FI64797C - Foerfarande foer framstaellning av nya blodtrycknedsaettande peptider - Google Patents

Description

} Γοΐ kuulutusjOlkaisu sAnc\n jgfä [B] (11) UTLAGG N I N (SSSKRI FT 64797 ]RpJö C (45) F-tcnUi 10 01 1931 ^ ^ (51) K*.«k.3/im.ci.3 C 07 C Λ 03/52 SUOM I —FI N LAN D (21) P*tenttlh*k«mui —p*t«m»n*öknlnj 782216 (22) H»keml*pUvt — AntOknlnfidig 11.07.78 W (23) AlkupSIvi —Glltlghetsdaf 11.07.78 (41) Tullut julkiseksi — Bllvlt offentllg 19.01.79

Patentti- ja rekisterihallit» N*ht*vtk.lp«on j. kuulaiksi™ pvm— ’’o.

Patent- OCh registerstyrelsen Artsöksn utlsgd och utl.skrtften publtcsrsd ju.uy.uj (32)(33)(31) Pyydetty etuoikeus —Begird prlorltet l8.07 · 77

Unkari-Ungern(HU) RI-6^1 (71) Richter Gedeon Vegyeszeti Gyär R.T., 21, Gyömröi ut., Budapest X,

Unkari-Ungern(HU) (72) Lajos Kisfaludy, Budapest, György Nyeki, Budapest, Läszlo Szirmai, Budapest, Egon Karpati, Budapest,

Katalin Gidai, Budapest, Laszlo Szporny, Budapest,

Unkari-Ungern(HU) (7^) Oy Kolster Ab (5M Menetelmä uusien verenpainetta aientavien peptidien valmistamiseksi -Förfarande för framstalining av nya hlodtrycknedsättande peptider

Keksinnön kohteena on menetelmä kaavan I mukaisten verenpainetta alentavien peptidien ja niiden happoadditiosuolojen valmistamiseksi, X-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-V (I) jossa X on hydroksiasetyyli tai L- 04-hydroksipropionyyli, ja Y on L-leusyyli, L-isoleusyyli, L-alanyyli tai 0-metyyli-treonyyli .

Kaavan I mukaiset yhdisteet ovat angiotensiini II-analogeja. Angiotensiini II on oktapeptidi, jolla on hyperteosiivinen vaikutus. Elimistössä valmistuu angiotensiini I globu1iinista, jota maksa tuottaa reniiniksi nimitetyn entsyymin avulla, jota erittyy munuaisista. Elimistössä tämä yhdiste muuttuu angiotensiini II:ksi.

z 64797

Ensimmäinen angiotensiini II-analogi kuvattiin ensimmäisen kerran vuonna 1970- Havaittiin, että tämä yhdiste toimi angiotensiinin II spesifisenä kilpailevana inhibiittorina j_n vivo- sekä myös in vitro-testeissa (G.R. Marshall et ai: Proc. Natl . Acad. Sei. USA 67_, 1624 ( 19 7 0 ) ; P.A. Khairallah et ai.: 0. Med. Chem. _13 1B1 (1970)). Tämä havainto sai aikaan laajalle levinnyttä mielenkiintoa ja herätti lukuisat laboratoriot syntetisoimaan ja tarkkailemaan uusia angiotensiini II-analogeja, joilla on antagonistisia ominaisuuksia ja joita siten voidaan käyttää diagnostisoimaan tai jopa hoitamaan hypertensioita, jotka ovat reniinistä riippuvaisia. Oo tutkimustyön alkuvaiheissa kävi ilmi, että analogit, joissa 8-Phe-ryhmä oli substituoitu aminohapolla, jossa oli alifaattinen sivuketju, olivat kaikkein lupaavimpia yhdisteitä tätä tarkoitusta varten. Tämä muutos angiotensiini II:n molekyylin rakenteessa tarkoittaa nimittäin käytännöllisesti agonis-tisen vaikutuksen katoamista ja voimakkaan antagonistisen aktiivisuuden ilmestymistä. (D. Gagnon et ai.: Br. 3. Pharmacol., £3, 409 (1971); D.T. Palst et ai.: Circ. Res., 29_, 664 (1971)). Antagonisitista vaikutusta voidaan huomattavasti lisätä, kun θ-asemassa suoritetun modifioinnin lisäksi 1-Asp-ryhmä korvataan Sar-ryhmällä (D.T. Pals et ai.:

1 R

Circ., 2_9, 673 ( 1971)). Tällä tavalla valmistettu (Sar , Ala )-angio-tensiini II on jo laskettu liikkeelle. Tämän yhdisteen edullisten \ra\-kutusten katsotaan aiheutuvan entsymaattisen hajoamisen ijn vivo vähentymisestä ja sen suuresta affiniteetista reseptoriasemiin.

Olettamus, että angiotensiini II:n antagonistisille analogeille löytyy käyttöä reniinistä riippuvaisten hypertensioiden diangosoinnis-sa ja, joissakin tapauksissa, hoidossa (D. Ganten ja F. Gross: Med. Klin. 7_1, 2043 ( 1976); 3.L. Marx: Spencd jjT4, 821 (1976); P. Needleman ja G.R. Marshal: Fed. Proc. 3jj 2486 ( 1976)), on todistettu oikeaksi kliinisin testein (H.R. Brunner et ai.: Lancet, 1045 (1973); A.J.M. Conker et ai.: Lancet, 1535 (1974); T. Ogihara et ai.: Lancet, 219 (1974); 3.H. Laragh et ai.: New Engl. 3. Med., 292, 695 (1975); W.A. Pettinger et ai.: New Engl. 3. Med., 292 1214 (1975); Streeten et ai.: Circ. Res. 3_6, täyd. 1 ., 125 (1975); H.R. Brunner ja H. Gavras: Schweitz, Med. Wschr. 106, 1791 (1976)).

) 3 64797 Näihin asti valmistettujen angiotensiini II-analogien rakenteen ja biologisen aktiivisuuden vertailu on antanut jonkin verran hyvin tärkeää tietoa agonistis-antagonistisen aktiivisuuden tulkitsemiseksi (M.C. Khosla et ai.: "Handbook of Experimental Pharmacology" nide 37, I.H. Page ja F.H. Bumpus eds. 1974; G.R. Marshal: Fed. Proc., 35, 2494 (1976]).

Keskeisenä nykyisessä tutkimustyössä on uusien antagonistien valmistus, joilla ei ole ei-toivottuja sivuvaikutuksia ja joilla on pitempi biologinen puoliintumisaika CM.C. Khosla et ai.: J. Med. Chem., 19, 244 (1976); sama., 20, 253 (1977)).

Nyt on keksitty, että kun 8-fenyylialaniini-osa angiotensiini II:n molekyylissä korvataan a 1 ifaattise11a oc-amino-karboksyylihappo-radikaalilla ja samanaikaisesti liitetään alifaattinen oi-hydroksi-karboksyylihapporadikaali uuden angiotensiini II:n 1-asemaan» saadaan kilpailevia inhibiittoreita, jotka huomattavasti vähentävät angiotensiini II:lla jjn v_iv£-testeissä aiheutettua hypertensiota vieläpä ihonalaisesti annettuna.

Keksinnön mukaisesti valmistetaan yleisen kaavan I mukaisia yhdisteitä siten, että saatetaan reaktiivinen heptapeptidijohdannai-nen, jolla on yleinen kaava II

H-Arg(A)-Val-Tyr(B)-Ile-His(E)-Pro-Y-OG f II) jossa A on nitro- tai tosyyliryhmä, B on bentsyyli- tai substiuoitu bensyyliryhmä, E on dinitrofenyyliryhmä, ja G on nitrobensyy1iryhmä tai alempi alkoksiryhmä, ja Y tarkoittaa samaa kuin edellä,

reagoimaan reaktiivisen amino-oksikarboksyylihappo-johdannaisen kanssa, jolla on yleinen kaava III

W-X’-M (III) jossa X’ on amino-oksiasetyyli tai 'X-amino-oksipropionyyliryhmä, 4 64797 W on bentsyylioksikarbonyy1i- tai tert.butoksi-karbonyyiiryh- ΓΠ3 , j 3 m on hydroksyy 1 iryhrnä tai pivaloyy1ioksi-, n i trof eno ks i - , ?,'3,h-trikloorifenoksi-, pentakloorifenoksi-, pentafluorifenoksi-, N-sukkiini-imidioksi- tai atsidoryhmä,

lohkaistaan suojaryhmä E pois ja sen jälkeen muut sivuketjujen suoja-ryhmät ja päätesuojaryhmät saaduista yhdisteistä, joilla on yleinen kaava IV

W-X’-Arg(A)-Val-Tyr(Bl-Ile-His(El-Pro-Y-OG (IV) jossa B, W, X', Y, A, E ja G tarkoittavat samaa kuin edellä, ja haluttaessa muutetaan saatu yleisen kaavan I mukainen yhdiste happoaddi-t iosuoIäkseen.

E:llä merkitty suojaryhmä lohkaistaan edullisesti pois 2-mer-kaptoetanolin avulla, kun taas jäljelle jääneet sivuketju- ja pääte-suojaryhmät poistetaan katalyyttisesti hydraamalla. Tämä tarkoittaa myös, että kaikki sivuketju- ja päätesuojaryhmät - lukuun ottamatta suojaryhmää E - voidaan poistaa yhdessä ainoassa reaktiovaiheessa. Seurauksena aminoryhmän poistamisesta N-pääte--amino-oksihaposta ammoniakin muodossa saadaan oi.-hydroksi-happo. oi-hydroksihapporyhmän poistaminen tällä tavalla selostetaan tässä ensimmäistä kertaa kirjallisuudessa.

Keksinnön mukaisessa menetelmässä lähtöaineina käytettyjä yleisen kaavan II reaktiivisia heptapeptidi-johdannaisia voidaan valmistaa millä tahansa peptidikemiassa tunnetulla menetelmällä. Eräs sopiva menetelmä on kuvattu esimerkiksi unkarilaisessa patentissa n:o 16Θ 431. Tämän menetelmän mukaisesti sivuketjujen toiminnalliset ryhmät suojataan ryhmillä, jotka ovat pysyviä happolyysin olosuhteissa, joka hap-polyysi suoritetaan poistettaessa suojaryhmä liittämisen, jälkeen.

5 64797 Tämän keksinnön mukaisen menetelmän erään edullisen suoritusmuodon mukaisesti käytetään C-pääte-aminohapon tilapäistä suojaamista varten p-nitrobentsyy1iryhmää (NB) , arginiinin guanidiiniryhmä suojataan nitroryhmä1lä, kun taas tyrosiinin hydroksyyliryhmä suolataan ben-tsyyliryhmällä (Bzl) ja histidiinin imidatsolirenkaan suojaryhmä on dinitrafenyy1iryhmä (Dnp). Kaikki nämä suojaryhmät ovat pysyviä lievästi happamissa olosuhteissa, minkä seurauksena N-pääte-t-butoksikar-bonyyliryhmä (Boc) voidaan poistaa ilman minkäänlaista vaaraa, että nämä ryhmät lohkeaisivat. Tämä suojaryhmien erikoisyhdistelmä tekee mahdolliseksi poistaa dinitrofenyy1iryhmä ensisijassa ja sen jälkeen valmistaa yleisen kaavan I yhdisteitä yhdessä ainoassa reaktiovaihees-sa katalyyttisesti hydraamalla.

Yleisen kaavan I yhdiste voidaan puhdistaa sinänsä tunnetulla tavalla, edullisesti karboksimetyyliselluloosa-ioninvaihtokromatögrasiaa käyttäen. Tämän menetelmän tuloksena yhdisteet saadaan, yleensä lyofiloituina jauheina, jotka voidaan helposti muuttaa eri suoloiksi tai komplekseiksi.

Yleisen kaavan I yhdisteiden antagonistinen aktiivisuus testattiin uroSkissoilla. Verenpaine mitattiin kaulavaltimosta. Testit suoritettiin antamalla Hypertensin CCIBA)-ruis ke reiden ulkosivulle no-peudella 0,5 Aig/kg/min. Kun verenpaineen lisäys oli vakiintunut, tes- / tiyhdisteiden ja Saralasiinin (l-fieGly- S-L-Val-B-L-Alalangiotensiini II l· vesipitoiset, fysiologiset tai kantajan sisältävät liuokset annettijrT yhtenä ainoana annoksena, laskimon sisäisesti tai ihonalaisesti j-6' verenpaineen alenema mitattiin.

Taulukossa 1 on valtimoverenpaineen alenema esitetty testiyh-disteiden vaikutuksen alaisena laskimonsisäisesti annettuna. Vertailun vuoksi käytetään Saralasiinia. Taulukossa i esitetyt arvot saatiin laskemalla kuuden kokeen tulosten keskiarvo. Virhemarginaalit osoittavat pääarvon hajonnan.

6 64797

Taulukko 1

Eri angiotensiini II-analogien, jotka on annettu laskimonsisäisesti, vaikutus verenpaineeseen angiotensiinin II laskimonsisäi-sen ruiskeen vaikutuksen alaisena

Analogi Verenpaineen alenema (mm/

Hg) sen jälkeen, kun on annettu 10 jug/kg 20 jug/kg laskimonsisäiset annokset (hydroksiasetyyli'*', Leuö)-AngII -31-4,7 -42-2,8 (hydroksiasetyyli·*·, Ile®)-AngII -24-1,7 -30-2,3 (hydroksiasetyyli^, Thr(Me)®)-Angll -33-5,3 -38-4,1 ( L-ol -hydroksipropionyy 1 i ^ , Leu®)-AngII -32-3,7 -40-2,7 ( L- - hydroksipropionyy 1 i , Ile®)-AngII -31-3,3 -38-4,1

Sara lasiini -41-2,5 - '' /

Edellisessä taulukossa esitetyistä tiedoista voidaan selvästi nähdä, että jokaisella angiotensiini II-analogi1la, joka'on substituoitu ai ifaattisesta hydroksi-karboksyylihaposta johdetulla radikaalilla 1-asemassa, on merkittävä verenpainetta alentava vaikutus, Aktiivisuuden määrä on verrannollinen käytettyyn annokseen.

Testejä suoritettiin myös ihonalaisesti antaen. On huomattava, että tämä antotie angiotensiini II:lle tai sen analogeille ei ole aikaisemmin esitetty kirjallisuudessa. Ihonalaista antamista varten lisättiin testattavaa yhdistettä sisältävään fysiologiseen suolaliuokseen karboksimetyyliselluloosaa ja vastaavasti gelatiinia. Viiden erillisen testin keskiarvoa vastaavat tulokset on esitetty souraavassa taulukossa 2. Virherajat on esitetty pääarvon yhteydessä.

64797

Taulukko 2

Ihonalaisesti annettujen eri angiotensiini II-analogien vaikutus verenpaineeseen laskimonsisäisesti ruiskeena annetun angiotensiini II: n vaikutuksen alaisena

Verenpaineen alenema CmmHg)

Analogit Annos Liuotin 15 30 60 120 /ug/kg minuutin kuluttua (L-c* -hydroksi- 200 fysiologi- -28-3,1 -38-2,4 -25-1,5 -5-1,8 propionyyli, nen suola-

Leu^)-Ang II liuos CMC

(L- **·-hydroksi- propionyyli,

Ileö)-Ang II 200 gelatiini -28*10 -28*7,0 -25*6,0 -5*7,3^ CMC = karboksimetyyliselluloosa

Edellä annettujen arvojen mukaan tämän keksinnön mukaisesti valmistetut ihonalaisesti annetut uudet yhdisteet alentavat tahallisesti aiheutettua korkeaa verenpainetta merkittävällä tavalla, vieläpä 60 minuuttia antamisen jälkeen.

Keksinnön mukaisia peptidejä sekä myös niiden farmaseuttisesti hyväksyttäviä suoloja käytetään farmakologisiin tarkoituksiin tavanomaisten farmaseuttisten yhdistelmien muodossa. Nämä farmaseuttiset yhdistelmät sisältävät keksinnön mukaisia yhdisteitä sekoitettuina orgaanisten tai epäorgaanisten kantajien kanssa, jotka sopivat annettaviksi suolensisäisesti tai ruoansulatuskanavan ulkopuoiisesti. Siten farmaseuttiset yhdistelmät voidaan muovata jähmeiksi lyofilaa-teiksi, joissa erilaisia inerttejä yhdisteitä, jotka eivät reagoi peptidien kanssa, esim. hiilivetyjä, voidaan käyttää kantajina. Kun farmaseuttiset yhdistelmät muodostetaan laimeiksi tai väkeviksi suspensioiksi tai emulsioiksi, ne sisältävät myös erilaisia säilöntä-ja stabiloimisaineita.

6 4 7 97

Farmaseuttisia yhdistelmiä, jotka sisältävät keksinnön yhdisteitä, voidaan käyttää renaalisten hypertensioiden differenti-oituun havaitsemiseen sekä myös lisääntyneen ranaalisen verenpaineen aiheuttamien oireiden hoitoon.

Enemmän keksinnön yksityiskohtia valaistaan seuraavin ei-ra-joittavin esimerkein. Esimerkeissä käytetyt lyhennykset vastaavat kirjallisuudessa yleensä käytettyjä lyhennyksiä (J. Biol. Chem.

247, 977 (1972)). ^-aminohappoja merkitään tavulla ”0", joka on symbolin edessä, joka vastaa kyseessä olevaa aminohappoa.

Miinpä esimerkiksi OGly tarkoittaa amino-oksietikkahappoaj OAla tarkoittaa Ot-ami no - o ksi prop ion i happoa jne. Muita lyhennyksiä ovat esimerkiksi: PFP = pentafluorifenyy1i ja Z = karbometoksi.

Keksinnön mukaisen menetelmän suorituksessa haihduttaminen suoritetaan aina Buchi Rotavapor -laitteistossa. Sulamispisteet määritettiin tri Tottolin laitteessa (valmistanut Buchi). Ohutlevykromatografia suoritettiin "Kieselgel G nach Stahl" -pii-happogeelilevyi1lä (E. Merck, Darmstadt). Kroma gramm t kehitettiin seuraavilla liuotinseoksilla: 1. etyyliasetaatti : (pyridiini/etikkahappo/vesi-seos, 2U:6:11 ) = 9 5 : 5 2. etyyliasetaatti : (pyridiini/etikkahappo/vesi-seos, 20:6:11) = 90 : 10, 3. etyyliasetaatti : (pyridiini/etikkahappo/vesi-seos, 20:6:11) = 00 : 20, 4. Etyyliasetaatti: (pyridiini/etikkahappo/vesi-seos, 20:6:11) = 70 : 30, 5. ri-butanol i/et i kkahappo/ves i - seos, 4:1:5, 6. n-butanoli/etikkahappo/pyridiini/vesi-seos, 30:6:20:24 ja 7. n-butanoli/etyy1 iasetaatti/etikkahappo/vesi-seos, 1 :1:1 :1.

Kun esimerkeissä esitetään R^-arvoja, viitataan edellä esitettyjen liuotinjärjestelmien järjestysnumeroihin.

Paperi-sähköforeesi suoritettiin LMIM-, keskijännitteisessä vaakasuorassa laitteistossa MN 214 -paperilla pH --- 1,9 puskuri-liuoksessa glutamiinihapon ohella. Jännite: 450 V, aika: kolme tun-t i a .

Dhutlevykrornatogrammat kehitettiin osittain ninhydriini- 9 64797 liuoksella, osittain tavanomaisella kloorausmenetelmällä, joka suoritettiin o-toluidiini-KJ-liuoksella.

Lopputuote puhdistettiin seuraavasti: 0,5 g vapaata peptidiä liuotettiin sen jälkeen 4 ml:aan 0,01 n ammoniumasetaattipuskuria. Saatu liuos kaadettiin 0,5 l:n karboksimetyy1iseiluloosalla (CMC 52) täytettyyn kolonniin. Kolon-ni oli sitä ennen saatettu tasapainotilaan edellä kuvatulla puskuriliuoksella. 1,5 1 0,01 Π ammoniumasetaatti1iuosta ja 1,5 1 0,4 M ammoniumasetaatti1iuosta sekoitettiin gradienttisekoittimella ja suoritettiin grad ien tt i e luo i nt i . Virtausnopeus säädettiin 25 ml: ks.i/ tunti ja koottiin 10 ml:n jakeita. Kolonnista poistuva eluaattiy' rekisteröitiin jatkuvasti LKB Uvicord-II -laitteella ja saadkäy- s rän perusteella pääjakeet lyofiloitiin Leybold-Hereus -lyofiloin-tilaitteessa. Tällä tavalla valmistettu lyofilaatti kromatografoltiin uudelleen samalla gradienttieluo imismenetelmä1lä ja eluaatti lyofiloitiin uudelleen.

Esimerkki 1 [Hydroksiasetyyli , Leu )-angiotensiini II Vaihe 1

Boc-ArgCN02)-Val-TyrCBzl)-Ile-His(Dnp)-Pro-Leu-0NB

Liuokseen, jossa on 4,2 g (12 mmoolia) Leu-ONB · HBr 5I4 ml:ssa kloroformia lisätään 1,68 ml trietyyliamidia ja 3,81 g (10 mmoolia) Boc-Pro-OPFP. Reaktioseosta sekoitetaan huoneen lämpötilassa 20 minuuttia, ravistellaan veden kanssa ja sen jälkeen 10-%:isen vesipitoisen sitruunahappoliuoksen kanssa ja kuivataan.

• 1 ' K lorof ormi 1 iuos haihdutetaan. Saatu suojattu dipeptidi (R^. = 0-> ö) liuotetaan 20 mlraan kloorivetyhapon 8 M liuosta dioksaanissa. 10 minuutin kuluttua liuos laimennetaan kuumalla eetterillä ja haih- Λ dutetaan. Tällä tavalla valmistettu d ipept idi - kloori hydraatt i (R^, = 0,56) liuotetaan 50 ml:aan kloroformia, liuoksen pH-arvo säädetään 8:aan trietyyliamiinilla ja lisätään 8,8 g (15 mmoolia) Boc-His(Dnp)-OPFP. Liuosta sekoitetaan huoneen lämpötilassa yksi tunti huolehtien siitä, että liuoksen pH pidetään arvossa 8. Sen jälkeen lisätään liuokseen 1,65 ml Ν,ΙΜ-dimetyyli-aminoetyyliami inia aktiivisen esterin ylimäärän poistamiseksi ja 10 minuutin kuluttua reaktio-seosta ravistellaan sitruunahapon 10-%:isella vesipitoisella liuoksella, kloorivetyhapon 1 N vesipitoisella liuoksella ja natrium- 10 64797 vetykarbonaatin 5-%:isella vesipitoisella liuoksella. Kuivaamisen jälkeen liuos haihdutetaan. Jäljelle jäävä suojattu tripeptidi 1 (R_P = 0,65) liuotetaan 25 mitään kloorivetyhapon Θ M liuosta di-oksaanissa ja 15 minuutin kuluttua saatu tripeptidi (R^ = 0,47) saostetaan lisäämällä kuivaa eetteriä. Sakka suodatetaan erilleen ja liuotetaan välittömästi seokseen, jossa on 50 ml kloroformia ja 20 ml dimetyyliformamidia. pH säädetään arvoon 8 trietyyliamiinil-la ja lisätään 6,0 g (15 mmoolia) Boc-Ile-OPFP. 30 minuuttia myöhemmin reaktioseos haihdutetaan kuiviin ja jäännös liuotetaan 100 ml:aan etyyliasetaattia. Etyyliasetaattiliuos uutetaan vesipitoisella sitruunahappoliuoksella, 1 N vesipitoisella kloorivetyhappo-liuoksella ja lopuksi vedellä. Kuivaamisen jälkeen etyyliasetaatti poistetaan haihduttamalla ja jäännöstä käsitellään eetterin ja ni-heksaanin 1 :9-seoksella. Saatu suojattu tripeptidi (R^ = 0,64) eristetään ja liuotetaan 25 ml:aan kloorivetyhapon 8 M liuosta di-oksaanissa. 15 minuutin kuluttua tetrapeptidi (R^. = 0,40) saoste taan kuivalla eetterillä ja suodatetaan sen jälkeen erilleen. Saatu tetrapeptidi-kloorihydraatti liuotetaan seokseen, jossa on 50 ml kloroformia ja 30 ml dimetyyliformamidia, ja liuoksen pH säädetään arvoon B trietyy1iamiini1la. Lisätään 6,0 g (11,5 mmoolia) Boc-Tyr(Bz1)-0PFP. Liuos haihdutetaan 15 minuutin kuluttua, jäännös liuotetaan etyyliasetaattiin ja lisätään 0,66 ml N,N-dimetyyli-aminoetyy1iamiinia, 10 minuutin seisomisen jälkeen etyyliasetaat-tiliuosta ravistellaan sitruunahapon 10-%:isella vesipitoisella liuoksella, kloorivetyhapon 1 N vesipitoisella liuoksella ja lopuk- - si vedellä, kuivataan ja haihdutetaan. Hai hdutusjäännöstä käsitel- 2 lään kuivalla eetterillä ja suojattu pentapeptidi (R_p = 0,8) eristetään suodattamalla. Tuote liuotetaan 25 mitään kloorivetyhapon 8 M -liuosta dioksaanissa ja 15 minuutin kuluttua saatu pentapepti- 4 di (R_p = 0,8) saostetaan kuivalla eetterillä, suodatetaan ja pestään eetterillä. Sakka liuotetaan sitten välittömästi 50 mitään dimetyyliformamidia, pH säädetään arvoon 8 tri etyy1iamiini11 a ja lisätään 4,2 g (11 mmoolia) Boc-Val-OPFP. Yhden tunnin sekoittamisen jälkeen huoneen lämpötilassa liuos haihdutetaan, jäännös liuotetaan kloroformiin ja ravistellaan sitruunahapon 10-%tisen vesipitoisen liuoksen kanssa, sitten kloorivetyhapon 1 N vesipitoisen liuoksen kanssa ja lopuksi veden kanssa. Liuos kuivataan, haihdute- 11 64797 taan ja jäännöstä käsitellään eetterillä. Saatu suojattu heksapep-2 tidi (R_p = 0,82) eristetään suodattamalla. Tuote liuotetaan 25 ml:aan kloorivetyhapon 8 N liuosta dioksaanissa ja 15 minuutin ku -luttua saostetaan heksapeptidi (R_p = 0,55) kuivalla eetterillä, suodatetaan ja pestään eetterillä. Heksapeptidi liuotetaan välittömästi 50 ml:aan dimetyy1 iformamidia, pH säädetään arvoon 8 trietyy-liamiinilla ja lisätään 4,8 g (10 mmoolia) Boc-Arg(NC^)-OPFP. 30 minuutin kuluttua liuotin korvataan kloroformilla ja liuosta ravistellaan kloorivetyhapon 1 N vesipitoisen liuoksen kanssa ja sen jälkeen veden kanssa. Liuos kuivataan, haihdutetaan ja jäännös-ta käsitellään etanolilla. Suojattu heptapeptidi (R_p = 0,8) eristetään antamaan 7,6 g (53 % laskettuna lähtö-Boc-Pro-OPFP:ille). Sulamispiste: 192-195°C.

Vaihe 2

Z-0Gly-Arg(N02)_Val-Tyr(Bzl)-Ile-His(Dnp)-Pro-Leu-0NB

1,8 g (1,25 mmoolia) Boc-Arg(NO^)-Vai-Tyr(Bzl)-Ile-His(Dnp)-Pro-Leu-ONB liuotetaan 10 mitään kloorivetyhapon 8 M liuosta dioksaanissa. 15 minuutin kuluttua vapaa hehtapeptidikloorihydraat- ti saostetaan kuivalla eetterillä, suodatetaan ja pestään kuival- 3 la eetterillä (R_p = 0,36). Tuote liuotetaan välittömästi 20 mitään dimetyyliformamidia, pH asetetaan arvoon 8 trietyyliamiinilla ja lisätään 0,9 g (2,3 mmoolia) Z-OGly-OPFP. 15 minuutin kuluttua liuotin korvataan kloroformilla, liuosta ravistellaan kloorivetyhapon 1 IM vesipitoisen liuoksen kanssa ja veden kanssa. Kuivaamisen ja haihduttamisen jälkeen jäännöstä käsitellään etanolin ja eetterin 2:8-seoksella, tuote eristetään suodattamalla. Saadaan 1,6 g (85 %) ot si kkoy hd istettä. Sulamispiste: 1 65-174°C (R^.Z = 0,80).

Vaihe 3

Suojaryhmien poistaminen 1,6 g (1,0 mmoolia) Z-GGly-Arg(Νθ£)~Val-Tyr(Bzl)-Ile-His-(Dbp)-Pro-Leu-0NB liuotetaan 5 ml:aan dimetyyliformamidia ja lisätään 3,5 ml 2-merkaptoetanolia. Liuosta sekoitetaan huoneen lämpötilassa yksi tunti. Sen jälkeen lisätään seokseen kuivaa eetteriä ja saostunut aine suodatetaan erilleen, pestään kahdella 10 ml:n erällä eetteriä ja puhdistetaan saostamalla metanoli/eetteristä. Saadaan 1,3 g (95 %) Z-OGly-Arg(N G ^)-Vai-Tyr(Bzl)-1le-Hi s-Pro-Leu-ONB, RfZ = 0,2.

12 64797

Edellä saatu peptidi liuotetaan 30 ml:aan metanolin, etikka-hapon ja veden 5:1 :1-seosta. Lisätään 0,5 g 10;%:ista pa 11adium/hiili -katalyyttiä ja johdetaan vetyä voimakkaan sekoituksen alaisen liuoksen läpi 20 tuntia. Reaktion kulkua tarkkaillaan käyttäen ohutlevykromatografiaa. Kun reaktio on päättynyt, suodatetaan katalyytti erilleen, pestään 20 ml:lla metanolin, etikkahapon ja veden 5:1:1-seosta ja liuos haihdutetaan kuiviin. Jäännös liuotetaan et ano 1i/vesi-seokseen ja haihdutetaan useampia kertoja etikkahapon paistamiseksi. Peptidi eristetään sitten käsittelemällä kuivalla etanolilla ja suodatetaan erilleen. Saadaan 0,fl g [67 %) hydroksi-1 8 asetyyli ,Leu /-angiotensiini II. Puhdistaminen suoritetaan, kuten edellä esitettiin. = 0,41; R_pR = 0,59; R^7 = 0,60; /pH = 1,9/ = 0,98.

Aminohappoanalyysi: Pro: 1,0/1/; Vai: 1,01/1/; Ile: 1,02/1/; Arg: 1,01/1/; His: 1,0/1/; Leu : 1,02/1/; Tyr: 0,73/1/.

Esimerkki 2 1—1 ' ~ ^ 0

( L-(X-hydroksipropionyy 1 i ,Leu )-angiotensiini II

Vaihe 1

Z-0Ala-Arg(N02)"Val-Tyr(Bzl)-Ile-His(Dnp)-Pro-Leu-0NB

1.8 g (1,25 mmoolia) esimerkin 1 vaiheessa 1 saatua Boc-Arg(NO^)“Val-Tyr(Bzl)-Ile-His(Dnp)-Pro-Leu-ONB liuotetaan 8 ml:aan kloorivetyhapon 8 M liuosta dioksaanissa. Vapaa heptapeptidi säestetään liuoksesta kuivalla eetterillä, suodatetaan sen jälkeen eroon 3 ja pestään kuivalla eetterillä (R-t, - 0,36). Yhdiste liuotetaan vä littömästi 20 ml:aan dimetyyliformamidia, pH säädetään arvoon Θ tri-etyyliamiinilla ja lisätään 0,93 g (2,3 mmoolia) Z · OAla-LlPFP. 15 minuutin kuluttua liuotin korvataan kloroformilla ja saatua liuosta ravistellaan kloorivetyhapon 1 N vesipitoisen liuoksen kanssa ja sen jälkeen veden kanssa. Uute kuivataan ja haihdutetaan. Jäännöstä käsitellään etanolin ja eetterin 4:1-seoksella, saadaan 1,75 g (93 %) otsikkoyhdistettä. Sulamispiste: 164-172°C; = 0,85.

Vaihe 2

Suojaryhmien poistaminen 1 ,6 g Z - Π A1 a 1 - A rg f N O 2 ) - Va 1 - T y r ( B z 1 ) ~11 e - H i s ( O n p ) - P ro - L o u -HUB liuotetaan 5 ml : aan dimetyyliformamidia, lisättään 3,5 ml 2-mei— kaptoetanolia ja seosta sekoitetaan yksi tunti huoneen lämpötilas- 13 64797 sa. Sen jälkeen lisätään kuivaa eetteriä ja saatu sakka suodatetaan erilleen ja puhdistetaan metanoli/eetteri-saostuksella. Saadaan 1,3 g (92 %) Z-OAla-Arg(NO-)-Val-Tyr(Bzl)-Ile-His-Pro-Leu-ONB; 2 .... ^ R^ = 0,27. Tama peptidi liuotetaan metanol in, etikkahapon ja veden 5:1 :1 - seokseen, lisätään 0,5 g 10-%:ista pa 11 adium/hii1i-katalyyttiä ja vetykaasua johdetaan voimakkaan sekoituksenalaisen liuoksen läpi 20 tuntia. Reaktion kulkua tarkkaillaan ohutlevykro-matografiaa käyttäen. Kun reaktio on loppuun edennyt, katalyytti suodatetaan erilleen, pestään ja liuos haihdutetaan kuiviin. Jäännöksen liuottaminen etano 1i/vesi-seokseen ja haihduttaminen toistetaan useita kertoja. Jäännöstä käsitellään sitten kuivalla eta-nolilla, saadaan (L- - hydro ks ipropyy 1 i -Lou ) - ang iotens i i ni II. Saanto: ϋ,B5 g (70 %). Saatu tuote puhdistetaan, kuten edellä kuvat tiin. Rf5 = 0,36; Rf6 = 0,57; Rf7 = 0,60; EGlu/pH = 1,0/ = 0,97.

Aminohappoanalyysi: Pro: 0,98/1/; Vai: 1,0/1/; Ile: 1,1/1/; Arg: 1,0/1/; His: 0,98/1/; Leu: 0,98; Tyr: 0,56/1/.

Esimerkki 3 1 8 (Hydroksiasetyyli ,Ile )-angiotensiini II Vaihe 1

Bac-Arg(N02)-Val-Tyr(Bzl)-Ile-His(Dnp)-Pro-Ile-GNB

/

Liuokseen, jossa on 4,15 g (15 mmoolia) Ile-GNB*HC1 5P ml:ssa kloroformia, lisätään 2,1 ml trietyy1iamiinia ja sen jälkeen lisätään 3,81 g (10 mmoolia) Boc-Pro-OPFP. Reaktioseosta sekoitetaan 20 minuuttia huoneen lämpötilassa. Sitä ravistellaan sitten veden kanssa ja sitruunahapon 10-%:isen vesipitoisen liuoksen kanssa, kuivataan ja haihdutetaan. Saatu suojattu dipeptidi (R^. = 0,9) liuotetaan 20 ml:aan kloorivetyhapon 8 M liuosta dioksaanissa ja 10 minuutin kuluttua reaktioseos laimennetaan kuivalla eetterillä . 4 ja haihdutetaan. Vapaa dipeptidi-hydrokloridi (R^ = 0,44) liuote taan 30 ml:aan kloroformia, pH säädetään arvoon 8 trietyyliamiinil-la ja lisätään 8,8 g (15 mmoolia) Boc-His(Dnp)-OPFP. Yhden tunnin kuluttua lisätään 1,65 ml N,N-dimetyyli-aminoetyy1iamiinia reaktio-seokseen, jota ravistellaan 15 minuutin kuluttua sitruunahapon 10-%:isella vesipitoisella liuoksella, kloorivetyhapon 1 N vesipitoisen liuoksen kanssa ja lopuksi veden kanssa.' Uute kuivataan ja hai hdutetaan. Suojattu tripeptidi (R_p = 0,50) liuotetaan 20 ml.-aan kloorivetyhapon 8 M liuosta dioksaanissa, eristämättä. 15 minuutin 4 14 64797 kuluttua tripeptidi (R^ = 0,25) saostetaan kuivalla eetterillä, suodatetaan ja pestään kuivalla eetterillä. Se liuotetaan sitten välittömästi seokseen, jossa on 50 ml kloroformia ja 20 ml dimetyy-1 iformamidia. Saadun liuoksen pH säädetään arvoon 8 trietyy1iamii-nilla ja lisätään 6,0 g (15 mmoolia) Boc-Ile-OPFP. Seoksen annetaan seistä 30 minuuttia ja liuotin korvataan etyyliasetaatilla ja liuosta ravistellaan sitruunahapon 10-%:isen vesipitoisen liuoksen kanssa, kloorivetyhapon 1 N vesipitoisen liuoksen kanssa ja lopuksi veden kanssa. Saatu uute kuivataan, haihdutetaan ja jäljelle jäänyt suojattu tetrapeptidi eristetään uuttamalla n_-heksaanin ja 7 eetterin 9:1 -seoksel la. Suojattu tetrapeptidi (R^, = 0,65) liuote taan 25 ml:aan kloorivetyhapon 8 M liuosta dioksaanissa. 30 minuutin jälkeen saatu tetrapeptidi (R^ = 0,41) saostetaan lisäämällä kuivaa eetteriä, suodatetaan erilleen ja pestään. Se liuotetaan välittömästi 70 ml:aan dimetyyliformamidin ja kloroformin 1:1-seok-sesta. Sen jälkeen liuoksen pH säädetään arvoon 8 ja lisätään 6,0 g (11,5 mmoolia) Boc-Tyr(Bzl)-0PFP. 15 minuutin kuluttua liuotin korvataan etyyliasetaatilla ja lisätään 0,66 ml N,N-dimetyyli-ami-noetyyliamiinia. 15 minuutin kuluttua sitä ravistellaan sitruuna-hapon 10-%:isen vesipitoisen liuoksen, kloorivetyhapon 1 N vesipitoisen liuoksen ja lopuksi veden kanssa. Kuivaamisen ja haihdutta- 2 misen jälkeen saatu suojattu pentapeptidi (Rf = 0,59) eristetään lisäämällä kuivaa eetteriä. Se liuotetaan sitten 20 ml:aan kloori- vetyhappoa dioksaanissa. 15 minuutin kuluttua pentapeptidi-hydro-4 kloridi (R^ = 0,4) saostetaan lisäämällä kuivaa eetteriä, suodatetaan ja pestään 20 mlrlla kuivaa eetteriä. Se liuotetaan välit-.

s tömästi 50 ml:aan dimetyy1 iformamidia, pH säädetään arvoon 8 tpi" etyyliamiinilla ja lisätään 4,62 g (12 mmoolia) Boc-Vai-OPFP. Yhden tunnin jälkeen liuotin korvataan kloroformilla ja liuosta ravistellaan sitruunahapon 10-%:isen vesipitoisen liuoksen, kloorivetyhapon 1 N vesipitoisen liuoksen ja lopuksi veden kanssa. Saatu uute kuivataan, haihdutetaan ja haihdutusjäännöstä käsitellään 2 kuivalla eetterillä suojatun heksapeptidin (R^, = 0,50) saostami- seksi. Se liuotetaan sitten 20 ml:aan kloorivetyhapon 8 M liuosta dioksaanissa ja 15 minuutin kuluttua saadusta liuoksesta saoste- 4 taan heksapeptidi (R^. = 0,47) lisäämällä kuivaa eetteriä. Heksa- peptidi suodatetaan erilleen ja pestään 20 ml:lla kuivaa eetteriä.

Se liuotetaan välittömästi 50 ml:aan dimetyyliformamidia, pH sää- 15 64797 detään arvoon 8 trietyyliamiinilla ja lisätään 5,38 g (12 mmoolia) Boc-Arg(NO2)-OPFP. Seoksen annetaan seistä 30 minuuttia. Sen jälkeen liuotin korvataan kloroformilla ja liuosta ravistellaan kloorivety hapon 1 N vesipitoisen liuoksen ja veden kanssa. Uute kuivataan, haihdutetaan ja suojattu heptapeptidi eristetään etanolin avulla. Saadaan 9,7 g (68 % laskettuna lähtö-Boc-Pro-DPFP:sta) ot-si kkoyhdistettä . = 0,67.

Vaihe 2 Z-OGly-ArgCNC^J-Val-ArgCNC^-Val-TyrtBzlJ-Ile-HistDnp)-

Pro-Ile-ONB

1,6 g (1,1 mmoolia) Boc-Arg ( N02) -Val-Tyr(Bzl) -1le-His (Dnp) -Pro-Ile-ONB liuotetaan 8 ml:aan kloorivetyhapon 8 M liuosta dioksaa-nissa. Liuoksen annetaan seistä 15 minuuttia, sitten saatu heptapeptidi - hydrok lori di (R_p4 = 0,45) seostetaan kuivalla eetterillä, suodatetaan ja pestään 20 ml:lla kuivaa eetteriä. Se liuotetaan välittömästi 10 ml:aan dimetyy1 iformamidia, pH säädetään arvoon 8 trietyyliamiinilla ja lisätään 0,6 g (1,5 mmoolia) Z-0Gly-0PFP.

30 minuutin kuluttua liuotin korvataan kloroformilla ja liuosta ravistellaan kloorivetyhapon 1 N vesipitoisen liuoksen ja veden kanssa. Uut kuivataan ja haihdutetaan ja suojattu peptidi eristetään kuivalla eetterillä. Saadaan 1,45 g (85 %) otsikkoyhdisteitä. Sulamispiste 151-158°C; = 0,68.

Vaihe 3

Suojaryhmien poistaminen 1,45 g (0,94 mmoolia) Z-OGly-Arg(NO2)-Val-Tyr(Bzl)-Ile-His (Dnp)-Pro-Ile-ONB liuotetaan 5 ml:aan dimetyyliformamidia. Lisätään 3,5 ml 2-merkaptoetanolia, sekoitetaan liuosta yksi tunti ja säestetään Z-0Gly-Arg(NO2)-Vai-Tyr(Bz1)-Ile-His-Pro-Ile-ONB kuivalla eetterillä. Saostamisen jälkeen metanoli/eetteri1lä saadaan 7 1,05 g (82 %) peptidiä (R_p = 0,10). Se liuotetaan 30 ml:aan meta-nolin etikkahapon ja veden 5:1:1-seosta, lisätään 0,5 g 10-%:ista pa 1ladium/hii1i-katalyy11iä ja johdetaan vetykaasua voimakkaan sekoituksenalaisen reaktioseoksen läpi 21 tuntia. Reaktion edistymistä tarkkaillaan käyttäen ohutlevykromatografiaa. Katalyytti suodatetaan erilleen, liuos haihdutetaan kuiviin ja saatu vapaa peptidi erotetaan kuivalla etanolilla. Saadaan 0,48 g (64,5 %) (hydr-1 8 oksiasetyyli 1,Ilea)-angiotensiini II. Tuote puhdistetaan sinänsä tunnetulla tavalla. R^ = 0,29; = 0,57; = 0,58; E^^CpH = 1,9) = 1,03.

1F5 6 4 7 97

Aminohappoanalyysi : Pro: 0,99/1/; Val: 1,19/1/; He: 2,06/ 1/; Tyr: 0,74/1/; His: 0,98/1/; Arg: 0,96.

Esimerkki 4 1 8 (l_-°i-hydroksipropionyyli ,Ile )-angiotensiini II Vaihe 1

Z-OAla-Arg(N02)-Val-Tyr(Bzl)-Ile-His(Dnp)-Pro-Ile-ONB

1,6 g (1,1 mmoolia) Boc-Arg(N02)~Va1-Tyr(Bz1]-Ile-His( Dap)-Pro-Ile-ONB liuotetaan 8 ml:aan kloorivetyhapon 8 N liuosta diok-saanissa. Liuoksen annetaan seistä 15 minuuttia ja heptapeptidi saostetaan lisäämällä kuivaa eetteriä (R^ = 9,45), suodatetaan ja pestään. Se liuotetaan välittömästi 10 mitään dimetyy1iformamidia, pH säädetään arvoon 8 trietyyliamiinilla ja lisätään 0,61 g (1,5 mmoolia) Z-OAla-OPFP. 30 minuutin kuluttua liuotin korvataan kloroformilla ja liuosta ravistellaan kloorivetyhapon 1 N vesipitoisen liuoksen kanssa ja veden kanssa. Kuivaamisen ja haihduttamisen jälkeen saatu suojattu peptidi (R^7 = 0,63) eristetään eetterillä,,-' Saadaan 1,4 g (83 %) otsikkoyhdistettä. Sulamispiste: 164-1 68°0'.

Vaihe 2

Suojaryhmien poistaminen 1,4 g (0,9 mmoolia) Z-OAla-Arg(N02)-Vai-Tyr(Bzl)-Ile-His-(Dnp)-Pro-Ile-ONB liuotetaan 5 ml-.aan dimetyy 1 iformamidia ja lisätään 3,5 ml 2-merkaptoetanolia. Liuoksen annetaan seistä yksi tunti ja sitten Z-OAla-Arg(N02)-Vai-Tyr(Bzl)-1le-His-Pro-11 e-ONB saostetaan eetterillä ja puhdistetaan metanoli/eetterisaostuksella. Saalis: 0,8 g (65 %); R^ = 0,13; R^/J = 0,27. Saatu suojattu peptidi liuotetaan 10 ml:aan metanolin, etikkahapon ja veden 5:1:1-seosta. Liuokseen lisätään 0,5 g 10-%:ista pal1adium/hii1i-katalyyt-tiä ja vetykaasua johdetaan sekoituksenalaisen seoksen läpi 16 tuntia. Kun reaktio päättyy, suodatetaan katalyytti erilleen, liuos haihdutetaan ja tuote eristetään kuivan etanolin avulla. Saadaan 1 8 0,4 g (0,65 %) ( L-CK-hydro ks i - propionyy li -Ile ) - angiotensi i ni II.

. . .. 5

Puhdistaminen suoritetaan edellä kuvatulla tavalla. - 0,30;

Rf6 - 0,58; Rf7 = 0,58; EG1 (pH = 1,9) = 1,07.

Aminohappoanalyysi: Pro: 1,04/1/; Vai: 0,98/1/; Ile: 1,98/ 2/; Tyr: 0,98/1/; Hi s: 1,05/1/; Arg: 1,0/1/.

64797

Esimerkki 5 1 ö f Hydroksiasetyyli ,Ala )-angiotensiini II Vaihe 1

Boc-Ai'g(N02)-Val-Tyr(Bzl)-Ile-His(Dnp)-Pro-Ala-0NB

Liuokseen, jossa on 1,21 g (4 mmoolia) Ala-ONB'HBr 15 ml:ssa kloroformia lisätään 0,55 ml trietyyliamiinia ja 0,75 g (2 mmoolia) Boc-Pro-OPFP. Liuosta sekoitetaan huoneen lämpötilassa 10 minuuttia, uutetaan vedellä ja sitruunahapon 10-%risella vesipitoisella liuoksella, kuivataan ja haihdutetaan. Saatu suojattu dipeptidi 1 (R^ = 0,64) liuotetaan 4 mlraan kloorivetyhapon 8 M liuosta diok- saanissa, eristämättä. Liuoksen annetaan seistä 10 minuuttia, laimennetaan eetterillä ja haihdutetaan. Dipeptidi-hydrokloridi (R^ = 0,55) liuotetaan 15 mlraan kloroformia. pH säädetään arvoon 8 trietyy 1 iami i ni 1 la ja lisätään 1,76 g (3 mmoolia) Boc-His(Dnp)-OPFP.

30 minuutin kuluttua lisätään 0,44 ml IM, N-d imetyy 1 iaminoetyy 1 iami i -nia liuokseen. Sen annetaan seistä viisi minuuttia ravistellaan sitten sitruunahapon 10-%:isen vesiliuoksen kanssa, kloorivetyhapon 1 N vesipitoisen liuoksen kanssa ja 5-%:isen vesipitoisen natrium- vety karbonaatti 1iuoksen kanssa. Uute kuivataan, haihdutetaan ja 2 suojattu tripeptidi (R- = 0,57) liuotetaan 4 mlraan 8 M kloorive- ' 3 tyhappo 1 iuosta dioksaanissa . Tripeptidi (R^. = 0,28) saostetaan kuivalla eetterillä 10 minuutin kuluttua, suodatetaan ja pestään eetterillä. Se liuotetaan välittömästi 20 mlraan kloroformin ja dimetyy1 iformamidin 1:1-seosta. pH säädetään arvoon ö trietyyli-amiinilla ja lisätään 1,58 g (4 mmoolia) Boc-I le-0PFP. 20 minuutin kuluttua liuotin korvataan etyy1iasetaati1la ja etyy1iasetaat-tiliuosta ravistellaan sitruunahapon 10-%risen vesipitoisen liuoksen kanssa ja sen jälkeen veden kanssa. Kuivaamisen ja haihdutta-misen jälkeen suojattu tetrapeptidi (R_p = 0,57) sekoitetaan eetterin ja _n-heksaanin 1:9-seoksen kanssa ja suodatetaan erilleen.

Sen jälkeen se liuotetaan 4 mlraan kloorivetyhapon 3 M liuosta di~ -a oksaanissa, annetaan seistä 15 minuuttia ja tripeptidi (R^ - 0,38) saostetaan kuivalla eetterillä, suodatetaan ja pestään. Se liuotetaan välittömästi 15 mlraan kloroformin ja dimetyyliformarnidin 2r1-seosta, pH säädetään arvoon 8 trietyy1iamiini1la ja lisätään 1,66 g (3 mmoolia) Boc-TyrfBz1)-OPFP. 15 minuutin kuluttua liuotin korvataan etyyliasetaatilla ja lisätään 0,22 ml N,N-dimetyy1iami- 18 64797 noetyy1iamiin ia. Viisi minuuttia myöhemmin sitä ravistellaan sitruunahapon 10-%:isen vesipitoisen liuoksen kanssa, kloorivetyhapon 1;' vesipitoisen liuoksen kanssa ja lopuksi veden kanssa.

Kuivaamisen ja haihduttamisen jälkeen suojattu pentapeptidi 2 (R.p = 0,60) kootaan eetteriin, suodatetaan ja pestään eetterillä. Sen jälkeen se liuotetaan 4 mlzaan kloorivetyhapon 8 M liuosta 4 dloksaanissa. 10 minuutin kuluttua pentapeptidi (R^ = 0,62) seos tetaan eetterillä, suodatetaan ja pestään kuivalla eetterillä. Se liuotetaan välittömästi 20 mlzaan kloroformin ja dimetyy1 iformami-din 1:1-seosta, liuoksen pH säädetään arvoon 8 trietyy1iamiini1la ja lisätään 1,6 g (4 mmoolia) Boc-Val-OPFP. Seoksen annetaan seistä 20 minuuttia. Sen jälkeen liuotin korvataan etyyliasetaatilla, saatua liuosta ravistellaan veden kanssa ja sitruunahapon 10-%zisen vesipitoisen liuoksen kanssa. Uute kuivataan, haihdutetaan ja saa- 2 tu suojattu heksapeptidi (R^~ = 0,65) kootaan eetteriin, suodatetaan ja pestään eetterillä. Se liuotetaan välittömästi 20 mlzaan dimetyy1 iformamidia, pH säädetään arvoon 8 trietyy1iamiini1la ja lisätään 2,9 g (6 mmoolia) Boc-Arg(N02)-OPFP. 20 minuutin kuluttua liuotin korvataan kloroformilla ja liuosta ravistellaan sitruuna-hapon 10-%:isen vesiliuoksen kanssa ja veden kanssa. Kuivaamisen ja haihduttamisen jälkeen jäännös hierretään etyyliasetaatin ja eetterin 1z2-seoksella, suodatetaan ja pestään samalla liuotin-seoksella. Saadaan 2,0 g (72 %) vastaavaa suojattua heptapeptidiä. Sulamispiste: 185-187°C; = 0,70.

Vaihe 2

Z-OGly-Arg(NO2)-Val-Tyr(Bzl)-Ile-His(Dnp)-Pro-Ala-ONB

1,35 g (1 mmooli) Boc-Arg(NO2)-Va1-Tyr(Bzl)-Ile-His(Dnp)-

Pro-Ala-ONB liuotetaan 4 mlzaan kloorivetyhapon 8 N liuosta diok- saanissa. Liuoksen annetaan seistä 15 minuuttia, minkä jälkeen ' 4 heptapeptidi-hydrokloridi (R^ = 0,63) seostetaan ’ kuivalla eette rillä, suodatetaan ja pestään eetterillä. Se liuotetaan välittömästi 15 mlzaan dimetyy1 iformamidia, liuoksen pH säädetään arvoon 8 trietyyliarniinilla ja lisätään 0,96 g (2,5 mmoolia) Z-OGly-OPFP.

20 minuutin kuluttua liuotin korvataan kloroformilla ja liuosta ravistellaan veden kanssa. Vesipitoinen uute kuivataan, haihdutetaan ja suojattu peptidi eristetään käsittelemällä etanolilla. Saalis: 1,16 g (83 % ) ; sulamispiste 133-13ri°G; Rr^ ~ 0,72.

19 N

) 64797

Vaihe 3 '

Suojaryhmien poistaminen 1,5 g (1 mmooli) Z-OGly-Arg[Νϋ£)~Va1-Tyr(Bz1)-11e-His(Dnp)-Pro-Ala-ONB liuotetaan 5 ml:aan dimetyy1 iformamidia ja lisätään 2,95 ml 2-merkaptoetano1 ia. Liuoksen annetaan seistä yksi tunti, minkä jälkeen lisätään kuivaa eetteriä, saatu sakka suodatetaan erilleen ja pestään etanolilla. Saadaan 1,1 g (82 %) Z-QGly-Arg-(N02)-Val-Tyr(Bzl)-I1e-His-Pro-Ala-ONB. Rf2 = 0,15; Rf3 = 0,40.

Tämä suojattu peptidi liuotetaan metanolin, etikkahapon ja veden 5:1:1 -seokseen, lisätään 0,5 g 10-%:ista palladium/hiili-katalyyt-tiä ja johdetaan vetykaasua sekoituksenalaisen seoksen läpi 24 tuntia. Reaktion edistymistä tarkkaillaan käyttäen ohut levykroma-tografiaa. Kun reaktio päättyy, katalyytti suodatetaan erilleen, pestään 15 ml:lla metanolin, etikkahapon ja veden 5:1:1-seosta.

Liuos haihdutetaan sitten kuiviin, jäännös kootaan etanoli/vesi-seokseen ja haihdutetaan useita kertoja, eristetään sitten kuivan 1 s etanolin avulla. Saadaan 0,55 g (80 %) (hydroksiasetyyli ,Ala )-angiotensiini II, joka sitten puhdistetaan, kuten edellä kuvattiin. Rf5 = 0,28; Rf6 = 0,48; Rf7 = 0,50; EGlu(Ph = 1*9) = 1,0.

Aminohappoanalyysi: Pro: 0,95/1/; Ala: 1,1/1/; Vai: 1,0/ 1/; Ile: 1,0/1/; His: 1,0/1/; Arg: 1,0/1/; Tyr: 0,9/1/.

Esimerkki 6 1 8 (Hydroksiasetyyli ,Thr(Me))-angiotensiini II Vaihe 1

Boc-Arg(N02)“Val-Tyr(Bzl)-Ile-His(Dnp)-Pro-Thr(lv!e)-0lvle 0,69 g (3 mmoolia) Thr(Me)-OMe·HBr liuotetaan 30 ml:aan kloroformia, lisätään 0,42 ml trietyyliamiinia ja 1,7 g (4,5 mmoolia) Boc-Pro-OPFP. Liuoksen annetaan seistä kaksi tuntia, minkä jälkeen lisätään 0,33 ml Ν,Ν-dimetyyliaminoetyyliamiinia. 15 minuutin kuluttua liuotin korvataan etyyliasetaatilla ja saatua liuosta ravistellaan sitruunahapon 10-%:isen vesipitoisen liuoksen kanssa, kloorivetyhapon 1 N vesipitoisen liuoksen kanssa, veden kanssa ja lopuksi 5-%:isen vesipitoisen natriumvetykarbonaattiliuoksen kanssa. Kuivaamisen ja haihduttamisen jälkeen suojattu dipeptidi 1 (R_p = 0,76) liuotetaan 2 ml :aan kloorivetyhapon 8 M liuosta diok-saanissa eristämättä. 15 minuutin kuluttua liuos laimennetaan uet- 20 6 4 7 9 7 . . . . 3 terillä ja haihdutetaan. Jäljelle jäänyt dipeptidi (R^ = 0,16) liuotetaan 20 ml:aan kloroformia, pH säädetään arvoon 8 trietyyli-amiinilla ja lisätään 2,6 g (4,5 mmoolia) Boc-His(Dnp)-QPFP. Kahden tunnin sekoittamisen jälkeen huoneen lämpötilassa, lisätään 0,22 ml N,N-dimetyy1iaminoetyy1iamiinia liuokseen, jota ravistellaan 15 minuutin kuluttua sitruunahapon 10~%:isen vesipitoisen liuoksen kanssa, kloorivetyhapon 1 N vesipitoisen liuoksen kanssa ja veden kanssa. Kuivaamisen ja haihduttamisen jälkeen suojattu 1 tnpeptidi (R_p‘ = 0,5) liuotetaan 4 mitään kloorivetyhapon 8 N ve- sipitoista liuosta ilman eristämistä sitä ennen ja 15 minuutin ku- 3 luttua tri peptidi (R_p = 0,3) sa ostetaan kuivalla eetterillä, suodatetaan ja pestään eetterillä. Se liuotetaan välittömästi 20 mitään kloroformin ja dimetyy1 iformamidin 1i1-seosta, liuoksen pH säädetään arvoon 8 trietyy1iamiini1la ja lisätään 1,6 g (4 mmoolia) Boc-Ile-OPFP. 30 minuutin kuluttua liuotin korvataan etyyliasetaatilla ja etyy1iasetaatti1iuosta ravistellaan sitruunahapon 10-%tisen vesiliuoksen kanssa, kloorivetyhapon 1 N vesipitoisen liuoksen kanssa ja lopuksi veden kanssa. Kuivaamisen ja haihduttamisen jälkeen jäännöstä käsitellään eetterin ja ri-heksaanin 1:9-seoksella ja täten suojattu tetrapeptidi eristetään. Se liuotetaan sitten 7 mitään kloorivetyhapon 8 M liuosta dioksaanissa, liuok- .. . 4 sen annetaan seista 15 minuuttia, minkä jälkeen tetrapeptidi (R^. = 0,27) saostetaan kuivalla eetterillä. Se liuotetaan välittömästi 20 mitään kloroformin ja dimetyy1iformamidin 1:1~seosta, pH säädetään arvoon 8 trietyyliemiini 11a ja lisätään 1,6 g (3 mmoolia)

Boc-Tyr(Bz1)-0PFP. 30 minuutin kuluttua liuotin korvataan etyyliasetaatilla ja lisätään 0,22 ml N,N-dimetyy1iaminoetyy1iamiinia. Liuoksen annetaan seistä 15 minuuttia, minkä jälkeen sitä ravistellaan sitruunahapon 10-%:isen vesipitoisen liuoksen kanssa, kloorivetyhapon 1 M vesipitoisen liuoksen kanssa ja lapuksi veden kanssa. Uute kuivataan ja haihdutetaan ja suojattu pentapeptidi (R_pZ -0,63) eristetään eetterin avulla. Saadaan 0,4 g suojattua pentapeptidi ä . Saatu yhdiste liuotetaan 1 mitään kloorivetyhapon 8 M liuos- 4 ta dioksaanissa ja 15 minuutin kuluttua pentapeptidi (R _p - 0,4/) saostetaan kuivalla eetterillä, suodatetaan ja pestään eetterillä. Se liuotetaan välittömästi 10 mitään dimetyyiiFormamidia, liuoksen pH säädetään arvoon 8 tri etyyl i arni i nl 1 la ja lisätään 0,4 g (1 rnrnoo-11) Boc-Val-OPFP. Yhden tunnin kuluttua liuotin korvataan klorofor- 21 64 797 millä ja saatua liuosta ravistellaan sitruunahapon 10-%:isen vesipitoisen liuoksen kanssa, kloorivetyhapon 1 N vesipitoisen liuoksen kanssa ja veden kanssa. Kuivaamisen ja haihduttamisen jälkeen 2 suojattu heksapeptidi (R^, = 0,65) eristetään eetterin avulla. Sen jälkeen tuote liuotetaan 1,5 ml:aan kloorivetyhapon Θ N liuosta dioksaanissa, liuoksen annetaan seistä 15 minuuttia, minkä jälkeen 4 heksapeptidi (R^. = 0,48) seostetaan kuivalla eetterillä. Sakka suodatetaan erilleen, pestään eetterillä ja liuotetaan välittömästi 10 mitään dimetyyliformamidia. Liuoksen pH säädetään arvoon 8 trietyy1iamiini1la ja lisätään 0,45 g M mmoolia) Boo-Arg(NO2)-OPFP. Yhden tunnin kuluttua liuotin korvataan etyyliasetaatilla ja liuosta ravistellaan 10-%:isen sitruunahapon vesiliuoksen kanssa, kloorivetyhapon 1 N vesipitoisen liuoksen kanssa ja lopuksi veden kanssa. Saatu uute kuivataan, haihdutetaan ja käsitellään eetterin ja etanolin 9:1-seoksella antamaan 0,45 g (11,3 %) suojattua hepta-peptidiä. = 0,38; sulamispiste: 199-203°C (hajoaa).

Vaihe 2 Z-OGly-ArgfNO^I-Val-TyrfBzD-Ile-HisfDnpl-Pro-ThriMe)-OMe 0,45 g (0,34 mmoolia) Boc-Arg(N02)-Val-Tyr(Bzl)-Ile-His-(Dnp)-Pro-Thr(Me)-OMe liuotetaan 2 ml:aan kloorivetyhapon 8 M liuosta dioksaanissa. Liuoksen annetaan seistä 15 minuuttia, minkä jälkeen heptapeptidi eristetään lisäämällä kuivaa eetteriä 4 (R_P - 0,35). Se liuotetaan välittömästi 10 ml: aan dimetyylif ormamidia, liuoksen pH säädetään arvoon 8 trietyy1iamiini11 a ja lisätään 0,4 g (1 mmooli) Z-OGly-OPFP. Yhden tunnin kuluttua reaktio-seos laimennetaan 30 ml :11a kloroformia ja ravistellaan veden kanssa. Kuivaamisen ja haihduttamisen jälkeen suojattu peptidi eristetään eetterin ja etanolin 9:1-seoksen avulla. Saalis: 0,45 g (93 %); sulamispiste: 158-162°C; (R^ = 0,44).

Vaihe 3

Suojaryhmien poistaminen 0,45 g (0,31 mmoolia) Z-OGly-Arg(N02)-Vai-Tyr(Bz1)-11e-His(Dnp)-Pro-Thr(Me)-OMe liuotetaan 1,5 mlraan dimetyy1 iformami-dia ja lisätään 1 ml 2-merkaptoetanolia. Yhden tunnin kuluttua aine saostetaan kuivalla eetterillä, liuotetaan metanoliin, poistetaan väri pienellä määrällä tililtä ja (laihdutetaan lopuksi. Haiti- 22 64797

dutusjäännöstä hierretään eetterillä ja suodatetaan erilleen. Saadaan 0,38 g (98 %) Z-OGly-Arg(N0?)-Val-Tyr(Bzl)-Ile-His-Pro-Thr-3 4 Z

C Me) - OMe. R_p = 0,16; R^. = 0,52. Tuote suspendoidaan 5 ml; aan dioksaania ja lisätään 1,2 ml 1 N vesipitoista natriumhydroksidi-liuosta. Liuoksen annetaan seistä yksi tunti, minkä jälkeen sen pH säädetään arvoon 3 1 N vesipitoisella kloorivetyhappoliuoksella.

Saatu sakka liuotetaan kloroformin ja dimetyyliformamidin 3:1-seok-seen. Kuivaamisen ja haihduttamisen jälkeen peptidiä, joka on vapaa C-loppupäässä, käsitellään eetterillä. Saadaan 0,26 g (70 %) vapaata peptidiä; R_p = 0,25. Se liuotetaan sitten 10 ml:aan meta-nolin, etikkahapon ja veden 5;1 :1 - seosta, lisätään 0,1 g palladium/ hiili-katalyyttiä ja johdetaan vetykaasua sekoituksenalaisen liuoksen läpi 16 tuntia. Reaktion edistymistä tarkkaillaan käyttä- / en ohut levykromatografiaa. Kun reaktio päättyy, katalyytti suoda-tetaan pois ja liuos haihdutetaan kuiviin. Jäännös liuotetaan vesi/ / etanoli-seokseen ja haihdutetaan useampaan kertaan. Saadaan 0,16 g (80 %) (hydroksiasetyy1i ,Thr/Me/)-angiotensiini II, joka voidaan 5 6 7 puhdistaa, kuten edellä kuvattiin. R_p = 0,22; = 0,52; R^.

0,50; EGlu(pH = 1,9) = 0,98.

Aminohappoanalyysi; Thr; 0,6/1/; Pro: 1,0/1/; Vai: 1,0/1/;

Ile: 1,02/1/; Tyr; 0,85/1/; His: 1,0/1/; Arg: 0,96/1/.

v

Claims (1)

1. 23 64797 Patenttivaatimus Menetelmä kaavan I mukaisten verenpainetta alentavien peptidien ja niiden happoadditiosuolojen valmistamiseksi, X-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Y (I) · jossa X on hydroksiasetyyli tai L-^-hydroksipropionyyli, ja Y on L-leusyyli, L-isoleusyy1i, L-alanyyli tai O-metyyli-treonyyli, tunnettu siitä, että saatetaan reaktiivinen hepta-peptidijohdannainen, jolla on yleinen kaava II H-Arg(A)-Val-TyrCB)-Ile-His(E)-Pro-Y-OG (II) jossa A on nitro- tai tosyy1iryhmä, B on bentsyyli- tai substiuoitu bensyy1iryhmä, E on dinitrofenyyliryhmä, ja G on nitrobensyyliryhmä tai alempi alkoksiryhmä, ja Y tarkoittaa samaa kuin edellä, reagoimaan reaktiivisen amino-oksikarboksyy1ihappo-johdannaisen kanssa, jolla on yleinen kaava III W-X’-M (III) jossa X' on amino-oksiasetyyli tai -amino-oksipropionyyliryhmä, W on bentsyylioksikarbonyyli- tai tert.butoksi-karbonyyliryh- mä, ja M on hydroksyyliryhmä tai pivaloyylioksi-, nitrotenoksi-, 2,3,5-trikloorifenoksi-, pentakloorifenoksi-, pentafluorifenoksi-, N-sukkiini-imidioksi- tai atsidoryhmä, lohkaistaan suojaryhmä E pois ja sen jälkeen muut sivuketjujen suoja-ryhmät ja päätesuojaryhmät saaduista yhdisteistä, joilla on yleinen kaava IV 64797 24 W-X'-Ar£(A)-Val-Tyr(B)-Ile-His(E)-Pro-Y-OG (IV) jossa B, W, X’, Y, A, E ja G tarkoittavat samaa kuin edellä, ja haluttaessa muutetaan saatu yleisen kaavan I mukainen yhdiste happoaddi-tiosuolakseen. y 25 64797 Patent krav Förfarande för framstMl1 ning av blodtrycknedsöttande peptider med formeln I och deras syraadditionssaIter, X-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Y (I) väri X Mr hydroxiacetyl eller L-^-hydroxipropionyl, och Y Mr L-leucyl, l-isoleucyl, L-alanyl eller O-metyl-treonyl, kännetecknat därav, att man omsätter ett reaktivt heptapen-tidderrivat med den allmänna formeln II, H-Arg(A) - Val-Tyr(B)-Ile-His(E) -Pro-Y-OG (Ji) väri A Mr en nitro- eller tosylgrupp, B Mr en bensyl- eller substituerad bensylgrupp, E Mr en dinitrofenylgrupp, och G Mr en nitrobensylgrupp eller en IMgre alkoxigrupp, och Y har samma betydelse som ovan, med reaktivt aminooxikarboxylsyraderivat.med den allmMnna formeln III W-X'-M (III) väri X' Mr en aminooxiacetyl- eller ^-aminooxipropionylgrupp, W Mr en bensyloxikarbony1- eller en tert.butoxi-karbonylgrupp, och ΙΊ är en hydroxy lgrupp eller en pivaloyloxi-, nitrofenoxi-, 2,3,5-triklorfenoxi-, pentaklorfenoxI-, oentafluorfenoxi-, N-succinimidoxi-eller azidogrupp, man avspjälker skyddsgruppen E och dMrefter de andra skyddsgrupperna i sidokedjorna och den terminala skyddsgrupperna frMn de erhällna fo-reningarna med den allmMnna formeln IV