt, wobei man den entsprechenden niedrigen Alkylester des D'ipeptids der Formel

H-Thr-Ser-OH, vorzugsweise H-Thr-Ser~OMe erhält* »1 ^!2 »1 '2

γ γ Ύ Y

Der zuletzt genannte Dipeptidniedrigalkylester, vorzugsweise der Methylester, wird anschließend mit einem aktivierten Ester von Z-Phe-OH umgesetzt, wobei man den entsprechenden niedrigen Alkylester der Formel Z-Phe-Thr-Ser-OH, vorzugsweise

■ «1 »2 ■

-.■-■■ YT

Z-Phe-Thr-Ser-OMe erhält, v;orin γ und γ die obigen Bedeu-Ί '2

YY-;

tungen. besitzen, von dem die terminale Aminogruppe (Z) anschließend durch Hydrieren in Gegenwart eines Edelmetall- · katalysators entfernt wird, wobei man den entsprechenden Tripeptidniedrigalkylester von H-Phe-Thr-Ser-OH, vorzugsweise

. ■ »1 »2 .

YY

H-Phe-Thr-Ser-OMe, erhält.

•1 ^l2

YY

509824/1010

Anschließend wird der zuletzt genannte Tripeptidester, vorzugsweise der Methylester, mit einem aktivierten Ester von

1 2 Z-Thr-OH, worin γ für Wasserstoff steht, wenn γ und γ des

zuvor genannten Tripeptids "beide Wasserstoff bedeuten oder

t 1 ?

worin γ für Bu steht, wenn γ und γ" des zuvor genannten

Tripeptids beide Bu bedeuten, umgesetzt, wobei man den entsprechenden Tetrapeptidniedrigalkylester von Z-Thr-Phe-Thr-Ser-

i ' Ί «2

γ γ γ

OH, vorzugsweise Z-Thr-Phe-Thr-Ser-OMe, erhält, worin γ, γ

ι Μ '2 " '

γ γ υ

ρ
und γ die vorstehenden Bedeutungen besitzen. Wiederum wird die terminale Aminoschutzgruppe (Z) der zuletzt genannten Verbindung durch Hydrieren in Gegenwart eines Edelmetallkatalysators entfernt, wobei man den entsprechenden Tetrapeptidniedrigalkylester von H-Thr-Phe-Thr-Ser-OH, vorzugsweise

» »1 '2

γ γ γ

H-Thr-Phe-Thr-Ser-OMe, erhält.

t I₁ t₂

YYY

Anschließend v/ird die zuletzt genannte Verbindung mit einem aktivierten Ester von Z-Lys-OH umgesetzt, wobei man den niedri-

Boc

gen Alkylester von Z-Lys-Thr-Phe-Thr-Ser-OH, vorzugsweise

• ' «1 «2

Boc γ γ γ

1 2

Z-Lys-Thr-Phe-Thr-Ser-OMe, erhält, worin γ, γ und γ die ι j ' 1 ' 2

Boc γ YY

obigen Bedeutungen besitzen, gefolgt von Entfernen der terminalen Aminoschutzgruppe (Z) der zuletzt genannten Verbindung durch Hydrieren in Gegenwart eines Edelmetallkatalysators, wobei man den entsprechenden Pentapeptidniedrigalkylester

von H-Lys-Thr-Phe-Thr-Ser-OH, vorzugsweise « ι 11 «£

Boc YYY

H-Lys-Thr-Phe-Thr-Ser-OMe, erhält.

t ι '1 '2

Boc YYY

- 30 509824/1010

M/15 563

Die zuletzt genannte Verbindxmg wird anschließend mit einem aktivierten Ester von Ddz-Trp-OH umgesetzt, wobei man den entsprechenden niedrigen Alkylester von Ddz-Trp-Lys-Thr-Phe-

I t

Boc γ Thr-Ser-OHj vorzugsweise Ddz-Trp-Lys-Thr-Phe-Thr-Ser-OMe,

1-1 1 Ο ti ' 1 '2

γ y - Boc γ γ γ

1-2
erhält, worin γ, γ und γ die obigen Bedeutungen besitzen, der wiederum mit Hydrazinhydrat umgesetzt wird, wobei man

das entsprechende Hexapeptidhydrazid

1 Ddz-Trp-Lys-Thr-Phe-Thr^Ser-NHNEU isoliert, worin γ, γ und γ

Boc YYY

die obigen Bedeutungen besitzen. Dieses zuletzt genannte Hydrazid ist das Hexapeptid-Fragment 8-13, auf das zuvor Bezug genommen wurde.

Das vorstehende Hexapeptid-(Fragment 8-13) wird nun mit

H-Cys-OH gekuppelt, worin ß für Acm oder Trt steht, und zwar t

gemäß der Azidkupplungsmethode, wobei man das entsprechende Heptapeptid, Ddz-Trp-Lys-Thr-Phe-Thr-Ser-Cys-OH, erhält, worin

Boc γ γ γ ß

12

β, γ, γ und γ die vorstehenden Bedeutungen besitzen. Behandeln der zuletzt genannten Verbindung unter mild-saureri Bedingungen liefert das gewünschte zweite Heptapeptid gernäß der Erfindung.

In einer bevorzugten Ausführ ungsform wird das zweite Heptapeptid auf die nachfolgende Weise hergestellt:

Das bevorzugte erste Ausgangsmaterial ist entweder Serinmethylester oder sein entsprechendes hydroxygeschütztes Derivat G-t-Butylserinmethylester, beschrieben von E. Schröder, Justus Liebigs Ann.Chem., 670, 127 (1963).

- 31 509824/ 1010

M/15 563

Das bevorzugte zweite Ausgangsmaterial ist einer der nachfolgenden aktivierten Ester: Benzyloxycarbonylthreonin-pentachlorphenylester, hergestellt aus Pentachlorphenol und Benzyloxycarbonyl threonin, beschrieben von E. Wünsch und J.Jentsch, Chem.Ber., 97, 2490 (1964) oder Benzyloxycarbonyl-(O-t-butyl)-threonin-1-benzotriazolylester, hergestellt auf die zuvor für solche Ester aus Benzyloxycarbonyl-(O-t-butyl)-threonin beschriebene Weise, der von E. Schröder, obiges Zitat, beschrieben wurde.

Bezüglich der ersten Stufe der vorliegenden Ausfuhrungsform \\^rird der Serinmethylester oder sein entsprechendes hydroxygeschütztes Derivat mit einem der vorstehenden aktiven Ester kondensiert, wobei man das entsprechende Dipeptidderivat

der Formel Z-Thr-Ser-OMe erhält. Wenn der Serinmethylester •1 »2

γ γ

(H-Ser-OMe) als das erste Ausgangsmaterial verwendet wird, wird er vorzugsweise mit Benzyloxycarbonylthreonin-pentachlorphenylester kondensiert, und wenn 0-t-Butylserinmethylester als erstes Ausgangsmaterial verwendet wird, wird er mit Benzyloxycarbonyl-(O-t-butyl)-threonin kondensiert. Die vorliegende Kondensation der aktivierten Ester wird ausgeführt, indem man 1,0 bis 1,2 molare Äquivalente des aktivierten Esters bezüglich des ersten Ausgangsmaterials verwendet. Es ist offensichtlich, daß Säureadditionssalze der ersten Ausgangsmaterialien, d.h. bei denen das-Peptid eine freie Aminogruppe aufweist, beispielsweise Serinmethylesterhydrochlorid, ebenso wirksame Ausgangsmaterialien für derartige Reaktionen sind, unter der Voraussetzung., daß eine angenähert äquimolare Menge einer organischen Base zur Reaktionsmischung zugesetzt wird. DMF und THF sind günstige inerte organische Lösungsmittel für diese Reaktion. Die Kondensationsreaktion wird bei Temperaturen von 0 bis 10⁰C während einer halben bis 3 Stunden eingeleitet und anschließend 10 bis 24 Std. bei 20 bis 30°C gehalten.

- 32 509824/1010

M/15 563

Das Dipeptidderivat der Formel Z-Thr-Ser-OMe, das wie oben be-

Ί ^J2

γ γ

schrieben erhalten wird, wird anschließend einer Hydrierung in Gegenwart von 5 % Palladium auf Aktivkohle (5 % Pd/C) und einer äquimolaren Menge an Pyridinhydrochlorid oder einem Überschuß an Essigsäure, unterworfen. Methanol, Äthanol, Essigsäure oder Mischungen davon sind günstige Lösungsmittel für diese Hydrierung. Auf diese Weise wird die terminale Aminoschutzgruppe (Z) des Dipeptids entfernt, wobei man das entsprechende Dipeptid der Formel H-Thr-Ser-OMe, nämlich

»1 '2

Threonylserinmethylesteroder . (O-t-Butyl)-threonyl-(O-t-butyl)-serinmethylester, erhält.

Anschließend werden durch' dreimaliges Wiederholen der letzten zwei Stufen (d.h. dem Kuppeln eines, geeigneten aktivierten Esters einer Aminosäure, in der die terminale Aminogruppe durch einen Benzyloxycarbonylrest geschützt ist, mit dem geeigneten Peptid, das eine freie terminale Aminogruppe aufweist, gefolgt von Entfernen der terminalen Aminoschutzgruppe durch Hydrieren) die zuvor genannten Dipeptidderivate der Formel H-Thr-Ser-OMe in ihrer entsprechenden Pentapeptide

Y Y

der Formel H-Lys-Thr-Phe-Thr-Ser-OMe überführt. In dem Fall,

ti »1 '2
Boc γ YY

1 2 in dem H-Thr-Ser-OMe, worin γ und γ für Wasserstoff stehen,

Ί '2

YY

so in sein entsprechendes Pentapeptid der Formel H-Lys-Thr-Phe-Thr-Ser-OMe überführt wird, sind die bevorzugten

Boc ■·

aktivierten Ester in der Reihenfolge ihrer Verwendung: Benzyloxycarbonylphenylalanin-2,4,5-trichlorphenylester, beschrieben von J. Pless und R.A. Böissonnas, Helv.Chem.Acta, 1609 (1963);

- 33 5 0 9 8 2 4/1010

\\i M/15

Bonzyloxycarboriylthroonln-pGntachlorphonylGctor (oben beschrieben) und

Benzyloxycarbonyl-N -t-butyloxycarbonyllysin-p-nitrophenylester, beschrieben von E. Sandrin und R.A. Boissonnas, HeIv.

Chem.Acta, 46, 1637 (1963).

—" 12 +

In dem Falle, in dem Z-Thr-Ser-OMe, worin γ und γ beide Bu

T₁ »2

γ γ

bedeuten, auf diese Weise in sein entsprechendes Pentapeptid der Formel H-Lys-Thr-Phe-Thr-Ser-OMe überführt wird, sind die

I 14- I -j- I +■

Boc Bu Bu Bu

bevorzugten aktivierten Ester in der Reihenfolge ihrer Verwendung: Benzyloxycarbonylphenylalanin-2,4,5-trichlorphenylester, Benzyloxycarbonyl-(0-t-butyl)-tlireonin-1-benzotriazolylester und N^a-Benzyloxycarbonyl-N -t-butyloxycarbonyllysin-pnitrophenylester, die alle zuvor genannt wurden.

Die so erhaltenen Pentapeptide werden in ihre entsprechenden Hexapeptid-Fragmente 8-13 auf die folgende Weise überführt:

Das vorgenannte Pentapeptid der allgemeinen Formel

H-Lys-Thr-Phe-Thr-Ser-OMe wird mit dem aktivierten 1-Benzo-

i ι τι «ρ Boc γ γ γ

triazolylester von α,α-Dimethyl-3,5-dimethoxybenzylcarbonyltryptophan kondensiert, wobei man das entsprechende Kondensat Ddz-Trp-Lys-Thr-Phe-Thr-Ser-OMe erhält. Der zuletzt genannte

ι t ' 1 ' 2 Bog γ γ γ

aktivierte Ester wird aus seiner entsprechenden Säure Ddz-Trp-OH gemäß der zuvor beschriebenen Methode zur Herstellung solcher Ester hergestellt, wobei Ddz-Trp-OH zuvor von C.Birr et al., Justus Liebigs Ann.Chem. 76^, 162 (1972),'beschrieben wurde. Diese vorliegende Kondensation wird wiederum nach den oben genannten Bedingungen für die Kondensation anderer 1-Benzotriazolylester auf leichte und wirkungsvolle Weise erreicht.

509824/1010

Das zuletzt genannte Kondensat wird mit Hydrazinhydrat umgesetzt, wobei man das entsprechende Hexapeptidhydrazid der. Formel Ddz-Trp-Lys-Thr-Phe-Thr-Ser-NHNHo erhält, worin γ, γ

τ » ' 1 '2 Boc γ ' γ γ

und γ die obigen Bedeutungen besitzen. Diese besondere Reaktion erfolgt glatt und leicht, "wenn sie in einem inerten Lösungsmittel, beispielsweise Methanol, Äthanol DMF und dergleichen mit einem Überschuß an Hydrazinbydrat von beispielsweise 20 bis 50 molar Äquivalenten durchgeführt wird. Zeiten und Temperaturen sind nicht besonders kritisch bei dieser Reaktion. Zu Bedingungen, die sowohl praktisch als auch bequem für diese Reaktion sind, gehören eine Reaktionszeit von 6 Std. bis 3 Tagen und eine Reaktionstemperatur von -10 bis 30⁰C, vorzugsweise 0 bis 20 C.

Anschließend wird das obige Hexapeptidhydrazid, das Hexapeptid-Fragment 8-13, mit H-Cys-OH gekuppelt, worin ß für Acm oder Trt

steht,und zwar gemäß der Azidkupplungsmethode, die zuvor beschrieben wurde, wobei man das entsprochende Heptapeptid

Ddz-TrB-Lys-Thr-Phe-Thr-Ser-Cys-OH erhält, das bei Behandeln ι t ' 1 ' 2 '

Boc γ . · γ γ ß

unter mild-sauren Bedingungen, vorzugsweise indem man die zuletzt genannte Verbindung in einer Lösung von Essigsäure/Ameisensäure/Wasser (7:1 :·2) während 16 bis 24 Std. bei 20 bis 25°C stehen läßt, das gewünschte zweite Heptapeptid ergibt.

Bildung des linearen Tetradecapeptids

Bei der nächsten Stufe des erfindungsgemäßen Verfahrens werden das erste Heptapeptid (Fragment 1-7) und das zweite Heptapeptid (Fragment 8-14) gemäß der Azidkupplungsmethode gekuppelt, wobei man das entsprechende lineare Tetradecapeptid der Formel

- 35 - -

50 9824/1010

Boc-Ala-Gly-Cys-Lys-Asn-Phe-Phe-Tirp-Lys-Thr-Phe-Thr-Ser-Cys-OH ii > j Ί ' 2 '

α Boc Boc γ γ γ ß

1 2
worin α, ß, γ, γ und γ die obigen Bedeutlangen besitzen, erhalt.

Eine bequeme und wirksame Arbeitsweise für diese Stufe besteht darin, daß man das erste Heptapeptidhydrazid in DMF löst. Eine Lösung von ungefähr 2 bis 5 molaren Äquivalenten, vorzugsweise 3 molaren Äquivalenten, Chlorwasserstoff in Äthylacetat wird zu der zuletzt genannten Lösung bei -20 bis O⁰C, vorzugsweise -15°C, zugesetzt. Die Mischung wird auf -20 bis -10⁰C, vorzugsweise -15⁰C, gekühlt und 1,0 bis 1,5 molare Äquivalente, vorzugsweise 1,2 Äquivalente t-Butylnitrit werden zu der gerührten Lösung zugegeben. Nach ungefähr 15 Min. bei r20 bis 10⁰C, vorzugsweise -15⁰C, wird die Mischung durch Zugabe eines Überschusses an organischer Base, vorzugsweise 2 bis 5 Äquivalenten Triäthylamin oder N-Äthyldiisopropylamin alkalisch gemacht; anschließend wird im wesentlichen 1 Äquivalent des zweiten Heptapeptids zugesetzt. Eine weitere Zugabe von 1 bis 2 Äquivalenten organischer Base kann an diesem Punkt vorgenommen werden. Die Reaktionsmischung wird dann 1 bis 2 Std. bei -20 bis O⁰C und anschließend 3 bis 24 Std. bei 20 bis 30⁰C gerührt. Eindampfen des Lösungsmittels, Verreiben des Rückstands mit Wasser, Methanol oder einer Mischung von Methanol und wäßriger Zitronensäure (2 bis 5 %) und Abtrennen des Feststoffs ergibt das zuvor genannte lineare Tetradecapeptid, das ohne v/eitere Reinigung für die nachfolgende Stufe verwendet werden kann.

Somatostatin

Die Überführung des zuvor genannten linearen Tetradecapeptids in das cyclische Tetradecapeptid Somatostatin wird bequem und v/irksam ausgeführt, indem man zuerst das lineare Tetradecapeptid der Wirkung von Jod, vo.rzugsA«/eise in Gegenwart eines niedrigen Alkanols, unterwirft, wobei gleichzeitig Entfernung

50982«71010

der Sulfhydrylschutzgruppen,. d.h. der ei- und ß-Gruppen, worin α und ß für Acin oder Trt stehen, und Bildung der Disulfidbrücke erfolgen, wobei man das entsprechende zyklische Disulfidderivat der Formel

1 2 Boc Bo c ν ΎΥ

I Jl II

Boc-Ala-Gly-Cys-Lys-Asn-Phe-Phe-Tip -Lys-Thr-Phe-Thr-Ser-Cys-OH

erhält. Anschließendes Behandeln der zuletzt genannten Verbindung unter mäßig sauren Bedingungen entfernt die verbleibenden

t 1 2 t

Schutzgruppen (d.h. Boc und "Bu , wenn γ, γ und γ für Bu

stehen), wobei man Somatostatin erhält.

In einer bevorzugten Ausführungsform der obigen Umwandlung wird das lineare Tetradecapeptid in Essigsäure, Methanol, Äthanol oder einem anderen geeigneten niedrigen Alkanol, beispielsweise Propanol, Isopropanol oder Butanol gelöst. Zu dieser Lösung gibt man einen Überschuß an Jod (5 bis 2.5, vorzugsweise 10 molare Äquivalente), gelöst in demselben Lösungsmittel, vorzugsweise 2 bis 5 % Jod in Methanol. Zeit und Temperatur dieser Reaktion sind nicht kritisch, jedoch ist es wünschenswert, die Reaktion zwischen 0 und 30°C durch Einstellen der Zugabe der Jodlösung oder durch Kühlen der Reaktionsmischung oder durch eine Kombination von beidem, zu halten. Unter diesen Bedingungen erfordert die Zugabe üblicherweise 30 bis 60 Minuten.. Nach der Zugabe wird die Mischung 30 bis 120 Min., vorzugsweise 60 Min., bei 20 bis 30⁰C gerührt. Anschließend wird die Mischung auf ungefähr O⁰C gekühlt und ein Überschuß eines milden Reduktionsmittels, vorzugsweise Natriumthiosulfat in wäßriger Lösung, wird zugesetzt. Die Mischung wird konzentriert und der Rückstand wird in "Wasser suspendiert. Sammeln des festen Materials liefert das _x gewünschte entsprechende zyklische Disulfidderivat.

- 37 509824/1010

Alternativ kann das lineare Tetradecapeptid in das zuvor genannte entsprechende zyklische Disulfidderivat durch, die Methode von R.G. Hiskey und R.L. Smith, J. Amer. Chera. Soc., 90, 2677 (1968) unter Verwendung von Thiocyan überführt werden.

Wiederum alternativ wird das zuletzt genannte Derivat auch durch selektives Entfernen der Sulfhydrylschutzgruppen des obigen linearen Tetradecapeptids durch die Wirkung eines Quecksilber- oder Silbersalzes, beispielsweise Quecksilberacetat, Quecksilberchlorid, Silberacetat oder Silbernitrat in einem inerten organischen Lösungsmittel, beispielsweise DMF oder Essigsäure gemäß bekannten Methoden entfernt; vergl. beispielsv/eise B. Kamber und N. Rittel, HeIv. Chem. Acta, 52_, 1074 (1964), L. Zervas et al., J. Amer.Chem.Soc. 87, 4922 (1965) und R.G. Denkewalter et al., J. Amer. Chem. Soc, 91, 502 (1969). Das entsprechende Quecksilber- oder Disilbersalz wird, dann durch Schwefelwasserstoffbehandlung in das entsprechende freie Disulfhydrylderivat überführt; vergl. L.Zervas et al, obiges Zitat. Das zuletzt genannte Derivat wird dann in das zuvor genannte zyklische Disulfidderivat durch ein mildes Oxydationsmittel, ausgewählt unter Jod - gemäß der zuvor beschriebenen Methode, Sauerstoff - gemäß der Methode von J. Rivier et al., CR. Acad. Sei. Ser. D, 276, 2737 (1973), 1,2-Dijodäthan - gemäß der Methode von F. Weygand und G. Zumach, Z. Naturforsch. 17b, 807 (1962) und Natriumoder Kaliumhexacyanoferrat-III - gemäß der Methode von D. Jarvis et al., J. Amer. Chem. Soc, 83, 4780 (I96I) überführt.

Schließlich wird das zuvor genannte zyklische Disulfidderivat in .Somatostatin überführt, indem man es mäßig-sauren Bedingungen unterwirft, wodurch die verbleibenden Schutzgruppen des zyklischen Disulfidderivats entfernt werden. Im allge-

• *

- 38 -509824/1010

meinen wird diese Stufe ausgeführt, indem man das zyklische Disulfidderivat in einem wäßrigen Reaktionsmedium, das eine Mineralsäure enthält, bei 0 bis 20⁰C während 10 bis ungefähr 60 Min. löst. Zu Beispielen solcher Medien gehören Trifluoressigsäure, 10 bis 20 %ige wäßrige Schwefelsäure, 10 ?oige Phosphorsäure, 10 bis 30 %±ge Bromwasserstoffsäure und 10 bis 30-%lge Chlorwasserstoffsäure. Ein außerordentlich brauchbares Medium ist konzentrierte Chlorwasserstoffsäure. Zu bevorzugten Bedingungen für die vorliegende Stufe gehören Auflösen des zyklischen Disulfids in einem Minimum konzentrierter Chlorwasserstoffsäure, die auf O⁰C gekühlt wurde, und Stehenlassen der Mischung bei 0 C während 5 bis 10 Min. unter einer Stickstoffatmosphäre. Anschließend gibt man 10 Vol. Eisessig zu und ..kühlt, die Lösung auf ungefähr -70⁰C und lyophilisiert, wobei man Somatostatin erhält. Das letztere Produkt wird durch Ionenaustauscherchromatographie weiter gereinigt, wobei man vorzugsweise einen Carboxymethylcellulose-Kationenaustauscher und Ammoniumacetat als Eluiermittel verwendet. In diesem Falle wird das Produkt in Form seines Säureadditionssalzes mit Essigsäure erhalten. Alternativ wird das Produkt durch VerteilungsChromatographie auf chemisch modifiziertem, vernetztem Dextran, beispielsweise Sephadex LH-20 oder Sephadex G-25 unter Verwendung von Methanol oder Essigsäure als eluierendes Lösungsmittel, gereinigt. In dem Falle, in dem Sephadex LH-20 verwendet wird, wird das Produkt als freies Peptid erhalten. In dem Falle, in dem Sephadex G-25 und Essigsäure eingesetzt werden, erhält man das Produkt in Form seines Essigsäureadditionssalzes* Eindampfen der Sluate, Aufnehmen des Rückstands- in Wasser und Lyophilisieron liefert im wesentlichen reines erfindungsgemäßes Te tr ade cap ejgtid, nämlich das zyklische Disulfid von Alanylglycyl-cysteinyllysylasparaginyl-phenylalanyl-phenylalanyl-tryptophyllysylthreonyl-phenylalanyl-threonylseri^lcystein.

- 39 509824/1010

M/15 563

Lineare reduzierte Form

Die lineare reduzierte Form von Somatostatin erhält man, indem man die Schutzgruppen vom zuvor genannten linearen Tetradecapeptid der Formel

Boc-Alä-Gly-Cys-Lys-Asn-Phe-Phe-Trp-Lys-Thr-Phe-Thr-Ser-Cys-OH

Il I I · I Λ I Ο '

α Boc Boc γ γ γ ß

1 2
worin α, ß, γ, γ und γ die obigen Bedeutungen besitzen, oder

vom zuvor genannten Disulfhydrylderivat der Formel Boc-Ala-Gly-Cys-Lys-Asn-Phe-Phe-Trp-Lys-Thr-Phe-Thr-Ser-Cys-OH

I Il I Λ Ι Ο

Boc Boc Y₁ YY

12

worin γ, γ und γ die obigen Bedeutungen besitzen, unter mäßigsauren Bedingungen entfernt. Bevorzugte Bedingungen für diese Entschützungsstufe umfassen Auflösen des linearen Tetradecapeptids in konzentrierter Chlorwasserstoffsäure bei 0 bis 5⁰C in einer inerten Atmosphäre, beispielsweise Stickstoff oder Argon. Die Mischung wird 5 bis 10 Min. bei dieser Temperatur gehalten. Anschließendes Isolieren der linearen reduzierten Form wird auf dieselbe Weise wie zuvor für die Isolierung von Somatostatin beschrieben durchgeführt.

Auch die lineare reduzierte Form erhält man direkt durch Reduktion von Somatostatin. Reduktion mit Dithiothreitol gemäß der Methode von W.W. Cleland, Biochem. J5> 480 (1964) ist bevorzugt, obgleich auch andere Mittel, von denen bekannt ist, daß sie bei der Reduktion zyklischer Disulfide zu den entsprechenden Disulfhydrylderivaten v/irksam sind, anwendbar sind, beispielsweise Natriumbisulfit, gefolgt von Hydrolyse des intermediären Dithiosulfatderivats,

- 40 -

50982 4/1010

k4 M/15 563

(^b) Verbindungen I und Ia (R¹ = H und R² « COOH)

Das diesbezügliche erste Heptapeptidderivat, worin R Wasserstoff bedeutet und α für Trt steht, wird wie folgt hergestellt:

Der aktivierte Ester des Dipeptid-Fragments 1-2 wird erhalten, indem man Propionylglycin (beschrieben duröh L.D.Abbott, Jr., J.Biol.Chem., 1^5, 242 (1942) und hergestellt gemäß dem Verfahren von S.C.J. Fu und D.S.H. Mak, J. Chromatog., 54, 205 (1971)) mit im wesentlichen einem molaren Äquivalent 2,4,5-Trichlorphenol in einem inerten organischen Lösungsmittel, vorzugsweise Dimethylformamid (DMF) oder Tetrahydrofuran (THF) in Gegenwart von Dicyclohexylcarbodiimid (DCC, 1 bis 1,5 molare Äquivalente) bei -20 bis 10⁰C, vorzugsweise O⁰C, während ungefähr 1 Stunde,- anschließend bei 20 bis 3O⁰C während ungefähr 10 bis 24 Stunden, umsetzt. Auf diese Weise erhält man den aktivierten Ester, d.h. den 2,4,5-Trichlorphenylester von Propionylglycin.

In der nächsten Stufe wird der zuletzt genannte aktivierte Ester mit dem Pentapeptid (Pentapeptid-Fragment 3-7) H-Cys-Lys-Asn-Phe-Phe-OMe (zuvor beschrieben)' kondensiert,

tr

Trt Boc
wobei man CHzCHoCO-Gly-Cys-Lys-Asn-Phe-Phe-OMe erhält. Zu be-

Trt Boc

vorzugten Bedingungen für diese Kondensation gehören Auflösen des Essigsäureadditionssalzes dieses Pentapeptids in einem inerten organischen Lösungsmittel, vorzugsweise DMF, und Zusetzen einer ausreichenden Menge einer organischen Base, vorzugsweise N-Äthylmorpholin, bei 0 bis 1Q⁰C, um den pH der Mischung zwischen pH 7 und pH 8 zu halten. Ungefähr 1,0 bis 1,25 molare Äquivalente an CH^CtLjCo-Gly-OTcp und eine katalytische Menge an T-Hydroxybenzotriazol. im inerten organischen

- 41 - *

509824/1010

.5 563

Lösungsmittel, vorzugsweise DHF, werden dann zu der zuletzt genannten Lösung zugegeben und die erhaltene Mischung wird 2 bis 4 Tage bei 0 bis 1O°C gehalten. Anschließend wird der Heptapeptidester CH^CI-^CO-Gly-Cys-Lys-Asn-Phe-Phe-OMe aus der

Trt Boc Reaktionsmischung isoliert.

Der zuletzt genannte Heptapeptidester wird leicht in das entsprechende erste Heptapeptid, worin R für Wasserstoff steht und α die Bedeutung Trt besitzt, durch Reaktion mit einem Überschuß (20 bis 50 molare Äquivalente) Hydrazinhydrat überführt. Zu bevorzugten Bedingungen gehören Behandeln des zuletzt genannten Esters in einem inerten organischen Lösungsmittel, beispielsweise Methanol oder Dt¹IF, mit 30 bis 40 molaren Äquivalenten an Hydrazinhydrat bei 20 bis 3O⁰C während 1 bis Tagen. Abtrennen des Niederschlags ergibt das gewünschte erste Heptapeptid der Formel CH-CI^-CO-Gly-Cys-Lys-Asn-Phe-Phe-NHN^

Trt Boc

(d.h. das erste Heptapeptidderivat, worin R für Wasserstoff steht).

In der nächsten Stufe des Verfahrens werden das zuvor genannte erste Heptapeptidderivat (Fragment 1-7) und ein zweites Heptapeptid (Fragment 8-14) der Formel H-Trp-Lys-Thr-Phe-Thr-Ser-Cys-OH,

! I +- t 4- I -I- I

Boc. Bu^υ Bu^ Bu Trt

oben unter (a) beschrieben, vergl. auch unten, nach der Azidkupplungsmethode gekuppelt, wobei man das entsprechende lineare Tetradecapeptidderivat der Formel

CH^CH^CO-Gly-Cys-Lys-Asn-Phe-Phe-Trp-Lys-Thr-Phe-Thr-Ser-Cys-OH Trt Boc Boc Bu Bii* Bu Trt

erhält.

Eine bequeme und wirksame Arbeitsweise für diese Stufe besteht

- 42 5 0 9 8 2 4/1010

h-v -M/¹5

darin, daß man das erste Heptapeptidhydrazid in DMF löst. Eine Lösung von ungefähr 2 bis 5 molaren Äquivalenten, vorzugsweise 3 molaren Äquivalenten Chlorwasserstoff in Äthylacetat wird zu der zuletzt genannten Lösung bei -20 bis -10⁰C, vorzugsweise bei'ungefähr -15⁰C, zugegeben und 1,0 bis 1,5 molare Äquivalente, vorzugsweise 1,2 Äquivalente, t-Butylnitrit werden zu der gerührten Lösung zugegeben. Nach ungefähr ,15- Min. bei -20 bis 1O°C wird die Mischung durch. Zugabe eines Überschusses einer organischen Base, vorzugsweise 2 bis 5 Äquivalenten N-Äthyldiisopropylamin, alkalisch gemacht; anschließend wird im wesentlichen 1 Äquivalent des zweiten Heptapeptids zugegeben. Eine weitere Zugabe von 1 bis 2 Äquivalenten organischer Base kann an diesem Punkt erfolgen. Die Reaktionsmischung wird dann bei -10 bis 0⁰C während 1 bis 2 Std. und anschließend bei 20 bis 30⁰C während 15 "bis 25 Std, gerührt. Eindampfen des Lösungsmittels, Verreiben des Rückstands mit Wasser, Methanol oder einer Mischung von Methanol und.wäßriger Zitronensäure (2 bis 5 %) und Abtrennen der Feststoffe ergibt das zuvor genannte lineare Tetradecapeptid, das ohne v/eitere Reinigung für die nachfolgende Stufe verwendet werden kann (vergl.. unten).

Das zuvor genannte diesbezügliche zweite Heptapeptid der Formel H-Trp-Lys-Thr-Phe-Thr-Ser-Cys-OH, das in Abschnitt (a)

» I -f- 1 4- t 4- !

Boc Bu- Bu Bu Trt · . '

beschrieben ist, erhält man leicht, indem man Ö-t-Butylserinmethylester mit einem aktivierten Ester von Benzyloxycarbonyl-(O-t-butyl)-threonin umsetzt, wobei man Z-Thr-Ser-OMe

1+ Bu⁰

erhält.

Die terminale Aminoschutzgruppe (Z) der zuletzt genannten Verbindung wird anschließend durch Hydrieren in Gegenwart eines Edelmetallkatalysators entfernt, wobei man H-Thr-Ser-OMe erhält. Bu¹^ Bu*

- 43 509824/1010

L) 4 M/15 563

Der zuletzt genannte Methylester wird anschließend mit einem aktivierten Ester von Z-Phe-OH umgesetzt, wobei man Z-Phe-Thr-Ser-OMe erhält, von der die terminale Aminoschutz-

! -J- I 4-

¹³ Bu

gruppe (Z) anschließend durch Hydrieren in Gegenwart eines Edelmetallkatalysators entfernt wird, wobei man H-Phe-Thr-Ser-OMe erhält.

Danach wird der letztere Tripeptidester mit einem aktivierten Ester von Z-Thr-OH umgesetzt, wobei man Z-Thr-Phe-Thr-Ser-OMe

•t 't ' t ' +

Bu Bu Bu^x Bu^

erhält. Wiederum wird die terminale Aminoschutzgruppe (Z) der zuletzt genannten Verbindung durch Hydrieren in Gegenwart eines Edelmetallkatalysators entfernt, wobei man H-Thr-Phe-Thr-Ser-OMe erhält. Die letztere Verbindung wird

14- 14- !4-

Bu^x Bu^x Bu
mit einem aktivierten Ester von Z-Lys-OH umgesetzt, v/obei man

Boc Z-Lys-Thr-Phe-Thr-Ser-OMe erhält, gefolgt von Entfernen der

» !4- t 4- I 4-

Boc Bu Bu^x BtT

terminalen Aminoschutzgruppe (Z) der zuletzt genannten Verbindung durch Hydrieren in Gegenwart eines Edelmetallkatalysators, wobei man H-Lys-Thr-Phe-Thr-Ser-OMe erhält.

t 14- JJ-IJ.

Boο Bu Bu^x ^

Die zuletzt genannte Verbindung wird nun mit einem aktivierten Ester von Ddz-Trp-OH umgesetzt, wobei man Ddz-Trp-Lys-Tlir-Phe-Thr-Ser-OMe erhält, das wiederum mit Boc Bu Bu^x Bu^x

Hydrazinhydrat umgesetzt wird, wobei das entsprechende Hexapeptidhydrazid Ddz-Trp-Lys-T3ir-Phe-Thr-Ser-NHNHo isoliert

! If I 4- I +■ . ^

Boc Bu^x Bu^x Bu

wird. Dieses letztere Hydrazid ist das Hexapeptid-Fragment 8-13. Dieses Hexapeptid (Fragment 8-13) wird nun mit H-Cys-OH

Trt - 44 -

509824/1010

Μ/15 563

gemäß der Azidkupplungsmethode gekuppelt, wobei" man das entsprechende Heptapeptid Ddz-Trp-Lys-Thr-Phe-Thr-Ser-Cys-OH

Boc Bu Bu Bu .Trt erhält. Behandeln der letzteren Verbindung unter mild-sauren Bedingungen liefert das 'gewünschte zweite Heptapeptid, worin

p · 12t

R für COOH steht und γ, γ ' und γ jeweils Bu bedeuten.

Die Umwandlung des vorhergehenden linearen Tetradecapeptid-

1 2

derivats, worin R Wasserstoff bedeutet und R Carboxyl darstellt, das wie oben beschrieben erhalten wird, in die Ver-

1 2
bindung der Formel I (R = H und R = COOH) v/ird bequem und wirksam erreicht, indem man zuerst das lineare Tetradecapeptid der Wirkung von Jod (wie zuvor für die Herstellung des zyklischen Tetradecapeptidderivats in (a) beschrieben) unterwirft, wobei gleichzeitiges Entfernen der Sulfhydrylschutzgruppen, d.h. Trt, und Bildung der Disulfidbrücke erfolgen, wobei man das entsprechende zyklische Disulfidderivat der Formel

Boc Boc Bu Bu Bu

CH^CHp-CO-Gly-Cys-Lys-Asn-Phe-Phe-Trp-Lys-Thr-Phe-Thr-Ser-Cys-OH

³ I I

erhält. Anschließende Behandlung der zuletzt genannten Verbindung unter mäßig-sauren Bedingungen führt zur Entfernung der verbleibenden Schutzgruppen (d.h. Boc und Bu ), wobei man die Verbindung der Formel I (R = H und R = COOH) erhält.

Alternativ kann das lineare Tetradecapeptid in das zuvor genannte entsprechende zyklische Disulfidderivat gemäß der Methode von R.G. Hiskey und R.L.Smith, J. Airier.Chem« Soc, 90, 2677 (1968) unter Verwendung von Thiocyan überführt werden.

Wiederum alternaitv wird das zuletzt genannte Derivat auch erhalten, indem man selektiv die Sulfhydrylschutzgruppen des

- 45 5 09824/1010

M/15 563

obigen linearen Tetradecapeptids durch die Wirkung eines Quecksilber- oder Silbersalzes, beispielsweise Quecksilberacetat, Quecksilberchlorid, Silberacetat oder Silbernitrat, in einem inerten organischen Lösungsmittel, beispielsweise DMF oder Essigsäure gemäß bekannten Methoden, vergl. beispielsweise B. Kamber und ¥. Rittel, HeIv. Chem. Acta, f32, 1074 (1964), L. Zervas et al., J. Amer. Chem. Soc. 87, 4922 (1965) und R.G. Denkewalter et al., J. Amer. Chem. Soc., 91_, 502 (1969), entfernt.

Das entsprechende Quecksilber- oder .Disilbersalz wird dann durch Schwefelwasserstoffbehandlung in das entsprechende frei Disulfhydrylderivat überführt, vergl. L. Zervas et al., obiges Zitat. Das letztere Derivat wird dann in das zuvor genannte zyklische Disulfidderivat durch ein mildes Oxydationsmittel, ausgewählt unter Jod - gemäß der vorstehend beschriebenen Methode, Sauerstoff - gemäß der Methode von J. Rivier et al., CR. Acad. Sei. Ser. D, '276, 2737 (1973), 1,2-Dijodäthan - gemäß der Methode von P. Weygand und G. Zumach, Z. Naturforsch. 17b, 807 (1962) und Natrium- oder Kaliumhexacyanoferrat-III - gemäß der Methode von D. Jarvis et al., J. Amer. Chem. Soc, 83, 4780 (1961), überführt.

Schließlich wird das zuvor genannte zyklische Disulfidderi-

1 2

vat in das Tetradecapeptid der Formel I (R = H und R = COOH) überführt, indem man es mäßig-sauren Bedingungen unterwirft, wobei die verbleibenden Schutzgruppen des zyklischen Di-'sulfidderivats entfernt werden. Im allgemeinen wird diese Stufe ausgeführt, indem man das zyklische Disulfidderivat in einem wäßrigen Reaktionsmedium, das eine Mineralsäure- enthält, bei 0 bis 20⁰C während 10 bis ungefähr 60 Min. löst. Zu Beispielen für solche Medien gehören Trifluoressigsäure, 10 bis 20 %ige wäßrige Schwefelsäure, 10 %ige Phosphorsäure, 10 bis 30 %ige Bromwasserstoffsäure und 10 bis 30 ?oige Chlorwasserstoffsäure. Ein äußerst brauchbares Medium.ist konzen-

- 46 -509824/1010

M/15 563

trierte Chlorwasserstoffsäure. Zu bevorzugten Bedingungen für die vorliegende Stufe gehören Auflösen des zyklischen Disulfids in einem Minimum an konzentrierter Chlorwasserstoffsäure," die auf 0⁰C gekühlt ist und Stehenlassen der Mischung bei 0°C während 5 bis 10 Min. unter Stickstoffatmosphäre. Anschließend gibt man 10 Vol. Eisessig zu und kühlt die Lösung auf ungefähr -70⁰C und lyophilisiert, wobei man das zyklische Tetradecapeptid erhält. Das zuletzt genannte Produkt wird durch lonenaustauscherchromatographie, vorzugsweise .unter Verwendung eines Carboxymethylcellulose-Kationenaustausehers und Ammoniumacetät als Eluiermittel, weiter gereinigt. In diesem Falle wird das Produkt in Form seines Säureadditionssalzes mit Essigsäure erhalten. Alternativ wird das Produkt durch Verteilungschromatographie auf chemi'Sch-modifiziertemvernetztem Dextran, beispielsweise Sephadex LH-20 oder Sephadex G-25 unter Verwendung von Methanol oder Essigsäure als eluiereiides Lösungsmittel, gereinigt. In dem Fall, in dem SephatexLH-20 eingesetzt wird, wird das Produkt in Form des freien Peptids erhalten. In dem Fall, in dem Sephatex G-25 und Essigsäure verwendet v/erden, erhält man das Produkt in Form seines Essigsäureadditionssalzes. Eindampfen der Eluate, Aufnehmen des Rückstands in Wasser und Lyophilisieren liefert ein im wesentlichen reines Tetradecapeptid der Formel I

1 " 2
(R = H und R = COOH), das zyklische Disulfid von Propionylglycylcysteinyl-lysylasparaginyl-phenylalanyl-phenylalanyltryptophi^l-lysylthreonyl-phenylalanyl-threonylserylcystein.

Die lineare reduzierte Form des vorherigen Tetradecapeptids

12

(Ia; R=H und R = COOH) erhält man vorzugsweise durch Entfernen der Schutzgruppen vom zuvor genannten linearen Tetradecapeptid der Formel

CH^CHpCO-Gly-Cys-Lys-Asn-Phe-Phe-Trp-Lys-Thr-Phe-Thr-Ser-Cys-OH. Trt Boc Boc Bu . Bu^ Bu Trt

- 47 -509824/1010

ug M/15 563

Günstige Bedingungen für diese Entschützungsstufe bestehen darin, daß man das lineare Tetradecapeptid in konzentrierter Chlorwasserstoffsäure auf die zuvor für die Herstellung des linearen reduzierten Tetradecapeptids in (a) beschriebene "Weise auflöst.

Die lineare reduzierte Form wird auch direkt erhalten, in-

1 2 dem man das Tetradecapeptid der Formel I (R = H und R =

COOH) auf die in (a) beschriebene Weise reduziert.

1 ?

(c) Verbindungen I und Ia (R = NH_? und R = H)

Bezüglich des zweiten Heptapeptidderivats-'(Fragment 8-14) der Formel H-Trp-Lys-Thr-Phe-Thr-Ser-NHCHpCH-S-Trt v/ird

I 1 4- 1 4- I 4· C-C.

Boc Bu Bu Bu

zuerst eine praktische und bequeme Herstellung des Heptapeptidderivats durchgeführt, indem man ein Hexapeptid mit einer geschützten terminalen Aminosäure (Fragment 8-13) kuppelt, die zuletzt genannte Verbindung mit 2-Tritylthioäthylamin kuppelt und die terminale Aminoschutzgruppe entfernt. Das zuletzt genannte Heptapeptidderivat (Fragment 8-14) wird anschließend mit dem ersten Heptapeptid (Fragment 1-7) gekuppelt.

Insbesondere wird das Heptapeptidderivat (Fragment 8-14) hergestellt, indem man das Hexapeptidhydrazid Ddz-Trp-Lys-Thr-Phe-Tlir-Ser-riHNHp, zuvor in Abschnitt (a)

Boc Bu Bu⁰ Bu

beschrieben, mit 2-Tritylthioäthylamin (beschrieben von F. I. Carroll, et al., J. Org. Chem., 3.0, 36 (1965)) gemäß der Azidkupplungsmethode, die zuvor beschrieben wurde, kuppelt, wobei man das entsprechende Heptapeptidderivat

Ddz-Trp-Lys-Thr-Phe-Thr-Ser-NHCHpCHoS-Trt erhält.

¹ '+ 't 't

Boc Bu Bu Bu

- 48 -

509824/1010

M/15 563

Die zuletzt genannte Verbindung führt bei Behandlung unter mild-sauren Bedingungen, vorzugsweise indem man die zuletzt genannte Verbindung in einer Lösung von Essigsäure/Ameisensäure/Wasser (7:1:2) während 16 bis 24 Std. bei 20 bis 25⁰C stehen läßt, zum zweiten Heptapeptidderivat (Fragment 8-14), H-Trp-Lys-Thr-Phe-Thr-Ser-MHCHpCHoS-Trt, Bog Bu Bu Bu

In der nächsten Stufe des vorliegenden Verfahrens werden das erste Heptapeptidhydrazid (Fragment 1-7), Boc-Ala-Gly-Cys-Lys-Asn-Phe-Phe-NHNHo, das zuvor in Abschnitt

Trt Boe

(a) beschrieben wurde und das vorherige zweite Heptapeptidderivat (Fragment 8-14), das oben beschrieben wurde, nach der Azidkupplungsmethode auf dieselbe Weise wie für die Herstellung des linearen Tetradecapeptidderivats in (a) beschrieben, gekuppelt. Auf diese Weise erhält man das lineare Tetradecapeptidderivat der Formel

Boc-Ala-GLy- Cys-Lys-Äsn-Phe-Phe-Trp-Lys-Thr-Phe- Thr-Ser-

II Ii-)- 14-14-.

Trt Boc Boc Bu Bu Bu

NHCH₂CH₂S-Trt. ■ ■ -

Die Überführung des vorgenannten linearen Tetradecapeptid-

1 2

derivats in die Verbindung der Formel I (R- = NH₂ und R = H) wird bequem und wirksam durchgeführt, indem man zuerst das • zuletzt genannte lineare Tetradecapeptidderivat der Wirkung von Jod, vorzugsweise in Gegenwart von Methanol unterwirft [wie zuvor für die Herstellung des zyklischen Tetradecapeptidderivats in (a) beschrieben], wobei die Sulfhydrylschutzgruppe, d.h. Trt, entfernt wird und die Bildung der Disulfidbrücke erfolgt, wobei man das entsprechende zyklische Disulfidderivat der Formel

- 49 509824/1010

50 M/15 563

Boc-Ala-Gly- Cys-Lys-Asn-Phe-Phe- Trp-Lys-Thr-Phe- Thr-Ser-NHCHpCIL,

J ■ ί 1 -j- I -j- I 4- C-(L

Boc Boc Bu Bu Bu

erhält.

Anschließendes Behandeln der zuletzt genannten Verbindung unter mäßig-sauren Bedingungen, vorzugsweise mit auf ungefähr O⁰C gekühlter, konzentrierter Chlorwasserstoffsäure (wie zuvor für die Herstellung des zyklischen Tetradecapeptidderivats in (a) beschrieben), entfernt die verbleibenden Schutzgruppen (d.h. Boc und Bu ), wobei man das Tetradecapeptidderivat der Forme I (R¹ = NH₂ und R² = H) mit der Struktur

H-Ala-Gly-Cys-Lys-Asn-Phe-Phe-Trp-Lys-Thr-Phe-Thr-Ser-NHCI^CHg

erhält.

Alternativ wird das zuletzt genannte Tetradecapeptid aus dem entsprechenden linearen Tetradecapeptid erhalten, indem man Thiocyan oder die Wirkung eines Quecksilber- oder Silbersalzes, gefolgt von Behandlung mit Schwefelwasserstoff und dann mit einem milden Oxydationsmittel gemäß den in (a) und (b) beschriebenen Arbeitsweisen gebraucht.

Die lineare reduzierte Form des zuletzt genannten Tetradecapeptids erhält man vorzugsweise durch Entfernen der Schutzgruppen vom zuvor erwähnten linearen Tetradecapeptid der Formel

Boc-Ala-Gly-Cys-Lys-Asn-Phe-Phe-Trp-Lys-Thr-Phe-Thr-Ser-

Ji ι t+ ι+ r-f-

Trt Boc · Boc Bu Bu

NHCH₂CH₂S-Trt. - -

- 50 -

509824/1010

54 M/15 563

Günstige Bedingungen für diese Entschützungsstufe bestehen aus Auflösen des linearen Tetradecapeptids in konzentrierter Chlorwasserstoffsäure auf die zuvor für die Herstellung des linearen reduzierten Tetradecapeptids in (a) beschriebene Weise. Alternativ erhält man die lineare reduzierte Form durch direkte Reduktion des obigen Tetradecapeptidderivats der Formel I

/ 1 2

( R = NH₀ und R = H) auf die in (a) beschriebene Weise.

*2

1 2 (d) Verbindungen I und Ia (R = H und R = H)

Die Herstellung des Tetradecapeptids der Formel I (R =· H und .p

R = H) wird auf die nachfolgende Weise leicht durchgeführt:

Das erste Heptapeptidderivat (-Fragment 1-7), CH-CHp-CO-Gly-Cys-Lys-Asn-Phe-Phe-NHNHo (zuvor in (b) be-

Trt Boc

schrieben) und das zweite Heptapeptidderivat (Fragment 8-14), H-Trp-Lys-Thr-Phe-Thr-Ser-NHCHpCHpS-Trt (zuvor in (c) be-

t t -f- I 4- I +■ C. C.

Boc Bu . Bu^ Bu

schrieben), werden gemäß der Azidkupplungsmethode gekuppelt (wie zuvor für die Herstellung des linearen Tetradecapeptidderivats in (a) beschrieben), wobei man das entsprechende lineare Tetradecapeptidderivat der Formel

CH^CH₉-CO-GIy- Cys-Lys-Asn-Phe-Phe-Trp -Lys-Thr-Phe-Thr-Ser-Trt Boc Boc Bu^X Bu^x Bu

NHCH₂CH₂S
Trt

erhält.

Die Überführung des zuletzt genannten linearen Tetradecapeptid-

- 51 -

509824/1010

' H/15 563

1 2 derivats in die Verbindung der Formel I (R = H und R = H) ■wird bequem und wirksam durchgeführt, indem man zuerst das Tetradecapeptid der Wirkung von Jod, vorzugsweise in Gegenwart von Methanol gemäß den zuvor für die Herstellung des cyclischen Tetradecapeptidderivats in (a) beschriebenen Methode, unterwirft. Unter diesen Bedingungen wird die Sulfhydrylschutzgruppe, d.h. Trt, entfernt und es erfolgt Bildung der Disulfidbrücke des linearen Tetradecapeptids, wobei man das entsprechende zyklische Disulfidderivat der Formel

CH^CH₉-CO-GIy- Cys-Lys-Asn-Phe-Phe-Trp- Lys-Thr-Phe-Thr-Ser-NHCHoCH^

Boc ■ Boc Bu Bu ^{u 0}

erhält.

Anschließendes Behandeln der zuletzt genannten Verbindung unter mäßig-sauren Bedingungen, vorzugsweise mit auf ungefähr 0⁰C gekühlter konzentrierter Chlorwasserstoffsäure (v/ie zuvor für die Herstellung des zyklischen Tetradecapeptidderivats in (a) beschrieben) führt zur Entfernung der verbleibenden Schutzgruppen (d.h. Boc und Bu ), wobei man das Tetradecapeptid der Formel I (R¹ = H und R² = H), d.h.

CH₃CH₂-CO-GIy- Cys-Lys-Asn-Phe-Phe-Trp-Lys - Tlir- Fne-Thr-Ser- NHCH₂CH₂ erhält.

Alternativ wird das zuletzt genannte Tetradecapeptid aus dem entsprechenden linearen Tetradecapeptid erhalten, indem man Thiocyan oder die Wirkung eines Quecksilber- oder Silbersalzes , gefolgt von Behandeln mit Schwefelwasserstoff und anschließend mit einem milden Oxydationsmittel gemäß den in (a) und (b) be-

- 52 509824/1010

„ M/15 563

schriebenen Arbeitsweisen, gebraucht.

Die lineare reduzierte Form des zuletzt genannten Tetradeca-

1 2

peptids, der Verbindung Ia (R = H und R = H) wird vorzugsweise durch Entfernen der Schutzgruppen vom zuvor genannten linearen Tetradecapeptid der Formel

CH-vCHp-Co-Gly-Cys-Lys-Asn-Phe-Phe-Trp-Lys-Thr-Phe-Thr-Ser-

J ^ ■ 11 114- 14-1+·

Trt Boc Boc Bu Bu^x Bu^ü

-Tr t

erhalten. Günstige'Bedingungen für diese Entschützungsstufe umfassen Auflösen des linearen Tetradecapeptids in konzentrierter ChIorwasserstoffsäure auf die, zuvor für die Herstellung des linearen reduzierten Tetradecapeptids in '(a) beschriebene Weise.

Alternativ wird die lineare reduzierte Form durch direkte Reduktion des obigen Tetradecapeptidderivats der Formel I

12

(R = H und R = H) auf die in (a) beschriebene Weise erhalten.

Das erfindungsgemäße Verfahren ist auch wirksam zur Herstellung von Tetradecapeptiden der Formeln I und Ia, worin einer oder mehr der Aminosäurereste anstelle der L-Konfiguration die D-Konfiguration aufweist. Zu Beispielen solcher Verbindungen, die in einem ihrer Aminosäurereste die D-Konfiguration aufweisen gehören

H-Ala-Gly-Cys-D-Lys-Asn-Phe-Phe-Trp-Lys-Thr-Phe-Thr-Ser-Cys-OH,

L ι

das auch als [D-Lysin ]-somatostatin bezeichnet wird, und

- 53 509824/1010

-κ Μ/15 563

H-Ala-Gly-Cys-Lys-Asn-Plie-Phe-Trp-D-Lys-Thr-Phe-Thr-Ser-Cys-OH,

I I

das auch als [ D-Lys in ]-s omatos tatin bezeichnet wird.

Die zuletzt genannten Verbindungen erhalt man, indem man das Peptidzv/ischenprodukt, welches den geeigneten L-Lysinrest erhält, durch das entsprechende Zwischenprodukt ersetzt, indem der Lysinrest aus der D-Serie'stammt.

Schließlich ist es offensichtlich,für den Fachmann, daß auch äquivalente Schutzgruppen für Amino-, Hydroxy- oder Thiolgruppen, die von den hier offenbarten Schutzgruppen verschieden sind, bei den Ausführungsformen der Erfindung verwendet v/erden können, ohne daß man den Rahmen der vorliegenden Erfindung verläßt. Beispielsweise kann Acm das Trt als Thiolschutzgruppe ersetzen. Solche offensichtliche Abänderungen befinden sich im Rahmen der vorliegenden Erfindung. Die Lehre gemäß der vorliegenden Erfindung umfaßt auch gegebenenfalls das Schützen der Hydroxygruppe während des erfindungsgemäßen Verfahrens.

Das nachfolgende Fließdiagramm und die Beispiele erläutern die

Erfindung.

angegeben.

Erfindung. In diesen Beispielen sind die Temperaturen in ⁰C

- 54 -509824/1010

cn ο co

Ui

ι Erstes Heptapeptid + Zv/eites Heptapeptid ι

Lineares Tetradecapeptid —'

Entschützung

Oxydation

,,Oxyd. Cyclisches Disulfidderivat λ- > Disulfhydry!derivat

1) Ag oder, hg

Entschützung

Tetradecapeptidderivat (I)

Red.

Red,

Oxyd. Entschützung

Lineare reduzierte Form des
Tetradecapeptidderivats (Ia)

-P--CTJ OO

VJI

A!a

GIy 2

FIGUR 1 (Synthese von Verbindung I, worin R¹ für MH _uncj r² fy_r

cn

CD CD

CO

ho

'Ui

Boc-Boc-

A H-

Boc-Boc-

Boc Boc Boc Boc-

-OMe -OMe

OH -A

Cys 3

Lys

a'

QL'

Z₇I-A

Boc

Boc

Boc'

a Boc

BoC

Boc/

Boc'

Boc⁷

Boc-Boc·

Boc/f

Phe
6

Boc-

Boc-H

Phe
7

-OMe

-OMe
-OMe

-OMe

Trp
8

OMe	Ddz
OMe	Ddz
OMe	Ddz
OMe	Ddz
OMe	H
NHNH2

Lys 9

Boc

Boc

Thr
IO

Phe

Z--A

Z
A H

Boc⁷

Boc

Boc

BoC

Boc'

Bcc'

K stehen) Thr Ser

12

₇i

H-

₇i

I/ I

7^!/

ι/

₇i

₇i

7¹

₇i

A = 0-(carboxy!aktivierende Gruppe) H-CMe

y-

-CMe ■CMe

r/.

— OMe

OMe

- OMe

-OMe -CN'e

y.

-NHNH-

Cys

771

CH

Lr! S

0~ Ui

-Γι'.' CJA

M/15 563

Beispiel 1

t-Butyloxycarbonylalanylglycin-methylester (Boc-Ala-Gly-OMe)

Zu einer auf O⁰C gekühlten gerührten Lösung von 14,18 g (0,075 Mol) t-Butyloxycarbonylalanin und 10,1 g (0,075 Mol). 1-Hydroxybenzotriazol in 150 ml DMF gibt man 18,2 g (0,088 Mol) DCC. Man rührt noch 1 Std. bei 0⁰C und anschließend eine v/eitere Stunde bei Raumtemperatur. Zu dieser Mischung gibt man eine Lösung von 10g (0,0798 Mol) Glycinmethylester-hydrochlorid in 400 ml Dr-F und 12,8 ml N-Äthylmorpholin. .Die Mischung wird über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Den Niederschlag entfernt man durch Filtrieren und das Filtrat dampft man zur Trockene ein. Der Rückstand löst man in Äthylacetat (der unlösliche Anteil wird durch Filtrieren entfernt). Die Lösung wird mit 3 x 75 ml 10 %iger wäßriger Zitronensäure, 3 χ 100 ml einer gesättigten Natriumbicarbonatlösung, 2 χ 50 ml einer gesättigten Natriumchloridlösung gewaschen und über MgSOi getrocknet. Eindampfen des Lösungsmittels führt zur Titelverbindung in Form eines Öls.

NMR (CDCl₃) cT1,33 (s, 3H), 1,42 (s, 9H), 3,75 (s, 3H). Beispiel 2

t-Butyloxycarbonylalanylglycin (Boc-Ala-Gly-OH)

Zu einer gerührten Lösung von 86 g (0,33 Mol) t-Butyloxycarbonylalanylglycin-methylester (in Beispiel 1 beschrieben) in 600 ml Methoxyäthanol gibt man tropfenweise 350 ml 1n NaOH innerhalb einiger Minuten zu. Die Reaktion ist in 2 Std. beendet. Die Reaktionsmischung wird gekühlt und mit ungefähr

■ ■ - 57 -

509 8 2 4/1010

Si M/15

60 ml einer 50 %igen Zitronensäurelösung vorsichtig auf pH 4 eingestellt·. Das Lösungsmittel wird eingedampft, der Rückstand wird in Äthylacetat gelöst und der nicht gelöste Anteil wird durch Filtrieren entfernt. Das Filtrat wird über MgSO^ getrocknet und das Lösungsmittel wird eingedampft. Das rohe Produkt wird aus Äthylacetat/Petroläther (60 - 80°) umkristallisiert, wobei man die Titelverbindung erhält.

[a]^⁵ = -9,6° (c=1, DMF), Schmelzpunkt 128⁰C (Zersetzung).

Beispiel

t-Butyloxycarbonylalanylglycin-2,4,5-trichlorphenylester (Boc-Ala-Gly-OTcp) -

Zu einer auf -10 bis -15°C gekühlten gerührten Lösung von 56 g (0,227 Mol) t-Butyloxycarbonylalanylglycin (in Beispiel 2 beschrieben) und 58,5 g (0,237 Mol) 2,4,5-Trichlorphenol in 600 ml trockenem Äthylacetat gibt man tropfenweise eine Lösung von 61 g (0,295 Mol) DCC in 100 ml Äthylacetat zu. Die Mischung wird 2 Std. bei -10⁰C, 2 Std. bei O⁰C und schließlich über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Den Niederschlag entfernt man durch Filtrieren, das Lösungsmittel wird eingedampft und der Rückstand wird in Äthylacetat gelöst (unlöslicher Niederschlag wird durch Filtrieren entfernt). Das Lösungsmittel wird eingedampft und der Rückstand wird zuerst aus Äther und anschließend aus Äthylacetat/Petroläther kristallisiert, wobei man die Titelverbindung mit Schmelzpunkt 109 bis 111°C erhält. [a£⁵ = -18,7° (c=1, DMF).

- 58 -

509824/1010

s* ^M/15

Beispiel 4

t-Butyloxycarbonylphenyl-alanylphenyl-alaninmethylester (Boc-Phe-Phe-OMe)

Zu einer gerührten, auf 0⁰C gekühlten Lösung von 21,2 g (0,08 Mol) t-Butyloxycarbonylphenylalanin (Boc-Phe-OH) und 10,8 g (0,08 Mol) 1-Hydroxybenzotriazol in 120 ml DMF gibt man 18,3 g (0,089 Mol) DCC. Die Mischung rührt man 1 Std. bei 0⁰C und anschließend eine v/eitere Stunde bei ■ Raumtemperatur. Eine Lösung von 17,6 g (0,082 Mol) Phenylalanin-methylester-hydrochlorid in 240 ml DMF und 14 ml Äthylmorpholin v/erden zugegeben und die Mischung wird über Nacht bei 25⁰C gerührt. Der Niederschlag wird durch Filtrieren entfernt und das Filtrat wird unter vermindertem Druck eingedampft. Den Rückstand löst man in Äthylacetat und die Lösung wird mit 2 χ 160 ml 10 %iger wäßriger Zitronensäure,, 3 x 200 ml gesättigtem Natriumbicarbonat und 2 χ 120 ml gesättigtem Natriumchlorid gewaschen. Die Lösung wird über MgSO, getrocknet, das Lösungsmittel wird eingedampft und der Rückstand wird aus Äthyl acetat/Pe tr ο lather umkristalli"· siert, wobei man die Titelverbindung mit Schmelzpunkt 123 bis 124⁰C erhält.

[n£⁵ = -13,4° (C=I, DMF).

B e i s ρ j e 1 5

Phenylalanylphenylalanin-methylester-trifluoracetat (H-Phe-Phe-OMe·CF₃COOH)

Man löst 25 g (0,058 Mol)· t-Butyloxycarbonylphenylalanylphenylalanin-methylester (in Beispiel 4 beschrieben) in kalter Trifluoressigsäure bei 0⁰C und rührt die Lösung 1,5 Std. bei 0 C. Die Trifluoressigsäure wird unter vermindertem Druck

- 59 -509824 /1.0 1 0

M/15

eingedampft und man gibt 1 - 5 ml Methanol zum Verdampfungsrückstand zu. Die Mischung kristallisiert und nach Zugabe von Äther werden die Kristalle durch Filtrieren abgetrennt und mit Äther gewaschen, wobei man die Titelverbindung mit Schmelzpunkt 250⁰C (Zersetzung) erhält.

[ctjjj = 10,6° (C=I, DMF) nach Umkristallisation aus Methanol/ Isopropylather.

Beispiel

t-Butyloxycarbonyl-asparaginylphenylalanyl-phenylalaninmethylester (Boc-Asn-Phe-Phe-OMe)

Zu einer Lösung von 23,7 g (0,054 Mol) H-Phe-Phe-OMe·CF^COOH (beschrieben in Beispiel 5) in 100 ml DMF gibt man 7,84 ml N-Äthylmorpholin und 22,6 g (0,055 Mol) t-Butyloxycarbonylasparagin-trichlorplienylester. Die Mischung wird 3 1/2 Tage bei 0 C gehalten. Das Lösungsmittel verdampft man und den Rückstand verreibt man mit Äther und trennt den Feststoff ab. Umkristallisieren des Feststoffs aus Methanol ergibt die Titelverbindung mit Schmelzpunkt 194 bis 195⁰C.

[a]_D = -34,0° (c=1, DMF).

Beispiel7

Benzyloxycarbonyl-N^£-t-butyloxycarbonyl-lysylasparaginylphenylalanyl-phenylalanin-methylester (Z-Lys-Asn-Phe-Phe-OMe)

Bo c

Man löst 22,5 g (0,0417 Mol) Boc-Asn-Phe-Phe-OMe (in Beispiel 6 beschrieben) in 150 ml kalter Trifluoressigsäure und rührt die Lösung 1 Std. bei O⁰C. Das Lösungsmittel wird eingedampft und der Rückstand wird in Methanol gelöst. Zugabe von

- 60 509824/ 1010

/j . M/15

Äther liefert H-Asn-Phe-Phe-OMe·CF^COOH in Form eines Feststoffs. Zu einer auf 0 C gekühlten gerührten Lösung von 9,5 g (0,0172 Mol) der zuletzt genannten Verbindung in 70 ml DMF gibt man 2,4 ml N-Äthylmorpholin und eine Lösung von 10g (0,02 Mol) Z-Lys-ONp in 50 ml DMF. Man hält die

Boc

Lösung 2 Tage bei O⁰C. Anschließend -wird das Lösungsmittel unter vermindertem Druck eingedampft. Den Rückstand kristallisiert man aus Methanol, wobei man die Titelverbindung mit Schmelzpunkt > 200°C erhält.

Analyse:

	63	C	6	H	1Q	N
ber.:	62	,79.	6	,66''	■ 10	,88
gef.:	,94	,71	,49

Beispiel 8

N-(a-Phenyl-5-chlor-2-hydroxybenzyliden)-S-acetamidomethylcystein-dicyclohexylaminsalz (Chb=Cys-OH·NH(CVILj ^ )p)

Acm

19.6 g (0,085 Mol S-Acetamidomethylcystein-hydrochlorid und

19.7 g (0,085 Mol) 5-Chlor-2~hydroxybenzophenon v/erden in einer Lösung von Tetramethy1ammoniumhydrοxyd in Methanol (340 ml, 0,5 ml'Iol/ml) gelöst. Ungefähr 5 g hydratisiertes Alkalialuminiumsilikat (3A Molekular-Siebe) werden zugegeben und die Mischung wird 1 Tag bei Raumtemperatur gerührt. Den Feststoff entfernt man durch Filtrieren und das FiItrat dampft man zur Trockene ein. Den Rückstand löst man in einer Mischung von 800 ml Eis/Wasser und das unlösliche Material entfernt man durch Filtrieren (unumgesetztes Keton). Das Filtrat kühlt man und macht mit fester Zitronensäure sauer (pH 4) und extrahiert mit 3 x 200 ml Äthylacetat. Den Extrakt

- 61 509824/1010

wascht man mit kaltem Wasser und trocknet eine kurze Zeit über MgSO, . Man entfernt das MgSO, durch Filtrieren und gibt zum Filtrat eine Lösung von 15,5 g (0,085 Mol) Dicyclohexylamin in 50 ml Äthylacetat. Die Titelverbindung wird in Form von Kristallen erhalten, die einen Schmelzpunkt von 161 bis 163⁰C besitzen.

Beispiel

N-(a-Phenyl-5-chlor-2~hydroxybenzyliden)-S-acetamidomethylcys teinyl-N^£-t-butyloxycarbonyl-lysylasparaginylphenylalanylphenylalanin-methylesterhydrat (Chb=Cys-Lys-Asn-Phe-Phe-OMe·H₉O)

Acm Boc

Eine Suspension von 12 g (20,4 mMol) N-(a-Phenyl-5-chlor-2-hydroxybenzyliden)~S-acetamidomethylcystein-dicyclohexylaminsalz (in Beispiel 8 beschrieben) in 200 ml Wasser wird durch Zugabe von ungefähr· 55 ml 10 %iger Zitronensäurelösung auf pH 4 eingestellt. Die freie Säure wird mit Äthylacetat extrahiert, der Extrakt wird mit Wasser gewaschen und über Nacht bei 0 bis 10⁰C mit wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet. (BEMERKUNG: Bei Raumtemperatur tritt Zersetzung ein). Das Lösungsmittel wird eingedampft, der Rückstand wird in 150 ml DMF gelöst und die Lösung des freien Cysteinderivates wird sofort, wie unten beschrieben, verwendet.

Eine Lösung von 11,7 g (0,0152 Mol) des geschützten Tetrapeptids, Z-Lys-Asn-Phe-Phe-OMe (beschrieben in Beispiel 7)

Boc

in 210 ml trockenem, destilliertem DMF und 210 ml Eisessig wird in Gegenwart von 1,7 g 5 % Pd/C hydriert. Die Reduktion ist in 2 Std. beendet. Den Katalysator entfernt man durch Filtrieren, das Lösungsmittel wird eingedampft und der

- 62 509824/1010

M/15 563

Rückstand wird in Methanol gelöst und mit Äther ausgefällt, wobei man das entschützte Tetrapeptid H-Lys-Asn-Phe-Phe-OMe erhält. Boc

Zu der obigen Lösung des geschützten Cysteinderivats in DMF (vide supra) gibt man 2,7 g (0,02 Mol) 1-Hydroxybenzotriazol. Zu der bei -1O⁰C gerührten Lösung gibt man 4,1 g (0,02 Mol) DCC und hält die Mischung 30 Min. bei -10⁰C, 1 Std. bei O⁰C und 1 Std. bei Raumtemperatur. Eine Lösung des entschützten Tetrapeptids (vide supra) in 200 ml DMF und 2,6 ml N-Äthylmorpholin wird zu der auf O⁰C gekühlten Mischung zugegeben und das Rühren wird über Nacht bei Raumtemperatur fortgesetzt. Den Niederschlag entfernt man durch Filtrieren und das FiItrat wird zur Trockene eingedampft. Den Rückstand löst man in Methanol und fällt mit Äther aus. Das Produkt wird aus Methanol/Wasser kristallisiert, wobei man die Titelverb indung erhält.

[α]*-⁰ = -33,3° (c=1, DIiF)

NMR (CDCl₃) cT 1,35 (s, 9H), 1,8 (s, 3H)," 3,55 (s, 3H), 1,0 - 1,6 (m, 6H).

Beispiel 10

t-Butyloxycarbonylalanylglycyl-S-acetamidomethylcysteinyl-N t-butyloxycarbonyl-lysylasparaginylphenyl-alanylphenylalaninmethylester (Boc-Ala-Gly-Cys-Lys-Asn-Phe-Phe-OMe)

ι ι

Acm Boa . ■

13,3 g (0,0127 Mol) des geschützten Pentapeptids Chb=Cys-Lys-Asn-Phe-Phe-OMe (beschrieben in Beispiel 9) werden

! I

Acm Boc

in 500 ml einer 80 %igen Essigsäurelösung gelöst und die. Lösung wird 20 Std. gerührt. Das Lösungsmittel entfernt' man un-

- 63 50 9 824/1010

M/15

ter vermindertem Druck. Den Rückstand löst man in Methanol und fällt mit Äther, wobei man H-Cys-Lys-Asn-Phe-Phe-OMe

t I

erhält. Acm Boc

[a]^⁵ =cf-29,1° (c=1, DMF).

Zu einer kalten Lösung der zuletzt genannten Verbindung in 185 ml DMF gibt man bei O⁰C 2 ml N-Äthylmorpholin bei einem pH von 8, gefolgt von einer kalten Lösung von 7,5 g (0,0176 Mol) t-Butyloxycarbonylalanylglycin-2,4,5-trichlorphenylester. Die Lösung wird 2 Tage in einem Eisbad gehalten. Das Lösungsmittel verdampft man. Den Rückstand löst man in Äthanol und fällt mit Äther. Umkristallisation des Niederschlags aus Methanol ergibt die'Titelverbindung.

[aJq⁵ = -30,9° (c=1, DMF); NMR (CDCl₃) cT1,38 (s, 18H), 3,58 (s, 3H), 7,25 (m, 10H).

Aminosäureanalyse: AIa, 1,05» Asp, 1,16; Cys, 0,174; GIy, 1,00; Lys, 1,21; Phe, 1,86.

Beispiel 11

t-Butyloxycarbonylalanylglycyl-S-acetamidomethylcysteinyl-N^£- t-butyloxycarbonyl-lysylasparaginyl-phenylalanylphenyl-alaninhydrazid (Boc-Ala-Gly-Cys-Lys-Asn-Phe-Phe-NH-NHo)

ι ι <-

Acm Boc

Zu einer Lösung von 2,0 g (1,87 mMol) des Heptapeptidesters Boc-Ala-Gly-Cys-Lys-Asn-Phe-Phe-OMe (beschrieben in Beispiel

Acm Boc

10) in 8 ml Dimethylsulfoxyd gibt man 2 ml (41,3 mMol) Hydrazinhydrat. Die Mischung wird 8 Std. gerührt. Die Titelverbindung wird mit ungefähr 150 ml Wasser ausgefällt, filtriert und getrocknet.

Aminosäureanalyse: Lys, 0,98; Asp, 1,04; GIy, 1,0;. Ala, 1,01; 1/2 Cys, 0,37; Phe, 2,12.

- 64 509824/1010

M/15 563

Beispiel 12

NjS-Ditritylcysteinyl-N^-t-butyloxycarbonyllysylasparaginyl-

phenylalanyl-phenylalanin-methylester

(Trt-Cys-Lys-Asn-Phe-Phe-OMe)

Trt Boc .

Zu einer gekühlten gerührten Mischung von 100 ml Äthylacetat und 400 ml 5 %±ger wäßriger Zitronensäure gibt man bei O⁰C 15,82 g (0,023 Mol) NjS-Ditritylcystein-diäthylaminsalz. Die Mischung wird 30 Min. bei O⁰C gerührt. Die Schichten werden abgetrennt. Die wäßrige Schicht wird mit Äthylacetat extrahiert und die vereinigten organischen Phasen werden mit kalter 2,5 /oiger Zitronensäurelösung und gesättigter Natriumchloridlösung gewaschen. Die vereinigten organischen Phasen werden über MgSO/ getrocknet. Das Lösungsmittel wird eingedampft, wobei man N,S-Ditritylcystein erhält.

Zu einer Lösung von 0,023 Mol der zuletzt genannten Verbindung in 100 ml DMF gibt man 3,75 g (0,02?8 Mol) 1-Hydroxybenzotriazol. Zu der gerührten Lösung gibt man bei 0⁰C 4,81 g (0,0233 Mol) DCC. Die Mischung wird 2 Std. bei 0⁰C und 1 Std. bei Raumtemperatur gerührt. Zu der gekühlten gerührten Lösung gibt man bei 0⁰C eine Lösung von 14 g (0,0175 Mol) H-Lys-Asn-Phe-Phe-OMe in 254 ml DMF und 2,53 ml

Boc

N-Äthylmorpholin. Die Mischung wird 16 Std. bei 25⁰C gerührt. Das Lösungsmittel wird auf ungefähr 100 ml eingedampft und der erhaltene Rückstand wird durch Filtrieren gesammelt. Das Filtrat v/ird zur Trockene eingedampft. Den Rückstand löst man in 400 ml Äthylacetat und filtriert die Lösung, um etwas Niederschlag zu entfernen (verworfen). Das Filtrat wird mit 3 x 100 ml 2,5 %iger wäßriger Zitronensäure, 3 χ 100 ml Natrimbicarbonat und 2 χ 50 ml gesättigter Natriumchloridlösung gewaschen. Die Lösung wird über MgSOr getrocknet und das Lösungsmittel wird eingedampft. Den- Rückstand kristalli-

- 65 509824/1010

M/15 563

siert man aus Athylacetat/Petroläther, wobei man die Titelverbindimg mit Schmelzpunkt von 180 bis 181⁰C erhält.

[αξ⁵ = 17,9° (c=1, DMF).

Beispiel 13

t-Butyloxycarbonylalanylglycyl-S-tritylcysteinyl-N -t-butyloxycarbonyl-lysylasparaginyl-phenylalanyl-phenylalaninmethylester.(Boc-Alä-Gly-Cys-Lys-Asn-Phe-Phe-OMe)

Trt Boc

Zu einer Lösung von 13,5 g (10,7 mMol) Trt-Cys-Lys-Asn-Phe-Phe-OMe (beschrieben in Beispiel 12)

Trt Boc . ■ '"

in 800 ml Eisessig, gibt man bei Raumtemperatur tropfenweise 200 ml Wasser. Die Lösung wird 2 Std. bei 45°C gerührt, mit 1000 ml Wasser verdünnt und der Niederschlag wird durch Filtrieren entfernt. Das Filtrat v/ird zur Trockene eingedampft. Den Rückstand löst man in Methanol und das Produkt fällt man mit Äther aus, wobei man H-Cys-Lys-Asn-Phe-Phe-OMe

I !

erhält. Trt Boc

Zu einer gekühlten Lösung von 10,2 g (9,48 mMol) der zuletzt genannten Verbindung in 79 ml DMF gibt man bei O⁰C 1,5 ml N-Äthylmorpholin, eine Lösung von 5,64 g (13,3 mMol) t-Butyloxycarbonylalanylglycin-2,4,5-trichlorphenylester (beschrieben in Beispiel 3) in 25 ml DMF und eine katalytische Menge von ungefähr 0,5 g 1-Hydroxybenzotriazol. Die Lösung wird 3 Tage bei O⁰C gehalten. Das Lösungsmittel wird eingedampft. Den Rückstand löst man in Methanol. Zugabe von Äther führt zu einem Niederschlag. Kristallisation des Niederschlags aus Methanol ergibt die Titelverbindung.

OJq⁵ = -20,7 (c=1, DMF);

Aminosäureanalyse: Lys, 0,95; Asp, 0,94; GIy, 1,0; Ala, 0,98; Cys, 0,52; Phe, 1,92.

- 66 -509824/1010

M/15

Beispiel 14

t-Butyloxycarbonylalanylglycyl-S-tritylcysteinyl-N^-t-butyloxyearbpnyl-lysylasparaginyl-phenylalanyl-phenylalaninhydrazid (Boc-Ala-Gly-Cys-Lys-Asn-Phe-Phe-NH-NH-)

Trt Boc

Zu einer Lösung von 6,5 g (0,25 mMol) des Heptapeptidmethylesters Boc-Ala-Gly-Cys-Lys-Asn-Phe-Phe-OMe (beschrieben in

t 1

Trt Boc

Beispiel 13) in 410 ml Methanol, die in einem Eisbad gekühlt ist, gibt man 8,8 ml (0,179 Mol) Hydrazinhydrat tropfenweise zu. Die Mischung wird 20 Min. bei O⁰C gerührt. Anschließend wird noch 4 Tage bei Raumtemperatur gerührt. Den Niederschlag sammelt man, wäscht ihn mit kaltem Methanol und trocknet, wobei man die Titelverbindung erhält.

Aminosäureanalyse: Lys, 0,95; Asp, 1,0; GIy, 1,0; Ala, 1,0; Cys, 0,91; Phe, 2,03.

Beispiel 15_

Benzyloxycarbonylthreonylserin-methylester (Z-Thr-Ser-OMe)

Eine Lösung von 3,22 g (6,43 mMol) Benzyloxycarbonylthreoninpentachlorphenylester in 20 ml DMF wird zu einer Lösung von 1,0 g (6,43 mMol) Serinmethylester-hydrochlorid in 15 ml DMF und 0,895 ml Triäthylamin bei O⁰C zugegeben. Die Mischung wird 20 Std. bei Raumtemperatur gerührt und filtriert. Das Filtrat wird unter vermindertem Druck konzentriert. Den Rückstand verreibt man mit Äther/Petroläther (1:1), bis das gesamte Pentachlorphenol entfernt ist. Den unlöslichen Rückstand kristallisiert man aus Äthylacetat/Isopropylather, wobei man die Titelverbindung mit Schmelzpunkt von 133 bis 135°( erhält.

NMR (CDCl₃) J" 3,75 (3H), 5,1 (2H), 7,3 (5H). .·

- 67 5098 2 4/1010

/ £ Μ/15

Beispiel 1 5a

Benzyloxycarbonyl-(O-t-butyl)-threonyl-(O-t-butyl)-serinmethylester (Z-Thr-Ser-OMe)

Eine Mischung von 13,3 g (43 mMol) O-t-Butylserinmethylester und 14,4 g (46,8 mMol) Benzyloxycarbonyl-(O-t-butyl)-threonin und 5,33 ml (43 mMol) N-Äthylmorpholin in 100 ml trockenem THF v/ird auf 0⁰C gekühlt und 11,6 g (86 mMol) 1-Hydroxybenzotriazol werden zugegeben. Eine gekühlte Lösung von 9,3 g (45,1 mMol) DCC in 25 ml THF wird anschließend tropfenweise zugegeben und die Reaktionsmischung wird 45 Min. bei O⁰C und 90 Min. bei 25⁰C .gerührt. Nach Filtrieren wird das THF unter vermindertem Druck bei 25⁰C entfernt. Den Rückstand löst man in Äther, filtriert und extrahiert anschließend das Filtrat mit gesättigter NaHCO,-Lösung, gesättigter NaCl-Lösung, eiskalter Zitronensäure (1n), Wasser, gesättigter NaHCO^-Lösung, Wasser und gesättigter NaCl-Lösung. Den organischen Extrakt trocknet man über MgSO, und dampft unter vermindertem Druck ein. Den Rückstand unterwirft man einer Chromatographie auf Aluminiumoxyd (neutral). Eluieren mit Benzol liefert die Titelverbindung in Form eines Öls.

NMR (CDCl₃) cf1,2 (m, 21H), 3,74 (s, 3H), 5,15 (s, 2H), 7,35 (s, 5H).

Beispiel 16

Benzoyloxycarbonylphenylalanyl-threonylserin-methylester (Z-Phe-Thr-Ser-OMe)

Eine Mischung von 1,72 g (4,86 mMol) Benzyloxycarbonylthreonylserin-methylester (beschrieben in Beispiel I5) in 15 ml 15 %±ger Essigsäure und 15 ml Methanol, 5,34 ml

- 68 509824/1010

2450135

\* M/15

(5,34 mMol) 1n Chlorwasserstoffsäure und 0,15 g 5 % Pd/C wird unter einer"Wasserstoffatmosphäre 20 Std. rasch gerührt. Die Mischung wird durch Diatomeenerde (Celite) filtriert und das Filtrat wird zur Trockene konzentriert, wobei man das Threonylserin-methylester-hydrochlorid H-Thr-Ser-OMe'HCl, erhält.

Zu einer Lösung von 1,24 g (4,86 mMol) der zuletzt genannten Verbindung in 15 ml DMF und 0,623 ml) Triäthylamin gibt man eine Lösung von 2,32 g (4,86 mMol) Benzyloxycarbonylphenylalanin-2,4,5-trichlorphenylester in 30 ml DMF bei 0⁰C zu. Die Mischung wird -20 Std. gerührt und filtriert. Das Filtrat konzentriert man unter vermindertem Druck und den Rückstand verreibt man mit Äther/Hexan, bis das gesamte Trichlorphenol entfernt ist. Den Rückstand kristallisiert man aus Äthylacetat/lsopropyläther, wobei man die Titelvenbindung mit Schmelzpunkt 167 bis 171⁰C erhält.

NTiR (CDCl,) cT3,7 (3H), 5,03 (2H), 7,2 und 7,3 (10H)." Beispiel 16a

Benzyloxycarbonylphenylalanyl-(0-t-butyl)-threonyl-(0-tbutyl)-serin-methylester (Z-Phe-Thr-Ser-OMe)

14,4 g (30,8 mMol) Z-Thr-Ser-OMe (beschrieben in Beispiel 15a),

gelöst in 120 ml Methanol mit 3,56 g (30,8 mMol) Pyridinhydrochlorid wird mit 700 mg 5 % Pd/C als Katalysator hydriert, wobei man H-Thr-Ser-OMe erhält. 14,7 g (30,8 mMol)

Bu^t Bu^x

Z-Phe-OTcp und das zuvor genannte Produkt werden in 150 ml Äthylacetat gelöst und auf 0⁰C gekühlt. Anschließend gibt

- 69 509824/1010

man 3,96 ml (30,8 mMol) N-Äthylmorpholin zu und hält die Mischung 3 Tage bei 5⁰C. Nach Filtrieren wird das Filtrat wie in Beispiel 15a beschrieben.extrahiert. Der Extrakt wird getrocknet und unter vermindertem Druck eingedampft. Den Rückstand unterwirft man der Chromatographie auf Silikagel (1 kg), wobei man 20 % Äthylacetat in Benzol verwendet. Eindampfen des Eluats und Kristallisieren aus Äther/Hexan ergibt die Titelverbindung mit Schmelzpunkt 101 bis 1O3°C.

[«ξ⁵ = 9,4 (c=!, DMF).

Beispiel 17

Benzoylcarbonylthreonylphenylalanyl-threonylserin-methylester (Z-Thr-Phe-Thr-Ser-OMe)

Sine Mischung von 1,7 g Benzyloxycarbonylphenylalanylthreonylserin-methylester (beschrieben in Beispiel 16) in 15 ml 15 tfiger Essigsäure, 15 ml Methanol und 0,15 g 5 % Pd/C wird unter einer Wasserstoffatmosphäre 4 Std. rasch gerührt. Die Mischung wird durch Diatomeenerde (Celite) filtriert und das Filtrat wird zur Trockene konzentriert, wobei man H-Phe-Thr-Ser-OMe in Form seines Essigsäureadditionssalzes erhält.

Zu einer Lösung von 1,4 g (3,4 mMol) der zuletzt genannten Verbindung in 20 ml DMF und 0,48 ml Triethylamin gibt man bei 0 C eine Lösung von 1,71 g (3,4 mMol) Benzyloxycarbonylthreonin-pentachlorphenylester in 15 ml DHF. Die Lösung wird 20 Std. bei .Raumtemperatur gerührt und anschließend wird das Lösungsmittel entfernt. Den Rückstand verreibt man mit Äther, bis das gesamte Pentachlorphenol entfernt ist. Den Rückstand kristallisiert man aus Äthylacetat/Isopropyläther, wobei man die Titelverbindung in Form eines Monohydrats mit Schmelz-

- 70 -

50982471010

' M/15

punkt 195 bis 197°C erhält. Analyse

	56	C	6	H	9,	N	%
ber.1:	. 56	,12	6	,49	8,	02	%
gef.:	,06	,29	84

B e i s ρ i e 1 17a

Benzyloxycarbonyl-(O-t-butyl)-threonylphenylalanyl-(O-tbutyl) -threonyl- (O-t-butyl)-serin-methylester (Z-Thr-Phe-Thr-S er-OMe)

14- 14- If

Bu Bu Bu

10,5 g (17,1 mMol) Z-Phe-Thr-Ser-OMe (beschrieben in Bei-

14- If

Bu^ Bu

spiel 16a) wird in 100 ml Eisessig mit 1 g 5 % Pd/C als Katalysator "hydriert.. Nach Beendigung (durch TLC untersucht) wird der Katalysator gesammelt und das Filtrat wird unter vermindertem Druck zur Trockene gebracht. Den Rückstand' H-Phe-Thr-Ser-OMe nimmt man in Benzol auf und dampft

Bu^ Bu

unter vermindertem Druck ein (zweimal) und trocknet über KOH-Pellets unter vermindertem Druck. 5,3 g (17,1 mMol) Z-Thr-OH und 4,61 g (34,2 mMol) 1-Hydroxybenzotriazol wer-

den in 100 ml trockenem THF gelöst. Während man bei O⁰C rührt, wird eine gekühlte Lösung von 3,52 g (17,1 mMol) DCC in 30 ml THF tropfenweise zu der zuletzt genannten Lösung zugegeben. Man rührt noch 1 Std. bei 0⁰C und 1 Std. bei 25 C. Das obige Hydrogenolyseprodukt wird in 35 ml THF das 2,19 ml (17,1.mMol) N-Äthylmorpholin enthält, gelöst und zu der Lösung des aktivierten Esters zugegeben. Nach 1-stündigem Rühren bei 25⁰C wird die Reaktionsmischung filtriert und das Filtrat wird unter vermindertem Druck einge-

- 71 509824/1010

M/15 563

dampft. Den Rückstand nimmt man in Äther auf, filtriert und das Filtrat wird mit kalter 1n Zitronensäure, Wasser, gesättigter NaHCO,-Lb'sung und gesättigter NaCl-Lösung extrahiert. Der nach dem Trocknen und Eindampfen der Ätherschichten zurückgebliebene Rückstand wird der Chromatographie auf Silikagel (1 kg) unter Verwendung von 20 % Äthylacetat in Benzol als Eluierungsmittel unterworfen. Das Eluat wird eingedampft und den Rückstand kristallisiert man aus Äther/ Hexan, wobei man die Titelverbindung mit Schmelzpunkt 110 bis 113⁰C erhält;

[ai³ = 27,5° (c=1, DMF).

Beispiel 18

Benzyloxycarbonyl-N^-t-butyloxycarbonyllysylthreonylphenylalanyl-threonylserin-methylester

(Z-Lys-Thr-Phe-Thrv-Ser-OMe)

Boc

Biine Mischung von 1,3 g Z-Thr-Phe-Thr-Ser-OMe (beschrieben in Beispiel 17) in 30 ml Methanol und 0,15 g 5 % Pd/C wird unter einer Wasserstoffatmosphäre 20 Std. schnell gerührt. Die Mischung wird durch Diatomeenerde filtriert und das Filtrat wird zur Trockene konzentriert, wobei man H-Thr-Phe-Thr-Ser-OMe erhält.

Zu einer Lösung von 1,0 g (2,18 mMol) der zuletzt genannten Verbindung in 15 ml DMF und 0,1 ml Triäthylamin gibt-man bei O⁰C eine Lösung von Benzyloxycarbonyl-N -t-butyloxycarbonyllysin-p-nitrophenylester in 15 ml DMF zu. Die Lösung wird 20 Std. gerührt und das Lösungsmittel wird unter vermindertem Druck entfernt. Den Rückstand löst man in 3 ml Methanol und gibt ihn langsam zu 100 ml Äther. Den Niederschlag sammelt man und' kristallisiert aus Methanol, wobei man die Titelverbindung mit Schmelzpunkt 169 bis 171⁰C erhält;

NMR (DMS0-d₆)cf1,36 (9H), 3,65 (3H), 5,05 (2H), 7,3 (lOH).

- 72 509824/1010

S *V M/15 563

Beispiel ,18a

Benzyloxycarbonyl-N -butyloxycarbonyllysyl-(O-t-butyl)-threonylphenylalanyl-(O-t-butyl)-threonyl-(O-t-butyl)-serinmethylester (Z-Lys-Tlir-Phe-Thr-Ser-OMe)

1 I 4- ! 4- t 4-

Bo c Bu^ Bu^ Bu^

8,52 g (11,05 HiMoI) Z-Thr-Phe-Thr-Ser-OMe, beschrieben in

Bu^X Bu Bu^X

Beispiel 17a, werden in Essigsäure hydriert und wie in Beispiel *i7a beschrieben aufgearbeitet. Der erhaltene Rückstand H-Thr-Phe-Thr-Ser-OMe wird in 50 ml DMF gelöst und 1,14 g

Bvl BvT Bvl

(11,05 mMol) N-Äthylmorpholin werden zugesetzt. Bei O⁰C gibt man dann 5,54 g (11,05 mMol) Z-Lys-ONp zu'und die Mischung

Boc

wird 70 Std. bei. 5°C gehalten. Das DMF wird dann unter vermindertem Druck bei 20 bis 3O⁰C entfernt und der Rückstand wird der Chromatographie auf Silikagel (1 kg) mit CHC1-2, das 2 % MeOH enthält, als Eluiermittel, unterworfen. Eindampfen des Eluats ergibt die Titelverbindung mit Schmelzpunkt 81 bis 85°C nach Umkristallisation aus Äther/Petroläther;

NMR .(CDCl₃) cf 0,99 bis 1,43 (m), 3,71 (s, 3H), 5,13 (s, 2H), 7,22 und 7,33 (.2 χ s, 10H)..

Beispiel 19

α,a-Dimethyl-3,S-dimethoxybenzyloxycarbonyl-tryptophyl-N^-tbutyloxycarboiiyl-lysyltlireonyl-phenylalanyl-threonylserin— methylester (Ddz-Trp-Lys-Thr-Phe-Thr-Ser-OMe)

Boc ·

Eine Mischung von 1,61 g Z-Lys-Thr-Phe-Thr-Ser-Ome (beschrie-

Boc

- 73 - -

509824/1010

M/15

ben in Beispiel 18) in 15 ml 15 /oiger Essigsäure und 15 nil Methanol und 0,15 g 5 % Pd/C wird unter einer Wasserstoffatmosphäre 20 Std. rasch gerührt. Die Mischung wird, durch D'iatomeenerde gefiltert und das Filtrat wird zur Trockene konzentriert, wobei man H-Lys-Thr-Phe-Thr-Ser-OMe erhält.

Boc

Anschürend wird eine Lösung von 0,653 g (1,53 mMol) α,α-Dimethyl-3,5-dimethoxybenzyloxycarbonyl-tryptophan, 0,345 g (3,0 mMol) N-Hydroxysuccinimid und 0,315 g (1,53 mI4ol) DCC in 13 ml trockenem TI-IF bei O⁰C 1 Stunde und dann bei 25°C 1 Stunde gerührt. Zu dieser Lösung gibt man eine Lösung von 1,159 g (1,53 mMol) H-Lys-Thr-Phe-Thr-Ser-OMe

wie oben beschrieben hergestellt, und 0,22 ml Triäthylamin in 10 ml THF. Die Mischung wird 3 Std. bei 25°C gerührt, filtriert und das Filtrat wird konzentriert. Den Rückstand unterwirft man einer Chromatographie auf einer Säule von Silikagel (100 g), wobei man CHCl^/MeOH/Pyridin (90:10:1) als Sluiermittel verwendet. Eindampfen des Eluats ergibt die Titelverbindung;

ASS? 289 m (£ = 5, 310),

282 nm (£ = 7, 410),

274 nm (6 = 7, 070),

219 nm (£ = 43, 700);

NMR (CDCl,) cf1,40 (9H), 3,74 (9H).

- 74 -

509824/1010

M/15 563

Beispiel 19a

η, a-Dimethyl-3,5-dimetlioxybenzyloxycarbonyl-tryptophyl-N^ butyloxycarbonyllysyl- ( O~t-butyl) -threonyl-phenylalanyl-(O-t-butyl)-threonyl-(0-t-butyl)-serin-methylester (Ddz-Trp~Lys-Thr-Phe-Thr~Ser-OMe)

t 14- t 4- ! 4-

Boc Bii Bu Bu

Eine Lösung von 7,3 g(7,3 mMol) Z-Lys-Thr-Phe-Thr-Ser-OMe

Boc Bu⁰ Bu Bu

(in Beispiel 18a beschrieben) in Essigsäure wird hydriert und wie zuvor beschrieben (vergl. beispielsweise Beispiel 17a) aufgearbeitet. Dieser erhaltene Rückstand H-Lys-Thr-Phe-Thr-Ser-OMe wird in 20 ml THF gelöst und

t 1 4- 14- ! +

Boc Bu ^u Bu Bu

0,935 ml (7,3 mMol) N-Äthylmorpholin werden ,zugegeben (erste Mischung).

Man löst 3,11 g (7,3. mMol) Ddz-Trp-OH in 55 ml trockenem THF, gibt 1,97 g (14,6 mMol) 1-Hydroxybenzotriazol zu und kühlt die Lösung auf 0⁰C. Eine gekühlte Lösung von 1,5 g (7,3 mMol) DCC in 15 ml THF' wird tropfenweise zugegeben und die Reaktionsmischung wird 1 Std. bei 0⁰C und 1 Std. bei 20 bis 25⁰C gerührt (zweite Mischung).

Die obige erste Mischung wird dann zu der obigen zweiten Mischung zugegeben und man rührt noch 1 Std. bei 20 bis 25°C. Anschließend kühlt man die Reaktionsmischung auf O⁰C, filtriert und dampft das Filtrat ein. Den Rückstand löst man in A'thylacetat. Die Lösung wird mit gesättigter NaHCO₃-Lösung und gesättigter NaCl-Lösung gewaschen und über MgSO^- getrocknet. Die Lösung konzentriert man und den Rückstand unterwirft man einer Chromatographie auf Silikagel (1 kg), wie zuvor beschrieben. Eindampfen des Eluats ergibt die Titelverbindung mit Schmelzpunkt 112 bis 114° nach Umkristallisation aus Ather/Petroläther;
[αξ⁵ = 10,1° (C=I, DMF).

- 75 509824/1010

κι M/15 563

Beispiel 20

α, α-Dimethyl-3, S-dimethoxybenzyloxycarbonyl-tryptopliyl-N -tbutyloxycarbonyl-lysylthreonyl-phenylalanyl-threonylserinhydrazid (Ddz-Trp-Lys-Tlir-Phe-Thr-Ser-NI-INH2)

Bo c

Eine Lösung von 1,05 g (0,95 mMol) Ddz-Trp-Lys-Thr-Phe-Thr-

. Boc

Ser-OMe, beschrieben in Beispiel 19 und 1,2 ml Hydrazinhydrat in 50 ml Methanol wird 2 Tage bei 0⁰C gerührt. Der Niederschlag wird gesammelt und mit Methanol gewaschen, wobei man die Titelverbindung mit Schmelzpunkt 203 bis 206⁰C erhält.

Beispiel 20a

«,α-Dimethyl-3,5-dimethoxybenzyloxycarbonyl-tryptophyl-N butyloxycarbonyl-lysyl-(0-t-butyl)-threonyl-phenylalanyl-(O-t-butyl)-threonyl-(O-t-butyl)-serin-hydrazid (Ddz-Trp-Lys-Tlir-Phe-Thr-Ser-NHNH?)

t 1+ t -j- t -)- *-

Boc Bu Bu BvT
Eine Lösung von 3,71 g (29,1 mMol) Ddz-Trp-Lys-Thr-Phe-Thr-Ser-

I t+ 1+ 1+

Boc Bu⁰ Bu^x Bu

OMe, in Beispiel 19a beschrieben, in 25 ml DMF wird mit 5 ml Hydrazinhydrat gemischt. Man läßt die Mischung 3 Tage bei Raumtemperatur stehen. Zugabe von Wasser zur Mischung, Sammeln des Niederschlags und Kristallisieren des Niederschlags aus Methanol ergibt die Titelverbindung mit Schmelzpunkt 189 bis 191⁰C

- 76 509824/1010

Beispiel 21 . ·

α,a-Diinetliyl-3,5-dimethoxybenzylojcycarbonyltryptophyl-N t-butyloxycarbonyl-lysylthreonyl-phenylalanyl-threonylseryl-S-acetamidomethylcystein
(Ddz-Trp-Lys-Thr-Phe-Thr-Ser-Cys-OH)

T t

Boc . Acm

Zu einer Lösung von 0,800 g (0,724 mMol) Ddz~TrO-Lys-Thr-Phe-Thr-Ser-NM\[H₉ (in Beispiel 20 be-r-

Boc

sclirieben) in 30 ml DMF gibt man bei -20°C 0,824 ml (1 ,81 mMol) 2,2n wasserfreie Chlorwasserstoffsäure in Äthylacetat, gefolgt von 0,125 ml (1,08 mMol) t-Butylnitrit. Die Mischung -wird 15 Min. bei -15.°C gerührt. Eine Lösung von 0,165 g (0,724 mMol) S-Acetamidomethylcystein und 0,354 ml (2,53 mMol) Triäthy'lamin in 15 ml DMF wird tropfenweise zu der obigen Lösung bei -15⁰C zugesetzt. Nach beendeter Zugabe wird die Lösung 1 Std. bei -15°C und anschließend 20 Std. bei 5°C gerührt. Das Lösungsmittel entfernt" man unter vermindertem Druck. Den Rückstand löst man in 5 ml Methanol und gibt ihn langsam zu 400 ml Äther. Der Niederschlag v/ird gesammelt, in 5 ml Methanol gelöst und langsam zu 100 ml kalter 0,5 m Zitronensäure zugegeben. Den Niederschlag sammelt man und wäscht mit 2 χ 20 ml Wasser. Der Niederschlag wird aus Methanol/Äthylacetat/Isopropyläther kristallisiert, wobei man die Titelverbindung mit Schmelzpunkt 139 bis 142⁰C erhält;

NMR (DMS0-d₆)'cri,35 (9H), 1,55 (6H), 1,83 (3H), 3,70 (6H).

- 77 -

09824/1010

M/15

Beispiel 21a

α,α-Dimethy1-3,5-dime thoxybenzyloxycarbonyltryptophyl-N^£- t-butyloxycarbonyl-lysylthreonyl-phenylalanyl-threonylseryl S-tritylcystein (Ddz-Trp-Lys-Thr-Phe-Thr-Ser-Cys-OH)

Boc Trt

Zu einer Lösung von 1,6 g (1,45 mMol) Ddz-Trp-Lys-Thr-Phe-Thr-Ser-NHN^ (beschrieben in Beispiel 20)

Boc

in 50 ml DMF gibt man bei -20°C 1,62 ml (2,26 mMol) 2,24n wasserfreie Chlorwasserstoffsäure in Äthylacetat, gefolgt von 0,253 ml (2,18 mMol) t-Butylnitrit und rührt die Mischung 15 Min. bei -15⁰C Eine Lösung von 0,527 g .(1,45 mMol) S-Tritylcystein und'0,71 ml (5,07 mMol) Triethylamin in 80 ml DMF wird tropfenweise bei -15°C zu der obigen Losung zugegeben. Nach beendeter Zugabe wird die Lösung 1 Std. bei -15°C und anschließend 20 Std. bei 5°C gerührt. Das Lösungsmittel entfernt man unter vermindertem Druck. Den Rückstand kristallisiert man aus Methanol; Schmelzpunkt 205 bis 208⁰C;

OT-IR (DMSO-dg) c^r1,40 (9H), 1,60 (6H), 3,75 (6H), 7,40 (20H).

Beispiel 21b

a,α-Dimethyl-3,S-dimethoxybenzyloxycarbonyltryptophyl-N^- t-butyloxycarbonyllysyl-iO-t-butylj-threonyl-phenylalanyl-(O-t-butyl)-threonyl-(O-t-butyl)-seryl-S-acetamidomethylcystein (Ddz-Trp-Lys-Thr-Phe-Thr-Ser-Cys-OH)

I 14- t 4- I 4- t

Boc Bu Bu Bu Acm 1,27 g (1 mMol) Ddz-Trp-Lys-Thr-Phe-Thr-Ser-Cys-NHNHp (be-

I I +· !4-14-» *-

Boc Bu^u Bu Bu Acm

schrieben in Beispiel 20a) werden in 25 ml trockenem, destilliertem DMF gelöst und auf -20⁰C gekühlt. Man gibt 2,5 ml 1n Chlorwasserstoffsäure in Äthylacetat zu, gefolgt von 0,138 ml (1,2 mMol) t-Butylnitrit. Die Mischung wird 15 Min; bei -15°C

\ - 78 -

509824/1010

M/15 363

gerührt. Eino Losung von 228 mg (1 mMol) S-Acetamidomethylcystein-hydroohlorid in 20 ml DMF', das 0,49 ml (3,5 mMol) Triethylamin"enthält, wird auf -15⁰C gekühlt und zu der obigen Reaktionsnischung zugesetzt. Man setzt das Rühren 1 Std. T>o5_ -15°C und über Nacht bei Raumtemperatur fort. Die Reaktionsmischung wird unter vermindertem Druck eingedampft. Den Rückstand verreibt man mit Wasser. Der Niederschlag wird gesammelt, .gewaschen und getrocknet, wobei man die Titelverbindung erhält;

HIIR (CDCl₇). c'1,12,.1,20 und 1,27 (27H), 1,45 (9H), 1,63 (6H), 1,95 (3H), 3,68 (6H);

Aminosäureanalyse: Lys, 1,0; .Thr, 2,0; Ser, 0,76; Cys, 0,6j Phe, 1,0.

B ο i s ρ i e 1 21c

n. _t c.;-D:o.iethyl-3,5-dirne thoxybenzyloxycarbonyltryptophyl-N^£- t-hutyloxycarbonyllysyl-(O-t-butyl)-threonylphenylalanyl-(O-t-butyl)-threonyl-(O-t-butyl)-seryl-S-tritylcystein (DdS-- £r O-Lys-Thr-Phe-Thr-Ser-Cys-OH)

J I -f- 14- If I

Boc Bu Bvl Bu Trt

1,27 g (1 mMol) Ddz-Trp-Lys»Thr-Phe-Thr-Ser-NHNH~ (beschrie-

Boc Bu^ Bu Bu¹' ..

ben in Beispiel 20a) werden in 2.0 ml ti-ockenem destilliertem DI-iP gelöst und auf -20⁰C gekühlt. Man gibt 1,25 ml 2n Chlorwasseretoffsäure in AtOAc zu, gefolgt von 0,137 ml (1,2 mMol) t-3utylni tr it.. Die Mischung wird 15 Min. bei -15°C· gerührt. Sine Lösung von 0,363 g (1 mMol) H-Cys-OH in 35 ml. DIiF, das

Trt

0,49 ml (3,5" mMol) Triethylamin"enthält, wird auf -15⁰C gekühlt und zu der obigen Reaktionsmischung zugesetzt. Das Rühren wird 1 Std. bei -15°C und über Nacht bei 20 bis 25⁰C fortgesetzt. Die Reaktionsmischung wird unter vermindertem

- 79 -

509824/1010 BAD

M/15 563

Druck (0,2 mm) bei 35°C eingedampft. Den Rückstand verreibt man mit eiskalter 1n Zitronensäure, filtriert und "wäscht mit Wasser. Nach dem Trocknen wird der Rückstand mit Hexan verrieben und der Rückstand wird nochmals getrocknet, wobei man die Titelverbindung erhält;

M-IR (CDCl₃) cT1,13, 1,17 und 1,23 (27H), 1,47 (9H), 1,74 (6H), 3,78 (6H).

Beispiel 22

Tryptophyl-N -t-butyloxycarbonyllysylthreonyl-phenylalanylthreonylseryl-S-acetamidomethylcystein-acetat

(H-Trp-Lys-Thr-Phe-Thr-Ser-Cys-OH·AcOH)

t t

"Boc Acm

Eine Lösung von 0,465 g (0,367 mMol)

Ddz-Trp-Lys-Thr-Phe-Thr-Ser-Cys-OH (beschrieben in Beispiel

Boc Acm

(21) in 25 ml 80 %iger Essigsäure wird 27 Std. bei Raumtemperatur' gerührt. Das Lösungsmittel wird unter vermindertem Druck entfernt. Den Rückstand löst man in 3 ml Essigsäure und gibt ihn langsam zu 300 ml Äther. Den Niederschlag sammelt und trocknet man, wobei man die Titelverbindung erhält;

NMR (DMSO-dg) c^r1,34 (9H), 1,90 (3H).

- 80 -

509824/1010

g^ M/15 56;>

Beispiel 22a

Tryptophyl-N^-t-butyloxycarbonyllysylthreonyl-phenylalanyl-

threonyl-S-tritylcystein-acetat

(H-Trp-Lys-Thr-Phe-Thr-Ser-Cys-OH·AcOH)

Boc ■ Tr t

Eine Lösung von 1,02 g (0,710 mMol)

Ddz-Trp-Lys-Thr-Phe-Thr-Ser-Cys-OH (beschrieben in Bei-

! 1

Boc Trt

spiel 21a) in 50 ml 80 %iger Essigsäure wird 27 Std.-bei
Raumtemperatur gerührt. Man gibt 100 ml Wasser zu. Den Niederschlag sammelt man, wäscht mit Äther und trocknet, wobei man die Titelverbindung erhält;

NMR (DMSO-dg) cf 1,40 (9H), 7,35 (20H) Beispiel 22b

Tryp topliyl-N^c-butyloxycarbonyllysyl- (0-1- butyl) -thr eonylphenylalanyl-(0-t-butyl)-threonyl-(0-t-butyl)-seryl-S-acetamidomethylcystein (H-Trp-Lyc-Thr-Phe-Thr-Ser-Cys-OH)

Boc Bu^u Bu^υ Bu Acm

1>50 g (1,045 mMol) Ddz-Trp-Lys-Thr-Phe-Thr-Ser-Cys-OH (be-

t l-t 14- »4- I

t/

t 't

Boc Bu" Bu" Bu" Acm
schrieben in Beispiel 2Tb) wird in einer Mischung von' 12 ml kalter Essigsäure/Ameisensäure/Viasser (7:1:2) gelöst und
bei Raumtemperatur über Nacht gerührt. Das Lösungsmittel wird eingedampft. Den Rückstand löst man in Methanol. Der pH der Lösung wird mit konz. Ammoniumhydroxydlösung auf-~6,5 eingestellt und das Produkt wird ausgefällt, indem man die Lösung zu Wasser zusetzt. Nach dem Trocknen wird das Produkt in
Methanol, v/ieder aufgelöst und durch Zugabe-von kaltem Äther ausgefällt, wobei man die Titelverbindung erhält;

.NMR- (CDCl₃) cf 1,17, 1,20 und 1,27 (2?H), 1,41-(9H), 1,91 (3H); Aminosäureanalyse: Lys, 1,0; Thr, 2,2; Ser, 0,65, 1/2 Cys, 0,69; Phe, 1,1. .

- 81 -

509 824/1010

Μ/15 563

Beispiel 22c

Tryptophyl-N^c-t-butyloxycarbonyllysyl-(0-t-'b'utyl)-threonylphenylalanyl-(0-t-butyi)-threonyl-(0-t-butyl)-seryi-S-tritylcystein (H-Trp-Lys-Thr-Phe-Thr-Ser-Cys-OH)

t «-μ t + ι +· t Boc Bu Bu Bu Trt

5,13 g (3,2 mMol) Ddz-Trp-Lys-Thr-Phe~Thr-Ser-Cys-OH (be-

t t 4- ! 4- t -j- t

Boc Bu Bu ^b Bu Trt

schrieben in Beispiel 21c) v/erden in 56 ml einer Mischung von Essigsäure/Ameisensäure/Wasser (7:1:2) gelöst und die Lösung wird bei Raumtemperatur über Nacht gerührt. Das Lösungsmittel wird eingedampft. Den Rückstand löst man in 26 ml Methanol und gibt konz. Ammoniaklösung zu, um den pH auf ungefähr 6,5 einzustellen. Die Lösung wird tropfenweise zu kaltem Wasser zugesetzt und der Niederschlag wird gesammelt und in einem Exsikkator über P₂Or- getrocknet. Den Feststoff verreibt man mehrmals mit Petroläther und trocknet wiederum, wobei man die Titelverbindung erhält;

Aminosäureanalyse: Lys, 1,0; Thr, 2,12; Ser, 0,67; Cys, 0,16; Phe, 1,12.

Beispiel

t-Butyloxycarbonylalanylglycyl-S-acetamidomethylcysteinyl-N^£- t-butyloxycarbonyllysyl-asparaginyl-phenylalanyl-phenylalanyltryptophyl-N -t-butyloxycarbonyllysylthreonyl-phenylalanylthreonylseryl-S-acetamidomethylcystein (Boc-Ala-Gly-Cys-Lys-Asn-Phe-Phe-Trp-Lys-Thr-Phe-Thr-Ser-Cys-OH)

It T I

Acm Boc Boc Acm

Zu einer Lösung von 0,327 g (0,305 mMol) des ersten Heptapeptids, Boc-Ala-Gly-Cys-Lys-Asn-Phe-Phe-NHNHo (beschrieben in

Acm Boc

Beispiel 11) in 10 ml Dimethylsulfoxyd (DMSO) und 10 ml DMF gibt man bei -15⁰C 0,38 ml (0,763 mMol) 1,92n wasserfreien

- 82 -

5 0 9 8 2 4/1010

Μ/1 !5 563

Chlorwasserstoff in Äthylacetat, gefolgt von der Zugabe von, 0,043 ml (0,397 mMol) t-Butylnitrit. Man rührt die Mischung 15. Min. bei -15°C Es werden 0,105 ml (0,76 mMol) Triäthyl·- amin zugegeben. Anschließend wird eine Lösung von 0,337 g (0,305 mMol) des zweiten Heptapeptids, H-Trp-Lys-Thr-Phe-Thr-Ser-Cys-OH, (beschrieben in Bei-

Boc Acm ■

spiel 22) in 5 ml DMS'o, 5 ml DMF und 0,039 ml Triethylamin zu der obigen Lösung bei -15°C zugegeben. Die erhaltene Lösung wird 1 Std. bei -15⁰C₁ 0,5 Std. bei 0°C und 3 Std." bei 25⁰C gerührt. Das Lösungsmittel wird unter vermindertem Druck entfernt und der Rückstand wird langsam zu 100 ml Äther zugegeben. Sammeln des erhaltenen Niederschlags ergibt die Titelverbindung, nämlich das lineare Teträdecapeptid. Die Aminosäureanalyse für das Produkt ist wie folgt: Lys, 2,09; Asp, 1,04; Thr, 2,08; Ser, 0,86; GIy, 1,00;, AIa, 1,05; Cys, 0,54; ?he, 2,89.

e i s ό i e 1 23a

t-Butyloxycarbonylalanylglycyl-S-tritylcysteinyl-N^-t-butylo^^carbonyl-lysylasparaginyl-phenylalanyl-phcnylalanyl-■bryOtopl^l-i^-t-bu^loxycarbonyllysylthreonyl-phenylalanylthreonylseryl-S-tritylcystein

(Boc-Ala-Gly-Cys-Lys-Asn-Phe-Phe-Trp-Lys-Thr-Phe-Thr-Ser-Cys-OH)

It ! 1

Trt Boc Boc ' Trt

Befolgt nan die Arbeitsweise gemäß Beispiel -23, ersetzt jedoch das dort beschriebene erste Heptapeptid durch Boc-Ala-Gly-Cys-Lys-Asn-Phe-Phe-NHNEU, das in Beispiel 14 be-

Trt Boc

schrieben ist, und ersetzt man das zweite Heptapeptid, das dort beschrieben ist, durch H-Trp-Lys-Thr-Phe-Thr-Ser-Cys-OH,

I I

Boc Trt

das in Beispiel 22a beschrieben ist, erhält man das. Titelprodukt, nämlich das lineare Tetradecapaptid. Die Aminosäure-

- 83 -50982 4/1010

M/15 563

analyse für dieses Produkt ist wie folgt: Lys, 2,01; Asp, 1,02; Thr, 1,92; Ser, 1,01; GIy, 1,0; AIa, 0,99; Cys, 0,61; Phe, 3,03.

Beispiel 23b

t-Butyloxycarbonylalanylglycyl-S-acetamidomethylcysteinyl-N^-tbutyloxycarbonyl-lysylasparaginyl-phenylalanyl-phenylalanyl- tryptophyl-N''-t-butyloxycarbonyllysyl-(0-t-butyl)-threonylphenylalanyl-(0-t-but3''l)-threonyl-(0-t-butyl)-seryl-S~acetamidomethy1cystein
(Boc-Ala-Gly-Cys-Lys-Asn-Phe-Phe-Trp-Lys-Thr-Phe-Thr-Ser-Cys-OH)

Acm Boc Boc Bu Bu Bu' Acm

Befolgt man die Arbeitsweise gemäß Beispiel 23 und verwendet man das dort beschriebene erste Heptapeptid, ersetzt jedoch das dort beschriebene zweite Heptapeptid durch H-Trp-Lys-Thr-Phe-Thr-Ser-Cys-OH, das in Beispiel 22 beschrie-

Boc Bu Bu^x Bu^ Acm

ben ist, erhält man das Titelprodukt, nämlich das lineare Tetradecapeptid. Dieses lineare Tetradecapeptid wird aus der Reaktionsmischung gleich isoliert, indem man das Lösungsmittel eindampft, den Rückstand mit Wasser verreibt, den verriebenen Rückstand sammelt und trocknet. Dieses Produkt ist für die nachfolgende Stufe ohne weitere. Reinigung geeignet. Ein Teil des Produkts ergibt die folgende Aminosäureanalyse nach Umkristallisation aus Methanol: Lys, 1,98; Asp, 1,02; Thr, 1,82; Ser, 0,93; GIy, 1,0; AIa, 0,97; Cys, 0,25; Phe, 3,02.

- 84 -

509824/ 1010

i$~ M/15 563

Beispiel 23c ·

t-Butylo^iycarbonylalanylglycyl-S-tritylcysteinyl-N -t-butyloxycarbonyllysylasparaginyl-phenylalanyl-phenylalanyl-tryptophyl-N^-t-butyloxycarbonyllysyl-(0-t-butyl)-threonylphenylalanyl-(0-t-butyl)-threonyl-(0-t-butyl)-seryl-S-tritylcystein (Boc-Ala-Gly-Cys-Lys-Asn-Phe-Phe-Trp-Lys-Thr-Phe-Thr-Ser-Cys-OH)

Trt Boc Boc Bu* Bu* Bu* Trt

Befolgt man die Arbeitsweise gemäß Beispiel 23, ersetzt jedoch das dort beschriebene erste Heptapeptid durch Boc-Ala-Gly-Cys-Lys-Asn-Phe-Phe-NHNHp, beschrieben in Bei-

Trt Boc

spiel 14, und ersetzt das dort beschriebene zweite Heptapeptid durch H-Trp-Lys-Thr-Phe-Tlir-Ser-Cys-OH, das in Beispiel 22c

Boc Bu* Bu* Bu* Trt

beschrieben ist, erhält man das Titelprodukt, nämlich das lineare Tetradecapeptid. Dieses lineare Tetradecapeptid wird aus der Reaktionsmischung gleich isoliert, indem man das Lösungsmittel eindampft, den Rückstand in Methanol löst, die erhaltene Lösung tropfenweise zu einer 5 ^igen wäßrigen Zitronensäurelösung zugibt und den erhaltenen· Niederschlag sammelt und trocknet. Dieses Produkt ist für die nachfolgende Stufe geeignet. Die Aminosäureanalyse für dieses Produkt ist wie folgt: Lys, 2,03; Asp, 1,18; Thr, 1,37; Ser, 0,54; GIy, 1,0; AIa, 1,0; Cys, 0,15; Phe, 2,96.

- 85 -

509824/1010

M/15 563

Beispiel 24

Zyklisches Disulfid von t-Butyloxycarbonylalanylglycylcysteinyl-N^-t-butyloxycarbonyl-lysylasparaginyl-phenylalanyl-phenyl-

alanyl-tryptophArl-N^-t-butyloxycarbonyllysyl-threonylphenylalanyl-threonylser3i^rl cystein
(Boc-Ala-Gly-Cys-Lys-Asn-Phe-Phe-Trp-Lys-Thr-Phe-Thr-Ser-Cys-OH)

Boc Boc

Eine Lösung von 0,635 g (0,305 mMol) der Titelverbindung,gemäß Beispiel 23,
Boc-Ala-Gly-Cys-Lys-Asn-Phe-Phe-Trp-Lys-Thr-Phe-Thr-Ser-Cys-O^

Acm Boc Boc Acm

in 700 ml Methanol wird im Verlauf von 1 Std, bei Raumtemperatur zu einer Lösung von 0,778 g (3,05 mMol) Jod in 156 ml Methanol zugegeben. Nach beendeter Zugabe wird die Lösung bei Raumtemperatur 45 Min. gerührt. Die Lösung kühlt man auf O⁰C und gibt langsam eine Lösung von 1,34 g (6,1 mMol) Natriumthiosulfat in 25 ml Wasser zu. Die Lösung wird beinahe zur Trockene konzentriert und zu 100 ml Wasser gegeben. Den erhaltenen Niederschlag sammelt man und wäscht mit Wasser und trocknet, wobei man die Titelverbindung erhält.

Die Titelverbindung erhält man auch, indem man die Arbeitsweise dieses Beispiels befolgt, jedoch die Titelverbindung gemäß Beispiel 23 durch eine äquimolare Menge der Titelverbindung gemäß Beispiel 23a ersetzt. In diesem Falle ist Methanol/Benzol (3:1) .ein geeignetes Reaktionslösungsmittel.

Auf dieselbe Weise werden die Titelverbindungen gemäß den Beispielen 23 und 23a nach der Methode von Hiskey und Smith, obiges Zitat, in die Titelverbindung überführt.

- 86 509824/1010

OS M/15 563

Beispiel 24a

Zyklisches Disulfid von t-Butyloxycarbonylalanylglycylcysteinyl-N^-t-butyloxyc.arbonyllysyl-asparaginyl-phenylalanyl-phenylalanyl- tryptophyl-N^fc-t-butyloxycarbonyllysyl-(0-t-birtyl)-tlireonylphenylalanyl-(O-t-butyl)-threonyl-(O-t-butyl)-serylcystein

(Boc-Ala-Gly-Cys-Lys-Asn-Phe-Phe-Trp-Lys-Thr-Phe-Thr-Ser-Cys-OH)

t ' ! I 4- J 4- t 4- ι

Boc · " Boc Bu Bu Bu

1>0 g (0,445"EiMoI) des linearen Tetradecapeptids gemäß Beispiel 23b, ■

Boc-Ala-Gly-Cys-Lys-Asn-Phe-Phe-Trp-Lys-Thr-Phe-Thr-Ser-Cys-OH,

!1 t 1 -f- t 4- t 4- t

Acm Boc Boc Bu Bu Bu Acm

v/erden in 900 ml heißem Methanol gelöst. Die' Lösung wird filtriert, um etwas unlösliche.s Material zu entfernen, auf Raumtemperatur gekühlt und tropfenweise zu einer Lösung von 1,13g (4,45 mMol) Jod in 500 ml Methanol im Verlauf von 1 Std. zugegeben. Man rührt die Mischung eine weitere Stunde, kühlt auf O⁰C und gibt eine Lösung von 2,2 g (8,9 mMol) Natriurathiosulfat in ungefähr 20 ml Wasser zu, um den Überschuß an Jod zu zerstören. Das Lösungsmittel wird eingedampft und der Rückstand wird mit 200 ml Wasser verrieben. Den Niederschlag sammelt man durch Filtrieren, wascht und trocknet. Das rohe Produkt wird in 15 ml Methanol gelöst.¹ Der unlösliche Anteil wird durch Filtrieren entfernt. Das Filtrat dampft man zur Trockene ein, wobei man die Titelverbindung erhält, die ohne weitere Reinigung für die nachfolgende Stufe geeignet ist. Ein Teil des Produkts wird durch -Filtrieren durch ein vernetztes Dextranadsorbens (Sephadex LH-20) gereinigt,' wobei man eine gereinigte Fraktion der Titelverbindung mit der nachfolgenden Aminosäureanalyse erhält: Lys, 2,2; Asp, 1,0; Ser, 0,98; Cys, 1,1; Thr, 2,0; GIy, 1,0; Phe, 3,5.

Man erhält die Titelverbindung auch, indem man die Arbeitsweise dieses Beispiels befolgt, jedoch die Titelverbindung gemäß Beispiel 23b durch eine äquivalente Menge der Titelverbindung ge-

50 9 8 24/⁸ίθΊ Ο

/¹ 563

maß Beispiel 23c ersetzt. In diesem Falle ist Methanol/Benzol (4:1) ein geeignetes Reaktionslösungsmittel.

Auf dieselbe Weise v/erden die linearen Tetradecapeptide gemäß den Beispielen 23b und 23c gemäß der Methode von Hiskey und Smith, obiges Zitat, in die Tite!verbindung überführt.

Beispiel 25

Somatostatin, zyklisches Disulfid von Alanylglycylcysteinyllysylasparaginyl-phenylalanyl-phenylalanyl-tryptophyllysylthreonyl-phenylalanyl-threonylserylcystein (H-Ala-Gly-Cys-Lys-Asn-Phe-Phe-Trp-Lys-Thr-Phe-Thr-Ser-Cys-OH)

Eine Lösung von 0,368 g (0,19 mMol) der Titelverbindung, nämlich des zyklischen Disulfide gemäß Beispiel 24,

I I

Boc-Ala-Gly-Cys-Lys-Asn-Phe-Phe-Trp-Lys-Tnr-Phe-Thr-Ser-Cys-OH,

Boc Boc

in 16,4 ml konz. HCl wird 8 Min. bei 0⁰C unter einer Stickstoffatmopsphäre gerührt. 164 ml Eisessig werden zugegeben und die Lösung wird gefriergetrocknet. Den Rückstand löst man in 60 ml V/asser und führt wiederum eine Gefriertrocknung durch. Der Rückstand wird in 50 ml Wasser gelöst, auf eine Säule mit Carboxymethylcellulose (Whatman CM-23) (2 χ 20 cm) aufgegeben und mit 0,100 m Ammoniumacetatpuffer eluiert. Das gereinigte Material, (0,0o5 g) wird aus Wasser lyophilisert, wobei man das Produkt in Form eines weißen Feststoffs in Form seines Essigsäureadditionssalzes erhält;

λ^.°^Η 274 mn (C 5.730), 281 nm (.6,060), 289 nm ( 5,410);

Aminosäureanalyse: Lys, 2,24; Thr, 2,31; Ser, 1,0; GIy, 1,0; Asp, 0,95; Ala, 0,95; Cys, 1,11; Phe, 3,17;

AcOH =3,09 Äquivalente. ' ■

- 88 -

5098 24/1010

Lyophilisieren der zuletzt genannten Verbindung aus verdünnter Chlorwasserstoffsäure ergibt das entsprechende Chlorwasserstoffsäur eadditi ons salz;

Lys, 2,16; · Thr, 2,09; Ser, 0,96; GIy, 1,0; Asp, 1,05; Ala, 1,0;' Ser, 1,06; Gys, 0,81; Phe, 2,9.'

Die Titelverbindung, Somatostatin, wird auch erhalten, indem man die Arbeitsweise dieses Beispiels befolgt, jedoch'die "Titelverbindung, nämlich das zyklische Disulfid gemäß Beispiel 24, durch eine äquivalente Menge der Titelverbindung, nämlich des zyklischen Disulfids gemäß Beispiel 24a, ersetzt.

Beispiel 26

Alanylglycylcysteinyllysylasparaginyl-phenylalanyl-phenylalanyl-tryptophyllysyl-threonyl-phenylalanyl-serylcystein (H-Ala-Gly-Cys-Lys-Asn-Phe-Phe-Trp-Lys-Thr-Phe-Thr-Ser-Cys-OH)

Befolgt man die Arbeitsweise gemäß Beispiel 25. , ersetzt man jedoch die Tite!verbindung, nämlich das zyklische Disulfid gemäß Beispiel 24 durch eine äquivalente Menge der Titelverbindung gemäß Beispiel 23a,
Boc-Ala-Gly-Cys-Lys-Asn-Phe-Phe-Trp-Lys-Thr-Phe-Thr-Ser-Cys-OH,

Trt Boc Boc Trt

erhält man die Titelverbindung dieses Beispiels;

Aminosäureanalyse: Lys, 1,83; Asp, 0,91 j- Thr, 2,31; Ser, 1,08; GIy, 1,0; AIa, 0,86; Cys, 0,38; Phe, 2,64.

Auf gleiche Weise führt der Ersatz durch die Titelverbindung gemäß Beispiel 23c zur Titelverbindung dieses Beispiels.

- 89 -

5Q9824/1Q1Q

90 ^M/15 563

Beispiel 27

Propionylglycin-2,4,5-trichlorphenylester (CH^CHp-CO-Gly-OTcp)

Zu einer Lösung von 5,24 g (40 mMol) Propionylglycin (S.C.J. Fu und D.S.H. Male, J. Chromatog., 54, 205 (1971) und L.D. Abbott, Jr., J.Biol.Chem., 145, 242, (1942)) in 50 ml DMF gibt man 8 g (41 mMol) 2,4,5-Trichlorphenol. Die Lösung wird in einem Eisbad gekühlt und 8,2 g (41 mMol) DCC werden zugesetzt. Man rührt die Mischung 1 Std. bei 0°C und 18 Std. bei 25°C. Den Niederschlag entfernt man durch Filtrieren,.das Lösungsmittel dampft man ein und den.Rückstand kristallisiert man aus Äthylacetat, wobei man die Titelverbindung mit Schmelzpunkt I7I bis 173⁰C ■ erhält;

NMR (DMSO-dg) cT1,05 (t, 3H), 2,27 (q, 2H), 4,26 (d, 2H), 7,81 und 8,1 (d, 2H).

Beispiel 28

Propionylglycyl-S-tritylcysteinyl-N'^-t-butyloxycarbonyllysylasparaginyl-phenylalanyl-phenylalanin-methylester

(CHvCHo-CO-Gly-Cys-Lys-Asn-Phe-Phe-OMe) -> ^- »ι

Trt Boc

Zu einer Lösung von 4,3 g (4 mMol) H-Cys-Lys-Asn-Phe-Phe-OMe

t I

Trt Boc

(beschrieben in Beispiel I3) und 0,56 ml N-Äthylmorpholin in 20 ml DMF gibt man bei O⁰C eine kalte Lösung von 1,5 g (4,85 mMol) CH^CH₂-CO-GIy-OTCp, beschrieben in Beispiel 27, und 200 mg 1-Hydroxybenzotriazol in 15 ml DMF. Die Lösung wird 3 Tage in einem Eisbad gehalten. Das Lösungsmittel wird eingedampft, der Rückstand wird in Methanol gelöst und das Produkt wird mit Äther ausgefällt. Den Niederschlag trennt man durch Filtrieren ab und kristallisiert aus Methanol/Isopropyläther, wobei man die Titelverbindung mit Schmelzpunkt 210 bis 213⁰C erhält; -22,9 (C=I, DMF).

- 90 -

509824/1010

gj H/15 563

Beispiel 29

Propionylglycyl-S-tritylcysteinyl-N -t-butyloxycarbonyl-

lysylasparaginyl-phenylalanyl-phenylalanin-hydrazid

(CH-^CHU-CO-Gly-Cys-Lys-Asn-Phe-Phe-NHNHp)

Trt Boc

Zu einer Lösung von 4,1 g (3,6 mMol) CHvCH~-CO-Gly-Cys-Lys-

Trt Boc

Asn-Phe-Phe-OMe (beschrieben in Beispiel 28) in 300 ml Methanol gibt man 6,4 ml (0,13 mMol) Hydrazinhydrat. Die Mischung wird 2 Tage bei Raumtemperatur gerührt. Den Niederschlag trennt man durch Filtrieren ab, wäscht mit kaltem Methanol und kristallisiert aus Methanol, wobei man die Titelverbindung mit Schmelzpunkt 218°C (Zersetzung) erhält;

[α~ζ⁵ -26,1 (c=1, DMF).

Beispiel 30

Propionylglycyl-S-tritylcysteinyl-N^-t-.butyloxycarbonyllysyl-asparaginyl-phenylalanyl-phenylalanyl-tryptophyl-N -tbutyloxycarbonyllysyl-(0-t-butyl)-threonylphenylalanyl-(0-t-butyl)-threonyl-(0-t-butyl)-seryl-S-tritylcystein (CH-^CHp-CO-Gly-Cys-Lys-Asn-Phe-Phe-Trp-Lys-Thr-Phe-Tlir-Ser-

-' '· 114- 14-fJ-

Trt Boc Boc Bu* Bu*

Cys-OH)
Trt

Zu einer gerührten Lösung von 0,564 g (0,5 mMol) CH^CH^CO-Gly-Cys-Lys-Asn-Phe-Phe-NHNt^ (beschrieben 'in Bei-

Trt Boc

spiel 29) in 6 ml DMF gibt man bei -1O°C 0,56 ml (1,28 mMol) einer 2,3n Lösung von Chlorwasserstoff in Äthylacetat. Die Mischung wird auf -15⁰C gekühlt und 0,07 ml (0,6.mMol) t-Butylnitrit werden zugesetzt. Die Lösung wird 15 Min. bei -1O°C gerührt, auf -15°C gekühlt und 0,166 ml (0,97 mMol) N-A'thyl-

- 91 -509824/10 10

diisopropylarain werden zugegeben, gefolgt von einer Lösung von 0,800 mg (0,57 mMol) H-Trp-Lys-Thr-Phe-Thr-Ser-Cys-OH (be-

I 14- I 4- I 4- I

Boc Bu Bu Bu Trt

schrieben in Beispiel 22b) und 0,098 ml (0,57 mMol) N-Äthyldiisopropylamin in 5 ml Di-IF. Die Mischung wird 1 Std. bei -10⁰C, 1 Std. bei O⁰C und 18 Std. bei 25⁰C gerührt.

Das Lösungsmittel wird eingedampft, der Rückstand wird in Methanol suspendiert und die Suspension wird tropfenweise zu einer 5 i^igen wäßrigen Zitronensäurelösung zugegeben. Den Niederschlag filtriert man, trocknet, verreibt mit Methanol und trocknet, wobei man die Titelverbindung erhält. Die Aminosäureanalyce (Oxydation mit Perameisensäure) ist für die Titelverbindung wie folgt: Lys, 2,37; Ser, 0,82; Asp, 0,98; GIy, 1,0; Thr, 2,06; Phe, 3,24; Cysteinsäure, 2,24.

Beispiel 31

Zyklisches Disulfid von Propionylglycylcysteinyllysyl-asparaginyl-phenylalanyl-phenylalanyl-tryptophyl-lysylthreonylphenylalanyl-threonylserylcystein

(CH^CHo-CO-Gly-Cys-Lys-Asn-Phe-Phe-Trp-Lys-Thr-Phe-Thr-Ser-Cys-OH) ^{3 Z} \ I

(I; R¹ = H und R² = COOH)

Man löst 0,800 g (0,32 mMol) des linearen Tetradecapeptids gemäß Beispiel 30,
CH^CHp-CO-Gly-Cys-Lys-Asn-Phe-Phe-Trp-Lys-Thr-Phe-Thr-Ser-Cys-OH,

Trt Boc Boc Bu Bu Bu Trt

in 900 ml heißem Methanol, kühlt die Lösung auf Raumtemperatur und gibt sie tropfenweise unter Rühren innerhalb einer Stunde zu 150 ml einer 0,5 %igen Lösung von Jod (30 mMol) in Methanol. · Die Mischung wird weitere 45 Min. gerührt, in einem Eisbad gekühlt und eine 1n Lösung von Natriumthiosulfat in 6 ml Wasser wird zugegeben, um den Überschuß an Jod zu zerstören (farblose Lösung), Das Lösungsmittel wird eingedampft und der.Rückstand wird mit Wasser verrieben, getrocknet und das trockene Produkt

50 9 8 24/101 Q

M/15-563

wird mit Isopropyläther verrieben, wobei man das zyklische Disulfidtetradecapeptid

I TH

CH^CHp-CO-Gly-Cys-Lys-Asn-Phe-Phe-Trp-Lys-Thr-Phe-Thr-Ser-Cys-OH

Bu ^c Bu °

I
ys

I ! + ι I

Boc " · Boc Bu Bu ^c Bu

erhält.

Zu 0,400 g (0,2 mMol) der letzteren Verbindung gibt man 16 ml kalte konz. Chlorwasserstoffsäure in einem Eisbad unter einer Stickstoffatmosphäre unter heftigem Rühren zu. Man rührt noch 10 Min., gibt 160 ml Eisessig zu und lyophilisiert die Lösung. Den Rückstand löst, man in Wasser und lyophilisiert.wiederum. Der Rückstand wird in 50 ml Wasser gelöst, auf eine Säule mit Carboxymethylcellulose (Whatman CM-23) (2,5 x 30 cm) aufgegeben und mit 0,03 m Ammoniumacetatpuffer eluiert. Das gereinigte Material wird aus Wasser lyophilisiert, wobei man die Titelverbindung als weißen Feststoff in Form seines Essigsäureadditionssalzes erhalt;

289 nm (£ 6,350).

Wiederholtes Lyophilisieren des zuletzt genannten Produkts aus Wasser ergibt die Titelverbindung in Form eines freien Peptidderivats;

Aminosäureanalyse: Lys, 2,07; Asp, 0,96; Thr, 2,07; Ser, 0,93; Phe, 3,14. .

Auf dieselbe Weise, jedoch unter Verwendung von Thiocyan gemäß der Methode von Hiskey und Smith, obiges Zitat, anstelle von Jod, erhält man ebenfalls die Tite!verbindung.

- 93

509824/1010

M/15 563

94

Beispiel 32

a,a-Dimcthyl-3,5-dimetlioxyberi2yloxycarbonyltryptophyl-N ~tbutyloxycarbonyllysyl-(0-1-butyl) -threonyl-phenylalanyl-(0-t-butyl)-threonyl-(0-t-butyl)-serin-2-(tritylthio)-äthylaraid (Ddz-Trp-Lys-Thr-Phe-Thr-Ser-NHCHpCHpS-Trt)

I 1 4· »4-14- '

Boc Bu Bu Bu⁰ Man löst 0,64 g (1 mMol) Ddz-Trp-Lys-Thr-Phe-Thr-Ser-NHNH-

1 14- t 4- » -f- ^

Boc Bu Bu Bu

(beschrieben in Beispiel 20a) in 10 ml trockenem destilliertem DI-IF und kühlt auf -20⁰C. 0,625 mMol 2n Chlorwasserstoffsäure in Äthylacetat werden zugegeben, gefolgt von 0,069 ml (0,6 mMol) t-Butylnitrat. Die Mischung wird 15 Min. bei -15⁰C gerührt. Eine Lösung von 159 mg (0,5 mMol)· 2-Tritylthioäthylamin (F.I. Carroll et al., J.Org.Chem., 30, 36 (1965)) in 10 ml DFIF, das 0,212 ml (1,25 mMol) N-Äthyldiisopropylamin enthält, wird auf -15°C gekühlt'und tropfenweise zu der obigen Reaktionsmischung zugegeben. Man rührt noch 1 Std. bei -15⁰C und über Nacht bei 25°C. Die Reaktionsmischung wird unter vermindertem Druck eingedampft, der Rückstand wird mit eiskalter 1n Zitronensäure verrieben, filtriert und mit Wasser gewaschen und getrocknet. Den Rückstand unterwirft man einer Chromatographie auf Silikagel (75 g) mit CHCl-, als Eluierungsmittel, das 3 % MeOH enthält, wobei man das chromatographisch reine Produkt erhält und aus MeOH-Isopropyläther kristallisiert, wobei man die Titelverbindung mit Schmelzpunkt 138 bis 14O°C erhält;

[cx,]q⁵ +10,8 (c=1, DMF).

509824/1010

ϊί/15 563

Beispiel 33

Tryptophyl-N^~t-butyloxycarbonyllycyl-(O-t-butyl)-threonyl- phenylalanyl- (O-t-butyl)-threonyl- (O-t-butyl) -serin-2-(tritylthio)-athylamid
(H-Trp-Lys-Thr-Phe-Thr-Ser-NHCHoCH^S-Trt)

It-I- 1+ If Ct-

Boc Bu Bu Bu
400 mg (0,256 mMol) Ddz-Trp-Lys-Thr-Phe-Thr-Ser-NHCHpCH^S-Trt

t I 4- 14-14- CC.

Boc Bu Bu⁰ Bu

(beschrieben in Beispiel 32) werden in einer Mischung von 3,5 ml kalter Essigsäure/Ameisensäure/Wasser (7:1:2) gelöst und bei Raumtemperatur über Nacht gerührt. Das Lösungsmittel wird eingedampft. Den Rückstand nimmt man in 15 ml Methanol auf. Der pH der Mischung wird mit konz. Ammoniumhydroxydlösung auf 6,5 eingestellt und das Lösungsmittel wird verdampft. Den Rückstand lyophilisiert man aus Wasser, wobei man die Titelverbindung in Form eines Feststoffs erhält. Lys, 1,06; Ser, 0,73; Thr, 1,86; Phe, 1,00.

Beispiel· 34

t-Butyloxycarbonylalanylglycyl-S-tritylcysteinyl-N^-t-butyloxy-carbonyllysyiasparaginyl-phenylalanyl-phenylalanyl-•tryptophyl-N* -t-butyloxycarbonyllysyl- (O-t-butyl) -thr eonylphenylalanyl-(O-t-butyl)-threonyl-(O-t-butyl)-serin-2-(tritylthio)-äthylamid

(Boc-Ala-Gly-Cys-Lys-Asn-Phe-Phe-Trp-Lys-Thr-Phe-Thr-Ser-

I I 4- I 4- t 4-

Trt Boc . Boc Bu Bu Bu

NHCH₂CH₂S-TTt.)

Man löst 0,400 g (0,320 mMol) Boc-Ala-Gly-Cys-Lys-Asn-Phe-

Trt Boc

Phe-NHNH₂ (in Beispiel 14 beschrieben) in 6,25 ml trockenem destilliertem DMF und kühlt auf -20⁰C. 0,40 ml (0,80 mMol) 2n Chlorwasserstoffsäure in Äthylacetat werden zugegeben, gefolgt von 0,044 ml (0,384 mMol) t-Butylnitrit. Die.Mischung wird 15 Min. bei -15°C gerührt. Eine Lösung von 0,492 g

- 95 -509824/1010

M/15 563

(0,320 mMol) H-Trp-Lys-Thr-Phe-Thr-Ser-NHCHpCHpS-Trt (beschrie-

T I -f- J -f- I +■ έ. C.

Boc Bu Bu Bu

ben in Beispiel 33) in 4,7 ml DMF und 0,136 ml (0,8 mMol) N-Athyldiisopropylamin werden auf -15°C gekühlt und tropfenweise zu der obigen Reaktionsmischung zugegeben. Man rührt noch 1 Std. bei -15⁰C und 18 Std. bei 25°C. Die Reaktionsmisehung wird unter vermindertem Druck eingedampft. Den Rückstand verreibt man mit eiskalter 2n Zitronensäure, filtriert und wäscht mit Wasser und verreibt dann und wäscht viermal mit Methanol und trocknet, wobei man die Tite!verbindung erhält. Die Aminosäureanalyse für das Produkt ist wie folgt: Lys, 2,24; Ser, 0,53; Asp, 1,04; GIy, 1,00; Thr, 1,90; AIa, 1,02; Phe, 3,16.

Beispiel 35

Zyklisches Disulfid von Alanylglycylcysteinyl-lysylasparaginyl phenylalanyl-phenylalanyl-tryptophyllysyl-thrg.onyl-phenyl-

alanyl-threonylserin-2-mercaptoäthylarnid (H-AIa-Gly-Cys-Lys-Asn-Phe-Phe-Trp-Lys-Thr-Phe-Thr -

(I; R¹ = NHo und R² = H)

Eine Lösung von 0,611 g (0,240 mMol) Boc-Ala-Gly-Cys-Lys-Asn-

Trt Boc Phe-Phe-Trp-Lys-Tnr-Phe-Thr-Ser-NHCHnCH₉S-Trt (beschrieben in

t i +■ 1 +· 1 4- C. C.

Boc Bu Bu¹' ⁰

Beispiel 34) in 30 ml trockenem destilliertem DMF wird langsam zu einer gerührten Lösung von 0,625 g (2,46 mMol) Jod in 122 ml Methanol bei Raumtemperatur zugegeben. Nach beendeter Zugabe wird die Lösung 1 Std. bei 25⁰C gerührt. Die Lösung kühlt man auf O⁰C und gibt eine 1n Lösung von Natriumdisulfat in Wasser langsam zu, um den Überschuß an Jod zu zerstören (farblose Lösung). Das Lösungsmittel wird beinahe bis zur Trockene eingedampft, der Rückstand wird in 10 ml Methanol gelöst und zu 40 ml kaltem Wasser zugegeben. Den Niederschlag sammelt man und wäscht ihn mit warmem Wasser und trocknet über Phosphor-

- 96 -5098 247 1010

2A58T35 '

M/15

pentoxyd, wobei man das cyolische Peptid Boc-Ala-Gly-Cys-Lys-Asn-Phe-Phe-Trp-Lys-Thr-Phe-Thr-Ser-NHCH-CHoS erhält

I I 1+ ! 4- I 4-- ti. C-

Boc Boc Bu^ Bu^{x x}

Dieses zyklische Peptid wird bei O⁰C unter einer Stickstoffatmosphäre 10 Min. in 19,4 ml konz. Chlorwasserstoffsäure heftig gerührt. Man gibt 195 ml Eisessig zu und lyophilisiert die Lösung. Den Rückstand nimmt man in 50 ml Wasser auf und lyophilisiert wiederum. Der Rückstand wird in 0,01 m Ammoniumacetat gelöst und zentrifugiert, um den festen Anteil'zu verwerfen. Die erhaltene trübe Lösung wird auf eine Säule von Carboxymethylcellulose (Whatman CM-23 (2,1 χ 35 cm)) aufgegeben und mit 0,06 m Ammoniumacetatpuffer eluiert und lyophilisiert, wobei man die Titelverbindung als zweiten Feststoff in Form ihres Essigsäureadditionssalzes' erhält;

λ*°» 273 η- (£4620), 282 nm (E 4779)., 289 nm (l 4301).

Wiederholtes Lyophilisieren des zuletzt genannten Produkts aus Wasser ergibt die Titelverbindung in Form eines freien Peptidderivats.

Aminosäureanalyse: Lys, 1,96; Ser, 069;, Asp, 0,92; GIy, 1,00; Thr, 1,83; Phe, 3,03.

Auf dieselbe ΐ/eise, jedoch unter Verwendung von Thiocyan gemäß der Methode von Hiskey und Smith_t oben zitiert, anstelle von Jod erhält man ebenfalls die Titelverbindung.

- 97 -

509824/1010

M/15 563

Beispiel 36

Propionylglycyl-S-tritylcysteinyl-N -t-butyloxycarbonyl-

lysylasparaginyl-phenylalanyl-phenylalanyl-tryptophyi-N^-t-

butyloxycarbonyllysyl-(0-t-butyl)-threonyl-phenylalanyl-

(0-t-butyl)-threonyl-(0-t-butyl)-serin-2-(tritylthio)-äthylamide

(CH^CHg-CO-Gly-Cys-Lys-Asn-Phe-Phe-Trp-Lys-Thr-Phe-Thr-Ser-

^T^ ^B°° ^Bo° ^B^

0,564 g (0,5 mMol) des Hexapeptids
CH-₅CH₂-CO-Gly-Cys-Lys-Asn-Phe-Phe-NHNH₂ (beschrieben in Bei-

Trt Boc

spiel 29) werden in 6 ml trockenem destilliertem DMF gelöst und auf -20°C gekühlt. Man gibt 0,66 ml (T,25 mMol) 1,9n Chlorwasserstoffsäure in Äthylacetat zu, gefolgt von 0,0685 (0,60 mMol) t-Butylnitrit. Die Mischung wird 15 Minuten bei -15⁰C gerührt. Eine Lösung von 0,670 g (0,50 mMol) H-Trp-Lys-Thr-Phe-Thr-Ser-NHCHoCHpS-Trt (beschrieben in Boc Bu Bu^x Bu

Beispiel 33) in 5 ml DMF, das 0,214 ml (1,25 mMol) N-Äthyldi isopropylamin enthält, wird auf -15⁰C gekühlt und zugegeben. Die Mischung wird nun 1 Std. bei -15°C und 18 Std. bei 25°C gerührt. Die Reaktionsmischung wird unter vermindertem Druck eingedampft. Den Rückstand verreibt man mit Methanol, anschließend mit eiskalter 1n Zitronensäure, filtriert und wäscht mit Wasser. Der feste Rückstand wird wiederum viermal mit MeOH verrieben und getrocknet, wobei man die Titelverbindung erhält;

NMR (DMSO-d₆) cf 1,05 und 1,13 (18H), 1,38 (27H), 7,37 (30H);

Aminosäureanalyse: Lys, 2,20; Asp, 0,98; Thr, 1,73; Ser, 0,50; GIy, 1,00; Phe, 2,96.

- 93 -

509824/1010

M/15 553

Beispiel 37

Zyklisches Disulfid von" Propionylg^cylcysteinyl-lysylasparaginyl-phenylalanyl-phenylalanyl-t'ryptophyl-lysyl-fchreonylphenylalänyl-threonylserin-Z-mercaptoäthylamid'(CH^CH₂-CO-GIy-

(I;, R¹ und R² = H)

Eine Lösung von 0,003 g (0,325 mMol) des Tetradecapeptids

CH-rCHp-CO-Gly-Cys-Lys-Asn-Phe-Phe-Trp-Lys-Thr-Phe-Thr-Ser- -^ ' ' ι Ί+ 't'i"

Trt.Boc Boc Bu Bu Bu

NHCH₂CH₂-S-Trt (in Beispiel 36 beschrieben) in 50 ml DMF wird bei 25°C langsam, zu einer gerührten Lösung von 0,823 g (3,25 EiMoI) Jod in 163 ml Methanol zugegeben. Nach beendeter Zugabe wird die Lösung 1 Std. bei 25°C gerührt. Die Lösung kühlt man auf 0⁰C und gibt .langsam eine Lösung von 1n Natriumthiosulphat in Wasser zu, um den Überschuß an Jod.zu zerstören (farblose Lösung)., Das Lösungsmittel wird eingedampft. Den Rückstand löst man in 10 ml Methanol und gibt ihn zu kaltem ¥asser zu. Der Niederschlag wird filtriert und über Pliosphorpentoxyd getrocknet, wobei man das zyklische Tetradecapeptid CH₃CH₂-CO-GIy-

-Cys-Lys-Asn-Phe-Phe-Trp-Lys-Thr-Phe-Tlir-Ser-NFICHpCHoS

I 114- I 4- I +· C-C.

Boc Boc Bu Bu^u Bu^u

erhält. Die zuletzt genannte Verbindung wird bei O⁰C unter einer Atmosphäre von Stickstoff 10 Min. in 25 ml konz. Chlorwasserstoffsäure heftig gerührt. Man gibt 250 ml Eisessig zu und lyophilisiert die Lösung. Der Rückstand wird in Wasser aufgenommen und wiederum lyophilisiert. Der Rückstand- (600 ml) wird in 0,01 m Ammoniumacetat gelöst, und man zentrifugiert, um den festen Anteil zu verwerfen; die erhaltene trübe Lösung wird auf eine Säule mit Carboxymethylcellulose (Whatman CM-23) (2,1 cm χ 35 cm) aufgegeben und mit 0,04 und 0,05 m Ammoniumacetatpuffer eluiert und lyophilisiert, wobei man die Titelverbindung als weißen Feststoff in Form ihres Essigsäureaddi-

— 99 — 50 98 24/1010

tionssalzes erhält.

λ "ax! ^2Q9 nm (ί 4280), 283 ran (E 4680), 267 nm U 4620).

Wiederholtes Lyophilisieren des zuletzt genannten Produkts aus Wasser ergibt die Titelverbindung in Form eines freien Peptidderivats.

Aminosäureanalyse: Lys, 1,96; Ser, 0,77; Asp, 1,01; GIy, 1,00; Thr, 1,79; Phe, 2,90.

Auf dieselbe Weise, jedoch unter Verwendung von Thiocyan gemäß der Methode von Hiskey und Smith, obiges Zitat, anstelle von Jid, wird die Titelverbindung ebenfalls erhalten.

Be.isOiel

Benzyloxycarbonyl-N -t-butyloxycarbonyl-D-lysylasparaginylphenylalanyl-phenylalanin-methylester (Z-D-Lys-Asn-Phe-Phe-OMe)

Boc

Zu einer auf O⁰C gekühlten und gerührten Lösung von 4,6 g (0,0089 Mol) H-Asn-Phe-Phe-OMe.CF₃COOH (beschrieben in Beispiel 7) in 40 ml DMF gibt man 1,15 ml N-Äthylmorpholin und eine Lösung von 4,5 g (0,0089 Mol) Z-D-Lys-ONp in 20 ml DMF.

Boc

Die Lösung wird 3 Tage bei 0⁰C gehalten. Anschließend v/ird das Lösungsmittel unter vermindertem Druck eingedampft. Der Rückstand wird aus Methanol kristallisiert, wobei man die Titel verbindung mit Schmelzpunkt 198 bis 199⁰C erhält;.

- 100 -

5 0 9 8 2 4/1010

M/15

Analyse:

	63	C	6	H	N	88	%
ber. :	62	,79	6	,66	10,	39	%
gef.:	,56	,72	10,

Der Benzyloxycarbonyl-N -t-butyloxycarbonyl-D-lysin-p-nitrophenylester (Z-D-Lys-ONp) wird gemäß der Arbeitsweise von

Boc

E. Sandrin und R.A. Boissonnas, Helv.Chim.Acta, 46_, 1637 (1963) lind den dort aufgeführten Literaturzitaten zur Herstellung des entsprechenden L-Lysinderivats hergestellt, mit der Ausnahme, daß anstelle von L-Lysin D-Lysin verwendet wird.

Beispiel 39

NjS-Ditritylcysteinyl-N^-t-butyloxycarbonyl-D-lysylasparaginyl-phenylalanyl-phenylalanin-methylester (Trt-Cys-D-Lys-Asn-Phe-Phe-OMe)

Trt Boc

Eine Lösung von 4,5 g (0,0058 Mol) des geschützten Tetrapeptids Z-D-Lys-Asn-Phe-Phe-OMe (beschrieben in Beispiel 38)

Boc ■

in 00 ml trockenem destilliertem DMF und 80 ml Eisessig wird in Gegenv/art von 0,6 g 5 % Pd/C hydriert. Die Reduktion ist in 3 Std. beendet. Der Katalysator wird durch Filtrieren entfernt und das Lösungsmittel wird eingedampft und der Rückstand wird in Methanol gelöst und mit Äther ausgefällt, wobei man das entschützte Tetrapeptid H-B-Lys-Asn-Phe-phe-OMe erhält. Boc

Zu der gekühlten und gerührten Lösung von 4,1 g (0,0056 Mol) des entschützten Tetrapeptids und 0,87 ml N-Äthylmorpholin in 30 ml DMF gibt man bei O⁰C eine Lösung von 5,3 g (0,0068

' - 101 -

509824/1010

^{M/15 563}

MoI) NjS-Ditritylcystein-N-hydroxysuccinimid-ester (B. Kamber, H. Bruckner, B. Riniker, P. Sleber und W. Rittel, HeIv.' Chim. Acta, 53, 556 (1970)) zu. Die Mischung wird 4 Tage bei 0⁰C gerührt. Das Lösungsmittel wird eingedampft, der Rückstand wird in 400 ml Äthylacetat gelöst und die Lösung wird filtriert, um etwas Niederschlag zu entfernen (verworfen). Das Filtrat wäscht man mit 3 x 100 ml 5 ?6iger wäßriger Zitronensäure, 3 X,1OO ml 7 tigern Natriumbicarbonat und 2 χ 50 ml einer gesättigten Natriumchloridlösung. Die Lösung wird über MgSO/ getrocknet und das Lösungsmittel wird eingedampft. Den Rückstand kristallisiert man aus Äthylacetat/Petroläther, wobei man die Titelverbindung mit Schmelzpunkt 169⁰C (Zersetzung) erhält;

= 9,9° (C=I, DMF).

Beispiel 4θ

t-Butyloxycarbonylalanylglycyl-S-tritylcysteinyl-N^-t-butyloxycarbonyl-D-lysylasparaginyl-phenylalanyl-phenylalaninmethylester (Boc-Ala-Gly-Cys-D-Lys-Asn-Phe-Phe-OMe)

I t

Trt Boc

Zu einer Lösung von 2,6 g (2,07 mMol) Trt-Cys-D-Lys-Asn-Phe-Phe-OMe (beschrieben in Beispiel 39) Trt Boc

in 160 ml Eisessig gibt man bei Raumtemperatur tropfenweise 30 ml Wasser. Die Lösung wird 2 Std. bei 45⁰C gerührt, mit 200 ml Wasser verdünnt und der Niederschlag wird durch Filtrieren entfernt. Das Filtrat v/ird zur Trockene eingedampft. Den Rückstand löst man in Methanol und das Produkt wird mit Äther ausgefällt, wobei,man H-Cys-D-Lys-Asn-Phe-Phe-OMe erhält. Trt Boc

Zu einer gekühlten Lösung von 1,6 g (1,49 mMol) der zuletzt genannten Verbindung in 20 ml DMF gibt man bei 0⁰C 0,24 ml

- 102 509824/ 1010

N-Äthylraorpholin, eine Lösung von 0,79 g (1,86 mMol) t-Butyloxycarbonylalanylglycin-2,4,5-trichlorphenylester (beschrieben in Beispiel 3) in 7 ml DMF und eine katalytische Menge von 0,10 g 1-Hydroxybenzotriazol. Die Lösung wird 3 Std. bei O⁰C gehalten. Das Lösungsmittel wird eingedampft. Den Rückstand löst man in Methanol. Zugabe von Äther führt zu einem Niederschlag. Kristallisation des Niederschlags aus Methanol ergibt die Titelverbindung mit Schmelzpunkt 232⁰C (Zersetzung).

[a]25 = 20,6 (c=1, DMP);

Aminosäureanalyse: Lys, 1,02; Asp, 1,03; GIy, 1,00; Ala, 1,00; Cys, 0,40; Phe 2,11.

Beispiel 41

l-Butyloxycarbonylalanylglycyl-S-tritylcysteinyl-N^-t-butyloxycarbonyl-D-lysylasparaginyl-phenylalanyl-phenylalaninhydrazid (Boc-Ala-Gly-Cys-D-Lys-Asn-Phe-Phe-NH-NH^)

- Trt Boc

Zu einer Lösung von 0,95 g (0,76 mMol) des Heptapeptidmethylesters Boc-Ala-Gly-Cys-D-Lys-Asn-Phe-Phe-OMe (be-

t I

Trt Boc

schrieben in Beispiel 40) in 12 ml DMF, die in einem Eisbad gekühlt ist, gibt man tropfenweise 1,5 ml (0,0305 Mol) Hydrazinhydrat zu. 'Die Mischung wird 20 Std. bei 25°C gerührt. Das Lösungsmittel wird eingedampft, der Rückstand wird mit Wasser und Methanol verrieben und getrocknet, wobei man die Tite!verbindung erhält.

Aminosäureanalyse: Lys, 1,07; Asp, 1,04; GIy, 1,00; Ala, 1,00; Cys, Spur; Phe, 2,18.

- 103 -

509824/10 10

H/15 563

Beispiel 42

t-Butyloxycarbonylalanylglycyl-S-tritylcysteinyl-N^-t-butyloxycarbonyl-D-lysylasparaginyl-phenylalanyl-phenylalanyltryptophyl-N*· -t-butyloxycarbonyllysyl-(O-t-butyl)-threonylphenylalanyl-(0-t-butyl)-threonyl-(0-t-butyl)-seryl-S-tritylcystein

(Boc-Ala-Gly-Cys-D-Lys-Asn-Phe-Phe-Trp-Lys-Thr-Phe-Thr-Ser-Cys-OH) _Trt Boc Boc Bu* Bu*

Befolgt man die Arbeitsweise gemäß Beispiel 23, ersetzt jedoch das dort beschriebene erste Heptapeptid durch Boc-Ala-Gly-Cys-D-Lys-Asn-Phe-Phe-NHNHg, das in Beispiel

Trt Boc

beschrieben ist, und ersetzt man das dort beschriebene zweite Heptapeptid durch H-Trp-Lys-Thr-Phe-Thr-Ser-Cys-OH, das

ι ι +· ι +■ ι + ι Boc Bu^u Bu^ Bu^ Trt

in Beispiel 22c beschrieben ist, erhält man das Titelprodukt, nämlich das lineare Tetradecapeptid. Dieses lineare Tetradecapeptid wird leicht aus der Reaktionsmischung isoliert, indem man das Lösungsmittel eindampft, den Rückstand in Methanol löst, die erhaltene Lösung tropfenweise zu einer 5 böigen wäßrigen Zitronensäurelösung zugibt und den erhaltenen Niederschlag sammelt und trocknet. Dieses Produkt ist geeignet für die nächste Stufe. Die Aminosäureanalyse für dieses Produkt ist wie folgt: Lys, 2, Hr, Asp, 1,09; Thr, 2,13; Ser, 0,71; GIy, 1,00; AIa, 1,00; Cys, 0,12; Phe, 3,08.

- 104 -

509824/1010

/or ^{ΆΜ 5δ3}

Beispiel 43.

Zyklisches Disulfid von t-Butyloxycarbonylalanylglycylcysteinyl-IT^-t-butylöxycarbonyl-D-lysylasparaginyl-phenylalanyl-phenylalanyl-tryptophyl-N^-t-butyloxycarbonyllysyl-(O-t-butyl)-threonyl-phenylalanyl-(O-t-butyl)-threonyl-(O-t-butyl)-serylcystein
(Boc-Ala-Gly-Cys-D-Lys-Asn-Phe-Phe-Trp-Lys-Thr-Phe-Thr-Ser-Cys-OH)

1 I J 4- I 4- f +·

Boc Boc Bu Bu Bu

0,65 g (0,25 mMol) des linearen Tetradecapeptids gemäß Beispiel

Boc-Ala-Gly-Cys-D-Lys-Asn-Phe-Phe-Trp-Lys-Thr-Phe-Thr-Ser-Cys-OH,

Trt Boc Boc Bu- Bu^u Bu^u Trt

werden in 10 ml v/armem DI/IF gelöst und die Lösung v/ird mit .122 ml Benzol und 490 ml· Methanol verdünnt. Die Lösung wird tropfenweise zu einer 0,5' %igen Lösung von Jod (2,4 mMol) in 122 ml Methanol im Verlauf von 1 Std. zugegeben. Die Mischung v/ird eine weitere Stunde gerührt, auf O⁰C gekühlt und eine Lösung von 1n Natriumthiosulfat in Wasser wird zugegeben, um den Überschuß an Jod zu zerstören. Das Lösungsmittel v/ird eingedampft und der Rückstand v/ird in Methanol gelöst. Das Methanol wird verdampft und der Rückstand wird mit Wasser verrieben, getrocknet, mit Diisopropyläther verrieben und getrocknet, wobei man die Titelverbindung mit der nachfolgenden Aminosäureanalyse erhält: Lys, 2,21; Asp, 1,02; Ser, 0,93; Cys, 1,08; Thr, 2,28; GIy, 1,00; Phe, 3,30; AIa, 1,00.

- 105 -

50982Λ/1010

JO (t ^M/15 563

Beispiel 44

λ
LD-Lys J-sornatostatin, zyklisches Disulfid von Alanyiglycyl-

cysteinyl-D-lysylasparaginyl-phenylalanylphenylalanyl-trypto-

phyllysylthreonyl-phenylalanyl-threonylserylcystein

(H-Ala-Gly-Cys-D-Lys-Asn-Phe-Phe-TrO-Lys-Thr-Phe-Thr-Ser-Cys-OH)

ι I ι

Befolgt man die Arbeitsv/eise gemäß Beispiel 25, ersetzt jedoch die Titelverbindung gemäß Beispiel 24, nämlich das zyklische Disulfid durch eine äquivalente Menge der Titelverbindung, nämlich des zyklischen Disulfide gemäß Beispiel 43,

Boc-Ala-Gly-Cys-D-Lys-Asn-Phe-Phe-Trp-Lys-Thr-Phe-Thr-Ser-Cys-OH,

Boc Boc Bu Bu Bu ^b

erhält man die TitelverMndung des vorliegenden Beispiels.

λ ma?^{1 29}° ^{nm (e 694O)}' 283 nm (i 6880);

Aminosäureanalyse: Lys, 1,97; Asp, 0,98; Thr, 1,87; Ser, 0,86; GIy, 1,00; AIa, 0,98; Cys, 0,87; Phe, 3,03.

Beispiel 45

Benzyloxycarbonyl-N^-butyloxycarDonyl-D-lysyl-(0-t-butyl)-threonyl-phenylalanyl-CO-t-butyl)-threonyl-(0-t-butyl)-serin-

methylester (Z-D-Lys-Thr-Pho-Thr-Ser-OMe)

i «t ' t ' t Boc Bu^c . Bu Bu^u

Unter Befolgung der Arbeitsweise gemäß Beispiel 18a werden Z-D-Lys-ONp und H-Thr-Phe-Thr-Ser-OMe gekuppelt, gefolgt von

I 1+ I -f- I +■

Boc ■ Bu Bu⁰ Bu

Chromatographie, v/obei man die Titel verbindung in Form eines Schaums erhält.

M-IR (CDCl₃) cT 1,3 (m, 42H), 3,75 (s, 3H), 5,17 (s), 7,3 und

7,38 (s, 10H).

- 106 -

509824/ 1010

Bezüglich der Herstellung von Z-D-Lys-OlTp vergl. Beispiel

Boc

Beispiel 46

α, rt'-Dimethyl-3,5-dimethoxybenzyloxycarbonyl-tryptophyl-N^-tbutyloxycarbonyl-D-lysyl-(O-t-butyl) -threonjrl-phenylalanyl-(O-t-butyl)-threonyl-(O-t-butyl)-serin-methylester
(Ddz-Trp-D-Lys-Thr-Phe-Thr-Ser-öMe)■

1 14- ' t ' t

Boc Bu Bu Bu

Unter Befolgung der Arbeitsweise gemäß Beispiel 19a wird
Z-D-Lys-Thr-Phe-Thr-Ser-OMe (beschrieben in Beispiel 45)

ι ι+ ι + ι -f-Boc Bu^x Bu Bu

hydriert, gefolgt von Kuppeln an Ddz-Trp-OH_h Nach Chromatographieren und Kristallisieren aus Äther/Petroläther erhält man die Titelverbindung mit Schmelzpunkt 106 bis 130°C.

	5	,4°	(c=1,	DMF) .	63 63	C	7 •7	H	8 8	N
Anaryse:						,19 ,09		,92 ,92		,79 ,78
				ber. : gef. :

Beispiel 47

a,"-Dimethyl-3,^-dimethoxybenzyloxycarbonyl-tryptophyl-N^-t butyloxycarbonyl-D-lysyl-C O-t-butyl)-threonyl-phenylalanyl-(O-t-butyl)-threonyl-(O-t-butyl)-serin-hydrazid
(Ddz-Trp-D-Lys-Thr-Phe-Thr-Ser-NHNH₉)

! »4- 14-1+ ^

Boc Bu Bu ⁰

Eine Lösung von 5,14 g (4,04 mMol)
Ddz-Trp-D-Lys-Thr-Phe-Thr-Ser-OMe (beschrieben in Beispiel 46)

114- J 4- 14-

Boc Bu Bu Bu

in 23 ml DMF wird mit 7,53 ml Hydrazinhydrat gemischt. Die Mischung .wird 21 Std. bei Raumtemperatur stehengelassen. Zugabe

- 107 50 9 824/1010

Jog ^:ί/15

von Wanner zur Mischung, Gammeln des Niederschlags und Kristallisation des Niederschlags aus Methanol/Diisopropyläther ergibt die Titelverbindung mit Schmelzpunkt 115 bis 130⁰C;
[a]25 _{= 9t}z° (c=1, DMF).

Beispiel

α,α-Dimethyl-3,5-dimethoxybenzyloxy-carbonyltryptophyl-N -t butyloxycarbonyl-D-lysyl-(0-t-butyl)-threonyl-phenylalanyl-(O-t-butyl)-threonyl-(0-t-butyl)-seryl-S-tritylcystein (Ddz-Tr-p-D-Lys-Thr-Phe-Thr-Ser-Cys-OH)

Eoc Bu Bu Bu Trt

2,15 g (1,69 mMol) Ddz-Trp-D-Lys-Thr-Phe-Thr-Ser-NHIIH.,

Boc Bu ^υ Bu ^υ Bu

(beschrieben in Beispiel 47) v/erden in 35 al trockenem destillierten DMF gelöst und auf -20⁰C gekühlt. Man gibt 2,11 ml 2n Chlorwasserstoffsäure in AtOAc zu, gefolgt von 0,233 ml (2,02 nülol) t-Butylnitrit. Die Mischung v/ird 15 Min. bei -15⁰C gerührt. Sine Lösung von 0,615 g (1,69 mMol) K-Cys-OH in 58 ml DMF, das 1,01 ml (5,92 mMol) Diisopropyl-Tr-t

äthylanin enthält, wird auf -15°C gekühlt und zu der obigen Reaktionsmischung zugegeben. Man rührt 1 Std. bei -15⁰C und über Nacht bei 20 bis 25°C. Die Reaktionsmischung v/ird unter vermindertem Druck (0,2 mm) bei 35°C eingedampft. Den Rückstand verreibt man mit eiskalter 1n Zitronensäure, filtriert, wäscht mit Wasser und trocknet, v/obei man die Titelverbindung erhält.

HMR (CDCl₃) J 1,13 und 1,2 (27H), 1,47(9H), 1,7 (6H), 3,70 (6H), 6,3 - 7,5 (29H).

- 108 -

509824/1010

M/15 563

B e i s ρ i e 1 49

Tryptophyl-N^-t-butyloxycarbonyl-D-lysyl-(0-t-butyl)-threonylphenylalanyl-(0-t-butyl)-threonyl-(0-t-butyl)-seryl-S-tritylcyatein (H-Trp-D-Lys-Thr-Phe-Thr-Ser-Cys-OH)

! 14- t 4- 1 f I

Boc Bu Eu Bu Trt

2,18 g Of36 alfol) Ddz-Trp-D-Lys-Thr-Phe-Thr-Ser-Cys-OH

I If 14- If I

Boc 3u Bu 3u Trt

(beschrieben in Beispiel 48) werden in 18 ml einer Mischung von Essigsäure/Aaeisensäure/v/asser (7:1:2) gelöst und die Lösung wird über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Das Lösungsmittel wird eingedampft. Der Rückstand v/ird in 15 ml Methanol gelöst und konz. Ammoniaklösung wird zugegeben, um den pH auf ungefähr 6,5 einzustellen. Die Lösung v/ird tropfenweise zu kaltem V/asser zugegeben und der Niederschlag wird gesammelt und in einem Exsiccator über P2O5 getrocknet. Der Feststoff wird mehrmals mit A" ther /Pe tr ο lather (1:1) verrieben und nochmals getrocknet, wobei man die Ti'telverbindung erhält.

Aminosäureanalyse: Lys, 1,0; Thr, 1,94; Ser, 0,58; Cys, 0,11; phe, 0,96.

Beispiel 50

t-Butyloxycarbonylalanylclycyl-S-tritylcysteinyl-N^-t-butyloxycarbonyllysylasparaginyl-phenylalanyl-phenylalanyl-tryptophyl- N -t-butyloxycarbOnyl-D-lysyl-(0-t-butyl)-threonyl-phenylalanyl-(0-t-butyl)-threonyl-(0-t-butyl)-seryl-S-tritylcystein (Boc-Ala-Gly-Cys-Lys-Asn-Phe-Phe-Trp-D-Lys-Thr-Phe-Thr-Ser-Cvs-OH)

I » I I f- I 4- I 4- "Ί

Trt Boc Boc Bu Bu Bu Trt

Unter Befolgung der Arbeitsweise gemäß Beispiel 23, jecloch unter Ersatz des dort beschriebenen ersten Heptapeptids durch 3oc-Ala-Gly-Cys-Lys-Asn-Phe-Phe-NHNH2 (beschrieben in Beispiel Trt Boc

- 109 '^: 509824/1010

14) und Ersatz dec dort beschriebenen zwaiten Heptapeptids durch K-Trp-D-Lys-'Thr-Phe-Thr-Sor-Cyc-OH (beschrieben in

I I +- f 4- f 4- I

Boc Bu Bu Bu Trt

Beispiel 43) erhält nan die Titelverbindung, nämlich de.s lino-are Tetradecapeptid. Dieses lineare Totradecapop~;id v/ird leicht aus der Reaktionsmischung isoliert, inic-r. man das Lösungsmittel eindampft, den Rücketand nacheinander mit Methanol, eiskalten In Zitronensäure, V.-'acser und Methanol verreibt und trocknet. Dieses Produkt ist für die nächste Stufe geeignet. Die Aminosäureanalyse für dieses Produkt ist v/ie folgt: Lys, 2,01; Asp, 1,C0; Thr, 1,79; Ser, 0,52; GIy, 1,00; AIa, 1,01; Cys, 0,12; ?he, 2,33.

Beispiel 51

Zyklisches Disulfid von t-ButyloxycarbonylaJ.ariyl.-lycyL-cysteinyl-N^-t-butylorc/carbonyllysylasparaginyl-phenylalanyl-phenylalanyl-tryp tophyl-i P-t-butyIoxyc arοony1-D-lysyl-(ö-t-butyl)-tiireonyl-phenylalanyl-CO-t-butyl )-t:ireonyl-(O-t-butyl)-serylcystein

(Boc-Ala-Gly-Cys-Lys-Asn-Phe-Phe-Trp-D-Lys-Thr-Phe-Thr-Ser-Cys-CH) ι ι " ι ι r t -t- »-

Boc Boc Bu Bu" Bu"

Unter Befolgung der Arbeitsweise gemäß Beispiel 43 v/ird das lineare.Tetradecapeptid gemäß Beispiel 50, Boc-Ala-Gly-Cys-Lys-Asn-Phe-Phe-Trp-D-Lys-Thr-Phe-Thr-Ser-Cys-OH

I ! I I -f- ! +· t ·*· I

?rt Boc Boc 3u Bu 3u° Trt

in DM?/Methanol mit Jod behandelt, v;obei man die Titelverbindung, nämlich das zyklische Disulfid-tetradecapeptid erhäl".

- 110 -

5 0 9 8 2 4/1010 bad

2A58135

U j M/15 563

Beic-^iel 52

"D-T-y.-^ „-Γ20 ate: tat in, zyklisches Disulfid von AlanylglycylcysteinyllyGyl-ar.paraginyl-phanylalanyl-phenylalanyl-tryptophyl-D-Iy r;ylthreor.yl-phenylalanyl-threonylseryl cystein (H-Alc-Gly-Cyc-Lyc-Aon-Phe-Phc—Trp-D-Lys-Thr-Phe-Thr-Ser-Cys-OH)

Sofolgt man dio Arbeitcv/eice gemäß Beicpiel 25, ersetzt jedoch die Titelverbindung, nümlich das zyklische Disulfid gemäß Beispiel ?Λ. d-^roh eine äquivalente Menge der Titelverbindung, nämlich dac zyklische Disulfid gemäß Beispiel 51, Boc-Ala-Gly-Cys-Lyc-Asn-Phe-Phe-Trp-D-Lys-Thr-Prjie-Thr-Ser-Cys-OH

I ¹¹X ^ft ' t

3oc Boc Bu . Bu Bu

err.elt nan die Titelverbindung des vorliegenden Beispiels.

Aninosäureanalyse: Lys, 1,94; Asp, 0,97; Thr, 1,84; 1/2 Cys, 1,36; Cer, 0,86; GIy, 1,00; AIa, 0,97; Phe, 2,97.

- 111 -

609824/1010

BAD

Claims (70)

PATENTANSPRÜCHE:

1. Verbindung der Formel I oder Ia

ο ■ ft

CH^CHC-Gly-Cys-Lys-Asn-Phe-Phe-Trp-Lys-Thr-Phe-Thr-Ser-M-ICHCHpS

\i ι h

Il

CH^CHC-Cay-Cys-Lys-Asn-Phe-Phe-Trp-Lys-Thr-Ihe-.Thr-Ser-- NHCHCH₂SH R R^

1 2

worin R Wasserstoff darstellt und R Wasserstoff oder Car-

1 2

boxyl bedeutet, oder worin R für Amino steht und R Wasserstoff darstellt.

2. Verbindung gemäß Anspruch 1, worin R Wasserstoff darstellt

2 und R Carboxyl bedeutet.

1 2

3. Verbindung gemäß Anspruch 1, worin R Amino bedeutet und R

Wasserstoff darstellt.

1 2

4. Verbindung gemäß Anspruch 1, worin R und R jeweils Wasserstoff bedeuten.

5. Verbindung der Formel

CltCHC-Gly-Cys-Lys-Asn-Phe-Phe-Trp-Lys-Thr-Phe-Thr-Ser-

R-⁵ α Boc Boc γ *γ γ

NHCHCH₂S-ß

R² - 112 -

50982Α/1010

H/15 563

2 3

worin R für Wasserstoff oder Carboxyl steht, R^ Wasserstoff

oder Boc-NH- bedeutet und α und ß jeweils Acm oder Trt be-

1 2
deuten und γ, γ und γ alle für Wasserstoff oder alle für

Bu stehen.

2 3

6. Verbindung gemäß Anspruch 5, worin R für COOH steht, R Wasserstoff darstellt, α und ß beide Trt bedeuten und γ, γ und

2 t

γ jeweils Bu darstellen.

7. Verbindung gemäß Anspruch 5, worin R Wasserstoff bedeutet,

3 1 R für Boc-NH- steht, α und ß jeweils Trt bedeuten und γ, γ .

2 t und γ jeweils Bu darstellen.

2 3

8. Verbindung gemäß Anspruch 5, worin R und R"^ jeweils Wasser-

•\ stoff darstellen, α und ß jeweils für Trt stehen und γ, γ

2 t und γ jeweils Bu bedeuten. ·

2 3

9. Verbindung gemäß Anspruch 5, worin R für COOH steht, R die

Bedeutung Boc-NH- besitzt, α und ß jeweils Acm oder Trt dar-

12 t

stellen und γ, γ und γ jeweils Wasserstoff oder jeweils Bu

bedeuten.

10. Verbindung der Formel

1 2 Jl

0 Boc Boc γ γ Ύ R

CH^CHC-dy- Cys - Lys-Asn-Phe-Phe-Trp-Lys-Thr-Phe-Thr-Ser-NHCHCHr

2 3

worin R Wasserstoff oder Carboxyl darstellt, R^ Wasserstoff

12

oder Boc-NH- bedeutet und γ, γ und γ entweder alle Wasserstoff oder alle Bu darstellen.

11.Verbindung gemäß Anspruch 10, worin R für COOH steht, R^

12 t

Wasserstoff bedeutet und γ, γ und γ alle für Bu stehen.

- 113 -

509824/1010

M/15 563

12. Verbindung gemäß Anspruch 10, v/orin R Wasserstoff dar

3 12 +

stellt, R für Boc-NH steht und γ, γ und γ jeweils Bu

. bedeuten.

2 "5

13. Verbindung gemäß Anspruch 10, worin R und R jeweils Was

12 t

serstoff bedeuten und γ, γ und γ jeweils für Bu stehen.

14. Verbindung gemäß Anspruch' 10, v/orin R Carboxyl bedeutet,

3 12

R für Boc-NH- steht und γ, γ und γ entweder alle für

Wasserstoff oder alle für Bu stehen.

15. Verbindung der Formel

Boc-Ala-Gly-Cys-Lys-Asn-Phe-Phe-NHNH-

ti <-

α Boc worin α für Acm oder Trt steht.

16. Verbindung der Formel

H-Trp-Lys-Thr-Phe-Thr-Ser-Cys-OH

! 1 I χ, Ip I

Boc γ γ' γ^ β

1 2 v/orin ß für Acm oder Trt steht und γ, γ und γ alle für

Wasserstoff oder alle für Bu stehen.

17. Verbindung der Formel

CH-.CHp-C-Gly-Cys-Lys-Asn-Phe-Phe-NHNHo

J C _f j C

Trt Boc

18. Verbindung der Formel

H-Trp-Lys-Thr-Phe-Thr-Ser-NHCHoCHp-S-Trt

t ι +· ' t ' t cc Boc Bu Bu Bu

509824/1010

'M/15 563

19. Pharmazeutisch verträgliches Säureadditionssalz der Verbindung der Formel I oder Ia gemäß Anspruch Ί.

20. Säureadditionssalζ gemäß Anspruch 19, worin die Säure Essigsäure ist.

21. Die Säureadditionssalze von'Somatostatin.

22. Das Essigsäureadditionssalz von Somatostatin.

23. Das Hydrochloridsäureadditionssalz von Somatostatin.

24. t-Butyloxycarbonylalanylglycin.

25. t-Butyloxycarbonylalanylglycin-2,4,5-trichlorphenylester.

26. N-(ß-Phenyl-5-chlor-2-hydroxybenzyliden)-S-acetamidomethylcystein-dicyclohexylaminsalz.

27. H-Ala-Gly-Cys-D-Lys-Asn-Phe-Phe-Trp-Lys-Thr-Phe-Thr-Ser-Cys-OH.

28. H-Ala-Gly-Cys-Lys-Asn-Phe-Phe-Trp-D-Lys-Thr-Phe-Thr-Ser-Cys-OH.

I I

29. Bee-Ala-GIy- Cys-D-Lys-Asn-Phe-Phe-Trp-Lys-Thr-Phe-Thr-Ser-Cys-"^Uii· Trt Boc. Boc Bu Bu Bu Trt

30. Boc-Ala-Gly-Cys-Lys-Asn-Phe-Phe-Trp-D-Lys-Thr-Phe-Thr-Ser-Cys-OH. Trt Boc · Boc Bu* - Bu* Bu* Trt

31. Boc-Ala-Gly-

Boc Boc BijT Bu¹³By

Cys-D-Lys-Asn-Phe-Phe-Trp-Lys-Thr-Phe-Thr-Ser-Cys-OH

- 115 509824/1010

M/15 563

32. Boc-Ala-Gly-

Boc ^Boc

f · J I I t

Cys-Lys-Asn-Phe-Phe-Trp-D-Lys-Thr-Phe-Thr-Ser-Cys-OH.

I . I "

33. Boc-Ala-Gly-Cys-D-Lys-Asn-Phe-Phe-NHNH?.

C.

I f

Trt Boc

34. H-Trp-D-Lys-Thr-Phe-Thr-Ser-Cys-OH.

I I +· I 4- I 4- J

Boc Bu Bu Bu Trt

35. Verfahren zur Herstellung eines Tetradecapeptids der Formel I

CHaCHC-GIy-M

-Cys-Lys-Asn-Phe-Phe-Trp-Lys-Tlir-Phe-Thr-Ser-NHCHCHoS I j

1 ₂ (I)

worin R Wasserstoff oder Amino bedeutet und R für Wasserstoff oder Carboxyl steht, dadurch gekennzeichnet, daß man

gemäß der Azidkupplungsmethode ein erstes Heptapeptidderivat der Formel

C
R^J a Boc

CH₃CHC-Gly-Cys-Lys-Asn-Phe-Phe-NHNH₂ ¹^ ' '

■worin R für Wasserstoff oder Boc-NH- steht und α die Bedeutungen Acm oder Trt besitzt, mit einem zweiten Heptapeptidderivat der Formel

H-Trp-Lys-Thr-Phe-Thr-Ser-NHCHCHoS-ß Boc γ YYr²

2 12

worin R die obigen Bedeutungen besitzt und γ, γ und γ entweder alle für Wasserstoff oder alle für Bu .stehen und ß für Acm oder Trt steht, umsetzt, wobei man das entspre-

- 116 5098 24/1010

Jjf. M/15 563

chende lineare Tetradecapeptidderivat der Formel 0

Il

CH^CHC-Gly-Cys-Lys-Asn-Phe-Phe-Trp-Lys-Thr-Phe-Thr-Ser- ftp α Boc ' Boc 'γ YY

NHCHCH₂S-Pd

2 3 12

worin R , R , α, ß, γ, γ und γ die obigen Bedeutungen besitzen, erhält, gefolgt von Oxydieren des linearen Tetradecapeptidderivats mit Jod oder Thiocyan, wobei man das entsprechende zyklische Disulfidderivat der Formel

R3O

CH_xCHC-GIy-

^ 12 2

Boc Boc Y . YYR

Cys-Lys-Asn-Phe-Phe-Trp-Lys-Thr-Phe-Thr-Ser-NHCHCHg

erhält und anschließend alle verbleibenden Schutzgruppen unter mäßig-sauren Bedingungen entfernt, wobei man das entsprechende Tetradecapeptid der Formel Ia erhält; oder gefolgt von einer Behandlung des linearen Tetradecapeptidderivats mit Quecksilber-II-acetat, Quecksilber-II-chlorid, Silberacetat oder Silbernitrat zur selektiven Entfernung der Sulfhydrylschutzgruppen, wobei man das Quecksilber-II- oder Disilbersalz des entsprechenden Disulfhydrylderivats erhält, Überführen des zuletzt genannten Salzes in sein entsprechendes freies Disulfhydrylderivat durch Behandeln mit Schwefelwasserstoff, Oxydieren des zuletzt genannten Derivats durch Behandeln mit Sauerstoff, 1,2-Dijodäthan, Natrium- oder Kaliumhexacyanoferrat-III oder Jod, wobei man das entsprechende zyklische Disulfidderivat erhält und Entfernen der verbleibenden Schutzgruppeh unter mäßigsauren Bedingungen, wobei man das gewünschte Tetradecapeptidderivat der Formel !erhält.

- 117 - ■

509824/1010

36. Verfahren gemäß Anspruch 35, dadurch gekennzeichnet, daß

1 2 "³S

R Amino darstellt, R Carboxy bedeutet, R für Boc-NH-

1 2 steht, α und ß für Acm oder Trt stehen und γ, γ und γ

alle für Wasserstoff oder alle für Bu stehen.

37. Verfahren gemäß Anspruch 35, dadurch gekennzeichnet, daß

1 2

R Wasserstoff bedeutet und R Wasserstoff oder Carboxyl

1 2

darstellt oder R für Amino steht und R Wasserstoff bedeutet, R für Wasserstoff oder Boc-NH- steht, unter der

2 ^

Voraussetzung, daß wenn R Wasserstoff darstellt, R die

Bedeutungen Wasserstoff oder Boc-NH- besitzt und wenn R für Carboxyl steht, Rr Wasserstoff darstellt, wobei α und

1- 2

ß jeweils für Trt stehen und γ, γ und ν alle die Bedeutung Bu besitzen.

38. Verfahren gemäß Anspruch 36, dadurch gekennzeichnet, daß man das erste Heptapeptid durch Reaktion eines aktivierten Esters von Boc-Ala-Gly-OH mit H-Cys-Lys-Asn-Phe-Phe-OMe,

I 1,

α Boc

worin a die obigen Bedeutungen besitzt, herstellt, wobei man Boc-Ala-Gly-Cys-Lys-Asn-Phe-Phe-OMe erhält, worin α die

I !

α Boc

obigen Bedeutungen besitzt, die zuletzt genannte Verbindung mit Hydrazinhydrat umsetzt und das erste Heptapeptid isoliert.

39. Verfahren gemäß Anspruch 38,dadurch gekennzeichnet, daß man das Pentapeptid H-Cys-Lys-Asn-Phe-Phe-OMe herstellt, indem

I t

α Boc
man H-Lys-Asn-Phe-Phe-OMe mit einem aktivierten Ester von

_r Boc

V^CY^S~^OH> worin α für Acm oder Trt steht und I Wasserstoff bedeutet und cf für Trt steht oder cTund cf zusammen für

Chb= stehen, umsetzt, wobei man ^.Cys-Lys-Asn-Phe-Phe-OMe

- 118 -

509824/1010

Μ/ι 5

erhält, worin«, ü" und d die obigen Bedeutungen "besitzen und anschließend die terminale Aminoschutzgruppe (Trt oder Chb=) der zuletzt genannten Verbindung unter mild-sauren Bedingungen entfernt, wobei man das gewünschte Pentapeptid erhält.

40. Verfahren gemäß Anspruch 39, dadurch gekennzeichnet, daß man das Tetrapeptid H-Lys-Asn-Phe-Phe-OMe herstellt, indem ■

Boc

man H-Asn-Phe-Phe-OMe mit einem aktivierten Ester von Z-Lys-OH umsetzt, wobei man Z-Lys-Asn-Phe-Phe-OMe erhält

I I

Boc Boc "

und die zuletzt genannte Verbindung mit Wasserstoff und einem Edelmetallkatalysator hydriert.

41. Verfahren gemäß Anspruch 40, dadurch gekennzeichnet, daß man das Tripeptid H-Asn-Phe-Phe-OMe durch Reaktion von H-Phe-Phe-OMe mit einem aktivierten Ester von Boc-Asn-OH umsetzt, wobei man Boc-Asn-Phe-Phe-OMe erhält und die terminale Aminoschutzgruppe (Boc) unter mäßig-sauren Bedingungen entfernt, wobei man das gewünschte Tripeptid erhält.

42. Verfahren gemäß Anspruch 41, dadurch gekennzeichnet, daß man-das Dipeptid H-Phe-Phe-OMe herstellt, indem man H-Phe-OMe mit einem aktivierten Ester von Boc-Phe-OH umsetzt, wobei man Boc-Phe-Phe-OMe erhält und die terminale Schutzgruppe (Boc) unter mäßig-sauren Bedingungen entfernt, wobei man das gewünschte Dipeptid erhält..

43. Verfahren gemäß Anspruch 30, dadurch gekennzeichnet, daß man den aktivierten Ester von Boc-Ala-Gly-OH herstellt, indem man H-GIy-OMe mit dem aktivierten Ester von Boc-Ala-OH umsetzt, wobei man Boc-Ala-GIy-OMe erhält, die zuletzt genannte Verbindung hydrolysierenden Bedingungen, unterwirft,

- 119 50 982 4/ 1010

\ /ί.0 Μ/15 563

wobei man Boc-Ala-Gly-OH erhält und die zuletzt genannte Verbindung zu einem entsprechenden gewünschten aktivierten Ester umsetzt.

44. Verfahren gemäß Anspruch 36, dadurch gekennzeichnet, daß

man das zweite Het>tapeptid durch Reaktion von

1 2 Ddz-Trp-Lys-Thr-Phe-Thr-Ser-NHNHo, worin γ, γ und γ die

t ι Ί '2 Boc γ ■γ γ

obigen Bedeutungen besitzen, mit H-Cys-OH, worin, ß für

Acm oder Trt steht, nach der Azidkupplungsmethode herstellt, wobei man das entsprechende Heptapeptid Ddz-Trp-Lys-Thr-Phe-Thr-Ser-Cys-OH erhält und die termi-

Boc γ γ ν ß

nale Aminoschutzgruppe (Ddz) der zuletzt genannten Verbindung unter mild-sauren Bedingungen entfernt, wobei man das zweiteHeptapeptid erhält.

45. Verfahren gemäß Anspruch 44, dadurch gekennzeichnet, daß

man das Hexapeptid Ddz-Trp-Lys-Thr-Phe-Thr-Ser-NHNH- her-

t ι ' 1 ' 2 Boc γ γ γ

stellt, indem man H-Lys-Thr-Phe-Thr-Ser-OMe, worin γ,

^{1 f} Ί '2

Boc γ - YY

1 2

γ und γ die obigen Bedeutungen besitzen, mit einem aktivierten Ester von Ddz-Trp-OH umsetzt, wobei man Ddz-Trp-Lys-Thr-Phe-Thr-Ser-OMe, worin ν, γ¹ und γ² die

II Mio' ' ' '

Boc γ γ y

obigen Bedeutungen besitzen, erhält, gefolgt von Umsetzen der zuletzt genannten Verbindung mit Hydrazinhydrat und Isolieren des Hexapeptids.

46. Verfahren gemäß Anspruch 45, dadurch gekennzeichnet, daß

man das Pentapeptid H-Lys-Thr-Phe-Thr-Ser-OMe herstellt,

ι ι 11 12 Boc γ YY

- 120 509824/ 1010

1 2 indem man H-Thr-Phe-Thr-3er-0Me, worin γ, γ und γ die

ι Ί '2

γ γ γ

obigen Bedeutungen besitzen, mit einem aktivierten Ester von Z-Lys-OH umsetzt, wobei man Z-Lys-Thr-Phe-Thr-Ser-OMe

ι it ' 1 ' 2

Boc Boc γ YY

1' 2
erhält, worin γ, γ und γ die obigen Bedeutungen besit-

^v-zen, und die terminale Schutzgruppe (Z) der zuletzt genannten Verbindung durch Hydrieren.in Gegenwart eines Edelmetallkatalysators entfernt.

47. Verfahren gemäß Anspruch 46, dadurch gekennzeichnet, daß man das Tetrapeptid H-Thr-Phe-Thr-Ser-OMe herstellt, in-

I I₁ I₂

Y YY-dem man das Tripeptid der Formel H-Phe-Thr-Ser-OMe, worin

; ί »2

Y Y

12 ' t

γ und γ beide für Wasserstoff stehen oder beide Bu darstellen, mit einem aktivierten Ester von Z-Thr-OH, worin

γ für Wasserstoff steht, wenn γ und γ" des zuvor genannten Tripeptids beide für Wasserstoff stehen, oder γ für

t 1 2

Bu steht, wenn γ und γ des zuvor genannten Tripeptids

beide für Bu stehen, umsetzt, wobei man

1 ρ Z-Thr-Phe-Thr-Ser-OMe erhält, worin γ, γ und γ die

ι ι-] i£

Y YY

obigen Bedeutungen besitzen und die terminale Aminoschutzgruppe (Z) von der zuletzt genannten Verbindung durch Hydrieren in Gegenwart eines Edelmetallkätalysators entfernt.

48. Verfahren gemäß Anspruch 47, dadurch gekannzeichnet, daß man das Tripeptid H-Phe-Thr-Ser-OMe herstellt, indem man

I₁ I₂ ■

γ γ

1 S?

H-Thr-Ser-OMe, worin γ und γ^ώ beide für Wasserstoff oder

I₁ I₂ .

YY
beide für Bu stehen, mit einem aktivierten Ester von

- 121 - :

509824/1010

^M/15563

Z-Phe-OH umsetzt, wobei man die entsprechende Verbindung

1 2 der Formel Z-Phe-Thr-Ser-OMe erhält, worin γ und γ die

• 1 »2

γ γ ■

vorstehenden Bedeutungen besitzen und die terminale Arninoschutzgruppe (Z) von der zuletzt genannten Verbindung durch Hydrieren in Gegenwart eines Edelmetallkatalysators entfernt.

49. Verfahren gemäß Anspruch 48, dadurch gekennzeichnet, daß

man das Dipeptid H-Thr-Ser-OMe herstellt, indem man das

Ί ^!2

Y Ύ

ρ Serinderivat der Formel H-Ser-OMe, worin γ Wasserstoff

•2

oder Bu bedeutet, mit einem aktivierten Ester von

1 2

Z-Thr-OH, worin γ Wasserstoff bedeutet, wenn γ des zu-

«1

vor genannten Serinderivats Wasserstoff darstellt, und

1t 2

γ für Bu steht, wenn, γ des zuvor genannten Serinderivats für Bu steht, umsetzt, wobei man die entsprechende Verbindung der Formel Z-Thr-Ser-OMe erhält und die termi-

•1 '2

Y Y

nale Aminoschutzgruppe (Z) der zuletzt genannten Verbindung durch Hydrieren in Gegenwart eines Edelmetallkatalysators entfernt.

50. Verfahren gemäß Anspruch 36, dadurch gekennzeichnet, daß man das dort definierte lineare Tetradecapeptid mäßigsauren Bedingungen unterwirft, wobei man die Verbindung der Formel H-Ala-Gly-Cys-Lys-Asn-Phe-Phe-Trp-Lys-Thr-Phe-Thr-Ser-Cys-OH erhält.

51. Verfahren gemäß Anspruch 36, dadurch gekennzeichnet, daß man das dort definierte entsprechende Disulfhydrylderivat mäßig-sauren Bedingungen unterwirft, wobei man die Verbindung der Formel H-Ala-Gly-Cys-Lys-Asn-Phe-Phe-Trp-Lys-Thr-Phe-Thr-Ser-Cys-OH erhält.

- 122 509824/VO10

M/15

52. Verfahren gemäß Anspruch 36, dadurch gekennzeichnet, daß man das lineare Tetradecapeptid einer Behandlung mit Jod

. in Gegenwart eines niedrigen Alkanols unterwirft, wobei man das entsprechende zyklische Disulfidderivat erhält.

53. Verfahren gemäß Anspruch 36, dadurch gekennzeichnet, daß man das lineare Tetradecapeptid einer Behandlung mit Jod bei einer Temperatur von ungefähr 0 bis 30⁰C während ungefähr 30 bis 180 Min. in einem niedrigen Alkanol unterwirft, wobei man das entsprechende zyklische Disulfidderivat erhält.

54. Verfahren gemäß Anspruch 37, dadurch gekennzeichnet, daß man das erste Heptapeptidderivat herstellt, indem man einen aktivierten Ester von Propionylglycin (CH-CH₉CO-GIy-OH) mit H-Cys-Lys-Asn-Phe-Phe-OMe umsetzt,

J- <- tr

Trt Boc
wobei man CH-^CHoCO-Gly-Cys-Lys-Asn-Phe-Phe-OMe erhält,

Trt Boc

gefolgt von einem Umsetzen der zuletzt genannten Verbindung mit Hydrazinhydrat und Isolieren des ersten Heptapeptidderivats, worin R für Wasserstoff steht.

55. Verfahren gemäß Anspruch 37, dadurch gekennzeichnet, daß man das zweite. Heptapeptidderivat der Formel H-Trp-Lys-Thr-

Boc Bu

Phe-Thr-Ser-NHCH₂CH₂S-Trt herstellt, indem man

Ddz-Trp-Lys-Thr-Phe-Thr-Ser-NHNHo gemäß der Azidkupplungs-

Boc Bu Bu But

methode mit 2-Tritylthioäthylamin umsetzt, wobei man das entsprechende Heptapeptidderivat Ddz-Trp-Lys-Thr-Phe-Thr-

¹ 'H- «

Boc Bu Bu

Ser-NHCHöCI-L-jS-Trt erhält und die terminale Aminoschutz- »t ■ ·

Bu .

- 123 -

50982A/1010

M/15 563

gruppe (Ddz) der zuletzt genannten Verbindung unter mildsauren Bedingungen entfernt, wobei man das zweite Heptapeptidderivat erhält.

56. Verfahren gemäß Anspruch 37, dadurch gekennzeichnet, daß man das lineare Tetradecapeptidderivat mäßig-sauren Bedingungen unterwirft, wobei man die Verbindung der Formel Ia

0
CH^CHC-Gly-Cys-Lys-Asn-Phe-Phe-Trp-Lys-Thr-Phe-Thr-Ser-

NHCHCH₉SH R²

1 2
worin R und R die obigen Bedeutungen besitzen, erhält.

57. Verfahren gemäß Anspruch 37, dadurch gekennzeichnet, daß man das dort definierte Disulfhydryiderivat mäßig-sauren Bedingungen unterwirft, wobei man die Verbindung der Formel Ia

CH^CHC-Gly-Cys-Lys-Asn-Phe-Phe-Trp-Lys-Thr-Phe-Thr-Ser-¹

NHCHCH₂SH R²

1 2
worin R und R die obigen Bedeutungen besitzen, erhält,

58. Verfahren gemäß Anspruch 37, dadurch gekennzeichnet, daß man das lineare Tetradecapeptidderivat einer Behandlung mit Jod in Gegenwart eines niedrigen Alkanols unterwirft, wobei man das entsprechende zyklische Disulfidderivat erhält.

- 124 -

509824/1010

Jisr ^M/15563

59. Verfahren gemäß Anspruch 37, dadurch gekennzeichnet, daß man das lineare Te±radecapeptidderivat einer Behandlung mit Jod bei einer Temperatur von ungefähr 0 bis 30 °C während ungefähr 30 bis 180 Min. in einem niedrigen Alkanol unterwirft, wobei man das entsprechende zyklische Disulfidderivat erhält.

60. Verfahren zur Herstellung eines Tetradecapeptidderivats der Formel I

H-AXa-GIy-

Cys-D-Lys-Asn-Phe-Phe-Trp-Lys-Thr-Phe-Thr-Ser-Cys-OH I . : . 1 . (i)

dadurch gekennzeichnet, daß man ein erstes Heptapeptid der Formel

Boc-Ala-Gly-Cys-D-Lys-Asn-Phe-Phe-NHNH- α Boc

worin α eine Sulfhydrylschutzgruppe, ausgewählt unter Acm oder Trt darstellt, mit einem zweiten Heptapeptid der Formel

H-Trp-Lys-Thr-Phe-Thr-Ser-Cys-OH

11 J-I >

Boc γ γ β

ν;orin ß eine Sulfhydrylschutzgruppe, ausgewählt unter Acm

1 2 oder Trt darstellt und γ, γ und γ entweder Wasserstoff oder die Hydroxyschutzgruppe Bu darstellen, unter der

1 Voraussetzung, daß wenn γ für Wasserstoff steht, γ und γ

t

Wasserstoff darstellen und wenn γ für Bu steht, γ und γ Bu darstellen, gemäß der Azidkupplungsmethode umsetzt, wobei man das entsprechende lineare Tetradecapeptid der Formel

Boc-Ala-Gly-Cys-D-Lys-Asn-Phe-Phe-Trp-Lys-Thr-Phe-Thr-Seri j ti Ί ' 2

α Boc Boc γ ΎΥ·

Cys-OH »

^ß ·

- 125 - "

509824/1010

Μ/15

1 2
erhält, worin nc, β, γ, γ und γ die obigen Bedeutungen besitzen, gefolgt von Behandeln des linearen Tetradecapeptids mit Jod oder Thiocyan, wobei man das entsprechende zyklische Disulfidderivat erhält und anschließendes Entfernen aller verbleibenden Schutzgruppen unter mäßigsauren Bedingungen, wobei man das gewünschte Tetradecapeptid der Formel I erhält, oder gefolgt von Behandeln des linearen Tetradecapeptidderivats mit entweder Quecksilber-II-acetat, Quecksilber-II-chlorid, Silberacetat oder Silbernitrat zur selektiven Entfernung der Sulfhydrylschutzgruppen, wobei man das Quecksilber-II- oder Disilbersalz des entsprechenden Disulfhydrylderivats erhalt, das zuletzt genannte Salz durch Behandeln mit Schwefelwasserstoff in sein entsprechendes fre'ies Disulfhydrylderivat überführt, das zuletzt genannte Derivat durch Behandeln mit Sauerstoff, 1,2-Dijodäthan, Natrium- oder Kaliumhexacyanoferrat-III oder Jod oxydiert, wobei man das entsprechende zyklische Disulfidderivat erhält und Entfernen der verbleibenden Schutzgruppen unter mäßigsauren Bedingungen, wobei man das gewünschte Tetradecapeptid der Formel I erhält.

61. Verfahren gemäß Anspruch 60, dadurch gekennzeichnet, daß man das dort definierte lineare Tetradecapeptid mäßigsauren Bedingungen unterwirft, wobei man die Verbindung der Formel H-Ala-Gly-Cys-D-Lys-Asn-Phe-Phe-Trp-Lys-Thr-Phe-Thr-Ser-Cys-OH erhält.

62. Verfahren gemäß Anspruch 60, dadurch gekennzeichnet, daß man das dort definierte entsprechende Disulfhydrylderi-

'"·. vat mäßig-sauren Bedingungen unterwirft, wobei man die Verbindung der Formel H-Ala-Gly-Cys-D-Lys-Asn-Phe-Phe-Trp-Lys-Thr-Phe-Thr-Ser-Cys-OH erhält. ■

126 -

509824/ 1010

M/15 563

63. Verfahren gemäß Anspruch 60, dadurch gekennzeichnet, daß man das lineare Tetradecapeptid einer Behandlung mit Jod in Gegenwart eines niedrigen Alkanols unterwirft, wobei man das entsprechende zyklische Disulfidderivat erhält.

64. Verfahren gemäß Anspruch 60, dadurch gekennzeichnet, daß man das lineare Tetradecapeptidderivat einer Behandlung mit Jod "bei einer Temperatur von ungefähr 0 bis 30⁰C während ungefähr 30 bis 180 Min. in einem niedrigen Alkanol unterwirft, wobei man das entsprechende zyklische Disulfidderivat erhält.

65. Verfahren zur Herstellung eines Tetradecapeptidderivats der Formel I

H-Ala-GIy-

Cys-Lys-Asn-Phe-Phe-Trp-D-Lys-Thr-Phe-Thr-Ser-Cys-OH

I . 1

dadurch gekennzeichnet, daß man ein erstes Heptapeptid der Formel

• Boc-Ala-Gly-Cys-Lys-Asn-Phe-Phe-NHNH«

α Boc

worin α für eine Sulfhydrylschutzgruppe, ausgewählt unter Acm oder Trt steht, mit einem zweiten Heptapeptid der Formel H-Trp-D-Lys-Thr-Phe-Thr-Ser-Cys-.OH

t ι ' 1 ' 2 '

Boc γ γ υ ß '

worin ß eine Sulfhydrylschutzgruppe, ausgewählt unter Acm

1 2 oder Trt darstellt, und γ, γ und γ entweder Wasserstoff

oder die Hydroxyschutzgruppe Bu darstellen, unter der Voraussetzung, daß wenn γ für Wasserstoff steht, γ und

2 t 1

γ ¥asserstoff bedeuten und wenn ν für Bu steht, γ und

2 t '

γ für Bu stehen, gemäß der Azidkupplungsmethode umsetzt, wobei man das entsprechende lineare Tetradecapeptid der Formel

- 127 - · '

509824/101 0

M/15 563

Boc-Ala-Gly-Cys-Lys-Asn-Phe-Phe-Trp-D-Lys-Thr-Phe-

t I Γ I

α Boc Boc γ

Thr-Ser-Cys-OH

\Λ IO I

γ γ ß

1 2
\ worin α, ß, γ, γ und γ die obigen Bedeutungen besitzen, erhält, gefolgt von Behandeln des linearen Tetradecapeptids mit Jod oder Thiocyan, wobei man das entsprechende zyklische Disulfidderivat erhält und anschliessendes Entfernen aller verbleibender Schutzgruppen unter mäßig-sauren Bedingungen, wobei man das gewünschte Tetrade capeptidderivat der Formel I erhält, oder gefolgt von Behandeln des linearen Tetradecapeptidderivats mit entweder Qeucksilber-II-acetat, Quecksilber-II-chlorid, Silberacetat oder Silbernitrat zur selektiven Entfernung der Sulfhydrylschutzgruppen, wobei man das Quecksilber-II- oder Disilbersalz des entsprechenden Disulfhydrylderivats erhält, das zuletzt genannte Salz durch Behandeln mit Schwefelwasserstoff in sein entsprechendes freies Disulfhydrylderivat überführt, Oxydieren des zuletzt genannten Derivats durch Behandeln mit Sauerstoff, 1,2-Dijodäthan, Natrium- oder Kaliumhexacyanoferrat-III oder Jod, wobei man das entsprechende zyklische Disulfidderivat erhält und Entfernen der verbleibenden Schutzgruppen unter mäßig-sauren Bedingungen, wobei man das gewünschte Tetradecapeptid der Formel I erhält.

66. Verfahren gemäß Anspruch 65, dadurch gekennzeichnet, daß man das dort definierte lineare Tetradecapeptid mäßigsauren Bedingungen unterwirft, wobei man die Verbindung der Formel H-Ala-Gly-Cys-Lys-Asn-Phe-Phe-Trp-D-Lys-Thr-Phe-Thr-Ser-Cys-OH erhält.

67. Verfahren gemäß Anspruch 65, dadurch gekennzeichnet, daß

- 128 -

509824/1010

#λλ Μ/15

man das dort definierte entsprechende Disulfhydrylderivat mäßig-sauren Bedingungen unterwirft, wobei man die Verbindung der Formel H-Ala-Gly-Cys-Lys-Asn-Phe-Phe-Trp-D-Lys-Thr-Phe-Thr-Ser-Cys-OH erhält.

68. Verfahren gemäß Anspruch 65, dadurch .gekennzeichnet, daß man das lineare Tetradecapeptid einer Behandlung mit Jod in Gegenwart eines niedrigen Alkanols unterwirft, wobei man das entsprechende zyklische Disulfidderivat .erhält.

69. Verfahren gemäß Anspruch 65, dadurch gekennzeichnet, daß man das lineare Tetradecapeptid einer Behandlung mit Jod bei einer Temperatur von ungefähr 0 bis 30⁰C während ungefähr 30 bis 180 Min. in einem niedrigen Alkanol unterwirft, wobei man das entsprechende zyklische Disulfidderivat erhält..

70. Arzneimittel, gekennzeichnet durch einen Gehalt an mindestens einer der Verbindungen gemäß Ansprüchen 1 bis 34 zusammen mit üblichen pharmazeutischen Trägern und/oder Hilfsmitteln.

- 129 509824/1010