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Verfahren zur Herstellung von Insulin und Insulinanalogen Gegenstand
der Anmeldung ist ein Verfahren zur Herstellung von Insulin und Insulin-analogen,
das dadurch gekennzeichnet ist, daß man N-Phthaloyl-insulin oder N-Phthaloyl-insulin-analoge
mit Hydrazin, welches ggf. durch eine Alkylgruppe mit 1-4 C-Atomen oder den Phenylrest
substituiert sein kann, in Gegenwart von Phenolen als Lösungsmittel, die ggf. bis
zu 30 % Wasser und Alkylgruppen mit insgesamt 1-4 C-Atomen als Substituenten enthalten
können, behandelt.
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Für die Herstellung von Insulinderivaten durch spezifisehe acylierung
an einer oder zwei der verhandenen drei Aminogruppen ist der vorübergehende Schutz
von zwei bzw. einer der drei Aminogruppen vorteilhaft bzw. meist sogar notwendig.
Durchdirekte Acylierung sind nämlich nur wenige einfache Derivate zugänglich, die
zudem nur im Gemisch mit ancleren Acylierungsprodukten anfallen und deshalb in aufwendiger
Weise gereinigt werden müssen.
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Man hat für den zeitweiligen Schutz die in der Peptidchemie of vorwendete
tert. -Butyloxycarbonyigruppe (Boo) eingesetzt, die z. B. durch Trifluoressigsäure
ohne Schädigung des Tnsulins wieder abgespalten werden kann. Sie läßt sich zudem
nach
der österr. Patentschrift 290.032 selektiv in zwei der drei
Aminogruppen des Insulins einführen, Woim man jedoch z. B.
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die B-Kette, welchc dio noch freie Aminogruppe trägt, durch.
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Edman-Abbau verkürzen will, wird bei jedom Abbauschritt, bei dem Trifluoressigsäure
benötigt wird, dio Boc-Gruppe gleichzeitig entfernt, so daß man für jeden neue Roaktionsstufe
nach Hoppe Seylerts Z. Physiol. Chemie 352 (1971), Seite 7, die Boc-Gruppon wieder
einführen muß.
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Eine andere Möglichkeit wurde in Nature 227 (1970), Seite 716, aufgezeigt.
NαB1-Phenylthiocarbamyl-insulin, hergestellt nach Hoppe Seylerts Z. Physiol.
Chem. 350 (1969), Seite 741, wird mit Trifluoressigsäure-phenylester trifluoracetyliert.
Die Trifluoracetyl-Gruppe (TFA) ist unter den Bedingungen des Edman-Abbaus stabil,
so daß der sukzossive Abbau der B-Kette durch Reaktion des TFA2-Insulins mit Phenylsenföl
und Behandlung des Reaktionsprodukts mit Trifluoressigsäure mehrmals wiederholt
werden kann. Erst dann spaltet man die TFA-Gruppen ab. Der Nachteil dieser Methode
liegt darin, daß NαB1-Pte-Insulin nur nach umständlicher Reinigung in mäßiger
Ausbeute zugänglich ist und sich deshalb als Ausgangsprodukt für präparative Zwecke
nicht eignet.Direktes Einführen der TFA-Reste in N Al und N B29 war bisher nicht
möglich.
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Zur herstellung der Ausgangsverbindung für den sukzessiven Abbau der
Insulin-B-Kette kann man Insulin mit N-Carbäthoxyphthalimid bei einem pH von etwa
8.4 bis 11 vorzugsweise bei pll 9-10, selektiv zu NαA1, N£1329-Bis-Phthaloylinsulin
(Pht2-Insulin) umsetzen. Diese Pht2-Verbindung dos Insulin war bisher nicht bekannt.
Sie erwies sich aber zunächst nur wegen einer gewissen Depotwirkung als wertvoll,
schien Jedoch für chemische Reaktionen am Insulin nicht brauchbar zu sein, da bokannt
war, daß Insulin unter den Bedingungen der Wiederabspaltung dos Phthaloylgruppe
mit Hydrazin s ohr rasch donaturiert wurde. Auf die Unbrauchbarkeit der Phthaloylgruppe
für solche Reaktächen wurde doshalb bereits in
Nature 227 (1970),
Seite 71G, hingewiesen.
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Überraschenderweise bleibt aber die Denaturierung des Insulin aus,
wenn man die Abspaltung der Phthaloylgruppe mittels IEydrazin in Phenol als Lösungsmittel
vornimmt.
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Die Denaturierung bleibt sogar auch wenn man bei mäßig 0 erhöhter
Temperatur, z. B. bei etwa 50°a und in wasserhaltigem Phenol arbeitet.
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Aufgrund dieser Tatsache ist die Phthloylgruppe auch in der liisulinchemio
als brauchbare Schutzgruppe geeignet.
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Die Differenzierbarkeit der Phthaloyl-Schutzgruppe gegrenüber allen
protonensolvolytisch und reduktiv abspaltbaren Schutzgruppen ist der besondere Vorteil
dieses neuen und überraschenden Verfahrens, welches dadurch in der Insulin-Chemie
besondere Bedeutung gewinnt.
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Die Abspaltung des Phthalylgruppe gelingt auch mit Alkyl-und Phenylhydrazin,
doch ist Hydrazin selbst in den bei sten Fällen vorzuziehen. Als Lösunhgsmittel
eignen sich außer Phenol auch Alkylphenole mit insgesamt 1-4 C-Atomen, z. B. Kresole
oder Äthyl-methyl-phenole. Die Phenole können bis zu etwa 30 % Wasser enthalten.
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Die Ausführung der Abspaltungsreaktion ist überaus einfach.
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Das phthaloylierte Insulin wird im erfindungsgemäßen Lösungsmittel
gelöst (Insulinkonzentration etwa 3-10 %). Man gibt ein erfindungsgemäßes Hydrazinderivat
oder Hydrazin in etwa derselben Gewichtsmenge wie Insulin zu und hält im Falle von
Ilydrazin als Abspaltungsreagens 10 - 20 Stunden bei 35-50 C, bevorzugt etwa 400
C.
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Dann fällt man das von Phthaloylgruppen befreite Insulin oder Insulinanaloge
mit einem organischen Lösungsmittel wie z. 13. Isopropanol, Äther, Essigester, Aceton
oder einem Gemisch dieser Lösungsmittel aus.
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Mit llilfe dieses Verfahrens sind neue, bisher nicht bcschriebene
Insuline mit interessauten physiologischen Eigenschaften zugänglich, die durch sukzessiven
Edman-Abbau an der B-Kette gewermen werden können. So erhält man aus NαA1,
N#B29-Bis-Phthaloyi-insulin durch viermaligen abbau und Abspaltung der Phthaloylgruppen
nach dem erfindungsgemäßen Verfahren das Des-(Phe-Val-Asn-Gln)B1-4-insulin, durch
fünfmaligen bzw. sechsmaligen Kdman-Abbau in entsprechender Weise das insulin und
das Des-(Phe-Val-Asn-Gln-His-Lou)B1-6-insulin Alle diese verkürzten Insuline besitzen
annähernd volle Insulinwirkung, sind jedoch wesentlich leichter löslich als Insulin
und damit auch in neutraler Lösung zur Schocktherapie verwendbar. Sie können ferner
in Mischung mit Kristall-Insulin als neutrale Depotzubereitung vorwendet werden.
Auch die Verlängerung der Insulin-Ketten um Aminoacyl-oder Peptidyl-Reste ist möglich.
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Die genannten Reaktionen sind nicht auf eine bestimmte Insulinart
beschränkt; sie können mit Insulin von Rind, Schwein, Blenscll, Fisch und mit Insulin
aus Vogel-Pankreas ausgeführt werden.
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Bei der Herstellung der oben genannten Insulin-Analogen nach dem erfindungsgemäßen
Verfahren nluss berücksichtigt werden, daß nach dem dritten Abbauschritt N-terminalos
Glutamin vorllegt, das zu Pyroglutaminsäure cyclisieren kann und damit der weiteren
reaktion entzogen ist. Dicsc Cyclisierung verläuft aber relativ langsam, so daß
es möglich ist, den Abbau über diese Stufe hinweg weiterzufübren. Die aus den folgenden
Reaktionen hervorgchenden Insuline müssen aber doch von der geringen Menge Pyroglutamylverbindung
befreit werden, wes z.B. durch mehrfache Kristallisation oder durch mchrfaches Umfällen
bei pH 5.2 oder durch Verteilungschromatographie geschehen kann. Auch die Synthese
des Insulins selbst kann mit Hllfe des erfindungsgemäßen Verfabrens verbessert werden.
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Die Verbesserung bezicht sich auf die Synthese der Ketten,
vor
allem der n-Kette nach der Festkörpersynthese von Merrifield, vgl, z. B. Biochemistry
3 (1964), Seito 1385. Verwendet man für den Schutz der #-Aminogruppe in Lysin B29
anstelle der üblichen Benzyloxycarbonylsohutzgruppe den säurestabilen Phthaloylrest,
so läßt sich die Ausbeute weseitlich steigern, vor allem, wenn man das Ankondensieren
der einzelnen Aminosäuren analog dem Verfahren der Patentanmeldung P 22 02 613.7
(HOE 72/F 016) mittels der Boc-Aminosäurenitrophenylester in Anwesenheit von z.
B.
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1-llydroxybenzotriazol vornimmt. Die Abspaltung der Phthaloylschutzgruppe
kann dann in der erfindungsgemäßen Weise, die Abspaltung der übrigen Schutzgruppen,
die Kombination ton A- und B-Ketten und die Reinigung des Rohinsulins können in
bekannter Weise vorgenommen werden.
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Die aus dem erfindungsgemäßen Verfahren resultierenden Insuline sind
Arzneimittel und werden zur Senkung des Blutzuckers bei Diabetes niellitus eingesetzt.
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Die nachfolgenden Beispiele dienen zur näheren Erläuterung des Verfahrens.
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B e i s p i e l 1 Des-(Phe-Val-Asn-Gln)B1-4-insulin ("Verbindung I")
a) 6.0 g krist. Rinderinsulin werden in 84 ml Wasser, 18 ml in Natriumhydrogencarbonat
und 325 ml Dimethylformamid gelöst. Man versetzt mit 2.04 g N-Carbäthoxy-phthalimid.
Nach 30 Min. fällt man das gebildete NαA1, $N#B29-Bis-phthaloyl-insulin (Pht2-Insulin)
-mit Isopropanol/Äther (1+5) aus, saugt den Niederschlag ab, wäscht mit Äther und
Wasser und trocknet ihm i. Vak.
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bei 300 über P205. Ausb. 5.95 g b) 5.95 g des nach a) erhaltenen
Pht2-Insulins werden in 100 ml 95-proz. Pyridin gelöst und nach Zusatz von 0.232
ml Phenylsenföl 3 1/2 Stdn. bei 24 gerührt. Man fällt dann mit Äther das Reaktionsprodukt
aus, filtriert den Niederschlag ab, wäscht ihn mit Äther und trockllet an der Luft.
Ausb. 5.9 g NαA1, N#B29 \-Bis-Pht-NαB1-Ptcinsulin (Pto = Phenylthiocarbamoyl).
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o) 5.8 g des nach b) erhaltenen produkts werden 2 Stdn.
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bei 24° in Trifluoressigsäure gerührt. Das Roaktionsprodukt wird
mit 200 ml Äther ausgefällt, abgesaugt und mit Äther gewaschen. Dann nimmt man die
Verbindung in 50 ml 95-prez. Pyridin auf, rührt 2 Stdn. bei Raumtemperatur, fällt
wieder mit Äther, saugt ab, wäscht das Produkt mit Äther und trocknet es über H2SO4
und KOH. Ausbeute 5.7 g Pht2-Des-PheB1-insulin.
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d) Man wiederholt mit 5.7 g der nach c) erhaltenen verbindung die
in b) und c) beschriebene Reaktionsfolge (Edman-Abbau) noch dreimal und erhält 4,9
g rohes NαA1, N#B29-Bis-Pht-des-(Phe-Val-Asn-Gln)D1-4-insulin.
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e) 4.0 g der nach d) erhaltenen Verbindung werden in 200 ml 80-proz.
Phenol gelöst und nach Zusatz von 4 ml Hydrazinhydrat 16 Stdn. auf 40° erwärmt.
Danach fällt man mit 2 Ltr. Isopropanol/Äther (1+5) 3.8 g rohes Des-(Phe-Val-Asn-Gln)B1-4-insulin
aus.
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Die Verbindung wird durch Verteilungschromatographie an Sophadex
RLH 20 (vernetztes Dextran-Gel, dessen OH-Gruppen veräthert sind) im System n-Butanol:Eisensig:Wasser
(8:4:40) in einer Säule 4 x 100 cm gereinigt. Man erhält als erste Fraktion 2. 1
g der reinen Verbindung, als Nebenprodukt in der zweiten Praktion 1.2 g einer Monoacylverbindung
(charakterisierbar durch Papierelektrophorese). Das Nebenprodukt ist Insulin mit
einer um Phe-Val-Asn verkürzten B-Kette, bei der das N-terminale Glutamin zur Pyroglutaminsäure
cyclisierte.
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Zur Charakterisierung des Des-(Phe-Val-Asn-Gln)B1-4-in sulins (I)
dient neben der Aminosäureanalyse die Papiereletrophorese, bei der die Verbindung
wie Insulin wandort.
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Aminosäure analyse : ber. für Insulin ber. für I gef.
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Asp 3 2 2.04 Glu 7 6 6.07 Val 5 4 3.98 Phe 3 2 2.01 llis 2 2 1.96
B e i s p i e l 2 Des-(Phe-Val-Asn-Gln-His-B1-5-insulin ("Verbindung II") 3.5 g
des nach Beispiel 1d) crhaltenen Pht2-Des-(Phe-Val-Asn-Gln)B1-4-insulins werden
nochmals nach Beispiel 1b und 1c) einem Edman-Abban unterwerfen. Man erhält 3.2
g rohes
Pht2-Des-(Phe-Val-Asn-Gln-His)B1-5-insulin. Man spaltet
wie in Beispiel le) die Phthaloylgruppen ab, reinigt durch Verteilungschromatographic
und erhält 1.5 g der Verbindungen II neben 1. 1 g der in Beispiel le bereits erwähnten
Pyroglutamylverbindung.
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Aminosäureanalyse: bor. für Insulin . ber. für II gef.
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Asp 3 2 2.02 Glu 7 6 6.01 Val 5 4 3.99 Phe 3 2 1.97 Ilis 2 1 o.96
B e i s p i @ l 3 Des-(Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu)B1-6-insulin("Verbindung III") 1.0
g eines nach Beispiel 2 als Zwischenprodukt erhaltonen Pht2-Des-(Phe-Val-Asn-Gln-His)B1-5
-insulins werden analog Beispiel 1b) und 1c) einem erneuten Abbau nach Edman unterworfen.
Man erhält 0.9 g Pht2-Des (Phe-Val-Asn-Gln-His-Lou)B1-6-insulin, das nach Beispiel
1c) von den Phtaloylgruppen befreit und durch Verteilungschromatographie gereinigt
wird. Ausb. 0.55 g der reinen Verbindung III.
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Aminosäureanalyse : ber. für Insulin ber. für III gef.
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Asp 3 2 2.03.
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Glu 7 6 5.99 Val 5 4 3.98 Phe 3 2 2.01 Lou 6 5 5.o8
R
e i sp i e l 4 Rinder-Insulin Die Rinder-Insulin-B-Kette wurde analog Hoppe Seyler's
Z. Physiol. Chemie 348 (1967), Seite 1355 und 352 (1971), Seite 419, nach Merrifield
(Biochemistry 3 (1964), Seite 1385), ausgehend von Polystyrolharz mit 1 % Vernetzung,
hergestellt. Lysin wurde als Boc-Lys(Pht)-ONp eingesetzt, alle weiteren Aminosäuren
ebenfalls als Boc-Nitrophenylester, weitere Carboxylgruppen in den Seitenketten
lagen analog der Vorschrift von Merrifield als Benzylester vor, die SH-Gruppe des
Cysteins wurde durch die S-tert. -Butylmercaptogruppe geschützt Peptides 1969, North-Holland
Publishing Comp., Amsterdam 1971, Seite 30).
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Jeder Kondensationsschritt wurde in Anwesenheit von 1-Hydroxybenzotriazol
analog dem Verfahren der Patentanmeldung P 22 02 613.7 (HOE 72/F 016) vorgenommen,
um Reaktionsgeschwindigkeit und Spezifität zu steigern.
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-Nach beendeter Synthese wird die B-Kette in belcarster Weise mit
HBr/Trifluoressigsäure vom Harz abgepalten.
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Man spaltet sodanndie N#-Phthalylgruppe analog Beispiel le durch Behandeln
mit Hydrazin in Phenol - ab (Ausb.
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52 %, bezogen auf die erste Aminosäure AlaB30) und führt die Spaltung
der asymmetrischen Disulfide und die Kombination mit natürlicher oder synthetischer
A-Kette analog Hoppe Seylerts Z. Physiol. Chem. 352 (1971), Seite 419, weiter. Man
erhält nach Reinigung des Insulins analog Z.
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Naturforsch. 24b (1969), Seite 1127, in 7-10 %-iger Ausb.
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kristallisiertes Rinderinsulin mit 23-25 Einh./mg.
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B e i s p i e l 5 NαA1-Arginyl-insulin 1,2 g Tria-adamantyloxycarbonyl-L-arginin-4-nitrophenyloster
hergestellt nach Chem. Ber. 103 (1970), Seite 1727, wird zur Lösung von 6.0 g NαB1-Pht-Insulin
in 100 ml Dimethylformamid gegeben"'.
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(Das Insulinderivat wurde analog Beleg. Pat. 770.758 durch Reaktion
von Boc2-Insulin mit N-Carbäthoxyphthalimid und Abspalten der Boc-Gruppen mittels
Trifluoressigsäure gewonnen. Gereinigt wurde die Verbindung durch Unfällen aus Pyridin/Äther
und Verrühren mit Wasser bei plI 5.) Nach 24 Stunden fällt man das R@aktionsprodukt
mit Äther aus und wäscht es mit Äther, Isopropanol und Wasser. Zur Abspaltung der
Adamantyloxycarbonylgruppen läßt man die Verbindung 1 Std. in 40 ml Trifluoressigsäure,
die 10 % Anisol enthält, stehen und fällt mit Äther. Der Niederschlag wird analog
Beispiel 1e) zur Abspaltung der Phthaloylgruppe mit Hydrazinhydrat in 80-proz. Phenol
behandelt und die Verbindung durch Verteilungschromatographie nach Beispiel 1e)
gereinigt. Man erhält 4,8 g N@Al-Arginyl-insulin. Aminosäureanalyse: Arg ber. 2,
gef. 1.92.
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Die Verbindung ist mit einer nach Hoppe Seyler's Z.
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Physiol. Chem. 352 (1971), Seite 719, hergestellten identisch.