HU177134B

HU177134B - Process for preparing angiotensin ii analogues containing alpha-hydroxy-acid in position 1 with angiotensin ii antagonist activity

Info

Publication number: HU177134B
Application number: HU77RI641A
Authority: HU
Inventors: Lajos Kisfaludy; Gyoergyne Nyeki; Laszlone Szirmai; Egon Karpati; Katalin Gidai; Laszlo Szporny
Original assignee: Richter Gedeon Vegyeszet
Priority date: 1977-07-18
Filing date: 1977-07-18
Publication date: 1981-07-28
Also published as: DE2831271C2; AT360678B; ATA518378A; FI782216A; GB2002779A; SE7807824L; CH637916A5; SU913940A3; NL7807627A; GB2002779B; AU520176B2; BE869076A; FR2398049A1; JPS5831337B2; AU3800978A; CS201013B2; YU41315B; IN149852B; US4209442A; IL55075A0

Description

Eljárás 1-es helyzetben α-hidroxisavat tartalmazó, angiotenzin-II-antagonista hatású angiotenzin-II analógok előállítására

A találmány tárgyát az

X—Arg—Val—Tyr—Ile—His—Pro—Y

I általános képletű angiotenzin-II antagonista hatású új peptidek, valamint az azokat tartalmazó gyógyászati készítmények előállítási eljárása képezi, e képletben

X valamely α-helyzetben hidroxilcsoportot tartalmazó 2-5 szénatomos alkánkarbonsav gyökét, előnyösen hidroxiacetil- vagy L-ö-hidroxipropionii-csoportot és

Y L-leucil-, L-izoleucil-, L-alanil- vagy L-O-metiltreonil-csoportot jelent.

A találmány oltalmi körébe tartozik a fenti peptideknek savakkal képezett addíciós sóinak az előállítása is.

Az angiotenzin-Π vérnyomásemelő hatású oktapeptid, amely a szervezetben oly módon keletkezik, hogy a máj által termelt α-globulinból a veséből felszabaduló enzim, a renin egy angiotenzin-I-nek nevezett dekapeptídet állít elő, és ez a szervezetben angiotenzin-II-vé alakul.

1970-ben írták le az első angiotenzin-II analógot, amely mind in vivő, mind in vitro körülmények között az angiotenzin-II specifikus kompetitív inhibitoraként viselkedett [G. R. Marshal és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sci. USA

67, 1624 (1970), P. A. Khairallah és munkatársai: J. Med. Chem. 13, 181 (1970)]. Ez a megfigyelés széles körű érdeklődést váltott ki és számos kutatóhelyet ösztönzött olyan új antagonista hatású angi5 otenzin-Π analógok szintézisére és vizsgálatára, amelyek alkalmasak a renin-függő hipertenziók diagnosztizálására és esetleges terápiás kezelésére. Mindjárt a kutatás kezdetén kiderült, hogy erre a célra azok az analógok felelnek meg legjobban, 0 amelyekben a 8-as helyzetű Phe-t valamilyen alifás oldalláncú aminosawaí helyettesítik az angiotenzin-II molekulában. Ez ugyanis az agonista hatás gyakorlati megszűntét jelenti jelentős antagonista hatás mellett (D. Gagnon és munkatársai: Br. J.

Pharmacol. 43 409 (1971), D. T. Pals és munkatársai: Circ. Rés. 29, 664 (1971)]. Az antagonista hatás nagymértékben fokozható, ha a 8-as pozíció fenti módosításai mellett az 1-helyzetű Asp helyett Sar-t építenek a molekulába [D. T. Pals és munka) társai: Circ. Rés. 29, 673 (1971)]. Az így előállított (Sár¹, Ala⁸)-angiotenzin-H a későbbiek során Saralasin néven forgalomba is került. Előnyös tulajdonságait az in vivő bekövetkező enzimatikus lebomlás csökkenésével és a receptor sejtekhez való > nagy affinitásával magyarázzák.

Az elvégzett klinikai vizsgálatok [H. R. Brunner és munkatársai: Láncét, 1045 (1973), A. J. M.

Dóikéi és munkatársai: Láncét, 1535 (1974), T.

Ogihara és munkatársai: Láncét, 219 (1974), J. H.

) Laragh és munkatársai: New Engl. J. Med. 292,

695 (1975), W. A. Pettinger és munkatársai: New Engl. J. Med. 292, 1214 (1975), D. Η. P. Streeten és munkatársai: Circ Rés. 36 Suppl. 1., 125 (1975), H. R. Brunner és H. Gavras: Schweiz. med. Wschr. 106, 1791 (1976)] igazolták a kutatás kezdeti feltételezését, miszerint az angiotenzin-II antagonista hatású analóg ai alkalmasak lesznek a renin-függő hipertenziók diagnosztizálásában és esetenként kezelésében [D. Ganten és F. Gross: Med. Kiin. 71, 2043 (1976), J. L. Marx: Science 194, 821 (1976), P. Needleman és G. R. Marshal: Fed. Proc. 35, 2486 (1976)].

Az eddig előállított angiotenzin-II analógok szerkezetének és biológiai hatásának összevetése számos fontos információt szolgáltatott az agonista-antagonista hatás értelmezésében [M. C. Khosla és munkatársai: „Handbook of Experimental Pharmacology” vol. 37. I. H. Page és F. M. Bumpus eds. 1974, G. R. Marshal: Fed. Proc. 35, 2494 (1976)].

A jelenlegi kutatások homlokterében elsősorban a mellékhatás-mentes, hosszabb biológiai felezési idővel bíró antagonisták előállítása áll [M. C. Khosla és munkatársai: J. Med. Chem. 19, 244 (1976), ibid. 20, 253 (1977)].

Azt találtuk, hogy ha az angjotenzin-Π molekulájában a 8-helyzetű fenilalanint valamely, a-helyzetben aminocsoportot tartalmazó alifás karbonsav gyökével helyettesítjük, miközben az 1-helyzetbe α-helyzetben hidroxilcsoportot tartalmazó alifás karbonsav gyökét építjük be, olyan angiotenzin-II kompetitív inhibitorokhoz jutunk, amelyek az angiotenzin-II-vel kiváltott hipertenziót in vivő jelentős mértékben csökkentik és ezt a hatást szubkután adásmód mellett is mutatják.

A találmány értelmében úgy állítjuk elő az

X—Arg—Val—Tyr—Ile-His—Pro—Y I

I általános képletű vegyületeket, ahol X és Y jelentése a fenti, hogy valamely

H-Arg(A)—Val—Tyr(B)-Ile—His(E)—Pro—Y—OG

II

II általános képhtű reakcióképes heptapeptid-származékot, ahol

A jelentése az Arg guanidinocsoportjának átmeneti megvédésére alkalmas, előnyösen nitro- vagy tozilcsoport,

B jelentése a Tyr. aromás hidroxilcsoportjának átmeneti megvédésére alkalmas csoport, előnyösen benzil- vagy szubsztituált benzilcsoport,

E jelentése a His imidazolcsoportjának átmeneti megvédésére alkalmas csoport, így például dinitrofenilcsoport,

G a C-terminális alifás aminosav karboxilcso portjának védésére szolgáló olyan csoportot jelent, amely enyhe savas behatásoknak ellenáll, de katalitikus hidrogenolízissel vagy vizes ásványi sav, illetve vizes vagy alkoholos alkálifémhidroxid-oldat hatására eltávolítható, valamely

Z-X’-M III

III általános képletű védett a-aminooxi-karbonsav-származékkal reagáltatunk — ahol

Z jelentése valamely acidolízissel vagy katalitikus hidrogénezéssel eltávolítható csoport, így például benziloxikarbonil- vagy t-butiloxikarbonilcsoport, X’ jelentése α-helyzetben aminooxicsoportot tartalmazó alifás karbonsav gyöke, előnyösen aminooxiacetil- vagy α-aminooxipropionilcsoport és

M jelentése hidroxilcsoport vagy valamely aktiváló csoport, előnyösen pivaloüoxi-, nitrofenoxi-, 2,3,5-triklórfenoxi-, pentaklórfenoxi-, pentafluorfenoxi-, N-szukcinimidoxi- vagy azidcsoport, és a kapott

Z—X—Arg(A)—Val—Tyr(B)—Ile—His(E)—Pro—Y—OG IV

IV általános képletű vegyületből először az E védőcsoportot, majd a többi oldallánci és terminális védőcsoportot eltávolítjuk, és kívánt esetben az I általános képletű vegyületet savaddíciós sójává alakítjuk.

Az E védőcsoport eltávolítását ismert módon, például lúgos kezeléssel vagy tiofenollal, különösen előnyösen 2-merkaptoetanollal végzett kezeléssel és a többi oldallánci és terminális védőcsoportot katalitikus hidrogenolízissel távolítjuk el, így a többi oldallánci és terminális védőcsoport egylépésben eltávolítható. Az N-terminális α-aminooxisavból - az aminocsoportnak ammónia formájában történő lehasadása következtében — α-hidroxisavat kapunk. Az Oí-hidroxisav-csoportnak ilyen módon való kialakítása új.

A szintézishez felhasznált II általános képletű reakcióképes heptapeptid-származékokat bármely a peptidkémiában használatos módszerrel előállíthatjuk, így például a 168 431 számú magyar szabadalmi leírásban ismertetett eljárás alkalmazásával. Az eljárásban az oldalfunkciós csoportok megvédésére olyan védőcsoportokat kell használni, amelyek a kapcsolás utáni védőcsoport eltávolításakor alkalmazott acidolízis körülményei közt stabilisak.

A találmány szerinti eljárás egyik előnyös kiviteli módja szerint a C-terminális aminosav kárboxilcsoportjának átmeneti védésére a p-nitro-benzilcsoportot (NB), az arginin guanidinocsoportjának védelmére a nitrocsoportot használjuk, míg a tirozin hidroxilcsoportját benzilcsoporttal, a hisztidin imidazol-gyűrűjét pedig dinitrofenilcsoporttal (Dnp) védjük. Ezek a védőcsoportok enyhe savas körülmények közt stabilak, így. az N-terminális Boc-csoport ezek károsodása nélkül eltávolítható. Ez a védőcsoport kombináció lehetővé teszik, hogy a IV általános képletű vegyületekből először a dinitrofenilcsoportot távolítsuk el, majd egy lépésben - katalitikus hidrogenolízissel - jussunk el az I általános képletű vegyületekhez.

Az I általános képletű vegyületeket önmagában ismert módon, célszerűen karboximetilcellulózos ioncserélő kromatográfiával tisztítjuk. Ennek során a vegyületeket többnyire liofilizált porok alakjában kapjuk, amelyek alkalmasak különböző sók, illetve komplexek képzésére.

Az I általános képletű vegyületek antagonista hatását altatott hímnemű macskákon vizsgáltuk. A vérnyomás mérését a nyaki verőéren keresztül végeztük. A vizsgálatok úgy történtek, hogy az egyik oldali combvénába Hypertensin (CIBA) infúziót adtunk 05 Mg/kg/perc sebességgel. Miután a vémyomásemelkedés stabilizálódott, a kísérleti anyagokat és a Saralasin összehasonlító anyagot egyszeri dózisban intravénásán vagy szubkutan adtuk vizes fiziológiás, illetve vivőanyagot tartalmazó oldatban és mértük a vérnyomás csökkenését.

Az 1. táblázat az intravénás adagolás hatására bekövetkező artériás vérnyomáscsökkenést szemlélteti. Az adatok hat kísérlet átlagát és a középérték szórását mutatják.

1. Táblázat

Az 1-helyzetben α-hidroxísavakat tartalmazó angiotenzin-II analógok hatása a vérnyomásra, angiotenzin-II infúzió alatt

Analógok

V émyomáscsökkenés (Hgmm) 10jug/kg 20pg/kg

i. v. i. v. beadásakor (hidroxiacetil^{* 1 * * * * * *}, Leu^s)-Ang-II (hidroxiacetil¹,

Ile⁸ )-Ang-II (hidroxiacetil¹, Thr/Me)⁸-Ang-II (L-a-hidroxipropionil¹, Leu®)-Ang-II (L-a-hidroxipropionil¹, Ile⁸)-Ang-II

Saralasin

-31 ±4,7 -42 ±2,8

-24 ±1,7 -30 ±2,3

-33 ±5,3 -38 ±4,1

-32 ±3,7 -40 ±2,7

-31 ±3,3 -38 ±4,1

-41 ±2,5

A táblázat adataiból látható, hogy valamennyi

1-es helyzetben α-helyzetben hidroxilcsoportot tartalmazó alifás karbonsavgyökkel helyettesített angiotenzin-II analóg jelentős vérnyomáscsökkentő hatással bír. A hatás nagysága a dózissal arányosan változik.

Vizsgálatainkat kiterjesztettük az irodalomban nem alkalmazott szubkutan felhasználási módra is. Ez esetben a vizsgálandó anyagot tartalmazó fiziológiás konyhasóoldathoz még karboximetilcellulózt, illetve zselatint is tettünk. Az eredmények, amelyek

5—5 állaton végzett kísérletek átlagait és a középérték szórását mutatják, a 2. Táblázatban láthatók.

A táblázat adatai szerint új vegyületeink szubkután alkalmazás mellett még 60 perc múlva is szignifikánsan csökkentik a kísérletesen előidézett magas vérnyomást.

A találmány szerinti peptideket, valamint azok sóit a szokásos gyógyszerkészítmények formájában használhatjuk fel a gyógyászatban. Az ilyen gyógyszerkészítmények a találmány szerinti vegyületeket enterális vagy parenterális beadásra alkal0 más szervetlen vagy szerves vivőanyag kíséretében tartalmazzák. így a gyógyszerkészítmények lehetnek szilárd liofilizátumok, ekkor vivőanyagként peptidekkel nem reagáló vegyületek, például szénhidrátok jöhetnek számításba, lehetnek híg vagy tömény szuszpenziók és emulziók, amelyek különböző tartósító és stabilizáló segédanyagokat is tartalmaznak.*

A gyógyszerkészítmények felhasználhatók diagnosztikumként a renális hipertenziók differenciált 0 megkülönböztetésére, továbbá terápiásán is minden olyan szindrómánál, ahol a kóroki szerepet az emelt renin vérszint játsza.

A találmány szerinti eljárás foganatosítási módjait. az alábbi példák szemléltetik.

A példákban alkalmazott rövidítések a szakirodalomban használt rövidítéseknek felelnek meg [J. Bioi. Chem. 247, 977 (1972)]. Az a-aminooxisavak rövidítésére a megfelelő aminosav szimbólum elé tett O-betűt használjuk: így OGly = aminooxiecetD sav, OAla = α-aminooxipropionsav stb. Továbbá rövidítések: PFP = pentafluorfenil, Thr(Me) = treonin-O-metiléter.

A vegyületek előállítása során a bepárlásokat mindig Büchi-féle Rotavapor készülékben végeztük. 35 Az olvadáspont meghatározások dr. Tottoli-féle (Büchi) készülékben történtek. A vékonyrétegkromatogramokat Stahl szerint készített, Kieselgel G (Merek) márkanevű szilikagél rétegen készítettük. A kromatogramok kifejlesztésére a következő oldó40 szerelegyeket használtuk:

1.

2.

3.

4.

5.

6.

7.

etilacetát: (piridin-ecetsav-víz etilacetát: (piridin-ecetsav-víz etilacetát: (piridin-ecetsav-víz etilacetát: (piridinecetsav-víz n-butanol: ecetsav : víz n-butanol: ecetsav: : piridin: víz n-butanol: etilacetát: ecetsav: víz = 20-6-11):95 :5 =20-6-11):90:10 = 20-6-11):80:20 = 20-6-11):70:30 =4:1:5 = 30 : 6 :20 :24 =1:1:1:1

A vékonyrétegkromatogramok előhívására egyrészt ninhidrin-oldatot használtunk, másrészt a szokásos klórozás után o-tolidin-kálium-jodid-oldattal hívtuk elő.

A papírelektroforetikus vizsgálatokat LMIM középfeszültségű horizontális készülékben (a Labor

Műszeripari Művek Budapest, gyártmánya) végeztük

MN 214 papíron (Macheiy-Nagel Co., NSzK), pH=l^-es pufferben glutaminsav mellett. A fe65 szüitség 450 V, az idő 3 óra volt.

2. Táblázat

Az 1-es helyzetben α-hidroxisavat tartalmazó angiotenzin-Π analógok hatása a vérnyomásra angiotenzin infúzió alatt s.c. alkalmazáskor

Analógok

Dózis

Mg/kg

Oldószer

s. c.

Vérnyomáscsökkenés (Hgmm)

30 60 120 perc múlva

I1Z. so + + CMC zselatin (L-a-hidroxipropionil, Leu⁸)-Ang-II 200 (L-a-hidroxi-pfopionil,

Ile^s)-Ang-II 200

A végtermék tisztítása: 0,5 g szabad pepiidet 4 ml 0,01 n ammóniumacetát pufferben feloldunk, majd az oldatot 0,5 liter karboximetilcellulóz (CMC 52) oszlopra rétegezzük, amelyet előzőleg a fenti pufferrel egyensúlyba hoztunk. Gradiens keverővei 1,5 liter, 0,01 mólos 1,5 liter 0,4 mólos ammóniumacetát-oldatokat összekeverve gradiens elúciót alkalmazunk. Az áramlási sebesség 25 ml/óra és 10 ml-es frakciókat szedünk. Az oszlopról lejövő eluátumot LKB Uvicord—II készülék (az LKB Produkter A. B. svéd cég gyártmánya) segítségével folyamatosan regisztráljuk, majd a kapott görbe alapján a kívánt terméket tartalmazó frakciót Leybold—Heraeus Jiofilizáló készüléken (Leybold—Heraeus Inc., USA, gyártmánya) liofilizáljuk. A liofílizátum kis mintáját a tisztaság ellenőrzése céljából ugyancsak gradiens elúció segítségével újra kromatografáljuk 20 ml-es analitikai oszlopon.

1. példa (Hidroxiacetil^{* 1} ,Leu⁸ )-angiotenzin-II előállítása

1. lépés

Boc—Arg(NO₂)—Val—Tyr(Bzl)—Ile—His(Dnp)— —Pro—Leu—ONB

4,2 g (12 mmól) Leu-ONB · HBr 50 ml kloroformos oldatához hozzáadunk 1,68 ml trietilamint és 3,81 g (10 mmól) Boc—Pro—OPFP-t. A reakcióelegyet szobahőmérsékleten 20 percig keveijük, majd 30 ml vízzel és 30 ml 10%-os vizes citromsavoldattal kirázzuk, szárítjuk és a kloroformos oldatot bepároljuk. A védett dipeptidet (R| =0,8) izolálás nélkül feloldjuk 20 ml 8 n sósavas dioxánban, 10 perc múlva 60 ml száraz éténél hígítjuk, majd bepároljuk. A szabad dipeptid-klórhidrátot (R* =0,56) 50 ml kloroformban feloldjuk, az oldat pH-ját trietilaminnal 8-ra állítjuk és hozzáadunk

8,8 g (15 mmól) Boc-His(Dnp)-OPFP-t. Az oldatot 1 órán át szobahőmérsékleten keverjük úgy, hogy az oldat pH-ját állandóan 8-on tartjuk. Ezután az oldathoz 1,65 ml Ν,Ν-dimetilaminoetilamint adunk a fölös aktivészter eltávolítása céljából, majd 10 perc múlv a reakcióelegyet 25—25 ml 10%-os vizes citromsav-oldattal, n sósavval és 5%-os nátriumhidrogénkarbonát-oldattal ki-

-28 ± 3,1 -38 ± 2,4 -25 ±1,5 -5 ± 1,8

-28 ± 10,0 -28 ± 7,0 -25 + 6,0 -5 ± 7,3 rázzuk. Vízmentes nátriumszulfáttal történő szárítás után az oldatot bepároljuk. A maradék védett tripeptidet (Rf =0,65) izolálás nélkül feloldjuk 25 ml 8 n sósavas dioxánban és 15 perc múlva a szabad 20 tripeptidet R⁴ = 0,47) 100 ml száraz éter hozzáadásával kicsapjuk, szüljük. Azonnal feloldjuk 50 ml kloroform és 20 ml dimetilformamid elegyében, trietilamin hozzáadásával a pH-t 8-ra állítjuk, és hozzáadunk 6,0 g (15 mmól) Boc-Ile-OPFP-t, 30 perc 25 múlva a reakcióelegyet szárazra pároljuk, a maradékot feloldjuk 100 ml etilacetátban, és 30—30 ml vizes citromsav-oldattal, n sósavval és vízzel extraháljuk. Vízmentes nátriumszulfáttal történő szárítás után az etilacetátot bepárlással eltávolítjuk, és a 30 maradékot 100 ml éter : n-hexán =1:9 elegyével eldörzsöljük és a védett tetrapeptidet (Rj = 0,64) szűréssel izoláljuk. Ezután feloldjuk 25 ml 8 n sósavas dioxánban, és 15 perc múlva a szabad tetrapeptidet (R⁴ =0,40) 120 ml száraz éterrel kicsapjuk 35 és szüljük. A tetrapeptid-klórhidrátot 50 ml kloroform és 30 ml dimetil-formamid elegyében feloldjuk, trietilaminnal az oldat pH-ját 8-ra állítjuk, és hozzáadunk 6,0 g (11,5 mmól) Boc—Tyr(Bzl)-OPFP-t. 15 perc múlva az oldatot bepároljuk, a 40 maradékot 100 ml etilacetátban feloldjuk és hozzáadunk 0,66 ml N,N-dimetilaminoetiIamint. 10 perc múlva az etilacetátos oldatot 30—30 ml 10%-os vizes citromsav-oldattal, n sósavval és vízzel kirázzuk, vízmentes nátriumszulfáttal történő szárítás és be45 párlás után a maradékot 70 ml száraz éterrel eldörzsöljük és a védett pentapeptidet (R^{2 *}=0,8) szűréssel izoláljuk. Ezután feloldjuk 25 ml 8 n sósavas dioxánban, és 15 perc múlva a szabad pentapeptidet (R⁴ = 0,8) 100 ml száraz éterrel kicsapjuk, 50 szüljük és 30—30 ml éterrel kétszer mossuk. Azonnal feloldjuk 50 ml dimetilformamidban, a pH-t trietilaminnal 8-ra állítjuk, és hozzáadunk 4,2 g (11 mmól) Boc-Val-OPFP-t. Egy órai szobahőmérsékleten történő keverés után az oldatot bepárol55 juk, a maradékot feloldjuk 100 ml kloroformban, majd 30—30 ml 10%-os vizes citromsav-oldattal, n sósavval és vízzel kirázzuk. Vízmentes nátriumszulfáttal történő szárítás után az oldatot bepároljuk és a maradékot 100 ml éterrel eldörzsöljük és a 60 védett hexapeptidet szűréssel izoláljuk (R² = 0,82).

A védett hexapeptidet 25 ml 8 n sósavas dioxánban feloldjuk és 15 perc múlva a szabad hexapeptidet (R³ =0,55) 120 ml száraz éterrel kicsapjuk, szűrjük és 30—30 ml éterrel kétszer mossuk. Azonnal fel65 oldjuk 50 ml dimetilformamidban, trietilaminnal a pH-t 8-ra állítjuk és hozzáadunk 4,8 g (10 mmól) Boc—Arg(NO₂)—OPFP-t. 30 perc után az oldószert elpárologtatjuk, a maradékot 100 ml kloroformban oldjuk és az oldatot 30 ml n sósavval, majd 30 ml vízzel kirázzuk. Vízmentes nátriumszulfáttal történő szárítás és bepárlás után a maradékot 100 ml etanollal eldörzsöljük és szűréssel izoláljuk a védett heptapeptidet (R² =0,8). Termelés 7,6 g (53% a kiindulási Boc—Pro—OPFP-re számítva). Op.: 192-195 °C.

aminsavhoz viszonyított elektroforézises mozgékonyság, pH = 1,9) = 0,98. Aminosav-analízis . Pro: 1,0 (1), Val: 1,01 (1), Ile: 1,02 (1), Arg: 1,01 (1), His: 1,0 (1), Leu: 1,02 (1), Tyr: 0,73 (1).

2. példa (L-a-hidroxipropionil¹, Leu^s)-angiotenzin-II előállítása

2. lépés

Z—OGly—Arg(NO₂)—Val—Tyr(Bzl)—Ile—His(Dnp)— —Pro—Leu—ONB l,8g (1,25 mmól) Boc-Arg(NO₂)-Val-Tyr(Bzl)—Ile—His(Dnp)—Pro—Leu—ONB-t 10 ml .8 n sósavas dioxánban feloldunk és 15 perc múlva a szabad heptapeptid-klórhidrátot 50 ml száraz éterrel kicsapjuk, szüljük 20 ml száraz éterrel mossuk (R^{3 * * * *} = 0,36). Azonnal feloldjuk 20 ml dimetilformamidban, trietilaminnal a pH-t 8-ra állítjuk, és hozzáadunk 0,9 g (2,3 mmól) Z—OGly-OPFP-t, 15 perc múlva az oldószert elpárologtatjuk, a maradékot 50 ml kloroformban oldjuk, az oldatot 20 ml n sósavval, majd 20 ml vízzel kirázzuk. Vízmentes nátriumszulfáttal történő szárítás és bepárlás után a maradékot 50 ml etanol: éter = 2:8 eleggyel eldörzsöljük és szűréssel izoláljuk. Termelés: 1,6 g (85%). Op.: 165-174 °C. R² =0,80..

1. lépés

Z—OAla—Arg(NOg)—Val—Tyr(Bzl)—Ile—His(Dnp)— -Pro—Leu—ONB

1,8 g (125 mmól) Boc—Arg(NO₂)—Val—Tyr(Bzl)-Ile—His(Dnp)-Pro— Leu—ONB-t lásd 1. példa 1. lépés, 8 ml 8 n sósavas dioxánban feloldunk, majd a szabad heptapeptidet 80 ml száraz éterrel kicsapjuk, szüljük és 30 ml száraz éterrel mossuk (Rf =0,36). Azonnal feloldjuk 20 ml dimetilformamidban, trietilaminnal a pH-t 8-ra állítjuk és hozzáadunk 0,93 g (2,3 mmól) Z—OÁla—OPFP-t. 15 perc múlva az oldószert elpárologtatjuk, a maradékot 50 ml kloroformban oldjuk és az oldatot 20 ml n sósavval és 20 ml vízzel kirázzuk. Vízmentes nátriumszulfáttal történő szárítás és bepárlás után a maradékot 50 ml etanol-éter = 4:1 eleggyel eldörzsöljük és szűréssel izoláljuk az anyagot. Termelés: 1,75 g (93%). Op.: 164-172 °C, Rf =0,85.

3. lépés

A védő csoportok eltávolítása

1,6 g (1,0 mmól) Z-OGly—Arg(NO₂)-Val—Tyr- ( B z 1)—Ile—His(Dnp)—Pro—Leu—ONB-t feloldunk ml dimetilformamidban és hozzáadunk 3,5 ml

2-merkaptoetanolt. Az oldatot 1 órán át szobahőmérsékleten keverjük, majd 100 ml száraz éter hozzáadása után a kivált anyagot szűrjük, 10—10 ml éterrel kétszer mossuk, majd metanolban oldva éterrel történő lecsapással tisztítjuk. A kapott Z—OGly—Arg(NO₂)—Val—Tyr(Bzl)—Ile—His—Pro-Leu-ONB súlya: 1,3 g (95%). Rf=0,2. Ezt a pepiidet 30 ml metanol: ecetsav : víz = 5 :1:1 elegyben feloldjuk, hozzáadunk 0,5 g 10%-os csontszenes palládiumot, és intenzív keverés közben 20 órán át hidrogén gázt buborékoltatunk át az elegyen. A reakció előrehaladtát vékonyrétegkromatográflásan ellenőrizzük. A reakció befejeztével a katalizátort kiszűijük, 20 ml metanol: ecetsav : víz = 5:1:1 eleggyel mossuk és az oldatot szárazra pároljuk. A maradékot az ecetsav eltávolítása céljából etanol—víz eleggyel többször bepároljuk. A pepiidet ezután 50 ml száraz etanollal eldörzsöljük és szűréssel izoláljuk, szűrjük. Termelés: 0,8 g (67%) hidroxiacetil¹ ,jLeu⁸)-angiotenzin-II, amelyfiek a tisztítását az előzőekben megadott módon végezzük. Rf =0,41, Rf=0^9, Rj=0,60, E_Gi_u (glut-

2. lépés

A védőcsoportok eltávolítása

1,6 g Z—OAla—Arg(NO₂)~Val—Tyr(Bzl)—Ile—His(Dnp)—Pro—Leu—ONB-t 5 ml dimetilformamidban feloldunk, hozzáadunk 3,5 ml 2-merkaptoetanolt és 1 órai szobahőmérsékleten történő keverés után az anyagot 120 ml száraz éterrel kicsapjuk, szüljük, metanolban oldjuk és éténél ismét kicsapjuk. Termelés 1,3 g (92%) Z-OAla—Arg(NO₂ )-Val—Tyr(Bzl)—Ile—His—Pro—Leu—ONB. Rf = 0,27. Ezt a pepiidet 30 ml metanol: ecetsav : víz = 5:1:1 elegyben feloldjuk, hozzáadunk 0,5 g 10%-os csontszenes palládium katalizátort és intenzív keverés közben 20 órán át hidrogén gázt buborékoltatunk át az elegyen. Kromatográfiás ellenőrzés után a katalizátort kiszűijük, mossuk és az oldatot szárazra pároljuk, azután 100 ml etanol: víz = 9 :1 elegyet adunk a maradékhoz, újból szárazra pároljuk, majd ezt a műveletet 100—100 ml vízzel még kétszer megismételjük. A maradékot 50 ml száraz etanollal eldörzsöljük és leszűrjük, így 0,65 g (L-a-hidroxipropionil¹-Leu⁸)-angiotenzin-II-t (70%) kapunk. Tisztítását az előzőekben megadott módon végezzük. Rf=0,36, Rf=0,57, R?=0,60, E_Gi_u(pH = 1.9) = 0,97. Aminosav-analízis: Pro: 0,98 (1),

Val: 1,0 (1), Ile: 1,1 (1), Arg: 1,0 (1), His: 098 (1), Leu: 098 (1), Tyr: 0,56 (1).

3. példa (Hidroxiacetil¹, Ile^s)-angiotenzin-II előállítása

1. lépés

Boc-Arg(N0₂)-Val-Tyr(Bzl)-Ile-His(Dnp)—Pro—He—ONB

4,15 g (15 mmól) Ile-ONB · HC1 50 ml kloroformos oldatához hozzáadunk 2,1 ml trietilamint és 3,81 g (10 mmól) Boc-Pro-OPFP-t. A reakcióelegyet szobahőmérsékleten 20 percen át keverjük, ezután 30 ml vízzel, majd 30 ml 10%-os vizes citromsav-oldattal kirázzuk, vízmentes nátriumszulfáttal szárítjuk és bepároljuk. A védett dipeptidet (R| =0,9) izolálás nélkül 20 ml 8 n sósavas dioxánban feloldjuk, majd 10 perc múlva a reakcióelegyet 60 ml száraz éterrel hígítjuk és bepároljuk. A szabad dipeptid-hidrokloridot (R* = 0,44) 30 ml kloroformban feloldjuk, trietilaminnal a pH-t 8-ra állítjuk, és hozzáadunk 8,8 g (15 mmól) Boc—His(Dnp)-OPFP-t. Másfél óra múlva a reakcióelegyhez 1,65 ml Ν,Ν-dimetilaminoetilamint adunk, 15 perc múlva 20—20 ml 10%-os vizes citromsav-oldattal, n sósavval és vízzel kirázzuk, vízmentes nátriumszulfáttal szárítjuk, majd bepároljuk. A védett tripeptidet (R| =0,50) izolálás nélkül 20 ml 8 n sósavas dioxáriban feloldjuk, 15 perc múlva a szabad tripeptidet R* = 0(25 (120 ml száraz éterrel kicsapjuk, szüljük és 30—30 ml száraz éterrel kétszer mossuk. Azonnal feloldjuk 50 ml kloroform és 20 ml dimetilformamid elegyében, trietil-aminnal a pH-t 8-ra állítjuk, és hozzáadunk 6,0 g (15 mmól) Boc-Ile—OPFP-t, 30 perc múlva az oldószert elpárologtatjuk, a maradékot 100 ml etilacetátban oldjuk, majd az oldatot 30—30 ml 10%-os vizes citromsav-oldattal, n sósavval és vízzel kirázzuk. Vízmentes nátriumszulfáttal történő szárítás és bepárlás után a védett tetrapeptidet 100 ml n-hexán : éter = 9:1 eleggyel eldörzsöljük és szűréssel izoláljuk. Ezután a védett tetrapeptidet (R² = 0,65) 25 ml 8 n sósavas dioxánban feloldjuk, 30 perc után a szabad tetrapeptidet (Ry =0,41) 120 ml száraz éter hozzáadásával kicsapjuk, szűrjük és 30-30 ml éterrel kétszer mossuk. Azonnal feloldjuk 70 ml dimetilformamid•kloroform = 1:1 elegyben, trietilaminnal a pH-t 8-ra állítjuk, és hozzáadunk 6,0 g (11,5 mmól) Boc—Tyr(Bzl)-OPFP-t. 15 perc múlva az oldószert elpárologtatjuk, a maradékot 100 ml etilacetátban oldjuk és 0,66 ml Ν,Ν-dimetilaminoetilamint adunk hozzá. 15 perc múlva 30—30 ml 10%-os vizes citromsav-oldattal, n sósavval és vízzel kirázzuk, majd vízmentes nátriumszulfáttal történő szárítás és bepárlás után a védett pentapeptidet (R² = 0,59) 100 ml száraz éter .hozzáadásával szilárdítjuk és szűréssel izoláljuk. Ezután 20 ml 8 n sósavas dioxánban feloldjuk, és 15 perc múlva a szabad pentapeptid-hidrokloridot (Rf =0,4) 120 ml száraz éter hozzáadásával kicsapjuk, szűrjük, 20 ml száraz éterrel mossuk. Azonnal feloldjuk 50 ml dimetilformamidban, trietilaminnal a pH-t 8-ra állítjuk, és hozzáadunk 4,62 g (12 mmól) Boc-Val-OPFP-t. Egy óra múlva az oldószert elpárologtatjuk, a maradé kot 100 ml kloroformban oldjuk és az oldatot 30-30 ml 10%-os vizes citromsav-oldattal, n sósavval és vízzel kirázzuk. Vízmentes nátriumszulfáttal történő szárítás és bepárlás után a maradékot 100 ml száraz éterrel eldörzsöljük és szűréssel izoláljuk a védett hexapeptidet (R^=0,56). Ezután 20 ml 8 n sósavas dioxánban feloldjuk és 15 perc múlva a szabad hexapeptidet (Rf = 0,47) 1 2 0 ml száraz éter hozzáadásával kicsapjuk, szüljük, 20 ml száraz éterrel mossuk. Azonnal feloldjuk 50 ml dimetilformamidban, trietilaminnal a pH-t 8-ra állítjuk és hozzáadunk 5,38 g (12 mmól) Boc— —Arg(N0₂)—OPFP-t. 30 perc múlva az oldószert elpárologtatjuk, a maradékot 100.ml kloroformban oldjuk és az oldatot 40 ml n sósavval, majd 40 ml vízzel kirázzuk. Vízmentes nátriumszulfáttal történő szárítás és bepárlás után a védett heptapeptidet 100 ml etanollal szilárdítjuk és szűréssel izoláljuk. Termelés 9,7 g (68%) a kiindulási Boc-Pro-OPFP-re számítva (R² = 0,67).

2. lépés

Z—OGly—Arg(NO₂)—Val—Tyr(Bzl)—Ile—His(Dnp)— —Pro—Ile—ONB

1,6 g (1,1 mmól) Boc-Arg(NO₂)-Val-Tyr(Bzl)—Ile—His(Dnp)—Pro—Ile—ONB-t 8 ml 8n sósavas dioxánban feloldunk és 15 perc múlva a szabad heptapeptid-hidrokloridot (Rf=0,45) 50 ml száraz éter hozzáadásával kicsapjuk, szüljük, 20 ml száraz éterrel mossuk. Azonnal feloldjuk 10 ml dimetilformamidban, trietilaminnal a pH-t 8-ra állítjuk és hozzáadunk 0,6 g (1,5 mmól) Z—OGly—OPFP-t. 30 perc múlva az. oldószert elpárologtatjuk, a maradékot 50 ml kloroformban oldjuk és az oldatot 30 ml n sósavval, majd 30 ml vízzel kirázzuk. Vízmentes nátriumszulfáttal történő szárítás és bepárlás után 50 ml száraz éterrel szilárdítjuk és szűréssel izoláljuk a védett peptidet. Termelés:

1,45 g (85%), op.: 151-158 °C, Rf =0,68.

3. lépés

A védőcsoportok eltávolítása

1,45 g (0,94 mmól) Z-OGly-Arg(NO₂)-Val-Tyr(Bzl)-Ile-His(Dnp)-Pro-Ile-ONB-t 5 ml dimetilformamidban feloldunk, hozzáadunk 3,5 ml

2-merkaptoetanolt és 1 órai keverés után a Z-OGly-Arg(NO₂ )-Val-Tyr(Bzl)-Ile-His—Pro—Ile—ONB-t 150 ml száraz éter hozzáadásával lecsapjuk. A csapadékot 20 ml metanolban oldjuk és 60 ml éterrel újból lecsapjuk. így 1,05 g (82%) peptidet kapunk (R| = 0,10). Ezt az anyagot 30 ml metanol: ecetsav : víz = 5 :1 :1 elegyében oldjuk, hozzáadunk 0,5 g 10%-os csontszenes palládium katalizátort, és erőteljes keverés közben 21 órán át hidrogén gázt buborékoltatunk át az elegyen. A reakció előrehaladtát vékonyrétegkromatográfiásan ellenőrizzük. A katalizátor kiszűrése után az oldatot szárazra párosuk, és a szabad peptidet 50 ml száraz etanollal eldörzsöljük és szűréssel izoláljuk. így 0,48 g (64,5%) (hidroxiacetil¹, Ile⁸)-angiotenzin-II-t kapunk, amelyet a megadott módon tisztítunk. Rf =0,29, Rf =0,57, Rf =0,58. EgiuCpH = 1,9) = 1,03. Aminosav-analízis: Pro: 0,99 (1), Val: 1,15 (1), Ile: 2,06 (2), Tyr: 0,74 (1), His: 0,98 (1), Arg: 0,95.

4. példa (L-a-hidroxipropionil¹ ,Ile^s )-angiotenzin-II előállítása

1. lépés

Z-OAla-Arg(NO₂)-Val-Tyr(Bzl)-Ile—His(Dnp)— —Pro—Ile—ONB

1,6 g (1,1 mmól) Boc-Arg(NO₂ )-Val-Tyr(Bzl)—Ile—His(Dnp)-Pro—Ile—ONB-t 8 ml 8 n sósavas dioxánban feloldunk és 15 perc múlva a szabad heptapeptidet (Rf =0,45) száraz éter hozzáadásával kicsapjuk, szüljük, 15—15 ml éterrel kétszer mossuk. Azonnal feloldjuk 10 ml dimetilformamidban, trietilaminnal a pH-t 8-ra állítjuk és hozzáadunk 0,61 g (15 mmól) Z-OAla-OPFP-t. 30 perc után az oldószert elpárologtatjuk, a maradékot 30 ml kloroformban oldjuk és az oldatot 15 ml n sósavval, majd 15 ml vízzel kirázzuk. Vízmentes nátriumszulfáttal történő szárítás és bepárlás után a védett pepiidet R² = 0,63/50 ml éter segítségével szilárdítjuk és szűréssel izoláljuk. Termelés: 1,4 g (82%). Op.: 164-168 °C.

A védőcsoportok eltávolítása

1,4 g (0,9 mmól) Z-OAla-Arg(NO₂)-Val-Tyr(Bzl)—Ile—His(Dnp)—Pro—Ile—ONB-t 5 ml dimetilformamidban feloldunk, és hozzáadunk 3,5 ml 2-merkaptoetanolt. Egy óra múlva az anyagot 100 ml éter hozzáadásával kicsapjuk, majd tisztítás céljából 20 ml metanolban oldjuk és 60 ml éterrel újból kicsapjuk. így 0,8 g (65%) Z—OAla-Arg- 50 (NO₂ )-VaI-Tyr(Bzl)—Ile—His-Pro—Ile—ONB-t kapunk. R² =0,13, R⁸ =0,27. Ezt a védett pepiidet feloldjuk 10 ml metanol: ecetsav: víz = 5:1:1 elegyben, hozzáadunk 0,5 g 10%-os csontszenes palládium katalizátort, és keverés közben 16 órán át 55 hidrogén gázt buborékoltatunk át az elegyen. A reakció befejeztével a katalizátort kiszűrjük, az oldatot bepároljuk, és az anyagot 30 ml vízmentes etanollal eldörzsöljük és szűréssel izoláljuk. így 0,4 g (0,65) (L-a-hidroxipropionil¹-Ile⁸ )-angioten- 60 zin-II-t kapunk, amelyet a megadott módon tisztítunk. Rf=0,30, Rf=O,58, R? =0,58, E_Glu(pH = 1,9)= 1,07, Aminosav-analízis: Pro: 1,04 (1), Val: 0,98 (1), Ile: 1,98 (2), Tyr: 0,98 (1), His: 1,05 (1), Arg: 1,0 (1). 65

5. példa (Hidroxiacetil¹, Ala⁸)-angiotenzin-II előállítása

1. lépés

Boc—Arg(NO₃ )—Val—Tyr(Bzl)—Ile—His(Dnp)— ₁₀ -Pro—Alá—ONB

1,21 g (4 mmól) Ala-ONB · HBr 15 ml kloroformos oldatához hozzáadunk 0,56 ml trietilamint és 0,76 g (2 mmól) Boc—Pro—OPFP-t. 20 perces szobahőmérsékleten történő keverés után az oldatot 10 ml vízzel és 10 ml 10%-os vizes citromsav-oldattal kirázzuk, vízmentes nátriumszulfáttal szárítjuk és bepároljuk. A védett dipeptidet (R| = 0,64) izolálás nélkül 4 ml 8 n sósavas dioxán₂₀ bán feloldjuk, 10 perc múlva az oldatot 20 ml éterrel hígítjuk, majd bepároljuk. A szabad dipeptidhidrokloridot (Rf =0,65) 15 ml kloroformban feloldjuk, trietilaminnal a pH-t 8-ra állítjuk, és hozzáadunk 1,76 g (3 mmól) Boc—His(Dnp)—OPFT-t. ₂₅ 30 perc után az oldathoz 0,44 ml N,N-dimetilaminoetilamint adunk, és 5 perc múlva 10—10 ml 10%-os vizes citromsav-oldattal, n sósavval és 5%-os nátriumhidrogénkarbonát-oldattal kirázzuk. Vízmentes nátriumszulfáttal történő szárítás és bepárlás után a védett tripeptidet (R² = 0,57) izolálás nélkül 4 ml 8 n sósavas dioxánban feloldjuk, és a szabad tripeptidet (Rf = 0,28) 10 perc múlva 50 ml száraz éter hozzáadásával kicsapjuk, szüljük és 10 ml éterrel mossuk. Azonnal feloldjuk 20 ml kloroform : dimetilformamid =1:1 elegyében, trietilaminnal a ³⁵ ρΗ-t 8-ra állítjuk és hozzáadunk l,58g (4 mmól) Boc-Ile—OPFP-t. 20 perc múlva az oldószert elpárologtatjuk, a maradékot 30 ml etilacetátban oldjuk, majd az oldatot 15—15 ml 10%-os vizes cítromsav-oldattal és vízzel kirázzuk. Vízmentes nátriumszulfáttal történő szárítás és bepárlás után a védett tetrapeptidet (Rf = 0,57) 30 ml éter: n-hexán = 1:1 eleggyel eldörzsöljük és szűrjük. Ezután 4 ml 8 n sósavas dioxánban feloldjuk és 15 perc múlva a szabad tetrapeptidet (Rf = 0,38) 50 ml száraz éterrel kicsapjuk, szüljük, mossuk. Azonnal feloldjuk 15 ml kloroform : dimetilformamid = 2:1 elegyben, trietilaminnal a pH-t 8-ra állítjuk és hozzáadunk 1,66 g (3 mmól) Boc-Tyr(Bzl)-OPFP-t. 15 perc múlva az oldószert elpárologtatjuk a maradékot 40 ml etilacetátban oldjuk, hozzáadunk 0,22 ml Ν,Ν-dimetilaminoetilamint, majd 5 perc elteltével 20—20 ml 10%-os citromsav-oldattal, n sósavval és vízzel kirázzuk. Vízmentes nátriumszulfáttal történő szárítás és bepárlás után a védett pentapeptidet (R? = 0,60) 30 ml éterrel eldörzsöljük, szüljük és 10 ml éténél mossuk. Ezután feloldjuk 4 ml 8 n sósavas dioxánban, 10 perc múlva a szabad pentapeptidet (Rf = 0,62) 30 ml éterrel kicsapjuk, szűrjük, 10 ml száraz éterrel mossuk. Azonnal feloldjuk 20 ml kloroform : dimetilformamid = 1:1 elegyében, trietilaminnal a pH-t 8-ra állítjuk, és hozzáadunk 1,6 g (4 mmól) Boc—Val-OPFP-t. 20 perc múlva az oldószert elpárologtatjuk, a maradékot 40 ml etilacetátban oldjuk, az oldatot 20 ml vízzel és 20 ml 10%-os vizes citromsav

IS

-oldattal kirázzuk. Vízmentes nátriumszulfattal történő szárítás és bepárlás után a védett hexapeptidet (R² =0,65) éterrel szilárdítjuk, szűrjük, 10 ml éterrel mossuk. Ezután 8 ml 8 n sósavas dioxánban feloldjuk és 20 perc elteltével a szabad liexapeptidet (R⁴ = 0,65) 50 ml száraz éter hozzáadásával kicsapjuk, szűrjük és 20 ml éterrel mossuk. Azonnal feloldjuk 20 ml dimetilformamidban, trietilaminnal a pH-t 8-ra állítjuk, és hozzáadunk 2,9 g (6 mmól) Boc-Arg(NO₂)-OPFP-t. 20 perc múlva az oldószert elpárologtatjuk, a maradékot 40 ml kloroformban oldjuk, majd az oldatot 20 ml 10%-os vizes citromsav-oldattal és 20 ml vízzel kirázzuk. Vízmentes nátriumszulfáttal történő szárítás és bepárlás után a maradékot 30 ml etilacetát: éter = 1:2 eleggyel eldörzsöljük, szűrjük és 10ml ugyanilyen eleggyel mossuk. Az így kapott védett heptapeptid súlva: 2,0 g (72%), op.: 185—187 °C. R² = 0,70.

2. lépés

Z-OGIy—Arg(NO₂)-Val—Tyr(Bzl)—He—His(Dnp)-Pro-Ala-ONB

1,35 g (1 mmól) Boc—Arg(NO₂ )-Bal—Tyr(Bzl)—Ile—His(Dnp)-Pro—Alá—ONB-t oldunk 4 ml 8n sósavas dioxánban, 15 perc múlva a szabad heptapeptid-hidrokloridot (R⁴=0,63) száraz éterrel kicsapjuk, szűrjük és éterrel mossuk. Azonnal feloldjuk 15 ml dimetilformamidban, a pH-t trietilaminnal 8-ra állítjuk és hozzáadunk 0,96 g (2,5 mmól) Z-OGly-OPFP-t. 20 perc múlva az oldószert elpárologtatjuk, a maradékot 30 ml kloroformban oldjuk és az oldatot 20 ml vízzel kirázzuk. Vízmentes nátriumszulfáttal történő szárítás és bepárlás után a védett peptidet 20 ml etanollal eldörzsöljük, leszűrjük és 10 ml etanollal mossuk. Termelés: 1,16 g (83%), op.: 133-135 °C, R² =0,72.

3. lépés

A védöcsoportok eltávolítása

1,5 g (1 mmól) Z-0Gly-Arg(NO₂)-Val-Tyr(Bzl)—Ile—His(Dnp)—Pro—Alá—ONB-t 5 ml dimetilformamidban feloldunk, hozzáadunk 2,95 ml 2-merkaptoetanolt, majd 1 óra múlva 100 ml száraz éterrel az anyagot kicsapjuk, szűrjük és 20 ml etanollal mossuk, igy 1,1 g (82%) Z-OGly-Arg(N O₂ )-V al-Ty r(Bzl)-Ile-His-Pro-Ala-ONB-t nyerünk. R² =0,15, R³ =0,40. Ezt a védett peptidet 15 ml metanol: ecetsav : víz = 5 :1 :1 elegyben oldjuk, hozzáadunk 0,5 g 10%-os csontszenes palládiumot, és keverés közben 24 órán át hidrogén gázt buborékoltatunk át az elegyen. A reakció végét vékonyrétegkromatográfíásan ellenőrizzük. Ekkor a katalizátort kiszűrjük, 15 ml metanol: ecetsav : víz = 5 :1 :1 eleggyel mossuk, az oldatot szárazra pároljuk. A maradékhoz 100 ml etanol: víz = 9:1 elegyet adunk, újból szárazra pároljuk, majd ezt a műveletet 100-100 ml vízzel még kétszer megismételjük. A maradékot 20 ml száraz etanollal eldörzsöljük és szűréssel izoláljuk a termé ket. így 0,55 g (80%) hidroxiacetil¹, Alá⁸ )-angiotenzin-II-höz jutunk, amelyet a fentiekben megadott módon tisztítunk. R| =0,28, R® =0,48, Rj =0,50, E_Giu(pH-l,9)= 1,0, Aminosav-analízis: Pro: 0,95 (1), Alá: 1,1 (1), Val: 1,0 (1), Ile: 1,0 (1), His: 1,0 (1), Arg: 1,0 (1), Tyr: 0,9 (1).

6. példa (Hidroxiacetil¹, Thr/Me/⁸ )-angiotenzin-II előállítása

1. lépés

Boc-Arg(NO₂)-Val-Tyr(Bzl)-Ile-His(Dnp)—Pro—Thr(Me)-OMe

0,69 g (3 mmól) Thr(Me)-0Me · HBr-t 30 ml kloroformban feloldunk, hozzáadunk 0,42 ml trietilamint és 1,7 g (4.5 mmól) Boc—Pro—OPFP-t. 2 óra múlva az oldathoz hozzáadunk 0,33 ml Ν,Ν-dimeiilaminoetilamint, majd 15 perc múlva az oldószert elpárologtatjuk, a maradékot 30 ml etilacetátban oldjuk, majd az oldatot 10—l^rnl 10%-os vizes citromsav-oldattal, n sósavval, vízzel es 5%-os nátriumhidrogénkarbonát-oldattal kirázzuk. Vízmentes nátriumszulfáttal történő szárítás és bepárlás után a védett dipeptidet (R/ =0,76) izolálás nélkül 2 ml 8 n sósavas dioxánban feloldjuk, majd 15 perc múlva az oldatot 20 ml éterrel hígítjuk és be pároljuk. A maradék szabad dipeptidet (Rf =0,18) 20 ml kloroformban feloldjuk, trietilaminnal a pH-t 8-ra állítjuk, és hozzáadunk 2,6 g (4,5 mmól) Boc—His(Dnp)-OPFP-t. Két órai szobahőmérsékleten történő keverés után az oldathoz 0,22 ml Ν,Ν-dimetilaminoetilamint adunk, majd 15 perc múlva 10—10 ml 10%-os vizes citromsav-oldattal, n sósavval és vízzel kirázzuk. Vízmentes nátriumszulfáttal történő szárítás és bepárlás után a szabad tripeptidet (R| = 0,5) izolálás nélkül 4 ml 8 n sósavas dioxánban oldjuk, és 15 perc múlva a szabad tripeptidet (R³ = 0,3) 30 ml száraz éterrel kicsapjuk, szűrjük és 10 ml éterrel mossuk. Azonnal feloldjuk 20 ml kloroform : dimetilformamid = 1:1 elegyében, trietilaminnal a pH-t 8-ra állítjuk, és hozzáadunk 1,6 g (4 mmól) Boc-Ile—OPFP-t. 30 perc után az oldószert elpárologtatjuk, a maradékot 30 ml etilacetátban oldjuk, majd 15—15 ml 10%-os vizes citromsav-oldattal, n sósavval és vízzel kirázzuk. Szárítás és bepárlás után· 30 ml éter : n-hexán = 1:9 eleggyel eldörzsöljük, leszűrjük és 10 ml ugyanilyen eleggyel mossuk, a védett tetiapeptidet (R² = 0,64). Ezt 7 ml 8 n sósavas dioxánban feloldjuk és 15 perc múlva a szabad tetrapeptidet (Rf = 0,27) 50 ml száraz éterrel kicsapva leszűijük. Azonnal feloldjuk 20 ml kloroform : dimetilformamid = 1:1 elegyben, trietúaminnal a pH-t 8-ra állítjuk, és hozzáadunk 1,6 g (3 mmól) Boc—Tyr(Bzl)—OPFP-t. 30 perc múlva az oldószert elpárologtatjuk, a maradékot 30 ml etilacetátban oldjuk és 0,22 ml NJ9-dimetilaminoetilamint adunk az oldathoz. 15 perc múlva az oldatot 10-10 ml 10%-os vizes citromsavoldattal, n’sósavval és vízzel kirázzuk, vízmentes nátriumszulfáttal szárítjuk, majd bepárlás után a védett pentapeptidet (R² = 0,63) éterrel eldörzsöljük és szűréssel izoláljuk. Súlya: 0,4 g. Ezt 1 ml 8 n sósavas dioxán ban feloldjuk, 15 perc múlva a szabad pentapeptidet (Rf = 0,47) 30 ml száraz éter hozzáadásával ki- 5 csapjuk, szüljük és 10 ml éterrel mossuk. Azonnal feloldjuk 10 ml dimetilformamidban, az oldat pHját trietilaminnal 8-ra állítjuk és hozzáadunk 0,4 g (1 mmól) Boc—Val—OPFP-t. Egy óra múlva az oldószert elpárologtatjuk, a maradékot 20 ml 10 kloroformban oldjuk, majd az oldatot 10—10 ml 10%-os vizes citromsav-oldattal, n sósavval és vízzel kirázzuk. Vízmentes nátriumszulfáttal történő szárítás és bepárlás után a védett hexapeptidet (Rf = 0,65) 30 ml éterrel eldörzsöljük és szűréssel 15 izoláljuk. Ezután 1,5 ml 8 n sósavas dioxánban feloldjuk, és 15 perc múlva a szabad hexapeptidet (Rf = 0,48) 30 ml száraz éterrel kicsapjuk, szűrjük és 10 ml éterrel mossuk. Azonnal feloldjuk 10 ml dimetilformamidban, trietilaminnal a pH-t . 8-ra 20 állíljuk, és hozzáadunk 0,45 g (1 mmól) Boc—Arg(NO₂)—OPFP-t. Egy óra múlva az oldószert elpárologtatjuk, a maradékot 30 ml etilacetátban oldjuk, majd az oldatot 10—10 ml 10%-os vizes citromsav-oldattal, n sósavval és vízzel kirázzuk. Vízmentes 25 nátriumszulfáttal történő szárítás és bepárlás után a maradékot 20 ml éter : etanol = 9:1 eleggyel eldörzsöljük és leszűgük. így 0,45 g (11,3%) védett heptapeptidet kapunk. Rf = 0,38, op.: 199-203 °C (bomlás közben). 3θ

2. lépés

Z—OGly—Arg(NO₂ )—Val—Tyr(Bzl)—Ile—His(Dnp)— 35 -Pro-Thr(Me)—OMe

0,45 g (0,34 mmól) Boc—Arg(NO₂ )-Val—Tyr(Bzl)—Ile—His(Dnp)—Pro—Thr(Me)—OMe-t 2 ml 8 n sósavas dioxánban feloldunk, 15 perc múlva a sza- 40 bad heptapeptidet (Rf = 0,35) száraz éter hozzáadásával izoláljuk. Azonnal feloldjuk 10 ml dimetilformamidban, trietilaminnal a pH-t 8-ra állítjuk és hozzáadunk 0,4 g (1 mmól) Z—OGly—OPFP-t. Egy óra múlva a reakcióelegyet 30 ml kloroformmal 45 hígítjuk és 20 ml vízzel kirázzuk. Vízmentes nátriumszulfáttal történő szántás és bepárlás után a védett pepiidet 20 ml éter : etanol = 9:1 eleggyel eldörzsöljük és szűréssel izoláljuk. Termelés: 0,45 g (93%), op.: 158-162 °C, R_f = 0,44. 50

3. lépés

A védőcsoportok eltávolítása

0,45 g (0,31 mmól) Z—OGly-Arg(NO2)—Val—Tyr(Bzl)—Ile—His(Dnp)—Pro—Thr(Me)—OMe-t

1,5 ml dimetilformamidban feloldunk, és hozzáadunk 1 ml 2-merkaptoetanolt. Egy óra múlva az anyagot 60 ml száraz éter hozzáadásával kicsapjuk, öc 20 ml metanolban oldjuk, kevés csontszénnel derítjük, majd bepároljuk. A maradékot 30 ml éterrel eldörzsöljük és szüljük. A kapott Z—OGly-Arg(NO₂ )—Val—Tyr(Bzl)—Ile—His—Pro—Thr(Me)—OMe súlya: 0,38 g (98%), R| =0,16, Rf =0,52. Ezt az 65 anyagot 5 ml dioxánban szuszpendáljuk és hozzáadunk 1,2 ml n nátriumhidroxid-oldatot. Egy óra múlva az oldat pH-ját n sósavval 3-ra állítjuk, az oldószert elpárologtatjuk és a kivált csapadékot 20 ml kloroform : dimetilformamid = 3:1 eleggyel extraháljuk. Vízmentes nátriumszulfáttal történő szárítás és bepárlás után a C-terminálison szabad pepiidet 20 ml éterrel eldörzsöljük és szűréssel izoláljuk. Súlya: 0,26 g (70%), Rf =0,25. Ezután az anyagot 10 ml metanol: ecetsav : víz = 5 : 1 :1 elegyben feloldjuk, hozzáadunk 0,1 g 10%-os csontszenes palládiumot, és keverés közben 16 órán át hidrogén gázt buborékoltatunk át az elegyen. Vékonyrétegkromatográfiás ellenőrzés után a katalizátort kiszűijük, és az oldatot szárazra pároljuk. 50 ml etanol: víz = 9 : 1 elegyet adunk a maradékhoz, újból szárazra pároljuk, majd ezt a műveletet 50—50 ml vízzel még kétszer megismételjük. így 0,16 g (80%) [hidroxiacetil¹, Thr(Me)]-angiotenzin-II-t kapunk, amelyet a fentiekben megadott módon tisztítunk. R® =0,22, R® = 0,53, Rf =0,50, Egiu(pH = 1,9) = 0,98, aminosav-analízis: Thr: 0,6 (1), Pro: 1,0 (1), Val: 1,0 (1), Ile: 1,02 (1), Tyr: 0,85 (1), His: 1,0 (1), Arg: 0,96 (1).

7. példa (Hidroxiacetil¹, Ile⁸ )-angiotenzin-II-diacetát előállítása

100 mg (hidroxiacetil¹, Ile⁸ )-angiotenzin-II oktapeptidet — amelyet a 3. példában leírt módon állítottunk elő — 20 ml 0,5 mólos vizes ecetsavoldatban oldunk és az oldatot liofilizáljuk. Ily módon az oktapeptid diacetát-sóját kapjuk, amelyben a peptidtartalom az ibolyántúli spektrum alapján meghatározva 88,5%, op.: 232—236 °C.

Claims

1. Eljárás az

X—Arg—Val—Tyr—Ile—His—Pro—Y I

I általános képletű peptidek — e képletben az aminosavak L-konfigurációjúak,

X valamely, α-helyzetben hidroxilcsoportot tartalmazó 2—5 szénatomos alkánkarbonsav gyökét, előnyösen hidroxiacetil- vagy 1-a-hidroxipropionilcsoportot és

Y L-leucil-, L-izoleucil-, L-alanil- vagy L-O-metil-treonil-csoportot jelent — valamint azok savaddíciós sóik előállítására, azzal jellemezve, hogy valamely

H—Arg(A)—Val—Tyr(B)—Ile-His(E)—Pro—Y—OG II

II általános képletű reakcióképes heptapeptid-származékot, ahol

A jelentése az Arg guanidincsoportjának átmeneti megvédésére alkalmas, előnyösen nitro- vagy tozilcsoport,

B jelentése a Tyr aromás hidroxilcsoportjának átmeneti megvédésére alkalmas csoport, előnyösen benzil- vagy szubsztituált benzilcsoport,

E jelentése a His imidazolcsoportjának átmeneti megvédésére alkalmas csoport, előnyösen dinitrofenil-csoport,

G a C-terminális alifás aminosav karboxilcsoportjának védésére szolgáló olyan csoportot jelent, amely enyhe savas behatásoknak ellenáll, de katalitikus hidrogenolízissel vagy vizes ásványi sav, illetve vizes vagy alkoholos alkálifémhidroxid-oldat hatására eltávolítható, valamely

Z-X’-M III

III általános képletű védett a-aminooxi-karbonsav-származékkal reagáltatunk - ahol

Z jelentése valamely acidolízissel vagy katalitikus hidrogénezéssel eltávolítható csoport, előnyösen benziloxikarbonil- vagy t-butiloxikarbonilcsoport,

X’jelentése α-helyzetben aminooxicsoportot tartalmazó alifás karbonsav gyöke, előnyösen aminooxiacetil- vagy a-aminooxipropionilcsoport és

M jelentése hidroxilcsoport vagy valamely aktiváló csoport, előnyösen pivaloiloxi-, nitrofenoxi-, 2,3,5-triklórfenoxi-, pentaklórfenoxi-, pentafluor fenoxi-, N-szukcinimidoxi- vagy azidcsoport, és a kapott

Z—X—Arg(A)—Val—Tyr(B)—He—His(E)-Pro—Y—OG

IV

IV általános képletű védett pepiidből először az E védőcsoportot, előnyösen 2-merkaptoetanollal való kezeléssel, majd a többi oldallánci és terminális védőcsoportot katalitikus hidrogenolízissel eltávolítjuk, és kívánt esetben a kapott vegyületet savaddíciós sójává alakítjuk.

2. Az 1. igénypont szerinti eljárás foganatosítási módja, azzal jellemezve, hogy az E védőcsoport eltávolítását 2-merkaptoetanollal végzett kezeléssel végezzük.

3. Az 1. igénypont szerinti eljárás továbbfejlesztése gyógyászati készítmények előállítására, azzal jellemezve, hogy valamely I általános képletű vegyületet — ahol X és Y jelentése megegyezik az 1. igénypontban adott meghatározás szerintivel - vagy.annak valamely gyógyászatilag elfogadható savaddíciós sóját a gyógyszerkészítésben szokásos módon hordozó- és/vagy egyéb segédanyagokkal összekeverve gyógyászati készítménnyé elkészítjük.