CH637916A5 - Neue, in der 1-stellung eine alpha-hydroxysaeure enthaltende, angiotensin-ii-antagonistisch wirkende peptide und verfahren zur herstellung dieser verbindungen. - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft neue Peptide und die Herstellung dieser neuen, angiotensin-II-antagonistisch wirkenden Peptide der allgemeinen Formel I

X-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Y (I)

worin

X den Rest einer in der oi -Stellung eine Hydroxylgruppe enthaltenden aliphatische, Carbonsäure, besonders eine Hydroxyacetyl- oder o( -Hydroxypropionylgruppe, und Y eine Leucyl-, Isoleucyl-, Alanyl- oder Threonylgruppe bedeuten.

Angiotensin-II ist ein blutdrucksteigernd wirkendes Octa-peptid, welches im Organismus auf solche Weise entsteht, dass ein aus der Niere freigesetztes Enzym, das Renin, das durch die Leber produzierte ot-Globulin in das Decapeptid Angiotensin-I überführt und dieses dann im Organismus in Angiotensin-II überführt wird.

Im Jahr 1970 wurde das erste Angiotensin-II-Analogon beschrieben, eine Verbindung, welche sich sowohl in vivo, als auch in vitro als spezifischer kompetitiver Inhibitor von Angiotensin-II verhält [G.R. Marschall u. Mitarb., Proc. Nat. Acad. Sei. USA 67, 1624 (1970); P.A. Khairralah u. Mitarb. J. Med. Chem. 13, 181 (1970)]. Diese Beobachtung hat in breiten Kreisen grosses Interesse hervorgerufen; zahlreiche Forscher wurden dazu angeregt, neue antagonistisch wirkende Angio-tensin-II-Analoga zu synthetisieren und zu untersuchen, welche zu der Diagnostizierung und eventuell zur therapeutischen Behandlung von durch Renin beeinflussten Hypertensionen eingesetzt werden könnten. Es hat sich gleich am Anfang dieser Forschungsarbeit herausgestellt, dass es sich zu diesem Zweck diejenigen Angiotensin-II-Analoga am besten bewähren, in welchen die Phe-Gruppe in der 8-Stellung des Angiotensin-II--Moleküls durch irgend eine aliphatische Seitenkette enthaltende Aminosäure ersetzt ist. Eine solche Abänderung des Moleküls bedeutet nämlich ein praktisches Aufheben der agonisti-schen Wirkung bei gleichzeitigem Auftreten einer starken antagonistischen Wirkung des Produkts [vgl.: D. Gagnon u. Mitarb., Br. J. Pharmacol. 43, 409 (1971); D.T. Pals u. Mitarb. Circ. Res. 29, 664 (1971)]. Die antagonistische Wirkung kann noch erheblich gesteigert werden, wenn man neben der oben erwähnten Abänderung der 8-Stellung des Moleküls auch die in der 1-Stellung befindliche Asp-Gruppe durch Sar ersetzt [vgl.: D.T. Pals u. Mitarb., Circ. Res. 29, 673 (1971)]. Das auf diese Weise hergestellte (Sar1, Alas)-Angiotensin-II-Analogon wurde später unter dem Namen «Saralasin» auch in Verkehr gebracht. Seine vorteilhaften Eigenschaften wurden durch eine Herab-

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

3

637 916

Setzung des in vivo eintretenden enzymatischen Abbaus und durch grosse Affinität des Moleküls zu den Rezeptorzellen erklärt.

Durch die auf diesem Gebiet durchgeführten klinischen Untersuchungen [H.R. Brunner u. Mitarb., Lancet 1973, 1045; A.J.M. Donker u. Mitarb., Lancet 1974, 1535; T. Ogihara u. Mitarb., Lancet 1974, 219; J.H. Laragh u. Mitarb., New Engl. J. Med., 292, (1975); W.A. Pettinger u. Mitarb., New Engl. J. Med., 292, 1214 (1975); D.H.B. Streeten u. Mitarb., Circ. res. 36, Suppl. 1, 125 (1975); H.R. Brunner u. H. Gavras, Schweiz. Med. Wschr., 106, 1791 (1976)] wurden die schon am Anfang dieser Forschungsarbeit gemachten Annahmen, dass die antagonistisch wirkende Analoga von Angiotensin-II in der Diagnose und in der Therapie von durch Renin beeinflussten Hyper-tensionen anwendbar sein werden, in vollem Umfang bestätigt, [vgl.: D. Ganton und F. Gross, Med. Klin. 71, 2043 (1976); J.L. Marx, Science 194, 821 (1976); P. Needleman und G.R. Marschall, Fed. Proc. 35, 2486 (1976)].

Ein Vergleich der Strukturen und biologischen Wirkungen der bis dahin hergestellten Angiotensin-II-Analoga hat zahlreiche wichtige Informationen zur Deutung der agonistischen bzw. antagonistischen Wirkung geliefert [M.C. Khosla u. Mitarb., Handbook of Expérimental Pharmacology, Vol. 37,1.H. Page u. P.M. Bumpus ed., 1974; G.R. Marschall, Fed. Proc. 35, 2494 (1976)].

In der letzteren Zeit steht besonders die Herstellung von nebenwirkungsfreien, längere biologische Halbwertzeiten zeigenden Antagonisten in der Vordergrund der Forschung [vgl.: M.C. Khosla u. Mitarb., J. Med. Chem. 19, 244 (1976); ibid. 20, 253 (1977)].

Es wurde nun gefunden, dass man durch die Ersetzung des in der 8-Stellung befindlichen Phenylalanins durch den Rest einer aliphatischen «c-Aminocarbonsäure und durch das Einführen des Restes einer in der a -Stellung eine Hydroxygruppe enthaltenden Carbonsäure in die 1-Stellung der Peptidkette solche angiotensin-II-kompetitive Inhibitoren herstellen kann, welche die durch Angiotensin-II erzeugte Hypertension in vivo erheblich herabsetzen und diese Wirkung auch bei subcutaner Verabreichung ausüben können.

Die derartigen angiotensin-II-antagonistischen Peptide können durch die allgemeine Formel I

X-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Y (I)

worin X und Y die oben angegebene Bedeutungen haben, gekennzeichnet werden; sie werden im Sinn der Erfindung so hergestellt, dass man ein reaktionsfähiges Heptapeptidderivat der allgemeinen Formel II

H-Arg(A)-Val-Tyr(B)-Ile-His(E)-Pro-Y-OG (II)

worin

A eine zum temporären Schutz des Guanidinorestes von Arg geeignete Schutzgruppe, vorteilhaft eine Nitro- oder Tosyl-gruppe,

B eine zum temporären Schutz der aromatischen Hydroxylgruppe von Tyr geeignete Schutzgruppe, vorteilhaft eine Benzyl- oder substituierte Benzylgruppe,

E eine zum temporären Schutz der Imidazolgruppe von His geeignete Schutzgruppe, vorteilhaft eine Dinitrophenylgruppe, G eine zum Schutz der Carboxylgruppe der C-terminalen Aminosäure geeignete, gegenüber schwach sauren Einflüssen widerstandsfähige, aber durch katalytische Hydrogenolyse oder durch Behandeln mit stärkeren Säuren oder mit Alkalien abspaltbare Schutzgruppe bedeuten, und Y die oben angegebene Bedeutung hat,

mit einem reaktionsfähigen Aminooxycarbonsäurederivat der allgemeinen Formel III

W-X'-M (III)

worin

X' einen in der -Stellung eine Aminooxygruppe enthaltende aliphatischen Carbonsäurerest, besonders eine Aminooxy-acetyl- oder of -Aminooxypropionylgruppe,

W eine durch Acidolyse oder katalytische Hydrogenolyse abspaltbare Schutzgruppe, vorteilhaft eine Benzyloxycarbonyl-oder tert.-Butyloxycarbonylgruppe, und M eine Hydroxylgruppe oder eine aktivierende Gruppe, vorteilhaft eine Pivaloyloxy-, Nitrophenoxy-, 2,3,5-Trichlorphen-oxy-, Pentachlorphenoxy-, Pentafluorphenoxy-, N-Succini-midoxy- oder Azidogruppe, bedeuten,

umsetzt und von der erhaltenen Verbindung der allgemeinen Formel IV

W-X'-Arg(A)-Val-Tyr(B)-Ile-His(E)-Pro-Y-OG (IV)

zuerst die Schutzgruppe E und dann die übrigen, an den Seitenketten anwesenden bzw. terminalen Schutzgruppen zusammen mit der Aminogruppe von X' hydrogenolytisch entfernt.

Schutzgruppe E wird vorteilhaft durch Behandlung mit 2-Mercaptoäthanol entfernt; die übrigen Seitenketten- und terminalen Schutzgruppen werden durch katalytische Hydrogenolyse abgespalten, das Entfernen dieser weiteren Schutzgruppen kann also in einem Schritt erfolgen. Dabei wird aber von der N-terminalen °C-Aminooxysäure auch die Aminogruppe in der Form von Ammoniak abgespalten, so dass als Endprodukt ein in der N-terminalen Stellung die entsprechende °<-Hydroxy-carbonsäure enthaltendes Peptid erhalten wird. Diese Herstellungsweise von in der N-Terminalen Stellung einen oc -Hydroxy-carbonsäurerest enthaltenden Peptiden ist eine neue, bisher nicht beschriebene Methode, welche ein an sich neues Element des erfindungsgemässen Verfahrens bildet.

Die im erfindungsgemässen Verfahren als Ausgangsstoffe einsetzbaren reaktionsfähigen Heptapeptidderivate der allgemeinen Formel II können nach beliebigen in der Peptidchemie üblichen Methoden, z.B. nach der in der ungarischen Patentschrift Nr. 168 431 beschriebenen Methode hergestellt werden. In diesem Herstellungsverfahren werden zum Schutz der funktionellen Seitengruppen zweckmässig solche Schutzgruppen eingesetzt, welche unter den Bedingungen des zum Abspalten der nach der Koppelungsreaktion zu entfernenden Schutzgruppen durchgeführten Acidolyse stabil bleiben.

Nach einer vorteilhaften Ausführungsweise des erfindungsgemässen Verfahrens wird zum temporären Schutz der Carboxylgruppe der C-terminalen Aminosäure die p-Nitro-benzylgruppe (NB), zum Schutz der Guanidinogruppe von Arginin die Nitrogruppe verwendet, während die Hydroxylgruppe von Tyrosin durch die Benzylgruppe und der Imidazol-ring von Histidin durch die Dinitrophenylgruppe (Dnp) geschützt wird. Diese Schutzgruppen sind unter schwach sauren Bedingungen stabil, so dass die N-terminale Boc-Gruppe ohne Schädigung dieser Gruppen entfernt werden kann. Durch diese vorteilhafte Kombination der Schutzgruppen wird es ermöglicht, dass man den Verbindungen der allgemeinen Formel IV zuerst die Dinitrophenylgruppe abspaltet und dann durch katalytische Hydrogenolyse in einem einzigen Schritt unmittelbar die Endprodukte der allgemeinen Formel I erhält.

Die erfindungsgemäss hergestellten Verbindungen der allgemeinen Formel I können nach an sich bekannten Methoden, vorteilhaft durch Ionenaustauschchromatographie an Carboxy-methylcellulose gereinigt werden. Dabei werden die Produkte meistens in der Form von lyophilisierten Pulvern erhalten; solche Produkte können unmittelbar zur Bildung von verschiedenen Salzen oder Komplexen eingesetzt werden.

Die antagonistischen Wirkungen der neuen Verbindungen der allgemeinen Formel I wurden an narkotisierten männlichen

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

637 916

4

Katzen untersucht. Der Blutdruck der Tiere wurde an der Halsarterie gemessen. Die Untersuchungen wurden derart durchgeführt, dass in eine Schenkelvene Hypertensin in einer Dosierungsrate von 0,5 jig/kg/min infundiert wurde; nachdem sich die Blutdrucksteigerung stabilisiert hatte, wurde die zu untersuchende Substanz in physiologischer Kochsalzlösung in einer einmaligen Dose intravenös oder subcutan verabreicht und dann wurde die durch den verabreichten Wirkstoff verursachte Verminderung des Blutdrucks gemessen.

Die durch die intravenöse Verabreichung von verschiedenen neuen Verbindungen verursachte Verminderung des Blutdrucks der Tiere wird durch die in der Tabelle I zusammengefassten Daten veranschaulicht. Diese Daten sind Durchschnittswerte von 6 Messungen, mit der Angabe der Streuung der Mittelwerte. Zum Vergleich wurden auch die mit dem bekannten Sarala-sin, d.h. l-(N-MethyIglycin)-5-L-valin-8-L-alanin-angiotensin-II unter den gleichen Bedingungen erhaltenen Werte angegeben.

20

Aus den Daten der obige Tabelle ist es eindeutig ersichtlich, dass sämtliche in der 1-Stellung durch einen eine cc-Hydroxyl-gruppe enthaltenden aliphatischen Carbonsäurerest substituierte Angiotensin-II-Analoga sehr erhebliche blutdrucksenkende 25 Wirkungen haben. Die Höhe dieser Wirkung ist proportional mit der Grösse der verabreichten Dosen.

Die Untersuchungen wurden auch auf die in der Literatur nicht übliche subcutane Verabreichungsweise dieser Verbindungen ausgedehnt. In diesem Fall wurde der die zu untersuchen-30 den Substanz enthaltenden physiologischen Kochsalzlösung auch noch Carboxymethylcellulose oder Gelatine (in der nachstehenden Tabelle: CMC bzw. Glt) zugesetzt. Die in der nachstehenden Tabelle II zusammengefassten Versuchsergebnisse sind Durchschnittswerte von an je fünf Tieren durchgeführten 35 Messunge, wobei die Streuungen der Mittelwerte ebenfalls angegeben sind.

Tabelle 1

Wirkung der in der 1-Stellung^-Hydroxysäuren enthaltenden A ngiotensin-II-A na Ioga auf den Blutdruck unter Infusion von Angiotensin-II

Veränderung des Blutdrucks (mm Hg) nach i.v. Dosen von Wirkstoff -10^ig/kg 20 pg/kg

(Hydroxyacetyl1, Leus)-Ang-II —31+4,7 —42 + 2,8

(Hydroxyacetyl1, Ile8)-Ang-II —24 + 1,7 —30 + 2,3

[Hydroxyacetyl1, Thr(Me)8]-Ang-II —33±5,3 —38 + 4,1 (L-a-Hydroxypropionyl1, Leu8)-

-Ang-II —33 ±3,7 —40 ±2,7 (L-oc-Hydroxypropionyl1, Ile8)-

-Ang-II —31+3,3 —38 ±4,1

Saralasin —41+2,5

Tabelle II

Wirkung der in der 1-Stellung eine «r-Hydroxysäure enthaltenden Angiotensin-II-Analoga auf den Blutdruck bei s.c. Verabreichung,

unter Infusion von Angiotensin

Dose Zusatz Blutdrucksenkung mm Hg, nach

Wirkstoff Jig/kg zur 15 30 60 120

s.c. Lösung Minuten

(L-a-Hydroxypropionyl1,

Leu8)-Ang-II 200 CMC —28 + 3,1 —38 + 2,4 —25 + 1,5 —5+ 1,8 (L-cc-Hydroxypropionyl1,

Ile8)-Ang-II 200 Glt —28 + 10 —28 + 7,0 —25±6,0 —5+7,3

Die Daten dieser Tabelle zeigen, dass die neuen Verbindungen bei subcutaner Verabreichung den experimentell hervorge-55 rufenen hohen Blutdruck auch nach 60 Minuten noch erheblich herabsetzen.

Auf Grund dieser Eigenschaften können die erfindungsgemässen neuen Angiotensin-II-Analoga, sowie die physiologisch unbedenklichen Salze und Komplexe dieser neuen Verbindun-60 gen in der Therapie als blutdrucksenkende Mittel angewendet werden. Unter physiologisch unbedenkliche Komplexe dieser neuen Angiotensin-II-Analoga sind solche Produkte zu verstehen, welche durch die Zugabe von gewissen organischen oder anorganischen Stoffen entstehen und dem Wirkstoff eine retar-65 dierte Wirkung verleihen. Als solche komplexbildende organische Stoffe kommen beispielsweise Gçlatine, Carboxymethylcellulose, Alginsäureester, Polyphloretinphosphate, Amino-säure-polymere, sowie andere Polymere und Kopolymere in Be-

5

637 916

tracht. Als physiologisch unbedenkliche Salze der neuen Peptide können die üblichen, pharmazeutisch anwendbaren Säureadditionssalze, z.B. Acetate hergestellt werden.

Die neuen Peptide, sowie deren physiologisch unbedenkliche Salze und Komplexe, werden in der Therapie in der Form von üblichen Arzneimittelpräparaten eingesetzt. Diese Präparate enthalten die neuen Verbindungen in Begleitung von zur entera-len oder parenteralen Verabreichung geeigneten anorganischen oder organischen Trägerstoffen. Die Arzneimittelpräparate können in der Form von festen Lyophilisaten hergestellt werden; in diesem Fall kommen als Trägerstoffe verschiedene mit den Peptiden nicht reagierende Verbindungen, wie z.B. Kohlenhydrate in Betracht. Ferner kann man konzentrierte oder verdünnte Suspensionen oder Emulsionen als Arzneimittelpräparate herstellen, welche neben den üblichen flüssigen Trägerstoffen auch stabilisierende und konservierende Hilfsstoffe enthalten.

Solche Arzneimittelpräparate können in der Therapie zur Behandlung von allen solchen Syndromen verwendet werden, in deren Ätiologie ein erhöhter Renin-Blutspiegel eine Rolle spielt; sie können ferner als Diagnostika zu einer differenzierten Unterscheidung von Hypertensionen renaler Herkunft dienen.

Die Herstellung der erfindungsgemässen neuen Peptiden wird durch die nachstehenden Beispiele näher veranschaulicht. Die in den Beispielen verwendeten Abkürzungen entsprechen den in der Fachliteratur üblichen Abkürzungen, vgl.: J. Biol. Chem., 247, 977 (1972).

Die folgenden weiteren Abkürzungen wurden verwendet:

PFP: Pentafluorphenyl

OGly: Aminooxy-essigsäure

OAla: L- OC-Aminooxy-propionsäure

Unter Aminooxysäuren sind in der oc -Stellung eine Amino-oxygruppe H2N-O- enthaltende Carbonsäuren zu verstehen; demnach haben Aminooxy-essigsäure bzw. cC -Aminooxy-propionsäure die folgenden Strukturformeln:

H2N-O-CH2-COOH bzw. CH3-CH-COOH

I

O-NH2

wobei «Aminooxyacetyl» bzw. « oc -Aminooxypropionyl» die Acylgruppen der obigen Aminooxysäuren bedeuten.

Bei der Herstellung der verschiedenen Verbindungen wurde das Eindampfen von Lösungen immer mit dem Büchischen «Rotavapor» Apparat durchgeführt. Die Schmelzpunkte wurden mit dem Dr. Tottoiischen Apparat (Büchi) bestimmt. Die Dünnschichtchromatogramme wurden auf «Kieselgel G nach Stahl» (E. Merck, Darmstadt) Platten aufgenommen; zur Entwicklung der Chromatogramme wurden die folgenden Lösungsmittelsysteme verwendet:

1/Äthylacetat: (Pyridin-Essigsäure-Wasser 20:6:11 ) = 95: 5 2/Äthylacetat: (Pyridin-Essigsäure-Wasser 20:6:11) = 90:10 3/Äthylacetat: (Pyridin-Essigsäure-Wasser 20:6:11) = 80:30 4/Äthylacetat: (Pyridin-Essigsäure-Wasser 20:6:11 ) = 70:30 5/n-Butanol: Essigsäure : Wasser = 4:1:5 6/'n-Butanol: Essigsäure : Pyridin : Wasser 30:6:20:24 7/n-Butanol: Äthylacetat : Essigsäure : Wasser = 1:1:1:1

Bei den angegebenen Rf-Werten ist das zur Bestimmung verwendete Lösungsmittelsystem jeweils angegeben. z.B. Rf(,).

Die papierelektrophoretischen Untersuchungen wurden auf «MN 214» Papier/Machery-Nagel & Co., BRD/, in einer Pufferlösung von pH = 1,9 mit Glutaminsäure als Standard durchgeführt. Die Stromspannung war 450 V, die Zeitdauer der Messungen war 3 Stunden lang.

Die Dünnschichtchromatogramme wurden einerseits mit Ninhydrinlösung, andererseits nach der üblichen Chlorierung, mit o-Tolidin-Jodkaliumlösung entwickelt.

Die Endprodukte wurden nach der folgenden Methode ge-5 reinigt: 0,5 g freies Peptid wurde in 4 ml 0,01 N Ammonium-acetat-Pufferlösung gelöst, die Lösung wurde auf eine 0,5 1 Carboxymethylcellulose (CMC 52) enthaltende und vorher mit der obigen Pufferlösung in Gleichgewicht gebrachte Säule aufgetragen. 1,5 1 0,01 M und 1,5 I 0,4 M Ammoniumacetatlösun-10 gen wurden mit einem Gradientmischer vermischt und so wurde eine Gradient-Elution durchgeführt. Die Strömungsgeschwindigkeit war 25 ml/Stunde; Fraktionen von je 10 ml wurden aufgefangen. Das von der Säule kommende Eluat wurde mit Hilfe eines «LKB Uvicord-II» Apparats (Hersteller: LKB, Uppsala, 15 Schweden) laufend registriert. Die auf Grund der Registrierkurve identifizierte Hauptfraktion wurde lyophilisiert, das Lyophilisat ebenfalls durch Gradient-Elution rechromatographiert und wieder lyophilisiert.

Die Herstellung der neuen Angiotensin-II-Analoga wird 20 durch die nachstehenden Ausführungsbeispiele näher veranschaulicht; es ist aber zu bemerken, dass das beschriebene Verfahren sowohl bezüglich der an sich bekannten peptidchemi-schen Operationen, als auch bezüglich der Wahl der Schutzgruppen verschiedene, dem Fachmann an der Hand liegende 25 Variationen zulässt, so dass die Erfindung in keiner Weise auf diese konkrete Beispiele beschränkt ist.

Beispiel 1

J0 (Hydroxyacetyl1, Leus)-angiotensin-II

Schritt 1:

Boc-A rg(NC>2)- Val-Tyr(Bzl)-Ile-His(Dnp)-Pro-Leu-ONB

4,2 g (12 mMol) Leu-ONB.HBr wurden in 50 ml Chloro-35 form gelöst und es wurden, 1,68 ml Triäthylamin und 3,81 g (10 mMol) Boc-Pro-OPFP der Lösung zugesetzt. Das Gemisch wurde bei Raumtemperatur 20 Minuten gerührt, dann mit Wasser und mit 10%iger wässriger Citronensäurelösung ausgeschüttelt, getrocknet und eingedampft. Das als Rückstand erhaltene 40 geschützte Dipeptid (Rr(,)= 0,8) wurde unmittelbar, ohne Reinigung in 20 ml 8 M Lösung von Salzsäure in Dioxan gelöst, nach 10 Minuten wurde die Lösung mit trockenem Äther verdünnt und eingedampft. Das auf diese Weise erhaltene, an der N-terminalen Aminosäure freie Dipeptid-hydrochlorid (Rr(4) = « 0,56) wurde in 50 ml Chloroform gelöst, die Lösung mit Triäthylamin auf pH = 8 eingestellt und mit 8,8 g (15 mMol) Boc-His(Dnp)-OPFP versetzt. Die erh'altene Lösung wurde bei Raumtemperatur eine Stunde gerührt, wobei der pH-Wert der Lösung stets bei 8 gehalten wurde. Dann wurden 1,65 ml so N,N-Dimethylamino-äthylamin zum Entfernen des überschüssigen Aktivesters der Lösung zugesetzt und nach 10 Minuten wurde das Reaktionsgemisch mit 10%iger wässriger Citronensäurelösung, mit 1 n-Salzsäurelösung und mit 5%iger Natrium-hydrogencarbonatlösung in der angegebenen Reihenfolge ausge-55 schüttelt, getrocknet und eingedampft. Das als Rückstand erhaltene geschützte Tripeptid (Rr<n= 0,65) wurde unmittelbar, ohne Reinigung in 25 ml 8 molarer Lösung von Salzsäure in Dioxan gelöst, nach 15 Minuten Stehen wurde das erhaltene, an der N-terminalen Aminosäure freie Tripeptid (Rf(4,= 0,47) 60 durch die Zugabe von trockenem Äther gefällt, abfiltriert und sofort im Gemisch von 50 ml Chloroform und 20 ml Dimethyl-formamid gelöst. Die Lösung wurde mit Triäthylamin auf pH = 8 gestellt und mit 6,0 g (15 mMol) Boc-Jle-OPFP versetzt. Nach 30 Minuten Stehen wurde das Reaktionsgemisch zur 65 Trocknen eingedampft, der Rückstand in 100 ml Äthylacetat gelöst und die Lösung mit 10°7oiger wässriger Citronensäurelösung, mit 1 n-Salzsäurelösung und mit Wasser ausgeschüttelt. Die organische Lösung wurde dann getrocknet, das Äthylacetat

637 916

6

verdampft und der Rückstand mit einem 1:9 Gemisch von Äther und n-Hexan behandelt. Das auf diese Weise isolierte geschützte Tetrapeptid (Rf(l) = 0,64) wurde in 25 ml 8 molarer Lösung von Salzsäure in Dioxan gelöst, nach 15 Min. wurde das erhaltene, an der N-terminale Aminosäure freie Tripeptid s (Rf(4)= 0,47) durch die Zugabe von trockenem Äther gefällt, abfiltriert und sofort im Gemisch von 50 ml Chloroform und 20 ml Dimethylformamid gelöst. Die Lösung wurde durch die Zugabe von Triäthylamin auf pH = 8 gestellt und mit 6 g (15 mMol) Boc-Ile-OPFP versetzt. Nach 30 Minuten wurde das Re- io aktionsgemisch zur Trockne eingedampft, der Rückstand in 100 ml Äthylacetat gelöst und die Lösung mit lO'Voiger wässriger Citronensäurelösung, mit 1 n-Salzsäurelösung und mit Wasser ausgeschüttelt. Die organische Phase wurde dann getrocknet und eingedampft und der Rückstand mit einem 1:9 Gemisch is von Äther und n-Hexan behandelt. Das auf diese Weise erhaltene geschützte Tetrapeptid (Rf(I)= 0,64) wurde in 25 ml 8 molarer Lösung von Salzsäure in Dioxan gelöst und nach 15 Min. Stehen wurde das erhaltene, an der N-terminalen Aminosäure freie Tetrapeptid (Rf<4,= 0,40) durch die Zugabe von trockenem 20 Äther gefällt und abfiltriert. Das erhaltene Tetrapeptid--hydrochlorid wurde im Gemisch von 50 ml Chloroform und 30 ml Dimethylformamid gelöst, die Lösung durch die Zugabe von Triäthylamin auf pH = 8 gestellt und mit 6,0 g (11,5 mMol) Boc-Tyr(Bzl)-OPFP versetzt. Nach 15 Minuten Stehen wurde 25 die Lösung eingedampft, der Rückstand in Äthylacetat gelöst und mit 0,66 ml N,N-Dimethylamino-äthylamin versetzt. Nach 10 Minuten Stehen wurde die Lösung mit 10°7oiger wässriger Citronensäurelösung, mit 1 n-Salzsäurelösung und mit Wasser ausgeschüttelt, getrocknet und eingedampft, der Rückstand mit 30 trockenem Äther behandelt und das auf diese Weise erhaltene geschützte Pentapeptid (Rf<2)= 0,8) durch Filtrieren abgetrennt. Dieses Produkt wurde dann in 25 ml 8 molarer Lösung von Salzsäure in Dioxan gelöst und nach 15 Minuten wurde das erhaltene, an der N-terminalen Aminosäure freie Pentapeptid 35 (Rf(4) = 0,8) durch die Zugabe von trockenem Äther gefällt, abfiltriert, mit Äther gewaschen und sofort in 50 ml Dimethylformamid gelöst. Die Lösung wurde mit Triäthylamin auf pH = 8 gestellt und mit 4,2 g (11 mMol) Boc-Val-OPFP versetzt. Die Lösung wurde bei Raumtemperatur eine Stunde ge- 40 rührt, dann eingedampft, der Rückstand in Chloroform gelöst, die Lösung mit 10%iger wässriger Citronensäurelösung mit 1 n-Salzsäurelösung und mit Wasser ausgeschüttelt, getrocknet und eingedampft. Der Rückstand wurde mit Äther behandelt und das auf diese Weise erhaltene geschützte Hexapeptid (Rf(2) = 45 0,82) durch Filtrieren abgetrennt. Dieses Produkt wurde in 25 ml 8 molarer Lösung von Salzsäure in Dioxan gelöst, und nach 15 Minuten Stehen wurde das erhaltene, an der N-terminalen Aminosäure freie Hexapeptid (Rf(3) = 0,55) durch die Zugabe von trockenem Äther gefällt, abfiltriert, und mit Äther gewa- 50 sehen. Das Produkt wurde sofort in 50 ml Dimethylformamin gelöst, mit Triäthylamin auf pH = 8 gestellt und mit 4,8 g (10 mMol) Boc-Arg(NC>2)-OPFP versetzt. Nach 30 Minuten wurde das Lösungsmittel verdampft und durch Chloroform ersetzt und diese Lösung mit 1 n-Salzsäurelösung und mit Wasser aus- 55 geschüttelt. Die abgetrennte organische Phase wurde getrocknet, eingedampft und der Rückstand mit Äthanol behandelt. Auf diese Weise wurden 7,6 g geschütztes Heptapeptid (Rf(2)= 0,8) erhalten (Ausbeute für das als Ausgangsverbindung eingesetzte Boc-Pro-OPFP berechnet: 53%); F. 192-195 °C. 60

Schritt 2:

Z-OGly-A rg(NOi)- Val-Tyr(Bzl)-Ile-His(Dnp)-Pro-Leu-ONB

1,8 g (1,25 mMol) Boc-Arg(N02)-Val-Tyr(Bzl)-Ile-His(Dnp)- 65 -Pro-Leu-ONB wurden in 10 ml 8 M Lösung von Salzsäure in Dioxan gelöst, nach 15 Minuten Stehen wurde das erhaltene, an der N-terminalen Aminosäure freie Heptapeptid-Hydrochlorid durch die Zugabe von trockenem Äther gefällt, abfiltriert und mit trockenem Äther gewaschen (Rf(3)= 0,36). Dieses Produkt wurde sofort in 20 ml Dimethylformamid gelöst, die Lösung mit Triäthylamin auf pH = 8 gestellt und mit 0,9 g (2,3 mMol) Z-OGly-OPFP versetzt. Nach 15 Minuten Stehen wurde das Lösungsmittel verdampft und durch Chloroform ersetzt, dann wurde die erhaltene Lösung mit 1 n-Salzsäurelösung und anschliessend mit Wasser ausgeschüttelt, getrocknet und eingedampft. Der Rückstand wurde mit dem 2:8 Gemisch von Äthanol und Äther behandelt und abfiltriert. Es wurden auf diese Weise 1,6 g Z-0Gly-Arg(N02)-Val-Tyr(Bzl)-Ile-His(Dnp)--Pro-Leu-ONB (85% d. Th.) erhalten: Rf<2)= 0,80; F. 165-174°C.

Schritt 3:

Das Entfernen der Schutzgruppen

1,6 g (1,0 mMol) Z-0Gly-Arg(N02)-Val-Tyr(Bzl)-Ile--His(Dnp)-Pro-Leu-ONB wurden in 5 ml Dimethylformamid gelöst und mit 3,5 ml 2-Mercaptoäthanol versetzt. Die erhaltene Lösung wurde bei Raumtemperatur eine Stunde gerührt, dann wurde das Produkt durch die Zugabe von trockenem Äther gefällt, abfiltriert, mit je 10 ml Äther zweimal gewaschen und durch Umfällen aus Methanol/Äther gereinigt. Es wurden auf diese Weise 1,3 g Z-0GIy-Arg(N02)-Val-Tyr(Bzl)-Ile-His-Pr0--Leu-ONB (95% d. Th.) erhalten; Rf(2)= 0,2.

Dieses Produkt wurde in 30 ml 5:1:1-Gemisch von Methanol, Essigsäure und Wasser gelöst, mit 0,5 g 10%iger Palladium-Aktivkohle versetzt und unter lebhaftem Rühren wurde 20 Stunden lang Wasserstoffgas durch das Gemisch geleitet. Das Fortschreiten der Reaktion wurde durch Dünnschichtchromatographie verfolgt, nach der Beendigung der Reaktion wurde der Katalysator durch Filtrieren entfernt, mit 20 ml 5:1:I-Gemisch von Methanol, Essigsäure und Wasser nachgewaschen und das mit der Waschflüssigkeit vereinigte Filtrat zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wurde zum Entfernen der Essigsäure im Gemisch von Äthanol und Wasser aufgenommen, eingedampft und diese Operation wurde mehrmal wiederholt. Das zuletzt als Rückstand erhaltene Peptid wurde mit wasserfreiem Äthanol behandelt und abfiltriert. Es wurden auf diese Weise 0,8 g (Hydroxyacetyl1, Leus)-angiotensin-II (67% d. Th.) erhalten, welches dann auf die oben beschriebene Weise gereinigt wurde. Rf(5) = 0,41; Rf(6,= 0,59; Rf(7,= 0,60; Egiu (pH= 1,9): 0,98.

Aminosäure-Analyse: Pro: 1,0 (1); Val: 1,0 (1); Ile: 1,02 (1); Arg: 1,0 (1); His: 1,0 (1); Leu: 1,02 (1); Tyr: 0,73 (1).

Beispiel 2

(L- oc -Hydroxypropionyl1, Leus)-angiotensin-II

Schritt 1:

Z-OAla-Arg(NO2)-Val-Tyr(Bzl)-Ile-His(Dnp)-Pr0-Leu-ONB

1,8 g (1,25 mMol) Boc-Arg(N02)-Val-Tyr(Bzl)-Ile-His(Dnp)~ -Pro-Leu-ONB (Beispiel 1, Schritt 1) wurden,in 8 ml 8 M Lösung von Salzsäure in Dioxan gelöst, das erhaltene, an der N-terminalen Aminosäure freie Heptapeptid wurde durch die Zugabe von trockenem Äther gefällt, abfiltriert, mit trockenem Äther gewaschen (Rf<3)= 0,36) und dann sofort in 20 ml Dimethylformamid gelöst. Diese Lösung wurde mit Triäthylamin auf pH = 8 gestellt und mit 0,93 g (2,3 mMol) Z-OAla-OPFP versetzt. Nach 15 Minuten Stehen wurde das Lösungsmittel verdampft und durch Chloroform ersetzt; die Lösung wurde mit 1 n-Salzsäure und anschliessend mit Wasser ausgeschüttelt, getrocknet und eingedampft. Der Rückstand wurde mit einem 4:1 Gemisch von Äthanol und Äther behandelt und das erhaltene Produkt durch Filtrieren isoliert. Es wurden auf diese Weise

7

637 916

1,75 g Z-OAla-Arg(NO2)-Val-Tyr(Bzl)-Ile-His(Dnp)-Pr0-Leu--ONB (93% d. Th.) erhalten; Rf(2) = 0,85; F. 164-172°C.

Schritt 2:

Das Entfernen der Schutzgruppen

1,6 g Z-OAla-Arg(N02)-Val-Tyr(BzI)-IIe-His(Dnp)-Pro-Leu--ONB wurden in 5 ml Dimethylformamid gelöst, 3,5 ml 2-Mer-captoäthanol der Lösung zugesetzt, dann wurde das Gemisch bei Raumtemperatur eine Stunde gerührt, das Produkt durch die Zugabe von trockenem Äther gefällt und durch Umfällen aus Methanol/Äther gereinigt. Es wurden auf diese Weise 1,3 g Z-0Ala-Arg(N02)-Val-Tyr(Bzl)-Ile-His-Pr0-Leu-0NB (92% d. Th.) erhalten (Rf(2)= 0,27). Dieses Produkt wurde im 5:1:1 Gemisch von Methanol, Essigsäure und Wasser gelöst, mit 0,5 g 10%iger Palladium-Aktivkohle versetzt und Wasserstoffgas wurde unter lebhaften Rühren 20 Stunden lang durch das Gemisch geleitet. Das Fortschreiten der Reaktion wurde durch Dünnschichtchromatographie verfolgt; nach der Beendigung der Reaktion wurde der Katalysator abfiltriert, mit dem selben Lösungsmittelgemisch nachgewaschen, das Filtrat zur Trockne eingedampft, der Rückstand mit wässrigem Äthanol versetzt, wieder eingedampft und diese Operation wurde mehrmal wiederholt. Zuletzt wurde der Rückstand mit trockenem Äthanol behandelt, abfiltriert und getrocknet. Es wurden 0,65 g (L- o( --Hydroxypropionyl1, Leu8)-angiotensin-II (70% d. Th.) erhalten; das Produkt wurde auf die oben beschriebenen Weise gereinigt. Rf(5) = 0,36; Rf(6»= 0,57; Rf<7»= 0,60; Eck, (pH = 1,9): 0,97.

Aminosäure-Analyse: Pro: 0,98 (1); Val: 1,0 (1); Ile: 1,1 (1); Arg: 1,0 (1); His: 0,98 (1); Leu: 0,98 (1); Tyr: 0,56 (1).

Beispiel 3 (Hydroxyacetyl1, Ilé)-angiotensin-II

Schritt 1 :

Boc-A rg(NOi)- Val- Tyr(Bzl)-Ile-His(Dnp)-Pro-Ile-ONB

4,15 g (15 mMol) Ile-ONB.HCl wurden in 50 ml Chloroform gelöst und mit 2,1 ml Triäthylamin und 3,81 g (10 mMol) Boc-Pro-OPFP versetzt. Das Gemisch wurde bei Raumtemperatur 20 Minuten gerührt, dann mit Wasser und mit 10%iger Citronensäurelösung ausgeschüttelt, getrocknet und eingedampft. Das als Rückstand erhaltene geschützte Dipeptid (Rf(1) = 0,9) wurde ohne Reinigung in 20 ml 8 M Lösung von Salzsäure in Dioxan gelöst; nach 10 Minuten wurde die Lösung mit trockenem Äther verdünnt und eingedampft. Das erhaltene, an der N-terminale Aminosäure freie Dipeptid-hydrochlorid (Rf(4) = 0,44) wurde in 30 ml Chloroform gelöst, die Lösung durch die Zugabe von Triäthylamin auf pH = 8 gestellt und mit 8,8 g (15 mMol) Boc-His(Dnp)-OPFP versetzt. Nach 1,5 Stunden Stehen wurde das Reaktionsgemisch mit 1,65 ml N,N-Di-methylamin-äthylamin versetzt, nach 15 Minuten mit wässriger 10%iger Citronensäurelösung, mit 1 n-Salzsäurelösung und schliesslich mit Wasser ausgeschüttelt, getrocknet und eingedampft. Das als Rückstand erhaltene geschützte Tripeptid (Rf(1)= 0,50) wurde ohne Reinigung in 20 ml 8 M Lösung von Salzsäure in Dioxan gelöst, die Lösung 15 Minuten stehen gelassen, dann wurde das erhaltene, an der N-terminalen Aminosäure freie Tripeptid (Rf(4)= 0,25) durch die Zugabe von trockenem Äther gefällt, abfiltriert und mit trockenem Äther gewaschen. Dieses Produkt wurde sofort im Gemisch von 50 ml Chloroform und 20 ml Dimethylformamid gelöst, die Lösung mit Triäthylamin auf pH = 8 gestellt und mit 6,0 g (15 mMol) Boc-Ile-OPFP versetzt. Nach 30 Minuten wurde das Lösungsmittel verdampft und durch Äthylacetat ersetzt, die Lösung mit wässriger 10%iger Citronensäure, mit 1 n-Salzsäurelösung und mit Wasser ausgeschüttelt, getrocknet und eingedampft. Der

Rückstand wurde mit einen 9:1 Gemisch von n-Hexan und Äther behandelt und das so isolierte geschützte Tetrapeptid (Rf(2) = 0,65) wurden in 25 ml 8 M Lösung von Salzsäure in Dioxan gelöst. Nach 30 Minuten Stehen wurde das erhaltene, an der N-terminale Aminosäure freie Tetrapeptid (Rf(4)= 0,41) durch die Zugabe von trockenem Äther gefällt, abfiltriert und mit trockenem Äther gewaschen. Dieses Produkt wurde sofort in 70 ml 1:1 Gemisch von Dimethylformamid und Chloroform gelöst, die Lösung mit Triäthylamin auf pH = 8 gestellt und mit 6,0 g (11,5 mMol) Boc-Tyr(Bzl)-OPFP versetzt. Nach 15 Minuten wurde das Lösungsmittel verdampft und durch Äthylacetat ersetzt, 0,66 ml N,N-Dimethylamino-äthylamino wurden der Lösung zugegeben und nach 15 Minuten wurde die Lösung mit wässriger 10%iger Citronensäurelösung, mit 1 n-Salzsäurelösung und mit Wasser ausgeschüttelt, getrocknet und eingedampft. Der Rückstand wurde mit trockenem Äther behandelt und das auf diese Weise erhaltene geschützte Pentapeptid (Rf(2) = 0,59) in 20 ml 8 M Lösung von Salzsäure in Dioxan gelöst. Nach 15 Minuten Stehen wurde das erhaltene, an der N-terminalen Aminosäure freie Pentapeptid-hydrochlorid (Rf(4) = 0,4) durch die Zugabe von trockenem Äther gefällt, abfiltriert und mit 20 ml trockenem Äther gewaschen. Dieses Produkt wurde sofort in 50 ml Dimethylformamid gelöst, die Lösung mit Triäthylamin auf pH = 8 gestellt und mit 4,62 g (12 mMol) Boc-Val-OPFP versetzt. Nach einer Stunde wurde das Lösungsmittel verdampft und durch Chloroform ersetzt, die Lösung mit wässriger 10%iger Citronensäurelösung, mit 1 n-Salzsäurelösung und schliesslich mit Wasser ausgeschüttelt, getrocknet und eingedampft. Der Rückstand wurde mit trockenem Äther behandelt und das so isolierte geschützte Hexapeptid (Rf(2) = 0,56) in 20 ml 8 M Lösung von Salzsäure in Dioxan gelöst. Nach 15 Minuten wurde das erhaltene, an der N-terminalen Aminosäure freie Hexapeptid (Rf(2) = 0,47) durch die Zugabe von trockenem Äther gefällt, abfiltriert und mit 20 ml trockenem Äther gewaschen. Das Produkt wurde sofort in 50 ml Dimethylformamid gelöst, die Lösung mit Triäthylamin auf pH = 8 gestellt und mit 5,38 g (12 mMol) Bos-Arg(N02)--OPFP versetzt. Nach 30 Minuten wurde das Lösungsmittel verdampft und durch Chloroform ersetzt, die Lösung mit 1 n-Salzsäure und mit Wasser ausgeschüttelt, getrocknet und eingedampft. Der Rückstand wurde mit Äthanol behandelt und abfiltriert. Es wurden 9,7 g Boc-Arg(N02)-Val-Tyr(Bzl)-Ile--His(Dnp)-Pro-Ile-ONB (68% d. Th. für das als Ausgangsstoff eingesetzte Boc-Pro-OPFP berechnet) erhalten; Rf(2) = 0,67.

Schritt 2:

Z-OGly-A rg(NC>2)- Val- Tyr(Bzl)-Ile-His(Dnp)-Pro-Ile-ONB

1,6 g (1,1 mMol) Boc-Arg(N02)-Val-Tyr(Bzl)-Ile-His(Dnp)--Pro-Ile-ONB wurden in 8 ml 8 M Lösung von Salzsäure in Dioxan gelöst und nach 15 Minuten wurde das erhaltene, an der N-terminalen Aminosäure freie Heptapeptid-hydrochlorid (R/4) = 0,45) durch die Zugabe von trockenem Äther gefällt, abfiltriert und mit 20 ml trockenem Äther gewaschen. Dieses Produkt wurde sofort in 10 ml Dimethylformamid gelöst, die Lösung mit Triäthylamin auf pH = 8 gestellt und mit 0,6 g (1,5 mMol) Z-OGly-OPFP versetzt. Nach 30 Minuten wurde das Lösungsmittel verdampft und durch Chloroform ersetzt, die Lösung mit 1 n-Salzsäure und mit Wasser ausgeschüttelt, getrocknet und eingedampft. Das als Rückstand erhaltene geschützte Peptid wurde durch Behandlung mit trockenem Äther isoliert. Es wurden auf diese Weise 1,45 g Z-0Gly-Arg(N02)--Val-Tyr(Bzl)-Ile-His(Dnp)-Pro-Ile-ONB (85% d. Th.) erhalten; Rf<2»= 0,68; F. 151-158°C.

5

10

IS

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

637 916

8

Schritt 3:

Das Abspalten der Schutzgruppen

1,45 g (0,94 mMol) Z-0Gly-Arg(N02)-Val-Tyr(Bzl)-Ile--His(Dnp)-Pro-Ile-ONB wurden in 5 ml Dimethylformamid gelöst, mit 3,5 ml 2-Mercaptoäthanol versetzt und das Gemisch eine Stunde gerührt. Das erhaltene Z-0GIy-Arg(N02)-Val--Tyr(Bzl)-Ile-His-Pro-Ile-ONB wurde durch die Zugabe von trockenem Äther gefällt. Nach Umfällen aus Methanol/Äther war die Ausbeute 1,05 g (82% d. Th.); Rf<2)= 0,10. Dieses Produkt wurde in 30 ml 5:1:1 Gemisch von Methanol, Essigsäure und Wasser gelöst, mit 0,5 g 10%iger Palladium/Aktivkohle versetzt und das Gemisch wurde unter lebhaftem Rühren 21 Stunden lang mit durch die Lösung geleitetem Wasserstoffgas behandelt. Das Fortschreiten der Reaktion wurde durch Dünnschichtchromatographie verfolgt. Nach der Beendigung der Reaktion wurde der Katalysator abfiltriert, das Filtrat zur Trockne eingedampft und das als Rückstand erhaltene freie Peptid durch Behandlung mit trockenem Äthanol isoliert. Es wurden auf diese Weise 0,48 g (Hydroxyacetyl1, Ile8)-angio-tensin-II (64% d. Th.) erhalten, welches dann auf die oben beschriebene Weise gereinigt wurde; Rf(5)= 0,29; Rf<6)= 0,57; Rfn= 0,58; Eoiu (pH = 1,9): 1,03.

Aminosäure-Analyse: Pro: 0,99 (1); Val: 1,15 (1); Ile: 2,06 (2); Tyr: 0,74 (1); His: 0,98 (1); Arg: 0,95 (1).

Beispiel 4

(L- <x -Hydroxypropionyl', Iléj-angiotensìn-II

Schritt 1:

Z-OA la-A rg(NO?)- Val- Tyr(Bzl)-Ile-His(Dnp)-Pro-Ile-ONB

1,6 g (1,1 mMol) Boc-Arg(N02)-Val-Tyr(Bzl)-Ile-His(Dnp)--Pro-lle-ONB wurden in 8 ml 8 M Lösung von Salzsäure in Dioxan gelöst und nach 15 Minuten wurde das erhaltene, an der N-terminalen Aminosäure freie Heptapeptid (Rf(4)= 0,45) durch die Zugabe von trockenem Äther gefällt, abfiltriert und mit trockenem Äther gewaschen. Das erhaltene Produkt wurde sofort in 10 ml Dimethylformamid gelöst, die Lösung mit Triäthylamin auf pH = 8 gestellt und mit 0,61 g (1,5 mMol) Z-OAla-OPFP versetzt. Nach 30 Min. wurde das Lösungsmittel verdampft und durch Chloroform ersetzt, die Lösung wurde mit 1 n-Salzsäure und mit Wasser ausgeschüttelt, getrocknet und eingedampft. Das erhaltene geschützte Peptid wurde durch Behandlung mit Äther isoliert. Es wurden auf diese Weise 1,4 g Z-0Ala-Arg(N02)-Val-Tyr(Bzl)-Ile-His(Dnp)-Pr0-Ile-0NB (82% d. Th.) erhalten; R/2i= 0,63; F. 164-168°C.

Schritt 2:

Das Abspalten der Schutzgruppen

1,4 g (0,9 mMol) Z-0Ala-Arg(N02)-Val-Tyr(Bzl)-Ile--His(Dnp)-Pro-Ile-ONB wurden in 5 ml Dimethylformamid gelöst und mit 3,5 ml 2-Mercaptoäthanol versetzt. Nach einer Stunde wurde das Produkt durch die Zugabe von trockenem Äther gefällt und durch Umfällen aus Methanol/Äther gereinigt. Es wurden 0,8 g Z-0Ala-Arg(N02)-Val-Tyr(Bzl)-Ile-His--Pro-Ile-ONB (65% d. Th.) erhalten; Rf(2) = 0,13; Rf(3)= 0,27. Dieses geschützte Peptid wurde dann in 10 ml 5:1:1 Gemisch von Methanol, Essigsäure und Wasser gelöst, mit 0,5 g 10%iger Palladium/Aktivkohle versetzt und Wasserstoffgas wurde unter Rühren 16 Stunden lang durch das Gemisch geleitet. Nach der Beendigung der Reaktion wurde der Katalysator abfiltriert, die Lösung eingedampft und das Produkt durch Behandlung mit trockenem Äthanol isoliert. Es wurden auf diese Weise 0,4 g (L-®£ -Hydroxypropionyl', Ile8)-angiotensin-II (0,65% d. Th.) erhalten, welches dann auf die oben beschriebene Weise gereinigt wurde. Rf{5)= 0,30; Rf®= 0,58; Rf(7)= 0,58; E0|U (pH =1,9): 1,07.

Aminosäure-Analyse: Pro: 1,04 (1); Val: 0,98 (1); Ile: 1,98 (2); Tyr: 0,98 (1); His: 1,05 (1); Arg: 1,0 (1).

Beispiel 5 (Hydroxyacetyl1, A la?)-angiotensin-II

Schritt 1 :

Boc-A rgfNOi)- Val- Tyr(Bzl)-Ile-His(Dnp)-Pro-A la-ONB

1,21 g (4 mMol) Ala-ONB.HBr wurden in 15 ml Chloroform gelöst und 0,56 ml Triäthylalamin und 0,76 g (2 mMol) Boc-Pro-OPFP wurden der Lösung zugesetzt. Die Lösung wurde 20 Minuten bei Raumtemperatur gerührt, dann mit Wasser und mit 10%iger wässriger Citronensäurelösung ausgeschüttelt, getrocknet und eingedampft. Das als Rückstand erhaltene geschützte Dipeptid (Rf(1) = 0,64) wurde ohne Reinigung in 4 ml 8 M Lösung von Salzsäure in Dioxan gelöst. Nach 10 Minuten ;Stehen wurde die Lösung mit Äther verdünnt und eingedampft. Das als Rückstand erhaltene, an der N-terminalen Aminosäure freie Dipeptid-hydrochlorid (Rf(4)= 0,65) wurde in 15 ml Chloroform gelöst, die Lösung mit Triäthylamin auf pH = 8 gestellt und mit 1,76 g (3 mMol) Bos-His(Dnp)-OPFP versetzt. Nach 30 Minuten wurden 0,44 ml N,N-Dimethylamino-äthylamin der Lösung zugegeben, welche dann nach 5 Minuten mit wässriger 10%iger Citronensäurelösung, mit 1 n-Salzsäurelösung und schliesslich mit Wasser ausgeschüttelt, getrocknet und eingedampft wurde. Das als Rückstand erhaltene geschützte Tripeptid (Rf(2)= 0,57) wurde ohne Reinigung in 4 ml 8 M Lösung von Salzsäure in Dioxan gelöst; nach 10 Minuten wurde das erhaltene, an der N-terminalen Aminosäure freie Tripeptid (Rf<3) = 0,28) durch die Zugabe von trockenem Äther gefällt, abfiltriert und mit Äther gewaschen. Dieses Produkt wurde sofort in 20 ml 1:1 Gemisch von Chloroform und Dimethylformamid gelöst, die Lösung mit Triäthylamin auf pH = 8 gestellt und mit 1,58 g (4 mMol) Boc-Ile-OPFP versetzt. Nach 20 Min. wurde das Lösungsmittel verdampft und durch Äthylacetat ersetzt, mit vvässriger 10%iger Citronensäurelösung und mit Wasser ausgeschüttelt, getrocknet und eingedampft. Der Rückstand wurde mit 1:9 Gemisch von Äther und Hexan behandelt und abfiltriert. Das auf diese Weise erhaltene geschützte Tetrapeptid (Rf(2) = 0,57) wurde in 4 ml 8 M Lösung von Salzsäure in Dioxan gelöst und nach 15 Minuten Stehen wurde das erhaltene, an der N-terminalen Aminosäure freie Tetrapeptid (Rf<3) = 0,38) durch die Zugabe von trockenem Äther gefällt, abfiltriert, mit trockenem Äther gewaschen und sofort in 15 ml 2:1 Gemisch von Chloroform und Dimethylformamid gelöst. Die Lösung wurde mit Triäthylamin auf pH = 8 gestellt und mit 1,66 g (3 mMol) Boc-Tyr(Bzl)-OPFP versetzt. Nach 15 Minuten wurde das Lösungsmittel verdampft, durch Äthylacetat ersetzt, die Lösung mit 0,22 ml N,N-Dimethylamino-äthylamin versetzt und nach 5 Minuten mit wässriger 10%iger Citronensäurelösung, mit 1 n-Salzsäurelösung und zuletzt mit Wasser ausgeschüttelt, getrocknet und eingedampft. Der Rückstand wurde mit Äther behandelt, abfiltriert, und mit Äther gewaschen. Das auf diese Weise erhaltene geschützte Pentapeptid (Rf(2!= 0,60) wurde in 4 ml 8 M Lösung von Salzsäure in Dioxan gelöst, . nach 10 Minuten Stehen wurde das erhaltene, an der N-terminalen Aminosäure freie Pentapeptid (Rf<4) = 0,62) durch die Zugabe von trockenem Äther gefällt, abfiltriert und mit trockenem Äther gewaschen. Das erhaltene Produkt wurde sofort in 20 ml 1:1 Gemisch von Chloroform und Dimethylformamid gelöst, die Lösung mit Triäthylamin auf pH = 8 gestellt und mit 1,6 g (4 mMol) Boc-Val-OPFP versetzt. Nach 20 Minuten wurde das Lösungsmittel abdestilliert, durch Äthylacetat ersetzt, die Lösung mit wässriger 10%iger Citronensäurelösung und mit Wasser ausgeschüttelt, getrocknet und eingedampft. Der Rück5

10

IS

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

9

637 916

stand wurde mit Äther behandelt, abfiltriert und mit Äther gewaschen. Das auf diese Weise erhaltene geschützte Hexapeptid (Rf(2) = 0,65) wurde in 8 ml 8 M Lösung von Salzsäure in Dioxan gelöst, nach 20 Minuten Stehen wurde das erhaltene, an der N-terminalen Aminosäure freie Hexapeptid (Rf(4) = 0,65) durch die Zugabe von trockenem Äther gefällt, abfiltriert und mit trockenem Äther gewaschen. Dieses Produkt wurde sofort in 20 ml Dimethylformamid gelöst, die Lösung mit Triäthylamin auf pH = 8 gestellt und mit 2,9 g (6 mMol) Boc-Arg(NC>2)--OPFP versetzt. Nach 20 Minuten wurde das Lösungsmittel abdestilliert, durch Chloroform ersetzt, die Lösung mit 10%iger wässriger Citronensäurelösung und mit Wasser ausgeschüttelt, getrocknet und eingedampft. Der Rückstand wurde 1:2 Gemisch von Äthylacetat und Äther verrieben, abfiltriert und mit dem selben Lösungsmittelgemisch gewaschen. Es wurden auf diese Weise 2,0 g Boc-Arg(N02)-Val-Tyr(Bzl)-Ile-His(Dnp)-Pro--Ala-ONB (72% d. Th.) erhalten; Rf<2) = 0,70; F. 185-187°C.

Schritt 2:

Z-0Gly-Arg(N02)-Val-Tyr(Bzl)-Ile-His(Dnp)-Pr0-Ala-0NB

1,35 g (1 mMol) Boc-Arg(N02)-Val-Tyr(Bzl)-Ile-His(Dnp)--Pro-Ala-ONB wurden in 4 ml 8 M Lösung von Salzsäure in Dioxan gelöst, nach 15 Minuten Stehen wurde das erhaltene, an der N-terminalen Aminosäure freie Heptpeptid-hydrochlorid (Rf(4) = 0,63) durch die Zugabe von trockenem Äther gefällt, abfiltriert und mit trockenem Äther gewaschen. Dieses Produkt wurde sofort in 15 ml Dimethylformamid gelöst, die Lösung mit Triäthylamin auf pH = 8 gestellt und mit 0,96 g (2,5 mMol) Z-OGly-OPFP versetzt. Nach 20 Minuten wurde das Lösungsmittel abdestilliert und durch Chloroform ersetzt, die Lösung mit Wasser ausgeschüttelt, getrocknet und eingedampft. Der Rückstand wurde mit Äthanol behandelt und abfiltriert. Es wurden 1,16 g Z-0Gly-Arg(N02)-Val-Tyr(Bzl)-Ile-His(Dnp)--Pro-Ala-ONB (83% d. Th.) erhalten; Rf(2,= 0,72; F. 133-135°C.

Schritt 3 :

Das Abspalten der Schutzgruppen

1,5 g (1 mMol) Z-0Gly-Arg(N02)-Val-Tyr(Bzl)-Ile--His(Dnp)-Pro-Ala-ONB wurden in 5 ml Dimethylformamid gelöst, mit 2,95 ml w-Mercaptoäthanol versetzt; nach einer Stunde wurde das Produkt durch die Zugabe von trockenem Äther gefällt, abfiltriert und mit Äthanol gewaschen. Es wurde auf diese Weise 1,1 g Z-0Gly-Arg(N02)-Val-Tyr(Bzl)-Ile-His--Pro-Ala-ONB (82% d. Th.) erhalten; Rf(2)= 0,15; Rf(3)= 0,40. Dieses geschützte Peptid wurde dann in 15 ml 5:1:1 Gemisch von Methanol, Essigsäure und Wasser gelöst, mit 0,5 g 10%iger Palladium/Aktivkohle versetzt und Wasserstoffgas wurde unter Rühren 24 Stunden lang durch die Lösung geleitet. Das Fortschreiten der Reaktion wurde durch Dünnschichtchromatographie verfolgt; nach der Beendigung der Reaktion wurde der Katalysator abfiltriert, mit 15 ml 5:1:1 Gemisch von Methanol, Essigsäure und Wasser nachgewaschen und das mit der Waschflüssigkeit vereinigte Filtrat zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wurde mit wässrigem Äthanol wiederholt zur Trockne eingedampft und schliesslich wurde der als Rückstand erhaltene Produkt mit trockenem Äthanol behandelt und abfiltriert. Es wurden auf diese Weise 0,55 g (Hydroxyacetyl1, Ala8)--angiotensin-II (80% d. Th.) erhalten, welches dann nach der oben beschriebenen Methode gereinigt wurde. Rf<5) = 0,28; Rf<6>= 0,48; Rf(7) = 0,50; E0iu (pH = 1,9): 1,0.

Aminosäure-Analyse: Pro: 0,95 (1); Ala: 1,1 (1); Val: 1,0 (1); Ile: 1,0(1); His: 1,0 (1); Arg: 1,0(1); Tyr: 0,9(1).

Beispiel 6

(Hydroxyacetyl', Thr[Me]8)-angiotensin-II

Schritt 1:

Boc-Arg(NC>2)-Val-Tyr(Bzl)-Ile-His(Dnp)-Pro-Thr(Me)-OMe

0,69 g (3 mMol) Thr(Me)-OMe.HBr wurden in 30 ml Chloroform gelöst, dann wurden der Lösung 0,42 ml Triäthylamin und 1,7 g (4,5 mMol) Boc-Pro-OPFP zugesetzt. Nach zwei Stunden wurden 0,33 ml N,N-Diäthylamino-äthylamin zugegeben, nach weiteren 15 Minuten wurde das Lösungsmittel abdestilliert und durch Äthylacetat ersetzt, die Lösung mit 10%iger wässriger Citronensäurelösung, mit Wasser und schliesslich mit 5%iger wässriger Natriumhydrogencarbonatlösung ausgeschüttelt, getrocknet und eingedampft. Das als Rückstand erhaltene geschützte Dipeptid (Rf(!> = 0,76) wurde ohne Reinigung in 2 ml 8 M Lösung von Salzsäure in Dioxan gelöst, 15 Minuten stehen gelassen, dann mit Äther verdünnt und eingedampft. Das als Rückstand erhaltene, an der N-terminalen Aminosäure freie Dipeptid (Rf(3)= 0,18) wurde in 20 ml Chloroform gelöst, die Lösung mit Triäthylamin auf pH = 8 gestellt und mit 2,6 g (4,5 mMol) Boc-His(Dnp)-OPFP versetzt. Das Gemisch wurde bei Raumtemperatur 2 Stunden gerührt, dann wurden 0,22 ml N,N-Dimethylamino-äthylamin zugegeben und nach 15 Minuten wurde das Gemisch mit wässriger 10%iger Citronensäurelösung, mit 1 n-Salzsäurelösung und zuletzt mit Wasser ausgeschüttelt, getrocknet und eingedampft. Das als Rückstand erhaltene geschützte Tripeptid (Rf!1)= 0,5) wurde ohne Reinigung in 4 ml 8 M Lösung von Salzsäure in Dioxan gelöst, nach 15 Minuten das erhaltene, an der N-terminalen Aminosäure freie Tripeptid (Rf(3)= 0,3) durch die Zugabe von trockenem Äther gefällt, abfiltriert, mit trockenem Äther gewaschen und sofort in 20 ml 1:1 Gemisch von Chloroform und Dimethylformamid gelöst. Die Lösung wurde mit Triäthylamin auf pH = 8 gestellt und mit 1,6 g (4 mMol) Boc-Ile-OPFP versetzt. Nach 30 Minuten wurde das Lösungsmittel abdestilliert, durch Äthylacetat ersetzt, die Lösung mit wässriger 10%iger Citronensäurelösung, mit 1 n-Salzsäurelösung und zuletzt mit Wasser ausgeschüttelt, getrocknet und eingedampft. Der Rückstand wurde mit 1:9 Gemisch von Äther und n-Hexan behandelt und abfiltriert. Das auf diese Weise isolierte geschützte Tetrapeptid (Rf(2)= 0,64) wurde in 7 ml 8 M Lösung von Salzsäure in Dioxan gelöst und nach 15 Minuten wurde das erhaltene, an der N-terminalen Aminosäure freie Tetrapeptid (Rf(4)= 0,27) durch die Zugabe von trockenem Äther gefällt, abfiltriert und sofort im 20 ml 1:1 Gemisch von Chloroform und Dimethylformamid gelöst. Die Lösung wurde mit Triäthylamin auf pH = 8 gestellt und mit 1,6 g (3 mMol) Boc-Tyr(Bzl)-OPFP versetzt. Nach 30 Minuten wurde das Lösungsmittel abdestilliert, durch Äthylacetat ersetzt und dann wurden 0,22 ml N,N-Dimethylamino-äthylamin der Lösung zugegeben. Nach 15 Minuten wurde die Lösung mit wässriger 10%iger Citronensäurelösung, mit 1 n-Salzsäurelö-sung und zuletzt mit Wasser ausgeschüttelt, getrocknet und eingedampft. Der Rückstand wurde mit Äther behandelt und ab-filtriert. Es wurden auf diese Weise 0,4 g geschütztes Pentapeptid (Rf(2>= 0,63) erhalten; dieses Produkt wurde in 1 ml 8 M Lösung von Salzsäure in Dioxan gelöst und nach 15 Minuten wurde das erhaltene, an der N-terminalen Aminosäure freie Pentapeptid (Rf(4) = 0,47) durch die Zugabe von trockenem Äther gefällt, abfiltriert und mit trockenem Äther gewaschen. Das Produkt wurde sofort in 10 ml Dimethylformamid gelöst, die Lösung mit Triäthylamin auf pH = 8 gestellt, und mit 0,4 g (1 mMol) Boc-Val-OPFP versetzt. Nach einer Stunde wurde das Lösungsmittel abdestilliert und durch Chloroform ersetzt und die Lösung mit wässriger 10%iger Citronensäurelösung, mit 1 n-Salzsäurelösung und zuletzt mit Wasser ausgeschüttelt, getrocknet und eingedampft. Der Rückstand wurde mit Äther behandelt und abfiltriert. Das auf diese Weise erhaltene geschütz-

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

637 916

10

te Hexapeptid (Rf(2)= 0,65) wurde in 1,5 ml 8 M Lösung von Salzsäure in Dioxan gelöst, nach 15 Minuten wurde das erhaltene, an der N-terminalen Aminosäure freie Hexapeptid (Rf(4) = 0,48) durch die Zugabe von trockenem Äther gefällt, abfiltriert und mit Äther gewaschen und sofort in 10 ml Dimethylformamid gelöst. Die Lösung wurde mit Triäthylamin auf pH = 8 gestellt und mit 0,45 g (1 mMol) Boc-Ärg(NC>2)-OPFP versetzt. Nach einer Stunde wurde das Lösungsmittel'abdestilliert und durch Äthylacetat ersetzt, die Lösung mit wässriger 10%iger Citronensäurelösung, mit 1 n-Salzsäurelösung und zuletzt mit Wasser ausgeschüttelt, getrocknet und eingedampft. Der Rückstand wurde mit einem 9:1 Gemisch von Äther und Äthanol behandelt und abfiltriert. Es wurden auf diese Weise 0,45 g Boc--Arg(NC>2)-Val-Tyr(Bzl)-Ile-His(Dnp)-Pro-Thr(Me)-OMe (11,3% d. Th.) erhalten; Rf<2)= 0,38; F. 199-203°C (Zers.).

Schritt 2:

Z-Ogly-A rg(NC>2)- Val- Tyr(Bzl)-Ile-His(Dnp)-Pro-

-Thr(Me)-OMe

0,45 g (0,34 mMol) Boc-Arg(NC>2)-Val-Tyr(Bzl)-Ile--His(Dnp)-Pro-Thr(Me)-OMe wurden in 2 ml 8 M Lösung von Salzsäure in Dioxan gelöst und nach 15 Minuten wurde das erhaltene, an der N-terminalen Aminosäure freie Heptapeptid (Rf<4)= 0,35) durch die Zugabe von trockenem Äther gefällt, abfiltriert und mit Äther gewaschen. Das Produkt wurde sofort in 10 ml Dimethylformamid gelöst, die Lösung mit Triäthylamin auf pH = 8 gestellt und mit 0,4 g (1 mMol) Z-OGly-OPFP versetzt. Nach einer Stunde wurde das Reaktionsgemisch mit 30 ml Chloroform verdünnt, mit Wasser ausgeschüttelt, getrocknet und eingedampft. Der Rückstand wurde mit einem 9:1 Gemisch von Äther und Äthanol behandelt und abfiltriert. Es wurden auf diese Weise 0,45 g Z-0Gly-Arg(N02)-Val-Tyr(Bzl)--Ile-His(Dnp)-Pro-Thr(Me)-OMe (93% d. Th.) erhalten; Rf= 0,44; F. 158-162°C.

Schritt 3:

Das A bspalten der Schutzgruppen

0,45 g (0,31 mMol) Z-0Gly-Arg(N02)-Val-Tyr(Bzl)-Ile-5 -His(Dnp)-Pro-Thr(ME)-OMe wurden in 1,5 ml Dimethylformamid gelöst und 1 ml 2-Mercaptoäthanol wurde der Lösung zugegeben. Nach einer Stunde wurde das Produkt durch die Zugabe von trockenem Äther gefällt, in Methanol gelöst, mit wenig Aktivkohle behandelt, abfiltriert und das Filtrat einge-io dampft. Der Rückstand wurde mit Äther behandelt und abfiltriert. Als Rückstand wurden 0,38 g Z-OGly-Arg(NC>2)-Val--Tyr(Bzl)-Ile-His-Pro-Thr(Me)-OMe (98% d. Th.) erhalten; Rf® = 0,16; Rf(4)= 0,52. Dieses Produkt wurde in 5 ml Dioxan suspendiert und mit 1,2 ml 1 n-Natriumhydroxydlösung ver-15 setzt. Nach einer Stunde wurde die Lösung durch die Zugabe von 1 n-Salzsäure auf pH = 3 gestellt, der erhaltene Niederschlag abfiltriert und in einem 3:1 Gemisch von Chloroform und Dimethylformamid gelöst. Die Lösung wurde getrocknet und eingedampft und der Rückstand mit Äther behandelt. Es 20 wurden 0,26 g an der C-terminalen Aminosäure freies Peptid (70% d. Th.) erhalten; R/4)= 0,25. Dieses Produkt wurde in 10 ml 5:1:1 Gemisch von Methanol, Essigsäure und Wasser gelöst, die Lösung mit 0,1 g 10%iger Palladium/Aktivkohle versetzt und Wasserstoffgas wurde unter Rühren 16 Stunden lang durch 25 die Lösung geleitet. Das Fortschreiten der Reaktion wurde durch Dünnschichtchromatographie verfolgt; nach der Beendigung der Reaktion wurde der Katalysator abfiltriert und die Lösung zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wurde mit wässrigem Äthanol behandelt, eingedampft und diese Opera-30 tion wurde mehrmal wiederholt. Es wurden auf diese Weise 0,16 g [Hydroxyacetyl1, Thr(Me)8]-angiotensin-II erhalten, welches dann nach oben beschriebener Methode gereinigt wurde; Rf(5) = 0,22; Rf(6) = 0,53; Rf(7)= 0,50; EG!u (pH= 1,9): 0,98.

Aminosäure-Analyse: Thr: 0,6 (1); Pro: 1,0 (1); Val: 1,0 (1); 35 Ile: 1,02 (1); Tyr: 0,85 (1); His: 1,0 (1); Arg: 0,96 (1).

v

Claims (11)

637 916

1. Peptide der allgemeinen Formel I

X-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Y (I)

worin

X den Rest einer in der -Stellung eine Hydroxylgruppe enthaltenden aliphatischen Carbonsäure, und

Y eine Leucyl-, Isoleucyl-, Alanyl-, oder Threonylgruppe be deuten.

2. Peptide nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Rest X eine Hydroxyacetyl- oder <x -Hydroxypropionyl-gruppe bedeutet.

2

PATENTANSPRÜCHE

3. Hydroxyacetyl-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Leu-OH als Verbindungen nach Anspruch 1.

4. -Hydroxypropionyl-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Leu-OH als Verbindungen nach Anspruch 1.

5. Hydroxyacetyl-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Ile-OH als Verbindungen nach Anspruch 1.

6. oc -Hydroxypropionyl-Arg-Val-Tyr-Ue-His-Pro-Ile-OH als Verbindungen nach Anspruch 1.

7. Hydroxyacetyl-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Ala-OH als Verbindungen nach Anspruch 1.

8. Hydroxyacetyl-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Thr(Me)-OH als Verbindungen nach Anspruch 1.

9. Verfahren zur Herstellung von Peptiden der allgemeinen Formel I

X-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Y (I)

worin

X den Rest einer in der cc-Stellung eine Hydroxylgruppe enthaltenden aliphatischen Carbonsäure, und

Y eine Leucyl-, Isoleucyl-, Alanyl- oder Threonylgruppe bedeuten, dadurch gekennzeichnet, dass man ein reaktionsfähiges Heptapeptidderivat der allgemeinen Formel II

H-Arg(A)-Val-Tyr(B)-Ile-His(E)-Pro-Y-OG (II)

worin

A eine zum temporären Schutz des Guanidinorestes von Arg geeignete Schutzgruppe,

B eine zum temporären Schutz der aromatischen Hydroxylgruppe von Tyr geeignete Schutzgruppe,

E eine zum temporären Schutz der Imidazolgruppe von His geeignete Schutzgruppe,

G eine zum Schutz der Carboxylgruppe der C-terminalen Aminosäure geeignete, gegenüber schwach sauren Einflüssen widerstandfähige, aber durch katalytische Hydrogenolyse oder durch Behandeln mit stärkeren Säuren oder mit Alkalien abspaltbare Schutzgruppe bedeuten, und

Y die oben angegebene Bedeutung hat,

mit einem reaktionsfähigen Aminooxycarbonsäurederivat der allgemeinen Formel III

W-X'-M (III)

worin

X' einen in der « -Stellung eine Aminooxygruppe enthaltende aliphatischen Carbonsäurerest,

W eine durch Acidolyse oder katalytische Hydrogenolyse abspaltbare Schutzgruppe, und M eine Hydroxylgruppe oder eine aktivierende Gruppe vertreten, umsetzt und von der erhaltenen Verbindung der allgemeinen Formel IV

W-X'-Arg(A)-V al-T yr(B)-Ile-His(E)-Pro-Y-OG (IV)

zuerst die Schutzgruppe E und dann die übrigen Schutzgruppen zusammen mit der Aminogruppe von X' hydrogenolytisch entfernt.

10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass man die Abspaltung der Schutzgruppe E durch Behandlung mit 2-Mercaptoäthanol durchführt.

11. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass

X eine Hydroxyacetyl- oder cc -Hydroxypropionylgruppe, A eine Nitro- oder Tosylgruppe,

B eine Benzyl- oder substituierte Benzylgruppe,

E eine Dinitrophenylgruppe,

X' eine Aminooxyacetyl- oder cC -Aminooxypropionylgruppe, W eine Benzyloxycarbonyl- oder tert.Butyloxycarbonylgruppe, und

M eine Pivaloyloxy-, Nitrophenoxy-, 2,3,5-Trichlorphenoxy-, Pentachlorphenoxy-, Pentafluorphenoxy-, N-Succinimid-oxy- oder eine Azidogruppe bedeuten.