CS201013B2

CS201013B2 - Process for preparing new analoges of angiotensine

Info

Publication number: CS201013B2
Application number: CS784757A
Authority: CS
Inventors: Lajos Kisfaludy; Gyorgy Nyeki; Laszlo Szirmai; Egon Karpati; Katalin Gidai; Laszlo Szporny
Original assignee: Richter Gedeon Vegyeszet
Priority date: 1977-07-18
Filing date: 1978-07-17
Publication date: 1980-10-31
Also published as: DE2831271C2; AT360678B; ATA518378A; FI782216A; GB2002779A; SE7807824L; CH637916A5; SU913940A3; NL7807627A; GB2002779B; AU520176B2; BE869076A; FR2398049A1; JPS5831337B2; AU3800978A; YU41315B; IN149852B; HU177134B; US4209442A; IL55075A0

Description

Vynález se týká způsobu přípravy nových analogů angiotensinu II s antagonistickými vlastnostmi.

Nové peptidy typu angiotensinu II jsou charakterizovány obecným vzorcem I,

X-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Y (I) v němž

X je zbytek odvozený od alifatické alfa-hydroxykarboxylové kyseliny a

Y znamená zbytek odvozený od alifatické alfa-aminokarboxylové kyseliny.

Výhodnými představiteli zbytků odvozených od alifatické alfa-hydroxykarboxylové kyseliny ve významu symbolu X jsou hydroxyacetylové a alfa-hydroxypropionylové skupiny, kdežto zbytky ve významu symbolu Y znamenají výhodně leucylovou, isoleucylovou, alanylovou nebo threonylovou skupinu.

Adiční soli s kyselinami a komplexy peptidů obecného vzorce I spadají také do rozsahu tohoto vynálezu.

Angiotensin II je oktapeptid s hypertenzním účinkem. V organismu se angiotensin I tvoří z alfa-globulinu produkovaného játry působením enzymu zvaného renin, který se uvolňuje z ledvin. V organismu se pak tato sloučenina přeměňuje na angiotensin II.

Prvá zmínka o prvním analogu angiotensinu II pochází z roku 1970. Bylo zjištěno, že tato sloučenina působí Jako specifický konkurenční inhibitor angiotensinu II při zkouškách in vivo a také in vitro (G. R. Marschall et al.: Proč. Nati. Acad. Sci USA 61, 1624 /1970/,

P.A. Kairallah et al.: J. Med. Chem. 13-, 181 /1970/). Tento poznatek vyvolal rozsáhlý zájem a byl podnětem pro četné laboratoře k syntetizování a výzkumu nových analogů angiotensinu II, které maj antagonistické vlastnosti a mohou být pouUitelné k ·diagnóze nebo dokonce k léčení hypeetenzí ovlivňovaných reninem. Skutečně již na začátku výzkumech prací se ukázalo, ie analogy, v nichž skupina 8-Phe byla substituována aminokkyeirnou s alifatickým postranním řetězcem, jsou neperspektivnějšími sloučeninami pro tento účel. Tato změna ve struktuře mdekuly angiotensinu II totiž znamená, ie prakticky zmizí a^<^r^n^!3ti^c^ký účinek a objeví se silný antagonistický účinek (D. Gagnon et al.: Br. J. Pharmaaol. , 43. 409 /1971/, D. T. Pals et al.: Circ. Ree., 29. 664 /1971/). A í^ohís tipkou aktivitu je · možno· značně zvýšit, jéstliže se kromě moHfikace provedené v poloze 8, nahradí skupina 1-Asp skupinou Sar (D. T. Pals et al.: Circ. Res. 29, 673 /1971/). Takto připravený (Sar1, Ala®) angiotensin II je již dostupný. Výhodné vlastnosti této sloučeniny se připisují její schopnosti snižovat enzymmtický rozklad in vivo a její velké afinitě k poloha receptorů.

Předpoklad., že antagonistické analogy angiltensint II mohou být použity při diagnóze a v některých případech při léčení hypprtenzí ovlivňovaných reninem (D. Geanten a F. Gross: Med. Kliň. 71, 2 043 /1976/, J. L. Marx: Science 124, 821 /1976/, P. Needleman a G. R. Maarhhll: Fed. Proč. 35. 2 486 /1976/), byl prokázán klinicými zkouškami (H. R. Brunner et · al.: Lannet, 1 045 /1973/, A. J. M. Donker et al.: Lancet 1 535 /1974//, T. ΟοΟΗθγι e't al.: Lancet 219 /1974/, J. A. Laragh et al.: New. Eigl. J. Mee., 292. 695 /1975/, W. A. Pettinger et al<: New. Eigl. J. Med. 292. 1 214 /1975/, D. Η. P. Streeten et · c1.: Circ. Res. 36, Suppl. 1., 125 /1975/, H. R. Brunner a H. Gavrns: Schweetz. med. Was^?. 106. 1 791 /1976/).

Srovnání struktury a biologické aktivity analogů angiotensinu II dosud připravených poskytlo určité velmi důležité informace pro výklad agonistickl-antlΟlnistického účinku (M. C. Kioola et ale: Handbook of Expprimeenal vol. 37, I. H. Page a F. H.

Biumus, vyd. 19*74, G. R. · 1М1гЬо11: Fed. Proč., 35. 2 494 /1976/).

Středem ússií současné výzkumné práce je příprava nových antloonisticky účinných sloučenin, které·jsou bez nežádoucích vedlejších účinků a maaí delší biologický poločas (M. C. mola et al.: J. Med. Chem., 12, 244· /^197^/^, ibid., 20, 253 /1977/).

Nyní bylo zjištěno, že náhradou jednotky fen^/lal-aninu v poloze 8 v mdekule lnoiltensinu II zbytkem alifa^í^ké alfa-mrnokarblxyllvé kyseliny a současiým připojením zbytku alifatické alfa-hydгoэykarboxyllvé kyseliny do polohy 1 se získají nové konkurenční inhibitory angiltensint II, které značně snižují hypertenzi vyvolanou angiotensinem II při zkouškách in vivo, dokonce při subkutánní aplikaci.

Sloučeniny obecného vzorce I,

X^-^Arg-^al-l^Tyr-^lLe-^His^-^ir^o-^Y (I) v němž

X a Y maaí výše definovaný význam, se podle vynálezu připravuj tak, že se reaktivní derivát heptapeptidu obecného vzorce II,

H-Arg(A)-aaa-Tyr(B)-!le-Hi s(E)-Pro-Y-Og (II) kde značí skupinu vhodnou pro přechodné chránění guanidi.nová skupiny argininu, skupinu vhodnou pro přechodné chránění skupinu vhodnou pro přechodné chránění aromatické hydroxylové skupiny tyrosinu, ^id^^ové skupiny hist-Linu, skupinu vhodnou pro chránění karboxylové skupiny alifatické aminolyshlrny na vém atomu uhlíku, přičemž tato chránicí skupina je stálá v mírně kyselém prostředí, ale je oddtěpitelná působením siliých kyselin nebo bází nebo katalytickou · hydrogena·* cí a

Ϊ má výše uvedený význam, uvede v reakci s reaktivním derivátem aminoozx/karboxylové kyseliny obecného'vzorce III,

W-X'-M (III) v němž

X' je skupina odvozená od alifatické alfa-minooxykarboxylové kyseliny, . W' je chránící skupina odstranitelná acidolysou nebo katalytickou hydrogenací a

M značí hydroxylovou nebo aktivačně působící skupinu, ze vzniklé sloučeniny obecného vzorce IV,

W-X'-Arg(A)-Val-Tyy(B)-Ile-His(E)-Pro-Y-CG (IV) kde ¹

B, W, X*, Y, A, E a G mmjí výše uvedený význam, se odštěpí chránící skupina ve významu symbolu E a potom se odštěpí chránící skupiny na ostatních postranních řetězcích a koncové chránící skupiny pomooí katalytické hydrogenace a popřípadě se získané sloučeniny obecného vzorce I přemění na jejich adiční soli s kyselinjmi nebo na jejich komplexy.

Ve sloučeninách obecného vzorce II znamená A přednostně nitroskupinu nebo tosylovou skupinu, B značí výhodně benzylovou nebo substiuuovanou benzylovou skupinu a E znamená s výhodou Sinitroeenylovou skupinu. Ve výchozích sloučeninách obecného vzorce III značí W přednostně bénzyloxykarbonylovou skupinu, nebo terc.butpxykarbonylovou skupinu, X* znamená výhodně aminooxyacetylovou skupinu nebo· alfa-miinooxypropionylovou skupinu a M je s výhodou pivaloyloxylová, nitrofenoxylová, pentafluorfenoxylová, N-sukcinimidoxylová, azidová, 2,3,t~Ιγϊοϊι^γΓenyzolová nebo pentachlorfenoxylová skupina.

Chhááící skupina ve významu symbolu E se s výhodou odštěpuje pomocí 2-meekaatoetanolu, zatímco zbýýaáící chránící skupiny na postranních řetězcích a korcové chránící skupiny se odstraňují katalytickou hydrogenad. To tedy znamená, že všechny chránící skupiny postranních řetězců a korcové chránící skupiny, kromě chhánnd skupiny E, mohou · být odstraněny v jednom reakčrím stupni. OOstrarěním aminoskupiny z korcového atomu dusíku alfaaminooxykyseliny ve formě amoniaku se získá alfa-haSroxakyseliгc. Tento způsob eliminace uvedené skupiny z clfa-hydrcnykyseliгy nebyl dosud v literatuře uveden.

Reaktivní derivát heptapeptidu obecného vzorce II, použitý jako výchozí maCetiál pro syntézu sloučenin podle vynálezu, se může připravovat jakoukoliv metodou zrámou v chemii peptidů. Vhodná metoda je popsána například v maďarském patentu č. 168431. Podle této metody se funkční skupiny postranních řetězců chrání skupinami, které jsou stálé za podmínek acidolysy, kde se odstraňování chránících skupir provádí po syntéze.

Při výhodném provedení způsobu podle vynálezu se pro přeohodné chránění karboxylové skupiny cminokyastiгy ra korcovém atomu uhlíku používá p-ritroberzylové skupiny (NB), guanidinová skupina arginiru se chrání nitroskupinou, zatímco hydroxylová skupina tyrosiru se chrání benzylovou skupinou (B21) a chránící skupinou pro imidazolový kruh histiSinu je diritrofenylová skupina (Dnp). Všechny tyto chránící skupiny jsou stálé v mírrě kyselém prostředí, proto je možno odstrcnit ttrč.butcxykcrbcnalcvou skupinu (Boc) na korcovém·atomu dusíku bez nebezpečí, že se tyto skupiny odštěpí. Tato speciální kombinace chránících skupin umožňuje o^£^s^i*a^i.t nejprve Siгitrotгnylovou skupinu a potom připravit sloučeniny obecného vzorce I v jednom stupni katalytickou hydrogenací.

Sloučeniny obecného vzorce I je možno čistit známým způsobem, s výhodou pomocí iontoo měničové chrcInaCocgafit, s použitím karioxymetyacelulózy. V souladu s touto · technologií se obvykle získávají sloučeniny ve formě lyo^izoovarých prášků, které je možno snadno převést ra různé soli nebo komplexy.

Antagonistický účinek sloučenin obecného vzorce I byl zkoušen na kocourech. Krevní tlak byl měřen v tepně na ·šíji. Zkoušky se prováděly zaváděním infúze Hypertensinu (CIBA) do vedleeší stehenní žíly rpchlootí 0,5 zuo/ko/min. Po ustálení ' zvýšené hladiny krevního tlaku byly aplikovány v jedné dávce intravenosně nebo subkutánně roztoky zkoušených sloučenin a Saralasin jako fpzinlngické roztoky nebo roztoky obsahující nosič a byl měřen pokles . krevního tlaku. ,

Snížení arteriálního krevního tlaku při intravenosním podáváni zkoušených sloučenin vyrobených podle vynálezu ilustruje tabulka 1. Jako referenční sloučeniny je použito Seralosinu. Hodnoty uvedené v tabulce 1 p^edstav^í průměr z výsledků, šesti stanovení. Meze chyby udávvjí rozptyl hlavní hodnoty.

Tabulka 1

Vliv různých analooů angiotensinu II na krevní tlak při ^trave^sní aplikaci (i. v. infúze angiotensinu II)

Aialogy	Snížení krevního tlaku (kPa) po aplikaci dávek (i. v.)
10 Ag/ko	20 Ag/ko
(ЩУlгnypcetyP· , Leu®) ano. II	-4,133 í 0,627	-5,599 í 0,373
(HУlгnyacetyP¹ , Ile⁸) ano. II	-3,2 i0>2227	-4 í 0,307
(Hydroyacetyl¹ , Thr/Me/⁶) ano. . II	-4,4 t 0,707	-5,066 + 0,547
(L-alfa-Hydroxypropionyy1, Leu⁸) ano. II	-4,266 ± 0,493	-5,333 ± 0,36
(L-alfa-Hplrnyypropionyp1, Ile®) ano. II	-4,133 ± 0,44	-5,066 i 0,547
Saralasin	-5,466 ± 0,333

Z údajů tabulky 1 jasně vyplývá, že každý analoo angintrnsinj II substituovaný v poloze 1 zbytkem odvozeným od alifatické hydroKykarboxylové kyseliny má významný účinek na snižování krevního tlaku. Rozsah tohoto účinku je úměrný použitému dávkování.

Zkoušky byly prováděny také se subkutánní aplikací. Je třeba připomenout, že tento způsob podáváni angintrnsinu II nebo jeho analooů nebyl dosud zveřejněn .v literatuře. Pro subkutánní aplikaci'byla k fyziologcckému roztoku chloridu sodného, obsahujícímu zkoušenou sloučeninu při dávána karbnyyleeyPlclιUlóza a popřípadě želatina. VVsledky ndpenVíljící průměru z pěti · separátních stanovení jsou shrnuty v tabulce 2. Meze chyby jsou vztaženy na hlavní hodnotu.

TTaulkk2

Vliv různých analooů angiotensinu II na krevní tlak při subkutánní aplikaci (i. v. infúze angintrnsinu II)

Analooy	Dávka /io/ko	RozpenιUtědln (fyzioloo. roztok NaCl)	Snížení krevního tlaku (kPa) P°
15 minutách	30 minutách
(L-alfa-Hydroxy- propionyl1, Leu®) ano. II	200	přísada CMC	-3,733 ± 0,413	-5,066 i 0,32

(L-alfa-HydroxypropiornyJ , Ile^e) ano. II· 200 přísada želatiny -3,733 ± 1,333 -3,733 i 0,933 pokračování tabulky 2

Aialogy	Dávka Jg/kg	(fyziolog. roztok NaCl)	Snížení krevního tlaku (kPa) po
60 minutách	120 minutách
(L-alfa-Hydroxy-		přísada
propionyl', Leu®) ang. 11	200	CMC	-3,333 ± 0,2	-0,667 í 0,24
(L-alfa-Hydroxy-		přísada
lrlplolnl¹, Ile®) ang. II	200	želatiny	-3,333 i 0,8	-0,667 t 0,973
CMC = karblxymaro^гlcelulózt
Z výše uvedených údajů	v tabulce	2 je patrné, že	subkutánní aplikace	nových sloučenin

podle vynálezu snižuje ve významné míre vysoký krevní tlak, který byl záměrně vyvolán, ještě 60 minut po podání.

V · textu používaný výraz komplexy peptidů podle vynálezu , znamená kommp<é:xní sloučeniny vytvořené s použitím určitých organických mattriálů, propůjčujících peptidům retardační účinek. Typickými reprezentanty těchto organických sloučenin jsou želatiny, karboxyneeylcelulózy, estery kyseliny alginové, poly(fluorethinfosfáty), polymery tminokyssrin nebo jiné polymery a kopolymery.

Peptidů vyrobených · způsobem podle vynálezu a rovněž jejich farmaceuticky vhodných solí a komplexů se používá pro fermakologické účely ve .formě běžných farmaceutických přípravků. V těchto přípravcích jsou sloučeniny vyrobené · způsobem podle vynálezu obsaženy ve směsi s organickými nebo anorganickými nosiči a jsou vhodné pro morální nebo parenterální aplikaci. Farmatertické přípravky mohou být formulovány jako pevné lyofilizáty, v nichž · je možno použít jako nosičů různých inertních sloučenin nereagujících s peptidy, například uhlovodíků. Jsou-li farmaceutické přípravky používány ve formě zředěných nebo končentrovaných suspenzí nebo ernuuzí, obsahnuí také různá ochranná a stabilizační činidla.

Farmaacutických přípravků obsah^ících sloučeniny vyrobené způsobem podle vynálezu, je možno používiťt pro diferencovanou detekci renální hypertenze a rovněž pro léčení každého syndromu, vyvolaného zvýšením renálniho krevního tlaku.

Daaší podrobn^ti způsobu podle vynálezu jsou objasňovány v dále uvedených příkladech provedení, které však neumez^ rozsah vynálezu. Zkratky použité v příkladech odpolídatí zkratkm. běžně používaiým v literatuře (J. Biol. Chem. 247. 977 /1972/). V případě, že alfa-aminokyseliny jsou označeny písmenem O umístěiým před symbol odpooíddaící příslušné aminnokyseině, znamená například Orly aminooxyoc tovou kyselinu, O AI a značí alí't-tmi^nloxy“ propanovou kyselinu atd. Daaší zkratky jsou například PFP = ·pentafluorfmyl a Z - karbometoxyl.

P4 způsobu·podle vynálezu se odpařování provádělo vždy plmolí rotačních odpařovacích zařízení. Teploty tání se stanovovaly přístrojem podle dr. Toltoliho. ClhOmaaografie na tenké vrstvě se prováděla na siltk1r5elových deskách za ^и^^ silika^^u G podle Stahla. C^jrom^togr^ímy byly vyvíjeny s použitím těchto směěí rlzpou-tědel:

1. etylacetát:	(směs · pyridinu, kyseliny octové a vody - 20:6:11) = 95:5,
2. etylacetát:	(směs pyridinu, kyseliny octové a vody - 20:6:11) = 90:10,
3. etylacetát:	(směs py^dinu, kyseliny octové a vody - 20:6:11) = 80:20,
4. etylacetát:	(směs pyridinu, kyseliny octové a vody - 20:6:11 ) = 70:30,

5. směs n-butanolu, kyseliny octové a vody ^s 4:1:5,

6. směs n-butanolu, kyseliny octové, pyridinu a vody = 30:6:20:24 a

7. směs n-butanolu, etylacetátu, kyseliny octové a vody = 1:1:1:1.

V příkladech udávané hodnoty Rf se vztahují к číslům výěe uvedených systémů rozpouštědel.

Papírová elektroforéza se prováděla v horizontálním zařízení LMIM se středním napětím^ na papíru MN 214, v tlumivém roztoku o pH 1,9 vedle kyseliny glutamové, při napětí 450 V a v době 3 hodin.

Chromatogramy na tenké vrstvě byly vyvíjeny částečně roztokem ninhydrinu, částečně běžnou chlorační technikou za použití roztoku o-tolidinu a jodidu draselného.

Konečný produkt byl čištěn takto: ve 4 ml 0,01 M amoniumacetátového tlumivého roztoku se rozpustilo 0,5 g volného peptidu. Získaný roztok se převedl jako horní vrstva na sloupec karboxymetyleelulózy (CMC 52) o objemu 0,5 litru, přičemž sloupec byl předtím uveden do rovnovážného stavu pomocí výše uvedeného tlumivého roztoku. Bylo přimíšeno 1,5 litru 0,01 M roztoku amoniumacetátu s 1,5 litru 0,4 M roztoku amoniumacetátu za použití gradientového míchadla a byla prováděna gradientová eluce. Rychlost toku byla upravena na 25 ml/h a byly jímány frakce po 10 ml. Registrace eluátů odtékajících z kolony byla prováděna kontinuálně pomocí přístroje LKB Uvicord-II a na základě vyhodnocení získané křivky byly hlavní frakce lyofilizovány v lyofilizačním zařízení podle Leybold-Herea. Takto připravený lyofilizát byl znovu chromatografován za použití stejné gradientově eluční techniky a eluát byl opět lyofilizován.

Příklady provedení

Příklad 1 (Hydroxyacetyl¹, Leu$)angiotensin II

P r v ní stupeň

Boc-ArgCNO^)-Val-Туг(Bzl)-Ile-His(Dnp)-Pro-Leu-ONB

К roztoku 4,2 g (12 mmolů) Leu-ONB . HBr v 50 ml chloroformu se přidá t ,68 ml trietylaminu a 3,81 g (10 mmolů) Boc-Pro-OPFP. Reakční směs se míchá při teplotě místnosti po dobu 20 minut, třepe se s vodou, potom s 10% vodným roztokem kyseliny citrónové a vysuší se. Chloroformový roztok se odpaří. Vzniklý chráněný dipeptid (R^. = 0,8) se rozpustí ve 20 ml 8 M roztoku kyseliny chlorovodíkové v dioxanu. Po 10 minutách se roztok zředí bezvodým éterem a odpaří se. Takto získaný dipeptidhydrochlorid (R^ ^s 0,56) se rozpustí v 50 ml chloroformu, pH roztoku se upraví na hodnotu 8 pomocí trietylaminu a pak se přidá 8,8 g (15 mmolů) Boc-His(Dnp)-OPFP. Roztok se míchá po dobu 1 hodiny při teplotě místnosti, přičemž se dbá na to, aby se pH roztoku udržovalo na hodnotě 8. Potom se pro odstranění přebytečného množství aktivního esteru přidá к uvedenému roztoku 1,65 ml N,N-dimetylaminoetylaminu a po 10 minutách se reakční směs protřepává s 10% vodným roztokem kyseliny citrónové, 1 N vodným roztokem kyseliny chlorovodíkové a pak 5% vodným roztokem hydrogenuhličitanu sodného.

Po vysušení se roztok odpaří. Jako zbytek se získá chráněný tripeptid (R^ = 0,65), který se rozpustí v 25 ml 8 M roztoku kyseliny chlorovodíkové v dioxanu a po 15 minutách se tripeptid (Rp = 0,47) vysráží přídavkem bezvodého éteru. Sraženina se odfiltruje a ihned se rozpustí ve směsi 50 ml chloroformu a 20 ml dimetylformamidu. Hodnota pH roztoku se upraví na 8 trietylaminem a pak se přidá 6,0 g (15 mmolů) Boc-Ile-OPFP. Po 30 minutách se

201' · OÍ 3 reakční směs odpaří do sucha a zbytek se rozpustí ve 100 ml etylacetátu. Etylacetátový roztok se extrahuje vodným roztokem kyseliny citrónové, 1 N vodným rozookem kyseliny chlorovodíkové a nakonec vodou. Po vysušeni se etylacetát ' o<dpí^:í a na zbytek se působí směsí éteru a n-hexanu (1:9). Získá se chráněný tetrapeptid (R? = 0,64), který se izoluje a rozpuutí v 25 ml 8 M roztoku kyseliny .chlorovodíkové v dioxanu. Po 15 minutách se přídavkem· bezvodého éteru vysráži tetra^pe^pti^d (R^ = ^0,40), ^který se ^potom odfiltruje. lískaný ' tetrapept^hydrochlorid se' rozputí ve směsi 50 ml 'chloroformu a -30 ml dimetylformamidu, pH roztoku se upraví na hodnotu 8 pomooí trietylminu a pak se přidá' 6,0' g (11,5 mnooů) Boo-Tyr(Bzl)-OPFP. Po 15 minutách se roztok odppaí, zbytek se ' rozpi^s^1^:í v etyllcetáts i přidá se 0,66 ml Ν,Ν-dioetrlloinoetrlEoins. Etylacetátový roztok se nechá 10 minut stát, potom se·protřepává s 10% vodným rozookem kyseliny citrónové, 1 N · vodným roztokem kyseliny chlorovodíkové i nakonec s vodou, vysuší se a pak se odpaH. Zbytek po odpaření se převede do bezvodého éte- ru a filtrací se izoluje chráněný pentapeptid (R^ = 0,8).

Produkt se rozpětí v 25 ml 8 N roztoku kyseliny chlorovodíkové v dioxanu a po 15 minutách se srážením bezvodým éterem získá pentapeptid (Rp = 0,8), který se filtruje a pomyje éterem. Potom se sraženina ihned rozpustí v 50 ml di^^tyl^i^<^:raa^^du, pH roztoku se upraví na hodnotu 8 pomocí trietylmios a pak se přidá 4,2 g (11 ohooů) Boc-Val-OPFP. Roztok se míchá po dobu 1 hodiny při teplotě místnooti a . pak· se odppH, zbytek se rozpustí v chloroformu a protřepává se s 10% vodným roztokem kyseliny citrónové, potom s 1 N vodným rozookem kyseliny chlorovodíkové a nakonec s vodou. Roztok se pak odpaří a zbytek se převede do éteru. Filtrací se izoluje chráněný hexapeptid (Rf = 0,82). Tento' produkt se rozpustí v 25 ml 8 N roztoku kyseliny chlorovodíkové v dioxanu a po 15 minutách se bezvotým éterem vysráži hexapeptid (r| = 0,55), který se filtruje a promyje éterem. Hexaaapaid se ihned rozpíjíš stí v 50 ml dime^]^ omiamidu, pH roztoku se upraví na hodnotu 8 pomocí trietylminu a potom se přidá 4,8 g (10 mirnlů) Boc-Arg(N02)-0PFP. · Po 30 minutách se uvedené rozpouštědlo v reakční směsi nahradí chlor^formnem a tento roztok se protřepává s 1 N vodným roztokem kyseliny chlorovodíkové a potom.s vodou. Roztok se pak ·vysuuí, odpaří a na zbytek se působí etmolem. Chráněný heptapeptid (Rf = 0,8) se izoluje v mioOství 7,6 g (53 %, vztaženo na výchozí Boc-Pro-OPFP). Teplota tání: 192 až 195 °C. _

Druhý stupeň

Z-α^lJ^-A^|g(N02)-V^l-Уr((B^l.)-]^l^<--И^i^sDoa)-^I^o-leuuO^«B

V 10 ml 8 M roztoku tyseliny chlorovodíkové v dioxanu se rozpětí 1,8 g (1,25 mnoou) Boo-./Ar((N2)-Val-Tyy(Bzl)-Ile-Hi((Dnp)-Pto-Leu-ONB. Po 15 minutách se bezvodým éterem vysráží volný heptapeptidkydrochlorid, oddfltruje se a promne bezvodým éterem (R^ = 0,36). Tento produkt se okunžžtě rozpětí ve 20 ml dioetrlformaoidu, pH roztoku se upraví na hodnotu 8 pomocíí trietylmiou a pak se přidá 0,9 g (2,3 mírnou) Z-ajly-OPFP. Po 15 minutách se uvedené rozpouštědlo v reakční směsi nahradí cH^^r^cform^i^m a tento roztok se protřepává s 1 N vodným roztokem kyseliny chlorovodíkové a potom s vodou. Po vysušení a odpaření se zbytek převede do směsi etan^u a éteru (2:8) a produkt se . izoluje filtrací. Získá se 1,6 g ⁽⁸5 %) И tulní s^učen!^ s te^otou tání: ¹⁶5 až ¹74 °C, = 0^,8°.

Třetíttpeeň

Oddsranění chránících skupin

V 5 ml dimetyOformamidu se rozpětí 1,6 g (1,0 mírnou) 'Z-OOOyrAAg¢N02)-VaOaTy:tBzO)--Oe-His(Doa)-Pro-LsuoONB a přidá se 3,5 ml 2-oerkaaaoetano0u. Roztok se míchá při teplotě místnosti po dobu 1 hodiny. Potom se ke směsi přidá bezvodý éter, vysrážená látka se odfiltruje, promyje éterem (2x po 10 ml) a čistí se srážením ze směsi metanolu a éteru..Získá se 1,3 g (95 %) Z-0Glr-Aгg(N0₂)-V£ll-У;r((Bzl)-:Ie--HS--(0^o-Lsu-0NB, ' = 0,2.

/»

Výše uvedený peptid se rozpustí ve 30 ml směsi nttmolu, kyseliny octové a vody (5:1:1). Potom se přidá 0,5 g 10%'paládia na dřevěném uhlí jako katalyzátoru a za energického míchání se roztokem probublává vodík po dobu 20 hodin. Průběh reakce se kontroluje ebhomatogrrfií na tenké vrstvě. Po ukončení reakce se katalyzátor odfiltruje, promyje 20 ml směsi metanolu, kyseliny octové a vody (5:1:1) a roztok se odpaří do sucha. Zbytek se rozpuutí ve směsi etanolu a vody a odpaří vícekrát po sobě pro odstranění kyseliny oc.tové. Peptid se potom izoluje působením bezvodého etcnulu a odfiltrováním. Získá se 0,8 g (67 %) ^ydro^xacctyl¹, Leu⁸⁾alnriottnsⁱnu II. Čištění se prov^í výše uvedeným z^půso^bem.

R® = 0,41, R® = 0,59, Rj = 0,60, Eg,_u(pH = 1,9) = 0,98.

Aiatýza 01111011^8611^: Pro = 1 ,0(1), Val =1,01(1), Ile = 1,02(1), Arg = 1,01(1),

His =1,0(1), Leu = 1,02(1) a Tyr = 0,73(1).

Příklad 2 ^aKa-h^ruty^upionyl¹, ^Leu⁸⁾cⁿ^iot.1nsⁱn ¹¹

První stupen

Z^OAla-Arg (OOg) -Val-Tyr (Bzl) -Ile-His (Dnp) -Pro-LuuoONB

V 8 ml 8 M roztoku kyseliny chlorovodíkové.v dioxanu se tUzpuutí 1,8 g (1,25 mulu) Boo--Ag((IOo)‘)Vvl-Tτy(Bвll-Ile-Hi((Dnp)-Pro-LeuoONB, .získaného v prvním stupni podle příkladu . 1 . Z roztoku se vysráží bezvodým éterem volný h1ptcpeptif_l ^ΗΠι^ι se c pak se promyje bezv^ým éterem (R® = 0,36). Sloučenina se ihned tuzpuutí ve 20 ml dim^^tyl^f^one^idu, pH roztoku se upraví na hodnotu 8 pomooí trietytminu a potom se přidá 0,93 g (2,3 mulu) Z-OAla-OPFP. - Po 15 minutách se uvedené rozpouštědlo v ' retkCní ·směsi.nahradí chlorfUrniem a získaný roztok se protřepává s 1 N vodným roztokem kyseliny chlorovodíkové a potom s .vodou. Extrakt se vysuší a odpaří se. Na zbytek se působí směsi etanolu a éteru (4:1) a získá se 1,75 g (93 .%) titulní sloučeniny s teplotou tání 164 až 172 °C, R® = 0,85.

Druhý stupen

Oddtranění chránících skupin

V 5 ml dimetylfořu amidu se rozpuutí 1,6 g Z-OOlea-Ag(NO₂)-VaVaTyT(BBB)-Ile-His(Dnp)-Pro-Leu-ONB, . přidá se 3,5 ml 2-1e1kaa0oettnulu a směs se pak míchá při teplotě místnosti po - - drbu 1 hodiny. Potom se přidá bezvrdý éter, vzniklá steženána - se οΪΠΙΛι^Ιι a vydstí srážením směsí metanolu a éteru. Získá se 1,3 g 0©2 %) Z-0Ala-Arg(N02)-ValaTτ'(I(вB)--le- o

-His-Pro-Luu-OOB, R^ = 0,27. Tentr peptid se rozpustí ve směsi metanolu, k'^seliny.octové a vody (5:1:1), přidá se 0,5 g 10% paládia na dřevěném uhlí jako katalyzátoru a potom se za energického míchání roztokem probublává plynný vrdík po drbu 20 hodin.' Průběh retkce se kontroluje chromtoggraií na tenké vrstvě. Po ukončení reakce se katalyzátor odfiltruje, promne a ' roztok . se do sucha. Rozpouutění zbytku ve směsi . etcnulu a vody a udpařuvání se několikrát opakuje. Ze'zbytku se pak působením bezvudéhr etanolu získá (L-alft-hydrotypropionyl ' , Leu° ^giotensih II ve výtěžku 0,65 g (70 %). Získaný produkt se čistí výše uvedeným způsobem.

Rj = 0,36, R® = 0,57, rJ = 0,60, E_01u(pH = 1,9) = 0,97.

Aialýza эПпоОуу^Зп: Ptu = 0,98(1), Val = 1,0(1), Ile = 1,1(1), Arg = 1,0(1), His '=0,98(1), Leu = 0,98 a Tyr =0,56(1).

Příklad 3 (H^drc^x^yacetjd 1, Ile⁸)cngiotensin II

První stupeň

Boo--Ag(NO₂ l-ValcTyr (Bzl )-He-His( Dnp)-Pro-Ile-ONB

Do roztoku 4,15 g (15 molů) Ile-ONB . HCL v 50 ml chloroformu se přidá 2,1 ml trietyliminu c potom ještě 3,81 g (10 mnoH) Boc-Pro-OPFP. Reakční směs se míchá při teplotě místnosti po dobu 20 minut, potom se protřepává s vodou c s 10% vodným roztokem kyseliny citrónové^, vysuší se c odppM. Zís^ká se ctoáněný ^di^pe^pt^{id (}Rp = 0,⁹⁾, ^který se roz^pustí ve ²⁰ ml 8 M roztoku kyseliny chlorovodíkové v dioxcnu, po 10 minutách se reckční směs zředí bezvo^dým éterem c od^paří se. ^Vzniklý volný ^^^^hy^ochlor^ (^Rp = ^0,44) se roz^pustí ve ³⁰ ml chloroformu, pH roztoku se uprcví nc hodnotu 8 pomoci trietycminu c přidá se 8,8 g (15 mmolů) Boc-His(Dnp)-OPFP. Po 1 hodině se k reckční směsi přidá 1,65 ml O,O-dfmeeylčninnolyle cminu c protřepává se 15 minut s 10% vodným roztokem kyseliny citrónové, 1 N vodným roztokem kyseliny chlorovodíkové c nckonec s vodou. Extrckt se vysuší c odpačí. Získá se chráněný tri^pe^ptid ^(rJ = ^0,50) ^který se roz^u^ ve ²⁰ ml 8 ^M rozteku k^^í^^<^^^li^n^y ch^lorovo^díklv^év dioxcnu, cniž se provádí izolcce. Po 15 minutách se bezvodým éterem vysráží tripeptid (Rp = 0,25), odfiltruje se c promyje bezvodým ·éterem. Potom se ihned rozpuutí ve směsi 50 ol chloroformu c 20 ol fioetylforžcžifu.

U 'vzniklého roztoku se pH uprcví nc hodnotu 8 trlttyCaminem c přidá se 6,0 g (15 m^ohů) Boo-Ile-OPFP. Směs se nechá stát 30 minut, potom se uvedená rozpouUtědlc ve sO^í^i. nchrcdí etylcce1^áÍe<^m c tento roztok se protřepává s 10% vodným roztokem kyseliny citrónové, 1 N vodným roztokem kyseliny chlorovodíkové c nckonec s vodou. Získcný extrckt se vysuší, odpaří c zbylý chráněný tltrcplptíf se izoluje extrckci zc pouUžtí směsi n-hexcnu c éteru (9:1). Chráněný tltrcplptíf (R„ = 0,65) se rozpustí v 25 ml 8 M roztoku kyseliny chlorovoi A dikové v dioxcnu, po 30 oinutách se přídavkem bezvodého éteru vysráží tetrcpeptid (RJ = = 0,41), oddiltruje se c promye. Ihned se rozpuutí v 70 ml sžžsí ^οθ^ΐίοηο^ί^ c ehlorotormu (1:1), potom se pH roztoku uprcví nc hodnotu 8 c přidá se 6,0 g (11,5 ornou) BoceTyr(Bzl)-OPFP. Po 15 minutách se uvedená rozpouštědle ve směsi nchrcdí etylccetáeem c přidá se 0,66 ml Ν,Ν-fimettlcminoettlcmins. Získcný roztok se po 15 minutách protřepává s 10% vodným rozookem kyseliny citrónové, 1 N vodným roztokem kyseliny chlorovodíkové c nckonec s vodou.

o

Po vysušení c odpaření se vzniklý chráněný pentcpeptid (R£ = 0,59) izoluje přídavkem bezvodého éteru. Potom se rozpuutí ve 20 ml roztoku kyseliny chlorovodíkové v dioxcnu. Po 15 minutách se přidáním bezvodého éteru vysráží pentcpeptidhyddoohlorid (Rp = 0,4), odfiltruje se·c prooyje se 20 ml bezvodého éteru. Potom se okamžitě rozpustí v 50 ml dimeeylOorocmidu, pil roztoku se uprcví nc hodnotu 8 pomooí trietyCmins c přidá se 4,62 g (12 mmolů) Boc-Val-OPFP. Po 1 hodině se uvedené rozpouštědlo ve směsi nchrcdí chloriormmeo c tento roztok se protřepává s 10% vodným roztokem kyseliny citrónové, 1 N vodným roztokem kyseliny chlorovodíkové c konečně s vodou. Získcný extrckt se vysuUÍ, odpcř.í c působením bezv^ého éteru nc zbytek se vysráží chráněný hexapepptid (Rf = 0,56). Ten se pck rozpuutí ve 20 ml 8 M roztoku kyseliny chlorovodíkové v dioxcnu c z roztoku se po 15 minutách přidáním bezvodého éteru vysráží hexi^]^(^e^p,id · (Rp = 0,47), který se pck odfiltruje c prooyje 20 ml bezvodého éteru. Potom se okcmítě rozpuutí v 50 ml fioetylforodoifu, pH roztoku se uprcví nc hodnotu 8 treetyCm:íinež c přidá se 5,38 g (12 moolů) Boc-A^gíOOoí-OPFP. Reakční směs se nechá stát po dobu 30 minut. Potom se uvedené rozpouštědlo ve sožsí nchrcdí chloroormmeo c tento roztok se protřepává s 1 N vodným roztokem kyseliny chlorovodíkové c s vodou. Extrckt se vysuUÍ, odpcří c pomooí etcnolu se izoluje chráněný ^р^ре^!^ Získá se 9,7 g (68 %, počítáno nc výchozí Boc-Pro-OPFP) titulní sloučeniny, Rp = 0,67.

201013 10

Druhý stupeň

Z-OGly-Arg(NO))-Val-Tyr(Bzl)-Ile-His(Dnp)-Pro-Ile-ONB

V 8 ml 8 11 roztoku kyseliny chlorovodíkové v dioxanu se rozpusSÍ peptid Boc-Arg(NOo)-Val-Tyr(Bzl)-Ile-lUs(Dnp)-Pro-Ile-ONB. Roztok se nechá stát 15 minut, vzniklý heptapeePidhydrooh^hori^d = 0^,45) se pak vysr^áží bezvodýrn ^erem, odfiltruje ae a promyje 20 ml bezvodého éteru. Potom se ihned rozpusSÍ v 10 ml ' dimetylformamidu, pH roztoku se upraví na ‘ hodnotu 8 pomocí trlttyraminu a přidá se 0,6 g (1,5 mmolu) Z-OGly-OPFP. Po 30 minutách se uvedené rozpouštědlo ve soO^I naJhradí chlor©omnem a tento roztok se protřepává s 1 N vodným roztokem_ kyseliny chlorovodíkové a s vodou. Extrakt se vysuuí, odppdří a pomoc::! bezvodého éteru se izoluje chráněný peppid. Získá se 1,45 g (85 %) titulní sloučeniny s teplotou tání 151 až 158 °C,'= 0,68.

Třetí stupen

Odssranéní chránících skupin

V 5 ml dimetyioormemidu se rozpusSÍ 1,45 g (0,94 mmou) Z-OJli-)Ag)NOo)-Vvl-TTyrBBz)-HeHHSsDDnpepPoo-Ile-OIB a přidá se 3,5 ml 2-m^e^l^(^]^p^«^<^itan<^o.u. Roztok se míchá 1 hodinu a pak se bezvodým éterem vysráží Z-0Gly-Arr)SOo)-Val-Tyr (Bzl)-Ill-His-Pgc-IleoO^B. Po vysrážení siTsí metanolu a éteru se získá 1,05 g (82 %) peptidu (R^ = 0,10). Tento se rozpusSÍ ve 30 ml směsi metanolu, kyseliny octové a vody (5:1:1), přidá se 0,5 g 10% paládia na dřevěném uilí jako katalyzátoru a potom se za energetického míchání probublává reakční směsí plynný vodík po dobu 21 hodin. Průběh reakce se kontroluje hhrcmrtocgaflí na tenké vrstvě. Katalyzátor se od^l^uje, roztok se odppďí do sucha a vzniklý volný peptid se izoluje pomooí ^bezvod^ého ^anolu. ^Získ^á se ^0,48 g ⁽⁶⁴,’5 %⁾ ‘⁽hydgoэ^χrjchlyl¹, I^le^Θ)Én^gictlnsⁱnu II. Produkt se čistí známým způsobem.

r1 = 0^,29, Rf = 0^,57, 4 = 0»58. ^Еи._и (^pH = 1,9) = 1,03·

Analýza aminooyssein: Pro = 0,99(1), Val = 1,15(1), IH = 2,06(2), , Tyr = 0,74(1),

His = 0,98(1) a Arg = 0,95.

Příklad ' 4 ⁽L-alf a-^^jdgc^χjppo^cioc^nj , Ibs^an^^ensin II

První stupeň

Z-0Ala-Arg(N2) -Vaa-TTyrBízl-Ile-Hi s( Inp)-Pgc-IleoO1B

V 8 ml 8 M roztoku kyseliny chlorovodíkové v dioxanu s6 ' rozpuusí 1,6 g (1,1 nohu) Bochelg))SO2)2ValaTτg(rSzl)-Ile-His(Dnp)-Pgc-Ileo(NB. Roztok se nechá stát 15 minut, pak se ^id^ím bezvodého étaru vysráží ^hep'^ta^peplt±d.- ^(R^ = ^0,45) od^ltouje se a ^o^je. ^Potom se ihned rozpussí v 10 ml dimetylf0^)^1^, pH roztoku se upraví na hodnotu 8 pomocsí trietylíminu a pak se přidá 0,61 g (1,5 mnoh) Z-OAla-OPFP. Po 30 minutách se uvedené rozpouštědlo ve srně в i nahradí chloro^nem a tento roztok se protřepává s 1 N vodným gczCoker ^J O kyseliny - chlorovodíkové a s vodou. Po vysušení a se vzniklý chráněný peptid (R^ = = 0,63) izoluje pomoc; í éteru. Získá se 1,4 g (83 %) titulní sloučeniny s teplotou tání 164 až 168 °C.

Druhý stupen

Odstranění chránících skupin

V 5 ol SiшetylforшεmiSu se rozpuutí 1,4 g (0,9 mnolu) Z-OAlQ-Arg(NO2)-Vel-Tyr(Bzl)-Il<--His(Dnp)-Pro-lle-O^B a přidá te 3,5 ol 2-oeekaaPoetanolu. Roztok te nechá stát 1 hodinu, pak te étereo vysráží Z-0Ala-Arg(N02)-Vvl-Tyr(Bzl)-Ile-Hit-Pro-IleoONB a přečistí te srážením toěsí metanolu a éteru. V^tětek ^0,8 g (65 %), ^R = OJ³, ^R = 0,27. Uved^ený ^chráněný peptid te rozpuutí v 10 ol toěsi oetanolu, kyseliny octové a vody (5:1:1), k tomuto roztoku te přidá 0,5 g 10% paládia na dřevěnéo uhlí jako katalyzátoru a potorn te la oí cháni probublává reakční toěsí plynný vodík po dobu 16 hodin. Po ukončení reakce te katalyzátor lddiltrujl, roztok te κΙρεΟ^ί. a produkt te izoluje pooocí buvodéh^o etanolu. Zítká te 0,4 g (0,65 %) (L-alfa-hrdrlxypropionyl1, Ilečbangiotensinu · II. Čištění se provádí výše uvlderýш způsobeno.

Rp = 0,30, Rp! = 0,58, rR = 0,58, E_Qlu (pH = 1,9) = 1,07.

Analýza aшinolyrtein: Pro = ) 104(11, Vva = 0,98(1), Ile = 1,98(2,,

Tyy = 1,99(Ц) HHs = 1,05(1) a A*g = 1,0(1).

Příklad 5 (¾гrdrlyrceltr19 -la⁸)angiotensin II .

První stupen

Boc-Arg(N02)-Val-Tyr(Bzz)-Ile-Hi s(Dip)-Pro-AaaoOřB

K roztoku 1,21 g (4 onolč) Ala-ONB . HBr v 15 ol chllroformu te přidá 0,56 ш1 trie^la^inu a 0,76 g (2 шIlшly) Boc-Pro-OPFP. Roztok te pak oíchá při teplotě oí^tnc^s^lti 20 oinut, extrahuje se vodou a 10% vodný^o roztokeo kyseliny citrónové, vysuší te a odpgai. Získaný chráněný dipeptid (R^. = 0,64) te rozpuutí ve 4 ol 8 M roztoku kyseliny chlorovodíkové v dioxanu, bez izolace. Roztok se nechá stát 10 oinut, zředí te vodou a odpaří se. Vzniklý Si^pl^ptⁱSh^ydrlchlori^d (R^ = ^0,65⁾ te rozjetí v ¹⁵ ol ^pH roztoku se upraví na hodnotu 8 trltrylшnineш a přidá ' te 1,76 g (3 юю^) Boc-His(Dnp)-OPFP. Po 30 oinutách te k roztoku přidá 0,44 ol ^N-dioetylaoinoetylaoinu, nechá te stát 5 oinut a potoo te protřepává t 10% vldnýш roztokeo kyseliny citrónové, 1 N vodnýo roztokeo kyseliny chlorovodíkové a 5% vodnýo roztekeo hydrogennuhičitanu sodného. Extrakt te vysuší, odpaař a chráněný tri2 peptid (R_f = 0,57) te rozpustí ve 4 ol 8 M roztoku kyseliny chlorovodíkové v dioxanu. Po ¹⁰ oinut^ác^h te bezvniýo étereo vysrá^ží . ^triplp^ti^s (^R^ = ^0,28⁾, odfiltruje te a pro^je étereo. Potoo te ihned rozpuuti ve 20 ol soěsi chloroforou a dioetylforosoidu (1:1),,pH roztoku te upraví na hodnotu 8 pooooí trieyyarninu a pák te přidá 1,58 g (4 moly) Boo-Hi-OPFP. Po 20 oinutách te uvedená rozpouštědla ve sošsi nahradí ltrla-ltáteш a tento roztok se protřepává s 10% vodnýo rozookeo kyseliny citrónové a potoo t vodou.

Po vysušení a odpaření te chráněný t^rap^t^ (R_f = 0,57) uvede ve styk te soěsi éteru a n-hexanu (1:9) a ldSiltrujl se. Potoo te rozpuutí ve 4 ol 8 M roztoku· kyseliny chlorovodíkové v dioxanu, roztok te nechá stát 15 oinut a bezvodýo étereo te vysráží tetrapeptid (Rp = 0,38), který.se ldSiltrujl a prooyje. Potoo te okanožtě rozpuutí v 15 ol toěsi -hloroforou a dlшetrlforπlaшidu (2:1), pH roztoku te upraví na hodnotu 8 pooooí a přidá te 1,66 g (3 oiQooy) Boc-Tyr(Bll)oOPFP. Po 15 oinutách te uvedené rozpouštědlo ve soěsi nahradí ltrlacltáteш a přidá se 0,22 ol N,N-dioetylaoinoetylsoinu. Po 5 oinutách te tento roztok protřepává s 10% vodnýrn rutokeo kyseliny citrónové, IN vodnýo rutekeo ^seliny chlorovodíkové a nakonec s vodou. Po vysušení a odpaření te chráněný pentapeptid (R^ = 0,60) převede do éteru, ^^Ι^^ι se a proo/je étereo. Potoo se rozpuutí ve 4 ol 8 M roztoku kyseliny chlorovodíkové v dioxanu. Po 10 oinutách se pooooí éteru vysráží pentapeptid (R^ = = 0,62), ldSiltrujl te a , pnoje bllvldýш étereo. Pak te okaožtě rnpuutl ve 20 ol toěsi chloroformu a dimetylformemidu (1:1), pH roztoku se upraví na hodnotu 8 trietylmuinem a přidá se 1,6 g (4 mnmly) Boc-Val-OPFP. Směs se nechá stát po dobu 20 minut. Potom se uvedená rozpouštědla ve směsi nahradí etylacetátem a získaný roztok se protřepává s vodou a 10% vodným roztokem kyseliny citrónově. Extrakt se vysuěí, odpaří a získaný chráněný hexapeptid p (Rf = 0,65) se převede do éteru, odfiltruje se a prOmyje éterem. Pak se ihned rozpustí ve 20 ml dimetylformamidu, pH roztoku se upraví na hodnotu 8 -^^ιΙπ^^τ a přidá se . 2,9 g (6 mnolů) Boc-Arg(O02)-OPFP. Po 20 minutách se uvedené rozpouštědlo ve směsi nahradí chloroformem a tento roztok se protřepává s 10% vodným roztokem kyseliny citrónové a s vodou. Po vysušení a odpia^ení se zbytek trituruje se stTsí e^l^etát^ a éteru (1:2), odfiltruje se a promývá stejnou stTsí rozpouStědel. Získá se 2,0 g (72 %) odpooíddjícího chráněného heptapeptidu, teploty tání 185 až 187 °C, r| = 0,70.

Druhý stpeň

Z-OG1y-Arg(N02)-Val-Tyr(Bzl)-Ile-His( top)-Pro-AaaoONB

Ve 4 ml 8 M roztoku kyseliny chlorovodíkové v dioxanu se rozpuutí 1,35 g (1 mml) Boc-A?g(O02)-Val-Tyr(Bzl)-Уee-HSs(inp)pPlo-AlaoOOB. Roztok se nechá stát 15 minut, načež se pomocí bezvodého éteru vysráží heptlptptidhydrochllrid (R^ = 0,63), který se oddiltruje a promyje éterem. Potom se ihned rozpuutí v 15 ml diretylfoтaridu, pH roztoku se upraví ná hodnotu 8 -^^ιΙπ^^τ a přidá se 0,96 g (2,5 mrlu) Z-OGly-OPFP. Po 20 minutách se uvedené rozpouštědlo ve směsi nahradí chУorilormem a tento roztok se protřepává s vodou. Vodný extrakt se vye^í, odpaří, a působením etan^u se izoluje chráněný peptid ve výtěžku 1,16 g (83 %) Teplota tání: 133 až 135 °C, r2 = 0,72.

Třetí stupeň

Ocdtranění c^ánicích skupin

V 5 ml diretylforτlridu se rozpětí 1,5 g (1 muml) Z-OG1ytA-g(NO2)-VvllTyr (BzD-Ile-His(Dnp)-PrQ-Aa--ONB a přidá se 2,95 ml 2-retkaptoetliolu. R^s^'tok se nechá stát 1 hodinu, načež se přidá bezvodý éter, vzniklá sraženina se lifiltrsjt a promyje etmolem. Získá se

1,1 g (82 %) Z-011y-Arg(O02)-Val-Tyr(Bzl)-lle-His-ft'--Ala-ONB, r| = 0,15, 4 “ °.40. Tent0 chráněný peptid se rozpětí ve směsi metanolu, kyseliny octové a vody (5:1:1), přidá se 0,5 g 10% paládia na dřevěném uhlí jako katalyzátoru a za míchání se rea^ní smmsí probublává plynný vodík . po dobu 24 hodin. Průběh reakce se konn-roluje chrlmrltlrrlií na tenké vrstvě- Po skončení reakce se katalyzátor oddiltruje a prom/je se . 15 ml směsi m^e^n^t^lu, k^^£^s^e^:iny octové a vody (5:1:1). Roztok se pak odpaří do sucha, zbytek se převede do směsi etano^ a vody a někoH^Tá! se odpluje, pomooí bezvodého etan^u se pak izoluje produkt. Získá se 0,55 g (80 %) . '(hydroJχrtlctyl1, -la8)aigilttisiiu II, který se potom čistí, jak uvedeno výše.

r| = 0,28, R*! = 0,48, 4 = 0^,50^, E_Qlu (pH = ' 1,9) = 1,0.

-nnlýza am.nolyteeii: Pro = 0,95(1), ALa = 1,1(1), Val = 1,0(1), Ile = 1,0(1) , • His =1,0(1), = 110(1) а Туг = 0,9(11.

Příklad 6 (Hddoxyacetyl¹ , Tlu?/Me/8)angiotensin II .

První stupeň .

Boo-Arg (NOgl-Val-TyHBzl )-Ile-His(Dnp)-Pro-Thr(Me)-OMe

Ve 30 ml chloroformu se rozpustí 0,69 g (3 moly) yhr(Me)-0Me . HBr a přidá se 0,42 mi trielyaminu a 1,7 g (4,5 rnool) Вос-Рп-ОРРР.· Roztok se nechá stát 2 hodiny, načež se přidá 0,33 ml O,Ο-dimeeylaoinoetylaminu. Po 15 minutách se uvedené rozpouštědlo v reakční soOsi nahradí etyl^s^ce^^řteem a tento roztok se protřepává s 10½ vodným roztokem kyseliny citrónové, 1N vodným rozookem kyseliny chlorovodíkové, vodou a nakonec s 5% vodným rozookem hydrogenUhli.či.tanu so^dn^ého. Po vysušení a odpaření se chráněný dipept^{id (R}^ = O,⁷⁶) rdpuutí ve 2 ml 8 M roztoku kyseliny chlorovodíkové v dioxanu bez izolace. Po 15 minutách se roztok zředí éterem a odpaří se. Zbylý dipeptid (R^ = 0,18) se rozpětí ve 20 ml chloroformu, pH roztoku se upraví na hodnotu 8 pomocí tricy/laminu a přidá se 2,6. g (4,5 mmoou) Boo-His(Dip)vOPFP. Po 2 hodinách míchání při teplotě místnosti se k rdt^oku přidá 0,22 ml NjN-dityl aminu a roztok · se po 15· minutách protřepává s 10% vodným rclCokeo kyseliny citrónové, 1 N vodným roztokem kyseliny chlorovodíkové a s vodou. Po vysušení a odpaření se c^hráněný tripept^{Vd (R}^ = ^0,5⁾ rozpětí ve 4 ml ⁸ ° váného roztoku ^kyselin^y chLorovodíkové bez předchozí izolace, po 15 minutách se pcmocí bezvodého éteru vysráží tripeptid (Rf = 0,3), odfiltruje se a promyje éterem. Potom se · okaTitE rdpi^s^stí ve 20 ml směsi chloroformu a dioetylforoloidu (1:1), pH roztoku se upraví na hodnotu 8 treelylmnnneo a přidá se 1,6 g (4 moly) Boc-Ile-OPFP. Po 30 minutách se uvedená směs rozpouštědel nahradí etylacetáteo a tento roztok se protřepává s 10% vodným rokokem kyseliny citrónové, 1 N vodným roztokem kyseliny chlorovodíkové a nakonec s vodou.

Po vysušení a odpaření se na zbytek působí směsí éteru a n-hexanu (1:9) a izoluje se chráněný tetrapeptid. Ten se potom rozpětí v 7 ml 8 M roztoku kyseliny chlorovodíkové v dioxanu, roztok se nechá stát 15 minuU, načež se pomocní belvcdéhc éteru vysráží tetrapeptid (Ri = 0,27). Potom se ihned rdpuutí ve 20 ml smOsi chloroformu a dioetylfóomlmidu (1:1), pH roztoku se upraví na hodnotu 8 treelylmDineo a přidá se 1,6 g ·(3 mmooy) Boc-Tyr(Bzl)-OPFP. Po 30 minutách se uvedené ' rozpouštědlo ve nahradí etylacetáeeo a přidá se 0,22 ml N ,N-dioeeylaminoetylaminu. Roztok se nechá stát 15 minut, načež se protřepává s 10% vodným roztokem kyseliny citrónové, 1 N vodným roztokem kyseliny chlorovodíkové a nakonec s vodou. · Extrakt se vysuUí, odpaří a pcmocí éteru se izoluje chráněný pentapeptid (R^ = 0,63), který se získá ve výtěžku 0,4 g. Tato sloučenina se rozpuutí v 1 ml 8 M roztoku kyseliny chlorovodíkové v d^tanu, po 15 minutách se vysráží bezvodým éterem pentapeptid (Ri = 0,47), tdfiltrsje se a promyje éterem. Potom se okamžžtě rozpustí v 10 ml dioetylforoamidu, pH roztoku se · upraví na hodnotu 8 trielylmnineo a přidá se 0,4 g (1 mmol) Boc-Val-OPFP. Po 1 hodině se uvedené rozpouštědlo ve sO^£^:l nahradí chlcriCromem a tento roztok se protřepává s 10% vodným roztokem kyseliny citrónové, 1 N vodným rdookem kyseliny chlorovodíkové s vodou. Po vysušení a odpaření se pomocií éteru izoluje chráněný hexapeptid (Ri = 0,65).

Produkt se potom rdpuutí v 1 ,5 ml 8 M roztoku tyueliny chlorovodíkové v diotanu, roztok se nechá stát 15 oinut, načež se bezvodým éterem vy^^^^^ážzí hexapept,id (R4 = 0,48). Sraženina se odfiltruje, promyje éterem a ihned se rozpětí v 10 ml dioetylformamidu. U roztoku se upraví pH na hodnotu 8 pcmocí trie^ami-nu a přidá se 0,45 g (1 mmol) BocvArgíOOgJ-OPFP. Po 1 hodině se uvedené rozpouštědlo v reakční smOs! nahradí etyLlcetáeer a tento roztok se protřepává s 10% vodným roltoker kyseliny citrónové, 1 N vodným roltoker kyseliny chlorovodíkové a nakonec s vodou. Získaný extrakt se vysuUi, odpaří a působením éteru a etanolu ⁽⁹:¹⁾ se získá ·⁰,⁴⁵ g (11^,3 %⁾ chrán^ěn^ého heptapeptídu, ^rÍ = 0^,38, teplota tání: 199 až 203 °C (rozklad).

201013 14

Druhý stupeň

Z-OGly-Arg(NO₂)-V al-Tyr(Bzl)-Ile-Hi s(Dnp)-Pro-Thr (Me)-OMe

Ve 2 ml 8 M roztoku kyseliny chlorovodíkové v dioxanu se rozpustí 0,45 g (0,34 mni) Boc-Arg(N02)-Val-Tyr(Bzl)-Ile-Hi8(I>n))-J0-o-hhr (Me^OMe. Roztok se nechá stát 15 ninut, načež se přídavkem bezvo^dého éteru izo^je taptapeptiů ^(Rf = ^0,3⁵⁾· Ten se okamžitě rozpustí v 10 ml dinetylfornanidu, pH roztoku se upraví na hodnotu . 8 a přidá se 0,4 g (1 mni) Z-OGly-OPFP. Po 1 hodině se reakční směs zředí 30 ml chloroformu a protřepává se s vodou. Po vysušení a odj^E^jřei^ií se pomooí sněsi éteru a etanolu (9:1) izoluje chráněný peptid ve výtěžku 0,45 g (93 %)· Teplota tání: 158 ai 162 °C, R^ = o,44.

Třetí stupeň

Odssranění círám-cích skupin

V 1,5 ml dimetyl^:^om^8^idu se rozpustí 0,45 g (0,31 mnnl·) Z-0Gly-Arg(N02)-Val-Tjn?(BBz')-ie--Hss8Dnp)-Poo-hhr(M))-Me a přidá se 1 ml 2-reekaptootaIols. Po 1 hodině se bezvodým éterem vysráží substance, rozpuutí se v metanolu,_odbarví pomocí malého množtví aktivního uhlí a nakonec se odpaří. Zbytek po odpaření se trituruje s éterem a odfiltruje se· Získá ^se 0,38 ^g (98 %) Z-0Gl^y-AI’^g(N0₂)^-Val-Tyr(Bzl)-Ie^--HS^--Po^--Th⁽’(M^e)-OMe, = 0,16, = 0^,52.

Produkt se suspenduje v 5 ml dioxanu a přidá se 1,2 ml 1 N vodného roztoku hydroxidu sodného. Roztok 'se nechá stát 1 hodinu, načež se jeho pH upraví na hodnotu 3 pomocí 1 N vodného roztoku kyseliny chlorovodíkové. Získaná sraženina se rozpuutí ve snnsi chloroformu a dinrtylformamifu (3:1). Po vysušení a odpaření se působí na volný peptid, tj. bez původní sku^pin^y na koncovém atomu uhl^u, ^éteren a z^ísk^á se ^{0,26 g (}7⁰ %⁾ vol.n^ého pep^i^u, ^R = = 0,25. Ten se pak rozpuutí v 10 ml snnsi metanolu, kyseliny octové a vody (5:1:1) přidá se 0,1 g paládia na dřevěném uilí jako katalyzátoru a za míchání se reakční snnsi probublává plynný vodík po dobu 16 hodin. Průběh reakce se kontroluje ch-omrao^gr-aií na tenké vrstvě. Po ukončení reakce se katalyzátor oddiltruje a roztok se odpaří do sucha. Zbytek se rozpuutí ve sž^í^^ vody a etanolu a o^i^^iřzí se vícekrát po sobě. Získá se 0,16 g (80 %) ;

(hydroo^χacc^eyl¹,^-Thr/Me/^S)αIgioteIsⁱIU II, ^který ^lze óislti^ výše uvedeným způsoben. .

r| = 0,22, Rf = 0^,53, Rf = 0^,50^, E_Qlu (^pH = 1^,9) = 0,98.

Alalýza aminolfyssein: Thi· = 0,6(1), Pro = 1,0(1), Val = 1,0(1), Ile = 1,02(1),

Tyr = 0,85(1), -is = 1,0(1) a Arg = 0,96(1).

Claims

1. Způsob přípravy nových analogů angiotensinu II obecného vzorce I,

X-Arg^vl-TTy-ne-His-Pro-í (I) v němž

X je zbytek odvozený od alifatické aIfa-hyfdroJQrУagboxyIové kyseliny a

Y znamená zbytek odvozený od alifatické aIfaaminoУágboxyIově kyseliny, a jejich edičních solí s kyselinami a jejich konrlexů, vyzmauuící se tín, že se reaktivní derivát heltαleptifu obecného vzorce II, _;

H-Arg(A)-Val-Tyr(B)-Ile-Hi s(E)-Pro-Y-CG (II) kde značí

A · skupinu vhodnou pro přechodné chránění guoiidinové skupiny argininu,

В skupinu vhodnou pro přechodné chránění aromatické hydroxylové skupiny tyrosinu,

E skupinu vhodnou pro přechodné chránění imidazolové skupiny histidinu,

G skupinu vhodnou pro chránění karboxylové skupiny alifatické aminokyseliny na koncovém atomu uhlíku, přičemž tato chránící skupina je stálá v mírně kyselém prostředí, ale je odštěpitelná působením silných kyselin nebo bází, nebo katalytickou hydrogenací a

Ϊ má výše uvedený význam, uvede v reakci s reaktivním derivátem aminooxykarboxylové kyseliny obecného vzorce III,

W-X'-M (III) v němž

X* je skupina odvozená od alifatické alfa-aminooxykarboxylové kyseliny,

W je chránící skupina odstranitelná acidolysou nebo katalytickou hydrogenací a

W-X*-Arg(A)-Val-Tyr(B)-Ile-His(E)-Pro-Y-OG (IV) kde

B, W, X', Y, A, E a G mají výše uvedený význam, se odštěpí chránicí skupina ve významu symbolu E a potom se odštěpí chránící skupiny na ostatních postranních řetězcích a koncové chránicí skupiny pomocí katalytické hydrogenace a popřípadě se získané sloučeniny obecného vzorce I přemění na adiční soli s kyselinami nebo na komplexy.

2. Způsob podle bodu 1, vyznačující se tím, že se používá výchozích sloučenin obecných vzorců II а III, v nichž je A nitroskupina nebo tosylová skupina, В benzylová nebo substituovaná benzylová skupina, E dinitrofenylová skupina, W benzyloxykarbonylová nebo terc.butoxykarbonylová skupina, x' siminooxy асе tylová nebo alfa-aminooxypropionylová skupina a M znamená pivaloyloxylovou, nitrofenoxylovou, 2,3,5-trichlorfenoxylovou, pentachlorfenoxylovou, pentefluorfenoxylovou, N-sukcinimidoxylovou nebo azidovou skupinu.

3· Způsob podle bodu 1, vyznačující se tím, že se ze sloučeniny obecného vzorce IV odstraňuje chránicí skupina ve významu symbolu E pomocí 2-merkaptoetanolu.