DE2831271A1

DE2831271A1 - Neue, in der l-stellung eine alpha -hydroxysaeure enthaltende, angiotensin-ii-antagonistisch wirkende peptide und verfahren zur herstellung dieser verbindungen

Info

Publication number: DE2831271A1
Application number: DE19782831271
Authority: DE
Inventors: Katalin Dr Gidai; Egon Dr Karpati; Lajos Dipl Ing Chem Kisfaludy; Geb Kuprina Olga Nyeki; Geb Sarkoezi Maria Szirmai; Laszlo Dr Szporny
Original assignee: Richter Gedeon Vegyeszeti Gyar RT
Current assignee: Richter Gedeon Vegyeszeti Gyar Nyrt
Priority date: 1977-07-18
Filing date: 1978-07-17
Publication date: 1979-03-01
Also published as: JPS5831337B2; CS201013B2; SE7807824L; ATA518378A; DK319578A; IL55075A0; GB2002779A; PL208497A1; IL55075A; CA1114810A; JPS5422368A; BE869076A; YU171578A; FI64797C; IN149852B; AU520176B2; FR2398049A1; AU3800978A; NO782464L; DE2831271C2

Description

DIpL-Chera. DR. Pe™ WÄGER

Patents; vs!i

8 Μ:Γ··:π-Ν 5, Moraaeiatr. 8/Π Telefon 223752

t3.KOV.t97·

NEUE, IN DER 1-STELLUNG EINE α-HYDROXYSAURE ENTHALTENDE, ANGIOTENSIN-II-ANTAGONISTISCH WIRKENDE PEPTIDE UNO VERFAHREN ZUR HERSTELLUNG DIESER VERBINDUNGEN

Die Erfindung betrifft die Herstellung von neuen, angiotensin-II-antagonistiech wirkenden Peptiden der allgemeinen Formel I

X-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Y

worin

X den Rest einer in der α-Stellung eine Hydroxylgruppe enthaltenden aliphatischen Carbonsäure, besonders

A 1360-67 /Fn6

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eine Hydroxyacetyl- oder a-Hydroxypropionylgruppe_/ und Y den Rest einer aliphatischen α-Aminocarbonsäure, besonders eine Leucyl-, Isoleucyl-« Alanyl- oder Threonylgruppe,

bedeuten, sowie von Säureadditionssalzen und Komplexen solcher Peptide.

Angiotensin-II ist ein blutdrucksteigend wirkendes Octapeptid, welches im Organismus auf solche Weise entsteht, daß ein aus der Niere freigesetztes Enzym, das Renin, das durch die Leber produzierte α-Globulin in das Decapeptid Angiotensin-I überfuhrt und dieses dann im Organismus in Angiotensin-II überführt wird·

Im Dahr 1970 wurde das erste Angiotensin-II-Analogjs beschrieben, eine Verbindung, welche sich sowohl in vivo, als auch in vitro als spezifischer Kompetitiver Inhibitor von Angiotensin-II verhält [G.R. Marschall u· Mitarb., Proc. Nat. Acad. Sei. USA 67, 1624 (1970)· P.A. Khairralah u. Mitarb. ü. Med. Chem. 18, 181 (1970)]. Diese Beobachtung hat in breitejr Kreisengroßes Interesse hervorgerufen; zahlreiche Forscher wurden dazu angeregt, neue antagonistisch wirkende Angiotensin-II-Analoga zu synthetisieren und zu untersuchen, welche zurd-er* Diganostizierung und eventuell zur therapeutischen Behandlung von durch Renin beeinflußten Hypertensionen eingesetzt werden könnten. Es hat sich gleich am Anfang dieser Forschungsarbeit herausgestellt, daß ,ersieh zu diesem Zweck diejenigen Angiotensin-II-Analoga am besten bewähren, in welchen die Phe-Gruppe in der* 8-Stellung des Angiotensin-II-Moleküls durch irgendeine^aliphatische Seitenkette enthaltende Aminosäure ersetzt ist. Eine solche Abänderung des Moleküls bedeutet nämlich eine praktische^ Aufhebender agonistischen Wirkung bei gleichzeitige^ -τ t einer

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starken antagonistischen Wirkung des Produkts [vgl·: 0« Gagnon u. Mitarb., Br. 3. Pharmacol. 43, 409 (1971)· 0·Τ. PaIs u. Mitarb. Circ. Res. 29, 664 (1971)]. Die antagonistische Wirkung kann noch erheblich gesteigert werden.wenn man neben der obenerwähnten Abänderung der 8-Stellung des Moleküls auch die in der 1-Stellung befindliche Asp-Gruppe durch Sar ersetzt [vgl.: 0.T. PaIs. u. Mitarb·, Circ. Res. 29, 673 (1971)]. Das auf diese Weise hergestellte (Sar , AIa )-Angiotensin-II-Analogen wurde später unter dem Namen "Saralasin" auch in Verkehr gebracht. Seine vorteilhaften Eigenschaften wurden durch eine Herabsetzung des in vivo eintretenden enzymatischen Abbaus und durch große Affinität des Moleküls zu den Rezeptorzellen erklärt.

Durch die auf diesem Gebiet durchgeführten klinischen Untersuchungen [H.R. Brunner u. Mitarb·, Lancet 1973. 1045; A.3.M, Donker u. Mitarb., Lancet 1974. 1535; T. Ogihara u. Mitarb·, Lancet 1974. 219; D.H. Laragh u. Mitarb., New Engl. 3. Med. 292, 695 (1975); W.A. Pettinger u· Mitarb., New Engl. 3, Med. 292. 1214 (1975); D.H.B· Streeten u. Mitarb., Circ· res.. 36, Suppl. 1, 125 (1975); H.R. Brunner u. H. Gavras, Schweiz. Med. Wschr. 106-, 1791 (1976)] wurden die schon am Anfang dieser Forschungsarbeit gemachten Annahmen, daß die antagonistisch wirkendeoAnaloga von Angiotensin-II in der Diagnose und in der Therapie von durch Renin beeinflußten Hypertensionen anwendbar sein werden, in vollem Umfang bestätigt [vgl·: D. Ganton und F. Gross, Med· Klin, 21» 2043 (1976); 3.L, Marx, Science 194, 821 (1976); P. Needleman und G.R. MaSchall, Fed.· Proc. 35, 2486 (1976)].

Ein Vergleich der Strukturen und biologischen Wirkungen der bis dahin hergestellten Angiotensin-II-Anelog·

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hat zahlreiche wichtige Informationen zur Deutung der agonistischen bzw· antagonistischen Wirkung geliefert [M*C· Khosia u. Mitarb·, Handbook of Experimental Pharmacology» Vol. 37, Ι·Η· Page u. P.M. Buinpus ed., 1974; G.R. Marshall, Fed. Proc. 35, 2494 (1976)].

In der letzt^/en Zeit steht besonders die Herstellung von .nebenwirkungsfreien, längere biologische HaIbwertzeiten freuenden Antagonisten im sLeff Vordergrund der Forschung [vgl·: M.C· Khosia u. Mitarb·, ü* Med· Chem.

244 (1976); ibid. 20, 253 (1977)].

Es wurde nun gefunden, daß man durch die Ersetzung des in der 8-Stellung befindlichen Phenylalanine durch den Rest einer aliphatischen α-Aminocarbonsäure und durch das Einfuhren des Restes einer in der α-Stellung eine Hydroxygruppe enthaltenden Carbonsäure in die 1-Stellung der Peptidkette solche angiotensin-II-kompetitive Inhibitoren herstellen kann, welche die durch Angiotensin-II erzeugte Hypertension in vivo erheblich herabsetzen und diese Wirkung auch bei subcutaner Verabreichung ausüben können·

Die derartigen angiotenein-II-antagonistischen Peptide können durch die allgemeine Formel I

X-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Y (i)

worin X und Y die oben angegebener)Bedeutung] haben, gekennzeichnet werden; sie werden im Sinn der Erfindung so hergestellt, daß man ein reaktionsfähiges Heptepeptidderivat der allgemeinen Formel II

H-Arg(Aj(-Val-Tyr(B)-Ile-His(E)-Pro-Y-OG (il)

worin

A eine zum temporären Schutz des Guanidinorestes von Arg geeignete Schutzgruppe, vorteilhaft eine Nitro- oder

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Tosylgruppe,

B eine zum temporären Schutz der aromatischen Hydroxylgruppe von Tyr geeignete Schutzgruppe, vorteilhaft eine Benzyl- oder substituierte Benzy!gruppe, E eine zum temporären Schutz der^jjidazolgruppe von His geeignete Schutzgruppe, vorteilhaft eine Dinitrophenylgruppe,

eine zum Schutz der Carboxylgruppe der C-terminalen Aminosäure geeignete, gegenüber schwach sauren Einflüssen widerstandsfähige, aber durch katalytische Hydrogenolyse oder durch Behandeln mit stärkeren Säuren oder mit Alkalien abspaltbare Schutzgruppe und

Y die oben angegebene Bedeutung hat,

mit einem reaktionsfähigen Aminooxycarbonsäurederivat der allgemeinen Formel ZII

W-X*<-M (III)

worin

X*¹ einen in der α-Stellung eine Aminooxygruppe enthaltender) aliphatischen Carbonsäurerest, besonders eine Aminooxyacetyl- oder a-Aminooxypropionylgruppe,

W eine durch AcidοIyse oder katalytische Hydrogenolyse abspaltbare Schutzgruppe, vorteilhaft eine Benzyloxycarbonyl- oder tert.-ButyloxycarbonylgruppS/und

M eine Hydroxylgruppe oder eine an sich bekannte aktivierende Gruppe, vorteilhaft eine Pivaloyloxy-, Nitrophenoxy-, 2,3,5-Trichlorphenoxy-, ßentachlorphenoxy-, ßentafluorphenoxy-, N-Succinimidoxy- oder Azidogruppe.

i^eoiefe

umsetzt und von der erhaltenen Verbindung der allgemeinen Formel IV

W-X»-Arg(A)-Val-Tyr(B)-Ile-His(E)-Pro-Y-OG (IV)

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zuerst die Schutzgruppe E, dann die übrigen, an den Seitenketten anwesenden bzw« terminalen Schutzgruppen entfernt^ und gewünschtenfalls da£ erhaltene Peptid der allgemeinen Formel I in ein Säureadditionssalz oder einen Komplex überführt.

Schutzgruppe E wird vorteilhaft durch Behandlung mit 2-Mercaptoäthanol entfernt; die übrigen Seitenketten- und terminalen Schutzgruppen werden durch katalytische Hydrogenolyse abgespalten; das Entfernen dieser weiteren Schutzgruppen kann also in einem Schritt erfolgen. Dabei wird aber von der N-terminalen a-Aminooxysäure auch die Aninogruppe in der Form von Ammoniak abgespalten, so daß als Endprodukt ein in der N-terminalen Stellung die entsprechende «-Hydroxycarbonsäure enthaltende/l Peptid erhalten wird· Diese Herstellungsweise von in der N-Terminalen Stellung einen a-Hydroxycarbonsäurerest enthaltenden Peptiden ist eine neue« bisher nicht beschriebene Methode,

eine

welche ein Jart sich neues Element des erfindungsgemäßen Verfahrens bildet·

Die im erfindungsgemäßen Verfahren als Ausgangsstoffe einsetzbaren reaktionsfähigen Heptapeptidderivate der allgemeinen Formel II können nach beliebige^ in der Peptidchemie üblichen Methoden, z.B. nach der in der ungarischen Patentschrift Nr. 168 431 beschriebenen Methode, hergestellt werden· In diesem Herstellungsverfahren werden zum Schutz der funktioneilen Seitengruppen zweckmäßig solche Schutzgruppen eingesetzt, welche unter den Bedin-

Y*
gungen deff zum Abspalten der nach der Koppelungereaktion zu entfernenden Schutzgruppen durchgeführten Acidolyse stabil bleiben·

Nach einer vorteilhaften Aueführungsweise des erfindungsgemäßen Verfahrene wird zum temporären Schutz der

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Carboxylgruppe der C-terrainalen Aminosäure die p-Nitrobenzylgruppe (NB), zum Schutz der Guanidinogruppe von Arginin die Nitrogruppe verwendet, während die Hydroxylgruppe von Tyrosin durch die Benzylgruppe und der Imidazolring von Histidin durch die Dinitrophenylgruppe (Dnp) geschützt wird· Diese Schutzgruppen sind unter schwach sauren Bedingungen stabil, so daß die N-terminale Boc-Gruppe ohne Schädigung dieser Gruppen entfernt werden*kann· Durch diese vorteilhafte Kombination der Schutzgruppen wird es ermöglicht, daß man den Verbindungen der allgemeinen Formel IV zuerst die Dinitrophenylgruppe abspaltet und dann durch katalytische Hydrogenolyse in einem einzigen Schritt unmittelbar die Endprodukte der allgemeinen Formel I erhält.

Die erfindungsgemäß hergestellten Verbindungen der allgemeinen Formel I können nach an sich bekannten Methoden, vorteilhaft durch Ionenaustauechchromatographie an Carboxymethylcellulo8e_/ gereinigt werden· Dabei werden die Produkte meistens in der Form von lyophilisierten Pulvern erhalten; solche Produkte können unmittelbar zur Bildung von verschiedenen Salzen oder Komplexen eingesetzt werden·

Die antagonistischen Wirkungen der neuen Verbindungen der allgemeinen Formel I wurden an narkotisierten mänlichen Kitzen untersucht·- Der Blutdruck der Tiere wurde an der Halsarterie gemessen· Die Untersuchungen wiu» den derart durchgeführt, daß in eine Schenkelvene Hypertenein in einer Dosierungerate von °,5 ug/kg/min infundiert wurde; nachdem sich die Blutdrucksteigerung stabilfceiert hatte, wurde die zu untersuchende Substanz in physiologischer Kochsalzlösung in einer einmaligen intravenös oder subcutan verabreicht, und dann wurde die

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durch den verabreichten Wirkstoff verursachte Verminderung des Blutdrucks gemessen·

Die durch die intravenöse Verabreichung von verschiedenen neuen Verbindungen verursachte Verminderung des Blutdrucks der Tiere wird durch die in der Tabelle I zusammengefaßten Oaten veranschaulicht· Diese Daten sind Durchschnittswerte von 6 Messungen^-mit der Angabe der Streuung der Mittelwerte· Zum Vergleich wurden auch die mit dem bekannten Saralasin, d.h. 1-(N-Methylglycin)-5-L-valin-8-L-alanin-angiotensin-II unter den gleichen Bedingungen erhaltenen Werte angegeben.

Tabelle I

Wirkung der in der 1-Stellung oc-Hydroxysäuren enthaltenden Angiotensin-II-Analoga auf den Blutdruck unter Infusion von Angiotensin-II

Veränderung des Blutdrucks Wirkstoff (mm Hg) nach i.v·. Dosen von

10 /ig/kg 20 yug/kg

(Hydroxyacetyl¹, Leu⁸)-Ang-II -31+4,7-42£2,8 (Hydroxyacetyl¹, XIe⁸)-Ang-II -24+1,7 -30^2,3

[Hydroxyacetyl'*, Thr(Me)⁸]-

-Ang-II -33+5,3 -38+4,1

(L-a-Hydroxypropionyl , Leu )-

-Ang-II -32+2,7 -40+2,7

(L-a-Hydroxypropionyl', He )-

-Ang-II -31+3,3 -38+4,1

Serala8in -41+2,5

Aus den Daten der obigen Tabelle ist >e^eindeutig ersichtlich, daß sämtliche in der 1-Stellung durch einen eine α-Hydroxylgruppe enthaltenden aliphatischen Carbonsäurerest substituiertenAngiotensin^II-Analoga sehr erhebliche blutdrucksenkende Wirkungen haben. Oie Höhe

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dieser Wirkung ist proportional jjnft der Größe der verabreichten Dosen·

Die Untersuchungen wurden auch auf die in der Lite ratur nicht übliche subcutane Verabreichungsweise dieser Verbindungen ausgedehnt« In diesem Fall wurde der die zu untersuchende/r"Substanz enthaltenden physiologischen Kochsalzlösung auch noch Carboxymethylcellulose oder Gelatine (in der nachstehenden Tabelle: CMC bzw· GIt) zugesetzt· Die in der nachstehenden Tabelle II zusammengefaßten Versuchsergebnisse sind Durchschnittwerte von an je fünf Tieren durchgeführten Messungen, wobei die Streuung^aer Mittelwerte ebenfalls angegeben sind·

Tabelle II

Wirkung der in der 1-Stellung eine a-Hydroxysäure enthaltenden Angiotensin-II-Analoga auf den Blutdruck bei s«c« Verabreichung^- unter Infusion von Angiotensin

Wirkstoff Dosf Zusatz Blutdrucksenkung mm Hg, nach

r⁹ llZnn ^{15 30 60}

s.c. Losung Minuten

(L-oc-Hydroxy-

propionyl ,

Leu⁸)-Ang-II 200 CMC -28+3,1 -38+2,4 -25+1,5 -5+1,8

(L-a-Hydroxypropionyl ,

Ile⁸)-Ang-II 200 GIt -28+10 -28,+7,O -25^6,0 -5^7,3

Die Daten dieser Tabelle zeigen, daß die neuen Verbindungen Jute subcutaner Verabreichung den experimentell hervorgerufenen hohen Blutdruck auch nach 60 Minuten noch erheblich herabsetzen·

Auf Grund dieser Eigenschaften können die erfin-

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dungsgemäBen neuen Angiotension-II-Analoga^- sowie die physiologisch unbedenklichen Salze und Komplexe dieser neuen Verbindungen in der Therapie als blutdrucksenkende Mittel angewendet werden· Unter physiologisch unbedenklichen Komplexe^dieser neuen Angiotensin-II-Analoga sind solche Produkte zu verstehen« welche durch die Zugabe von gewissen organischen oder anorganischen Stoffen entstehen und dem Wirkstoff eine retardierte Wirkung verleihen. Als solche komplexbildende organische Stoffe kommen Gelatine, Carboxymethylcellulose, Alginsäureester, Polyphloretinphosphate, Aminosäure-polymere*. sowie andere Polymere und Copolymere in Betracht· Als physiologisch unbedenkliche Salze der neuen Peptide können die üblichen, pharmazeutisch anwendbaren Säureadditionssalze, z.B. Acetate,hergestellt werden·

Die neuen Peptide^- sowie deren physiologisch unbedenkliche Salze und Komplexe werden in der Therapie in der Form von üblichen Arzneimittelpräparaten eingesetzt· Oiese Präparate enthalten die neuen Verbindungen -Bg/ zur enteralen oder parenteralen Verabreichung geeigneten anorganischen oder organischen Trägerstoffen· Die Arzneimittelpräparate können in der Form von festen Lyophilisaten hergestellt werden; in diesem Fall kommen als Trägerstoffe verschiedene^mit den Peptiden nicht reagierende Verbindungen, wie z.B. Kohlenhydra- te_/ in Betracht· Ferner kann man konzentrierte oder verdünnte Suspensionen oder Emulsionen als Arzneimittelpräparate herstellen, welche neben den üblichen flüssigen Trägeretoffen auch stabilisierende und konservierende

Hilfetoffe enthalten.

Solche Arzneimittelpräparate können in der Therapie zur Behandlung von allen solchen Syndromen verwendet

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werden, in deren Ätiologie ein erhöhter Renin-Blutspiegel eine Rolle spielt; sie können ferner als Diagnostika zu einer differenzierten Unterscheidung von Hypertensionen renaler Herkunft dienen.

Die Herstellung der erfindungsgemäßen neuen Peptid e/f wird durch die nachstehenden Beispiele näher veranschaulicht· Die in den Beispielen verwendeten Abkürzungen entsprechen den in der Fachliteratur üblichen Abkürzungen, vgl.: 3. Biol. Chem., 247, 977 (1972). Die von cc-Aminooxysäuren stammenden Gruppen werden durch ein dem üblichen Symbol der entsprechenden Aminosäure vorgesetzte^ ^H0" bezeichnet; so bedeutet z.B. "OGIy" Aminooxyessigsäure, "OAIa" L-a-Aminooxypropionsäure usw. Als weitere Abkürzung wird "PFP" für die Bezeichnung von Penta^fluorphenyl verwendet.

Bei der Herstellung der verschiedenen Verbindungen wurde das Eindampfen von Lösungen immer mit dem BÜGhischen "Rotavapor"-Apparat durchgeführt. Die Schmelzpunkte wurden mit dem Or_e Tottolischen Apparat (Büchi) bestimmte Dia Dünnschichtchromatografie wurden auf nr'r* "Kieselgel G nach Stahl⁰⁹ (E. Merck, Darmstadt)fPlatten aufgenommen· zu der Entwicklung der Chromatogramme wurden die folgenden Lösungsmittelsysteme verwendet: 1) Athylacetat: (Pyridin-Essigsäure-Wasser 2O:6:11)»95:5

2) Athylacetat: (Pyridin-Essigsäure-Wasser 20-s6:1i)»90r10

3) Athylacetat: (Pyridin-Essigsäure-Wasser 20i6:1i)»80:30

4) Athylacetat: (Pyridin-Essigsäure-Wasser 20:6:11) = 70:30

5) n-Butanol : Essigsäure j Wasser »4:1:5

6) n-Butanol : Essigsäure : Pyridin : Wasser * 30:6:20:24 7) n-Butanol : Athylacetat : Essigsäure s Wasser « 1:1:1:1

Bei den angegebenen Rf-Werten ist das zur.Bestimmung verwendete Lösungsmittelsystem jeweils angegeben.

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z.B. R_f

(3)

Die papierelektrophoretischen Untersuchungen wurden in einem "LMIM* horizontalen Mittelspannungsapparat, auf "MN-214*—Papier*, in einer Pufferlösung von pH =» 1,9 neben Glutaminsäure durchgeführt. Die angewendete.Stromspannung war 450 V^, mit einer Zeitdauer von 3 Stunden.

Die Dünnschichtchromatogramme wurden einerseits mit Ninhydrinlösung, andererseits nach der üblichen Chlorierung^ mit o-Tolidin-3odkaliumlösung entwickelt.

Die Endprodukte wurden nach der folgenden Methode gereinigt: 0,5 g freies Peptid wurde in 4 ml 0,01 M Ammoniumacetat-Pufferlösung gelöst; die Lösung wurde auf eine 0,5 1 Carboxymethylcellulose (CMC 52) enthaltende und vorher mit der obigen Pufferlösung ins Gleichgewicht gebrachte Säule aufgetragen. 1,5 1, 0,01 -M" und 1,5 L· 0,4 M Ammoniumacetatlösungen wurden mit einem Gradientmischer vermischt, und so wurde eine Gradient-Elution durchgeführt. Die Strömungsgeschwindigkeit war 25 ml/Stunde; Fraktionen von je 10 ml wurden aufgefangen. Das von der Säule kommende Eluat wurde mit Hilfe eines "LKB-Uvicord-II"-Apparats (Hersteller: LKB, Uppsala, SchwedenjVlSufend registriert. Die auf Grund der Registrierkurve identifizierte Haupt fraktion wurde lyophilisiert,,, das Lyophilisat ebenfalls durch Gradient-Elution rechromatographiert und wieder lyophilisiert·

Die Herstellung der neuen Angiotensin-II-Analoga wird durch die nachstehenden Ausführungsbeispiele näher veranschaulicht; es ist aber zu bemerken, daß das beschriebene Verfahren sowohl bezüglich der an eich bekannten peptidchemischen Operationen^, als auch bezüglich der Wahl der Schutzgruppen verschiedene, dem Fachmann an der Hand eee Variationen zuläßt, so daß die Er-

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findung in keiner Weise auf diese konkreten Beispiele beschränkt ist«

Beispiel 1

(Hydroxyacetyl , Leu )-angiotensin-II Schritt 1:

Boc-Arg(N0₂>-Val-Tyr(Bzl)-Ile-His(Dnp)-Pro-Leu-ONB

4,2 g (12 mMol) Leu-ONB.HBr wurden in 50 ml Chloroform gelöst und es wurden^ 1,68 ml Triäthylamin und 3,81 g (10 mMol) Boc-Pro-OPFP der Lösung zugesetzt. Das Gemisch wurde bei Raumtemperatur 20 Minuten gerührt, dann mit Wasser und mit 10 %-iger wäßriger Citronensäurelösung ausgeschüttelt, getrocknet und eingedampft· Das als Rückstand erhaltene geschützte Dipeptid (R* ^a 0,8) wurde unmittelbar», ohne Reinigung in 20 mire M Lösung von Salzsäure in Oioxan gelöst; nach 10 Minuten wurde die Lö-

sung mit trockenem Äther verdünnt und eingedampft· Das auf diese Weise erhaltene, an der N-terminalen Aminosäure freie Dipeptid-hydrochlorid (R^ ⁴' ■ 0,56) wurde in 50 al Chloroform gelöst, die Lösung mit Triäthylamin auf pH » 8 eingestellt und mit 8,8 g (15 mMol) Boc-His(Dnp)- -OPFP versetzt· Die erhaltene Lösung wurde bei Raumtemperatur eine Stunde gerührt, wobei der pH-Wert der Lösung stets bei 8 gehalten wurde· Dann wurden 1,65 ml N,N-Dimethylamino-äthylamin zum Entfernen des überschüssigen Aktivesters der Lösung zugesetzt, und nach 10 Minuten wurde das Reaktionsgemisch mit 10 %-iger wäßriger Citronensäurelösung, mit 1 n-Salzsäurelösung und mit 5 %-iger Natriumhydrogencarbonatlösung in der angegebenen Reihenfolge ausgeschüttelt, getrocknet und eingedampft« Das als Rückstand erhaltene geschützte Tripeptid (R₄: » 0,65) wurde unmittelbar^ ohne Reinigung in 25 ml^Ö—molaren Lösung von Salzsäure in D^oxan gelöst; nach 15 Minuten

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Stehen wurde das erhaltene, an der N-terminalen Aminosäure freie Tripeptid (R_f ' » 0,47) durch däre^ Zugabe von trockenem Äther gefällt, abfiltriert und sofort im Gemisch von 50 ml Chloroform und 20 ml Dimethylformamid gelöst· Die Lösung wurdemifi Triäthylamin auf pH = abgestellt und mit 6,0 g (15 mMol) Boc-Ile-OPFP versetzt. Nach 30 Minuten Stehen-wurde das Reaktionsgemisch zur Trockne einge-

dampft, der Rückstand in 100 ml Athylacetat gelöst und die Lösung mit 10 %-iger wäßriger Citronensaurelösung, mit 1 n-Salzsäurelösung und mit Wasser ausgeschüttelt.

Die organische Lösung wurde dann getrocknet, das Athylacetat verdampft und der Rückstand mit einem 1 :9-Gemisch von Äther und η-Hexan behandelt. e lierte geschützte Tetrapeptid (R^ = 0,64) wurde in, 25 ml 8 molarer Lösung von Salzsäure in Dioxan geJUTst, nach 15 Minuten wurde das erhaltene, an der N^ferminale Aminosäure freie Tripeptid (R^' = 0,47) >dtjrch die Zugäbe von trockenem Äther gefällt, abfiltriert und sofort im Gemisch von 50 ml Chloroform urjiKzO ml Dimethylformamid gelöst· Die Lösung wurde durcjr'aie Zugabe von Triäthylamin auf pH - 8 gestellt upramit 6,0 g (15 mMol) Boc-Ile- -OPFP versetzt. Nach 3€» Minuten wurde das Reaktionsgemisch zur Trockne eingedampft, der Rückstand in 100 ml Athylacetat ge^äet und die Lösung mit 10 %-iger wäßriger

CitronensäupBiösung, mit 1 N Salzsäurelösung und mit

Wasser ausgeschüttelt· Die organische Phase wurde dann getpocknet und eingedampft und der Rückstand mit einem 1:9 h a. Das auf diese Weise erhalten^ geschützte Tetrapeptid (R^ » 0,64)

wurde in 25 mlfiT-iiiolaren Lösung von Salzsäure in Dioxan gelöst, und nach 15 Minuten Stehen wurde das erhaltene, an der N-terminalen Aminosäure freie Tetrapeptid

Ca.) m

(Rx ' » 0,40) durch βίά" Zugabe von trockenem Äther gefällt

909809/071$

und abfiltriert· Das erhaltene Tetrapeptid-hydrochlorid wurde im Gemisch von 50 ml Chloroform und 30 ml Dimethylformamid gelöet^aie Löeung durch die'Zugabe von Triäthylamin auf pH = Eingestellt und mit 6,0 g (11,5 mMol) Boc- -Tyr(BzI)-OPFP versetzt. Nach 15 Minuten Stehen wurde die Lösung eingedampft, der Rückstand in Athylacetat gelöst und mit 0,66 ml Ν,Ν-Dimethylamino-äthylamin versetzt· Nach 10 Minuten Stehen wurde die Lösung mit 10 %-iger wäßriger Citronensäurelösung, mit 1 η Salzsäurelösung und mit Wasser ausgeschüttelt, getrocknet und eingedampft,

ti

der Rückstand mit trockenem Äther behandelt und das auf diese Weise erhaltene geechü^zte Pentapeptid (R, » 0,8) durch Filtrieren abgetrennt· Dieses Produkt wurde dann in 25 ml/"8--molaren Lösung von Salzsäure in Dioxan gelöst und nach 15 Minuten wurde das erhaltene, an der N-terminalen Aminosäure freie Pentapeptid (R- ' = 0,8) durch d±ö" Zugabe von trockenem Äther gefällt, abfiltriert, mit Äther gewaschen und sofort in 50 ml Dimethylformamid gelöst· Die Lösung wurde mit Triäthylamin auf pH » abgestellt und mit 4,2 g (11 mMol) Boc-Val-OPFP versetzt. Die Lösung wurde bei Raumtemperatur eine Stunde gerührt, dann eingedampft', der Rückstand in Chloroform gelöst^ aie Löeung mit 10 %-iger wäßriger Citronensäurelösung,mit 1 n-Salzsöurelösung und mit Wasser ausgeschüttelt, getrocknet und einge-

dampft. Der Rückstand wurde mit Äther behandelt und das

(2) auf diese Weise erhaltene geschützte Hexapeptid (R^ =0,82) durch Filtrieren abgetrennt· Dieses Produkt wurde in 25 müos molaren Lösung von Salzsäure in Dioxan gelöst und nach 15 Minuten Stehen wurde das erhaltene, an der N-ter-

(3) minalen Aminosäure freie Hexapeptid (R. ' » 0,56) durch Zugabe von trockenem Äther gefällt, abfiltriert^und mit Äther gewaschen. Das Produkt wurde sofort in 50 ml Di-

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/19

$ill -™

methylformamid gelöst, mit Triäthylamin auf pH =. 8-gestellt und mit 4,8 g ("10 mMol) Boc-Arg(NO₂)-OPFP versetzt. Nach 30 Minuten wurde das Lösungsmittel verdampft und durch Chloroform ersetzt und diese Lösung mit 1 n-Salzsäurelösung und mit Wasser ausgeschüttelt« Die abgetrennte organische Phase wurde getrocknet, eingedampft und der Rückstand mit Äthanol behandelt· Auf diese Weise wurden 7,6 g ge-

C ι?}
schütztes Heptapeptid (R* * 0,8) erhalten (Ausbeute fur das als Ausgangsverbindung eingesetzte Boc-Pro-OPFP berechnet: 53 %); F. 192-195 ⁰C.

Schritt 2
Z-OGly-Arg(NO₂)-Val-Tyr(Bzl)-Ile-His(Dnp)-Pro-Leu-ONB

1,8 g (1,25 mMol) Boc-Arg(NO-)-^Val-Tyr(BzI)-IIe-His(Dnp)-Pro-Leu-ONB wurden in 10 mlTS^wTösung von SaIzsäure in Oioxan gelöst; nach 15 Minuten Stehen wurde das erhaltene, an der N-terminalen Aminosäure freie Heptapeptid-Hydrochlorid durch die^Zugabe von trockenem Äther

gefällt, abfiltriert und mit trockenem Äther gewaschen (R* ' ^a 0,36)· Dieses Produkt wurde sofort in 20 ml Di-

. tVKXA

methylformamid gelöst^ die Lösung mit Triäthylamin auf pH »abgestellt und mit 0,9 g (2,3 mMol) Z-OGIy-OPFP versetzt· Nach 15 Minuten Stehen wurde das Lösungsmittel verdampft und durch Chloroform ersetzt, dann wurde die erhaltene Lösung mit 1 n-Salzsäurelösung und anschließend mit Wasser ausgeschüttelt, getrocknet und eingedampft·

Der Rückstand wurde mit dem 2:8-Gemisch von Äthanol und

■ ■■---.

Äther behandelt und abfiltriert· Es wurden auf diese Weise 1,6 g Z-OGly-Arg(NO₂)-Val-Tyr(Bzl)-Ile-His(Dnp)-Pro- -Leu-ONB (85 % d· Th) erhalten: R_f^ « 0,80; F. 165-174 ⁰C,

Schritt 3

Das Entfernen der Schutzgruppen

1#6 g (1,0 mMol) Z-OGly-Arg(NO₂)-Val-Tyr(Bzl)-

9 09 809/071Ϊ

-Ile-His(Dnp)~Pro-Leu-ONB wurden in 5 ml Dimethylformamid gelöst und mit 3,5 ml 2-Mercaptoäthanol versetzt· Die erhaltene Lösung wurde bei Raumtemperatur eine Stunde gerührt*, dann wurde das Produkt durch jMre"" Zugabe von trockenem Äther gefällt, abfiltriert, mit je 10 ml Äther zweimal gewaschen

und durch Umfallen aus Methanol/Ather gereinigt· Es wurden auf diese Weise 1,3 g Z-OGly-Arg(NO₂)-VaI-Tyr(BzI)-IIe- -His-Pro-Leu-ONB (95 % ά., Th.) erhalten; R_f^ = 0,2. Dieses Produkt wurde in 30 ml 5:1 :1-Gemisch voti Methanol, Essigsäure und Wasser gelöst, mit 0,5 g 10 %-iger Palladium-Aktivkohle versetz^ und unter lebhaftem Rühren wurde 20 Stunden lang Wasserstoffgas durch das Gemisch geleitet. Das Fortschreiten der Reaktion wurde durch Dünnschichtchromatographie verfolgt J nach der Beendigung der Reaktion wurde der Katalysator durch Filtrieren entfernt, mit 20 ml 5:1:1-Gemisch von Methanol, Essigsäure und Wasser nachgewaschen und das mit der Waschflüssigkeit vereinigte Filtrat zur Trockne eingedampft· Der Rückstand wurde

mir efiitm _ΛΜ.₅ « zum Entfernen der Essigsaure Xm' Gemisch -ve» Äthanol und Wasser auf genommen*. Ringed ampft₍ und diese Operation wurde mehrmals wiederholt. Das zuletzt als Rückstand erhaltene

Peptid wurde mit wasserfreiem Äthanol behandelt und abfiltriert. Es wurden auf diese Weise 0,8 g (Hydroxyacetyl , Leu⁸)-/Ängiotensin-II (67 % d. Th.) erhalten, welches dann auf die oben beschriebene Weise gereinigt wurde.

R_f ⁽⁵⁾ _a 0,41; R_f ⁽⁶⁾ « 0,59; R_f^ = 0,60; E_Glu(pH»1 ,9) :0,98.

Aminosäure-Analyse: Pro: 1,0 d); VaI: 1,0 (1); He: 1,02 (1); Arg: 1,0 (1). His: 1.0 (1)_; Leu: 1,02 (1); Tyr 0,73 (1).

909809/0712

Beispiel 2

(L-a-Hydroxypropionyl , Leu )-4ngiotensin-II Schritt 1
Z-OAla-Arg(NO₃)-VaI-Tyr(BzI)-Ile-His(Dnp)-Pro-Leu-ONB

1,8 g (1,25 mMol) Boc-Arg (NO^)-VaI-TyKBzI)-IIe-

Hie(Dnp)-Pro-Leu-ONB (Beispiel 1, Schritt 1) wurden in 8

iVr&pYYi- litt«.

mlf&Jft lösung von Salzsäure in Dioxan gelöst, das erhaltene, an der N-terminalen Aminosäure freie Heptapeptid wurde

durch uku Zugabe von trockenem Äther gefällt, abfiltriert,

" Ϊ)

" Ϊ3)

. mit trockenem Äther gewaschen (Rf = 0,36) und dann sofort in 20 ml Dimethylformamid gelöst· Diese Lösung wurde mit Triethylamin auf pH « abgestellt und mit 0,93 g (2,3 mMol) Z-OAIa-OPFP versetzt. Nach 15 Minuten Stfien wurde das Lösungsmittel verdampft und durch Chloroform ersetzt; die Lösung wurde mit 1 η-Salzsäure und anschließend mit Wasser ausgeschüttelt, getrocknet und eingedampft·

Der Rückstand wurde mit einem 4:1—Gemisch von Äthanol und Äther behandelt und das erhaltene Produkt durch Filtrieren isoliert· Es wurden auf diese Weise 1,75 g Z-OAla-Arg(NO-)- -Val-Tyr (Bzl)-Ile-His(0np)-Pro-Leu-ONB (93 % d. Th·) erhalten; R_f^²$ = 0,85; F. 164-172 ⁰C,

Schritt 2

Das Entfernen der Schutzgruppen

1,6 g Z-0Ala-Arg(N0₂)-Val-Tyr(Bzl)-Ile-His(Dnp)-Pro- -Leu-ONB wurden in 5 ml Dimethylformamid gelöstV3#5 ml 2-Mercaptoäthanol der Lösung zugesetzt; dann wurde das Gemisch bei Raumtemperatur eine Stunde gerührt·* das Produkt durch ££q Zugabe von trockenem Äther gefällt und durch Umfallen aus Methanol/Ather gereinigt. Es wurden auf diese Weise 1.3 g Z-OAla-ArgCNO^-Val-TvriBzD-Ile-His-Pro-Leu- -ONB (92 % d. Th.) erhalten (R_f^²^ - 0,27). Dieses Produkt wurde im 5:1ti-Gemisch von Methanol, Essigsäure und

90980 9/0712

Wasser gelöst^ mit 0,5 g 10 %-iger Palladium-Aktivkohle versetzt^und Wasserstoffgas wurde unter lebhaftem Rühren 20 Stunden lang durch das Gemisch geleitet· Das Fortschreiten der Reaktion wurde durch Dünnschichtchromatographie verfolgt; nach der Beendigung der Reaktion wurde der Katalysator abfiltriert« mit demselben Lösungsmittelgemisch nachgewaschen, das Filtrat zur Trockne eingedampft^ der Rückstand mit wäßrigem Äthanol versetzt.^wieder eingedampft, und diese Operation wurde mehrmalswiederholt· Zuletzt wurde der Rückstand mit trockenem Äthanol behandelt, abfiltriert und getrocknet.. Es wurden 0,65 g (L-oc-Hydroxypropionyl , Leu )-^ngiotensin-II (70 % d. Th.) erhalten; das Produkt wurde auf die oben beschriebene Weise gereinigt. R_f ⁽⁵⁾ = 0,36; R_f ⁽⁶⁾ - 0,57; R_f ^(?) ■ 0,60; E_Qlu (pH=1,9) : 0,97.

Aminosäure-Analyse: Pro: 0,98 (1); VaI: 1,0 (1); He: 1,1 (1); Arg: 1,0 (1); His: 0,98 (1); Leu: 0,98 (1); Tyr: 0,56

Beispiel 3
(Hydroxyacetyl'', Ile⁸)-^ngiotensin-II

Schritt 1
Boc-Arg(N0₂)-Val-Tyr(Bzl)-Ile-His(Dnp)- Pro-Ile-ONB

4,15 g (15 mMol) Ile-ONB.HCl wurden in 50 ml Chloroform gelöst und mit 2,1 ml Triethylamin und 3,81 g (10 mMol) Boc-Pro-OPFP versetzt· Das Gemisch wurde bei Raumtemperatur 20 Minuten gerührt, dann mit Wasser und mit 10 %-iger Citronensäurelösung ausgeschüttelt, getrocknet und eingedampft· Oas als Rückstand erhaltene geschützte Dipeptid (Rf =« 0,9) wurde ohne Reinigung in 20 mlrtT>t Lösung von Salzsäure in Dioxan gelöst; nach 10 Minuten wurde die Lösung mit trockenem Äther verdünnt und eingedampft· Oas erhaltene, an der N-terminaleftAminosäure freie Oipeptid-

909809/071^

hydrochlorid (R_x » 0,44) wurde in 30 ml Chloroform gelöst».

die Lösung durch jüö". Zugabe von Triethylamin auf pH = 8 Eingestellt und mit 8,8 g (15 mMol) Boc-His(Dnp)-OPFP versetzt· Nach 1,5 Stunden Stehen-wurde das Reaktionsgemisch mit 1,65 ml Ν,Ν-Dimethylamirß-äthylamin versetzt-^ nach 15 Minuten mit wäßriger[iO %-iger Citronensäurelösung, mit 1 n-Salzsäurelösung und schließlich mit Wasser ausgeschüttelt, getrocknet und eingedampft· Das als Rückstand erhaltene geschützte Tripeptid (R* = 0,50) wurde ohne Reinigung in 20 mJ/ΤΠΜ Lösung von Salzsäure in Oioxan gelöst^ die Lösung 15 Minuten stehengelassen} dann wurde das erhaltene, an der N-terminalen Aminosäure freie Tripeptid (R* = 0,25) d u rc h^die'" Zugabe von trockenem Äther gefällt, abfiltriert

und mit trockenem Äther gewaschen· Dieses Produkt wurde sofort im Gemisch von 50 ml Chloroform und 20 ml Dimethylformamid gelöst^ die Lösung mit Triethylamin auf pH » 8 ei" gestellt und mit 6,0 g (15 mMol) Boc-Ile-OPFP versetzt. Nach 30 Minuten wurde das Lösungsmittel verdampft und durch

Athylacetat ersetzt^ die Lösung mit wäßriger[io %-iger

Citronensäure, mit 1 n~Salzsäurelösung und mit Wasser ausgeschüttelt, getrocknet und eingedampft· Der Rückstand wur-

de mit einem 9:1-Gemisch von η-Hexan und Äther behandelt.

(2) und das so isolierte geschützte Tetrapeptid (Rr = 0,65) wurde/r'in 25 ml-^ö M Lösung von Salzsäure in Oioxan gelöst· Nach 30 Minuten Stehen wurde das erhaltene, an der N-terminalenAminosäure freie Tetrapeptid (R, = 0,41) durch d« Zugabe von trockenem Äther gefällt, abfiltriert und mit trockenem Äther gewaschen. Dieses Produkt wurde sofort in 70 ml,1:1—Gemisch von Dimethylformamid und Chloroform gelöst^ die Lösung mit Triethylamin auf pH » 8/'gestellt und mit 6,0 g (11,5 mMol) Boc-Tyr(BzI)-OPFP.versetzt· Nach 15 Minuten wurde das Lösungsmittel verdampft und durch

10 9.8 09/0713

Athylacetat ersetzt; 0,66 ml Ν,Ν-Dimethylamino-äthylamin wurden der Lösung zugegeben, und nach 15 Minuten wurde die Lösung mit wäßriger] 10 %-iger Citronensäurelösung, mit 1 n-Salzsäurelösung und mit Wasser ausgeschüttelt, getrocknet und eingedampft· Der Rückstand wurde mit trockenem

Äther behandelt und das auf diese Weise erhaltene geschützte Pentapeptid (R^ ²^ * 0,59) in 20 ml^EI^M-ösung von Salzsäure in Oioxan gelöst. Nach 15 Minuten Stehen wurde das erhaltene, an der N-terminalen Aminosäure freie Pentapeptid-hydrochlorid (R^ « 0,4) durch ^Ure^Zugabe von trockenem Äther gefällt, abfiltriert und mit 20 ml trocke-

nem Äther gewaschen· Dieses Produkt wurde sofort in 50 ml Dimethylformamid gelöst^, die Lösung mit Triäthylamin auf pH = 8^§estellt und mit 4,62 g (12 mMol) Boc-Val-OPFP versetzt. Nach einer Stunde wurde-das Lösungsmittel verdampft und durch Chloroform ersetzt.,^ die Lösung mlt(wäßrigerliO-%-iger/Citronensäurelösung, mit 1 n-6alzsäurelösung und schließlich mit Wasser ausgeschüttelt, getrocknet und

eingedampft· Der Rückstand wurde mit trockenem Äther behandelt und das so isolierte geschützte Hexepeptid (R,^v ' β 0,56) in 20 ml^STJ+ Lösung von Salzsäure in Dioxan gelöst· Nach 15 Minuten wurde das erhaltene, an der N-terminalen Aminosäure freie Hexapeptid (R, » 0,47) jnej durch ^ie Zugabe von trockenem Äther gefällt, abfiltriert und mit 20 ml trockenem Äther gewaschen· Das Produkt wurde sofort in 50 ml Dimethylformamid gelöst*>vi4>( die Lösung mit Triäthylamin auf pH =« 8/^esteilt und mit 5,38 g (12 mMol) Βοβ-Arg(NOg)-OPFP versetzt. Nach 30 Minuten wurde das Lösungsmittel verdampft und durch Chloroform ereetzt^die Lösung mit 1 η-Salzsäure und mit Wasser ausgeschüttelt, getrocknet und eingedampft· Der Rückstand

ff

wurde mit Äthanol behandelt und abfiltriert· Es wurden

909809/0712

9,7 g Boc-Arg(N0₂)-Val-Tyr(Bzl)-Ile-Hi3(Dnp)-Pro-Ile-ONB (68 % d· Th,.für das als Ausgangsstoff eingesetzte Boc-Pro- -OPFP berechnet) erhalten; R_f^ = 0,67.

Schritt 2
Z-0Gly-Arg(N0₂),Val-Tyr(Bzl)-Ile-His(Dnp)-Pro-Ile-0NB

1.6 g (1,1 mMol) Boc-Arg(NO_)-Val-Tyr(Bzl)-Ile- -His(Dnp)-Pro-Ile-ONB wurden in 8 ml/B^fr Lösung von Salzsäure in Oioxan gelöst und nach 15 Minuten wurde das erhaltene, an der N-terrainalen Aminosäure freie Heptapeptidhydrochlorid (R* = 0,45) durch die'Zugabe von trockenem Äther gefällt, abfiltriert und mit 20 ml trockenem Äther gewaschen. Dieses Produkt wurde sofort in 10 ml Dimethylformamid gelöst^^cfie Lösung mit Triöthylamin auf pH » B *iiagestellt und mit 0,6 g (1,5 mMol) Z-OGIy-OPFP versetzt· Nach 30 Minuten wurde das Lösungsmittel verdampft und durch Chloroform ersetzt^ die Losung mit 1 η-Salzsäure und mit Wasser ausgeschüttelt, getrocknet, und eingedampft· Das als Rückstand erhaltene geschützte Peptid wurde durch Behandlung mit trockenem Äther isoliert· Es wurden auf diese Weise 1,45 g Z-0Gly-Arg(N0₂)-Val-Tyr(Bzl)-Ile-His(0np)- -Pro-Ile-ONB (85 % d. Th.) erhalten; R_f>²^ - 0,68; F. 151-158⁰C.

Schritt 3

Das Abspalten der Schutzgruppen

1.46 g (0,94 mMol) Z-0Gly-Arg(N0₂)-Val-Tyr(Bzl)- -Ile-His(Dnp)-Pro-Ile-ONB wurden in 5 ml Dimethylformamid gelöst, mit 3,5 ml 2-Mercaptoäthanol versetzt und das Gemisch eine Stunde gerührt. Das erhaltene Z-OGIy-Arg(NO₂)-Val-Tyr(Bzl)-Ile-His-Pro-Ile-ONB wurde durchßk& Zugabe von trockenem Äther gefällt· Nach Umfallen aus Methanol/Ather -weWdie Ausbeute 1 jO5 g (82 % d· Th.); R_f ^v '= 0,10. Dieses Produkt wurde in 30 ml 5:1:1—Gemisch von Methanol,

§09809/071

Essigsäure und Wasser gelöst, mit 0,5 g 10 %-iger Palladium/Aktivkohle versetzt, und das Gemisch wurde unter lebhaftem Rühren 21 Stunden lang mit durch die Lösung geleitetem Wasserstoffgas behandelt· Das Fortschreiten der Reaktion wurde durch Dünnschichtchromatographie verfolgt· Nach der Beendigung der Reaktion wurde der Katalysator abfiltriert, das Filtrat zur Trockne eingedampft und das als Rückstand erhaltene freie Peptid durch Behandlung mit

trockenem Äthanol isoliert· Es wurden auf diese Weise 0,48 g (Hydroxyacetyl¹, Ile⁸)-^ngiotensin-II (64 % d. Th·) erhalten, welches dann auf die oben beschriebene Weise gereinigt wurde; R_f^ ■ 0,29; R_f^ = 0,57; R_f^⁷' = 0,58; ^EGlu CP^{H β} 1.9) 5 i.°³·

Aminosäure-Analyse: Pro: 0,99 (1)· VaI: 1,15 (1); He: 2,06 (2); Tyr: 0,74 (1); His: 0,98 (1); Arg: O.95(1). Beispiel 4

(L-a-Hydroxypropionyl , He )-/lngiotensin-II Schritt 1
2-OAla-Arg(NO₂)-Val-Tyr(Bzl)-Ile-His(Dnp)-Pro-Ile-ONB 1,6 g (1,1 mMol) Boc-Arg(NOJ-VaI-TVr(BzI)-IIe- -His(Dnp)-Pro-Ile-ONB wurden in 8 ml./ΈΠΜ Lösung von Salzsäure in Dioxan gelöst-und nach 15 Minuten wurde das erhaltene, an der N-terminalen Aminosäure freie Heptapeptid (R- =· 0,45) durch die*Zugabe von trockenem Äther gefällt, abfiltriert und mit trockenem Äther gewaschen. Das erhaltene Produkt wurde sofort in 10 ml Dimethylformamid gelöst·», die Lösung mit Triethylamin auf pH » abgestellt und mit 0,61 g (1,5 mMol) Z-OAIa-OPFP versetzt. Nach 30 Minuten wurde das Lösungsmittel verdampft und durch

Chloroform ersetzt^)die Lösung wurde mit 1 n-Salzsäure

und mit Wasser ausgeschüttelt, getrocknet und eingedampft. Das erhaltene geschtützte Peptid wurde durch Behandlung

909809/0712

mit Ather isoliert· Es wurden auf diese Weise 1,4 g Z-0Ala-Arg(N0)₂-Val-Tyr(B2l)-Ile-His(Dnp)-Pro-Ile-0NB (82 % d. Th.) erhalten; R_f^ » 0,63; F, 164-168 ⁰C.

Schritt 2
Das Abspalten der Schutzgruppen

1,4 g (0,9 mMol) Z-OAIa-Arg(NO₂)- VaI-Tyr(BzI)-Ile-His(Dnp)-Pro-Ile-ONB wurden in 5 ml Dimethylformamid gelöst und mit 3,5 ml 2-Mercaptoäthanol versetzt· Nach einer Stunde wurde das Produkt durch jiire' Zugabe von trockenem Äther gefällt und durch Umfallen aus Mithanol/Ather gereinigt· Es wurden 0,8 g . Z-OAla-Arg(NO₂)-VaI-Tyr(BzI)- -Ile-His-Pro-Ile-ONB (65 % d. Th.) erhalten; R^'« 0,13; R^ ' β 0,27. Dieses geschützte Peptid wurde dann in 10 ml 5:1 :1-Gemisch von Methanol, Essigsäure und Wasser gelöst^ mit 0,5 g 10 5&-iger Palladium/Aktivkohle * versetztjj^ntr Wasserstoffgas wurdeSunter Rühren 16 Stunden lang durch das Gemisch geleitet· Nach der Beendigung der Reaktion wurde der Katalysator abfiltriert, die Lösung eingedampft und das Produkt durch Behandlung mit trockenem Äthanol isoliert· Es wurden auf diese Weise 0,4 g (L-a- -Hydroxypropionyl'¹, Ile^-^ngiotensin-II (B*65 % d. Th.) erhalten, welches dann auf die oben beschriebene Weise gereinigt wurde. R^⁵' =0,30; R_f. ' = 0,58; R^ ^ ■ 0,58; E₆Iu (PH = 1.9): 1,07.

Aminosäure-Analyse: Pro: 1,04 (1); VaI: 0,98 (1); He: 1.98 (2); Tyr: 0.98 (1); His: 1.05 (1); Arg: 1,0 (1).

Beispiel 5

(Hydroxxyacetyl , AIa )-Angiotensin-II Schritt 1

Boc-Arg(NO₂)-Val-Tyr(Bzl)-Ile-His(Dnp)-Pro-Ala-ONB

1,21 g (4 mMol) Ala-ONB.HBr wurden in 15 ml Chloro-

Ö09809/Ö712

form gelöst, und 0,56 ml Triäthyl^Iamin und 0,76 g (2 tnMol) Boc-Pro-OPFP wurden der Lösung zugesetzt· .Die Lösung wurde 20 Minuten bei Raumtemperatur gerührt·* dann mit Wasser und mit 10 %-iger wäßriger Citronensäurelösung ausgeschüttelt, getrocknet und eingedampft. Das als Rückstand erhaltene geschützte Dipeptid (R* ' =» 0,64) wurde ohne Reinigung in 4 mls-eJM Lösung von Salzsäure in Dioxan gelöst· Nach 10 Minuten Stehen wurde die Lösung mit Äther verdünnt und eingedampft· Das als Rückstand erhaltene, an der N-terminalen Aminosäure freie Dipeptidhydrochlorid (R^ '»0,65) wurde in 15 ml Chloroform gelöst*, die Lösung mit Triäthyl-

la,¹», ^_m

amin auf pH = ^gestellt und mit 1,76 g (3 mMol) Bos-His(Dnp)· -OPFP versetzt. Nach 30 Minuten wurden 0,44 ml N-,N-Dimethylemino-äthylamin der Lösung zugegeben, welche dann nach 5 Minuten mit wäßriger! 10 %-iger Citronensäurelösung. mit 1 n-Salzsäurelösung und schließlich mit Wasser ausgeschüttelt, getrocknet und eingedampft wurde· Das als Rück-

f θ)

stand erhaltene geschützte Tripeptid (R₄: ^a 0,57) wurde ohne Reinigung in 4 ml./iEOt Lösung von Salzsäure in Dioxan gelöst; nach 10 Minuten wurde das erhaltene, an der N-terminalen Aminosäure freie Tripeptid (R* ^a 0,28) durch die^Zugabe von trockenem Äther gefällt, abfiltriert und

mit Äther gewaschen· Dieses Produkt wurde sofort in 20 ml 1:1-Gemisch von Chloroform und Dimethylformamid gelöst^, die Lösung mit Triäthylamin auf pH ■ 8^ gestellt und mit 1,58 g (4 mMol) Boc-Ile-OPFP versetzt.. Nach 20 Minuten wurde das Lösungsmittel verdampft und durch Athylacetat ersetzt j 1 mit wäßrigeq 10 ^-iger Citronensäurelösung und mit Wasser ausgeschüttelt, getrocknet und eingedampft· Der Rückstand

wurde mit 1:9-6emisch von Äther und Hexan behandelt und abfiltriert· Das auf diese Weise erhaltene geschützte Tetrapeptid (R* » 0,57) wurde in 4 mlrQ JM Lösung von SaIz-

309809/0712

säure in Dioxan gelöstj und nach 15 Minuten Stehen wurde das erhaltene, an der N-terminalen Aminosäure freie Tetrapeptid (Rf = 0,38) durchßku Zugabe von trockenem Äther gefällt-, abfiltriert, mit trockenem Äther gewaschen und sofort in 15 ml 2:1—Gemisch von Chloroform und Dimethylformamid gelöste Die Lösung wurde mit Triäthylamin auf pH = abgestellt und mit 1,66 g (3 mMol) Boc-Tyr(BzI)-OPFP versetzt· Nach 15 Minuten wurde das Lösungsmittel verdampft, durch Athylacetat ersetzt^ die Lösung mit 0,22 ml Ν,Ν-Dimethylamino-äthylamin versetzt und nach 5 Minuten mit wäßriger/10 %-iger Citronensäurelösung, mit 1 n—Salzsäurelösung und zuletzt mit Wasser ausgeschüttelt, getrock-

net und eingedampft· Der Rückstand wurde mit Äther behan-

delt, abfiltriert, und mit Äther gewaschen· Das auf diese Weise erhaltene Geschützte Pentapeptid (R^²' ■« 0,60)

wurde in 4 m ViOf Lösung von Salzsäure in Dioxan gelöst, nach 10 Minuten Stehen wurde das erhaltene, an der N-terminalen Aminosäure freie Pentapeptid (R- ' » 0,62) durch

Zugabe von trockenem Äther gefällt, abfiltriert und

mit trockenem Äther gewaschen· Das erhaltene Produkt wurde sofort in 20 ml 1:1—Gemisch von Chloroform und Dimethylformamid gelöst-^die Lösung mit Triäthylamin auf pH = ^gestellt und mit 1,6 g (4 mMol) Boc-Val-OPFP versetzt. Nach 20 Minuten wurde das Lösungsmittel abdestilliert, durch Athylacetat ersetzt-*, α ie Lösung mit wäßriger 10 %-iger Citronensäurelösung und mit Wasser ausgeschüttelt, getrocknet und eingedampft· Der Rückstand

M M

wurde mit Äther behandelt, abfiltriert und mit Äther gewaschen· Das auf diese Weise erhaltene geschützte Hexapeptid (Rx » 0,65) wurde in 8 inlroit Lösung von Salzsäure in Dioxan gelöst; nach 20 Minuten Stehen wurde das erhaltene, an der N-terminalen Aminosäure freie Hexe-

Ö09809/0712

peptid (R. = 0,65) durch iMCe Zugabe von trockenem Äther gefällt, abfiltriert und mit trockenem Äther gewaschen· Dieses Produkt wurde sofort in 20 ml Dimethylformamid gelöst_x die Lösung mit Träthylamin auf pH = 8/^estellt und mit 2,9 g (6 mMol) Boc-Arg(NO₂)-OPRf- versetzt. Nach 20 Minuten wurde das Lösungsmittel abdestilliert, durch Chloroform ersetzt^ die Lösung mit 10 %-iger wäßriger Citronensäurelösung und mit Wasser ausgeschüttelt, getrocknet und eingedampft. Der Rückstand wurdef 1 i'2-Gemisch von Athylacetat und Äther verrieben, abfiltriert und mit dem selben Lösungsmittelgemisch gewaschen. Es wurden auf diese Weise 2,0 g Boc-Arg(N0₂)#-Va1-Tyr(BzI)-IIe-His(Dnp)-Pro- -AIa-ONB (72 % d. Tho) erhalten; R_f^ = 0,70; F. 185-187⁰C.

Schritt 2
2-0Gly-Arg(NO₂)-Val-Tyr(Bzl)-Ile-His(Dnp)-Pro-Ala-0NB

1,35 g (1 mMol) Boc-Arg (NOj ,VaI-TyK BzI)-IIe- -His(Dnp)-Pro-Ala-ONB wurde in 4 mv8 M Lösung von Salzsäure in Oj,oxan gelöst; nach 15 Minuten Stehen wurde das erhaltene, an der N-terminalen Aminosäure freie Hepta peptid-hydrochlorid (R* = 0,63) durch d±6 Zugabe von trockenem Äther gefällt, abfiltriert und mit trockenem

Äther gewaschen. Dieses Produkt wurde sofort in 15 ml Dimethylformamid gelöst^ die Lösung mit Triethylamin auf pH » 8^gest:ellt und mit 0,96 g (2,5 mMol) Z-OGIy-OPFP versetzt. Nach 20 Minuten wurde,das Lösungsmittel abdestilliert und durch Ch Io ro tr m ersetzt·», die Lösung mit Wasser ausgeschüttelt, getrocknet und eingedampft. Der Rückstand

wurde mit Äthanol behandelt und abfiltriert· Es wurden 1,16 g Z-0Gly-Arg(N0₂)-Val-Tyr(Bzl)-Ile-His(Dnp)-Pro-Ala- -ONB (83 % d. Th.) erhalten; R^²^ -. 0,72; F. 133-135 ⁰C.

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Schritt 3

Das Abspalten der Schutzgruppen

1,5 g (1 raMol) Z-0Gly-Arg(N0₂)-Val-Tyr(BzI)-IIe- -Hi8(pnp)rPro-Ala-ONB wurden in 5 ml Dimethylformamid gelöst-i/Tirlt 2,95 ml ^Mercaptoäthanol versetzt j nach einer Stunde wurde das Produkt durch die" Zugabe von trockenem

. tr at

Äther gefällt, abfiltriert und mit Äthanol gewaschen. Es wurden auf diese Weise 1,1 g Z-0Gly-Arg(N0₂)-Val-Tyr(Bzl)-· -Ile-His-Pro-Ala-ONB (82 % d. Th.) erhalten; r/²'= 0,15; R Λ ' = 0,40. Dieses geschützte Peptid wurde dann.in 15 ml 5:1:1-Gemisch von Methanol, Essigsäure und Wasser gelöst, mit 0,5 g 10 %-iger Palladium/Aktivkohle versetzt^ und Wasserstoffgas wurde unter Rühren 24 Stunden lang durch die Lösung geleitet. Das Fortschreiten der Reaktion wurde durch Dünnschichtchromatographie verfolgt; nach der Beendigung der Reaktion wurde der Katalysator abfiltriert, mit 15 ml 5:1:1-Gemisch von Methanol, Essigsäure und Wasser nachgewaschen und das mit der Waschflüssigkeit vereinigte FiItrat zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wurde mit wäßrigem Äthanol wiederholt zur Trockne eingedampf t^ und schließlich wurde das als Rückstand erhaltene Produkt mit trockenem Äthanol behandelt und abfiltriert· Es wurden auf diese Weise 0,55 g (Hydroxyacetyl , AIa )-Angiotensin-II (80 % d. Th.) erhalten, welches dann nach der

oben beschriebenen Methode gereinigt wurde. r/⁵^ - 0,28; R_f^⁶^ » 0,48; R_f ⁽⁷^ * 0,50; ^EGlu ⁽P^H " ^tS) ϊ 1.0. .

Aminosäure-Analyse: Pro: 0,95 (1); AIa: 1,1 (1); VaI: 1.0 (1); lie: 1,0 (1); His: 1,0 (1); Arg: 1,0 (D; Tyr: 0,9 (1).

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Beispiel 6

(Hydroxyacetyl _t Thr[Me] )-^ngiotensin-II

Schritt 1

Boc-Arg(N0₂)-Val-Tyr(Bzl)-Ile-His(Dnp)-Pro-Thr(Me)-OMe -0,69 g (3 mMol) Thr(Me)-OMe«HBr wurden in 30 ml Chloroform gelöst} dann wurden der Lösung 0,42 ml Triäthylamin und 1,7 g (4,5 mMol) Boc-Pro-OPFP zugesetzt· Nach zwei Stunden wurden 0,33 ml N,N-Diäthylamino-äthylamin zugegeben7\nach weiteren 15 Minuten wurde das Lösungsmittel abdestilliert und durch Athylacetat ersetzt^, die Lösung mit 10 %-iger wäßriger Citronensäurelösung, mit Wasser und schließlich mit 5 %-iger wäßriger Natriumhydrogencarbonatlösung ausgeschüttelt, getrocknet und eingedampft· Das als Rückstand erhaltene geschützte Dipeptid (R^ = 0^76) wurde ohne Reinigung in 2 mViT-t* Lösung von Salzsäure in

Dioxan gelöst, 15 Minuten s^;teherigelassen, dann mit Äther verdünnt und eingedampft. Das als Rückstand erhaltene, an der N-terminalen Aminosäure freie Dipeptid (R, = 0,18) wurde in 20 ml Chloroform gelöst^aie Lösung mit Triäthylamin auf pH = abgestellt und mit 2,6 g (4,5 mMol) Boc- -His(Dnp)-OPFP versetzt· Das Gemisch wurde bei Raumtemperatur 2 Stunden gerührt; dann wurden 0,22 ml N_fN-Dimethylamino-äthylamin zugegeben_/und nach 15 Minuten wurde das Gemisch mit wäßriger{_10 %-iger Citronensäurelösung, mit 1 η-Salzsäurelösung und zuletzt mit Wasser ausgeschüttelt, getrocknet und eingedampft« Das als Rückstand erhaltene geschützte Tripeptid (R, =0,5) wurde ohne Reinigung in 4 ml^8">t Lösung von Salzsäure in Dioxan gelöst^, nach 15 Minuten das erhaltene, an der N-terminalen Aminosäure freie Tripeptid (R* » 0,3) durch die*'Zugabe von trockenem Äther gefällt, äbfiltriert, mit trockenem Äther gewaschen und sofort in 20 ml 1:1—Gemisch von Chloroform und

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Dimethylformamid gelöst· Die Lösung wurde mit Triäthylamin auf pH = S^estellt und mit 1,6 g (4 mMol) Boc-Ile- -OPFP versetzt. Nach 30 Minuten wurde das Lösungsmittel abdestilliert^ciurch Athylacetat ersetzt^cfie Lösung mit wäßrigerj10 %-%er Citronensäurelösung, mit 1 n—Salzsäurelösung und zuletzt mit Wasser ausgeschüttelt, getrocknet und eingedampft· Der Rückstand wurde mit 1:9—Gemisch von Äther und η-Hexan behandelt und abfiltriert· Das auf diese Weise isolierte aesch ützte Tetrapeptid (R_f » 0,64) wurde in 7 mlAiff-M Lösung von Salzsäure in Dioxan gelöst und nach 15 Minuten wurde das erhaltene, an der N-terminalen Aminosäure freie Tetrapeptid (R_f ^β 0,27) durch

Zugabe von trockenem Äther gefällt, abfiltriert und sofort ijir 20 ml 1:1-Gemisch von Chloroform und Dimethylformamid gelöst· Die Lösung wurde mit Triethylamin auf

pH =» erstellt und mit 1,6 g (3 mMol) Boc-Tyr(Bzl)-OPFP versetzt. Nach 30 Minuten wurde das Lösungsmittel abdestil

liert, durch Athylacetat ersetz^ und dann wurden 0,22 ml Ν,Ν-Dimethylamino-äthylamin der Lösung zugegeben· Nach 15 Minuten wurde die Lösung mit wäßriger 10%-iger Citronensäurelösung, mit 1 n-Salzsäurelösung und zuletzt mit Wasser ausgeschüttelt, getrocknet und eingedampft. Der

Rückstand wurde mit Äther behandelt und abfiltriert· Es

wurden auf diese Weise 0,4 g geschütztes Pentapeptid (Rr

■ti w£/ in - ' . ^β 0,63) erhalten; dieses Produkt wurde in 1 mJrTT*l Lösung von Salzsäure in Dioxan gelöst und nach 15 Minuten wurde das erhaltene, an der N-terminalen Aminosäure freie Pentapeptid (Rr ·» 0,47) durch ^Ure^Zugabe von trockenem Äther gefällt, abfiltriert und mit trockenem Äther gewaschen· Das Produkt wurde sofort in 10 ml Dimethylformamid gelöst die Lösung mit Triäthylamin auf pH » 8/■gestellt^ und mit 0,4 g (1 mMol) Boc-Val-OPFP versetzt. Nach einer Stunde

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wurde das Lösungsmittel abdestilliert und durch Chloroform ersetzt und die Lösung mit vüäßriger[io %-iger Citronensäurelösung, mit 1 n—Salzsäurelösung und zuletzt mit Wasser ausgeschüttelt, getrocknet und eingedampft. Der Rückstand

wurde mit Äther behandelt und abfiltriert· Das auf diese

(2) Weise erhalten geschützte Hexapeptid (R- ^a 0,65) wurde

in 1,5 ml/&J4 Lösung von Salzsäure in Dioxen gelöst" nach 15 Minuten wurde das erhaltene, an der N-terminalen Aminosäure freie Hexapeptid (R* = 0,48) durch die Zugabe von trockenem Äther gefällt, abfiltriert und mit Äther gewaschen und sofort in 10 ml Dimethylformamid gelöst· Lösung wurde mit Triäthylamin auf pH « 8^

und mit 0,45 g (1 mMol) Boc-Arg(NO-)-OPFP versetzt. Nach einer Stunde wurde das Lösungsmittel abdestilliert und durch Athylacetat ersetzt^, die Lösung mi^saBriger

<Q0 %-ige£>Citronensäurelösung, mit 1 n-Salzsäurelösung und zuletzt mit Wasser ausgeschüttelt, getrocknet und eingedampft. Der Rückstand wurde mit einem 9:1—Gemisch von

M H

Äther und Äthanol behandelt und abfiltriert· Es wurden auf diese Weise 0,45 g Boc-Arg(N0₂)-Val-Tyr(Bzl)-Ile- -His(Dnp)-Pro-Thr(Me)-OMe (11,3 % d. Th.) erhalten; R_f ⁽²? a 0,38; F. 199-203 ⁰C (Zers.).

Schritt 2

Z«0Gly-Arg(NO₂)-Val-Tyr(BzI)-Ile-His(Dnp)-Thr(Me)-OMe 0,45 g (0,34 mMol) Boc-Arg(NO_/i)-Val-Tyr(Bzl)-Ilo- -His(Dnp)-Pro-Thr(Me)-OMe wurden in 2 mlsliJM Lösung von Salzsäure in Dioxan gelöst und nach 15 Minuten wurde das erhaltene, an der N-terminalen Aminosäure freie Heptapeptid

(R- a 0,35) durch iüö" Zugabe von trockenem Äther gefällt, τ. -

abfiltriert und mit Äther gewaschen· Das Produkt wurde sofort in 10 ml Dimethylformamid gelöst^^ie Lösung mit Triäthylamin auf pH =* 8^gestellt und mit 0,4 g (1 mMol)

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Z-OGIy-OPFP versetzt. Nach einer Stunde wurde das Reaktionsgemisch mit 30 ml Chloroform verdünnt, mit Wasser ausgeschüttelt, getrocknet und eingedampft· 0er Rückstand wurde mit einem 9;1-Gemisch von Äther und Äthanol behandelt und abfiltriert· Es wurden auf diese Weise 0,45 g Z-OGIy- -A_rg(N0₂)-Val-Tyr(BzI)-Ile-His(Dnp)-Pro-Thr(ME)-OMe (93 % d. Th.) erhalten; R_f = 0,44· F. 158-162 ⁰C.

Schritt 3

Das Abspalten der Schutzgruppen· 0,45 g (0,31 mMol) Z-0Gly-Arg(N0₂)-Val-Tyr(Bzl)-Ile- -His(Dnp )-Pro-Thr(ME)-OMe wurden in 1,5 ml Dimethylformamid gelöst^ und 1 ml 2-Mercaptoäthanol wurde der Lösung zugegeben. Nach einer Stunde wurde das Produkt durch d-ie Zugabe von trockenem Äther gefällt, in Methanol gelöst, mit wenig Aktivkohle behandelt, abfiltriert und das Filtrat

eingedampft. Der Rückstand wurde mit Äther behandelt und abfiltriert. Als Rückstand wurden 0,38 g Z-OGly-Arg(NO )- -Val-Tyr(Bzl)-Ile-His-Pro-Thr(Me)-OMe (98 % d. Th.) erhalten; R_f -' = 0,16} R^⁴' = 0,52. Dieses Produkt wurde in 5 ml Dibxan_;suspendiert und mit 1,2 ml 1 n-Natriumhydroxydlösung versetzt. Nach einer Stunde wurde die Lösung durch die Zugabe von 1 η-Salzsäure auf pH = abgestellte der erhaltene Niederschlag abfiltriert und.in einem 3:1-Gemisch von Chloroform und Dimethylformamid gelöst. Die Lösung wurde getrocknet und eingedampft und der Rückstand mit Äther behandelt. Es wurden 0,26 g an der C-terminalen Aminosäure freies Peptid (70 % d· Th.) erhalten; R^⁴' = 0,25. Dieses Produkt wurde in 10 ml 5:1 :1—Gemisch von Methanol, Essigsäure und Wasser gelöst, die Lösung mit 0,1 g 10 %-iger Palladium/Aktivkohle versetzt^ und Wasserstoffgas wurde unter Rühren 16 Stunden lang durch die Lösung geleitet. Das Fortschreiten der Reaktion wurde durch Dünnschicht-

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Chromatographie verfolgt; nach der Beendigung der Reaktion wurde der Katalysator abfiltriert und die Lösung zur Trockne eingedampft· Der Rückstand wurde mit wäßrigem Äthanol behandeltV eingedampft, und diese Operation wurde mehrraaliwie-

derholt. Es wurden auf diese Weise 0,16 g [Hydroxyacetyl , Thr(Me) ]-/§|ngiotensin-II erhalten, welches nach oben beschriebenerMethode gereinigt w^rdej R_f ' » °#22; R_f ⁽⁶⁾ = 0,53; R_f ⁱ⁷⁾ - O,iO; E_Qlu (pH = 1,9): 0,98

Aminosäure-Analyse: Thr: 0,6 (1); Pro» 1,0 (1)· VaI: 1,0 (1); He: 1,02 (1); Tyr: 0,85 (1); His: 1,0 (1). Arg: 0,96 (i)o

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Claims

Dipl.-Chem. DR. PETER WAGER ^S ο O ο ι ο ·7

Patentanwalt " J* " ZOO I4/1

8 MÜNCHEN 5, Moraaatatr. 8/Π
Telefon 22 3? 52

PATENTANSPRÜCHE Peptide der allgemeinen Formel I

X-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Y (i)

worin
X den Rest einer in der α-Stellung eine Hydroxylgruppe enthaltenden aliphatischen Carbonsäure, besonders eine Hydroxyacetyl- oder a-Hydroxypropionylgruppe^und

Y den Rest einer aliphatischen oc-Aminocarbonsäure, besonders eine Leucyl-, Isoleucyl-, Alanyl-, oder Threonylgruppe,

bedeuten, sowie Säureadditionssalze und Komplexe davon·
2. Hydroxyacetyl-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Leu-OH·
3· a-Hydroxypropionyl-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro- -Leu-OH.
4# Hydroxyacetyl-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Ile-OHe
5* a-Hydroxypropionyl-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro- -Ile-OH.
6. Hydroxyacetyl-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Ala-OHe
7· Hydroxyacetyl-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Thr(Me)- -OH.

8· Verfahren zur Herstellung von Peptiden der allgemeinen Formel I

X-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Y (i)

worin

X den Rest einer in der α-Stellung eine Hydroxylgruppe enthaltenden aliphatischen Carbonsäure, besonders eine Hydrox|ftcetyl- oder a-Hydroxypropionylgruppe^ und

Y den Rest einer aliphatischen a-Aminocarbonsäure_/ besonders eine Leucyl-, Isoleucyl-, Alanyl- oder Threonylgruppe,

bedeuten, sowie von Säureadditionssalzen und Komplexen davon,

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.ORIGINAL IWSPECTED

dadurch gekennzeichnet , daß man ein reaktionsfähiges Heptapeptidderivat der allgemeinen Formel II

H-Arg(A)-Val-Tyr(B)-Ile-His(E)-Pro-Y-OG (il)

worin

A eine zum temporären Schutz des Guanidinorestes von Arg geeignete Schutzgruppe, vorteilhaft eine Nitro- oder Tosylgruppe,
S eine zum temporären Schutz der aromatischen Hydroxylgruppe von Tyr geeignete Schutzgruppe, vorteilhaft

eine Benzyl- oder substituierte Benzylgruppe, E eine zum temporären Schutz der Imidazolgruppe von His geeignete Schutzgruppe, vorteilhaft eine Dinitrophenylgruppe,

G eine zum Schutz der Carboxylgruppe der C-terminalen Aminosäure geeignete, gegenüber schwach sauren Einflüssen widerstandsfähige, aber durch katalytische Hydrogenolyse oder durch Behandeln mit stärkeren Säuren oder mit Alkalien abepaltbare Schutzgruppe und

Y die oben angegebene Bedeutung hat,

mit einem reaktionsfähigen Aminooxycarbonsäurederivat der allgemeinen Formel III

W-X^f-M (III)

worin

X'¹ einen in der α-Stellung eine Aminooxygruppe enthaltender) aliphatischen Carbonsäurerest, besonders eine Aminooxyacetyl- oder a-Aminooxypropionylgruppe, W eine durch Acidolyse oder katalytische Hydrogenolyse abspaltbare Schutzgruppe, vorteilhaft eine Benzyloxy-

carbonyl- oder tert«Butyloxycarbonylgruppe^und M eine Hydroxylgruppe oder eine an sich bekannte aktivie-

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rende Gruppe, vorteilhaft eine Pivaloyloxy-, Nitrophenoxy-, 2,3,5-Trichlorphenoxy-, ßentachlorphenoxy-, ftentafluorphenoxy-, N-fuoctniitiidoxy- oder Azidogruppe.

foe-üte.u.fen *

VcfXToTor f

umsetzt und von der erhaltenen Verbindung der allgemeinen Formel IV

lfif-X^tuArg(A)-.Val-Tyr(B)-Ile-His(E)-Pro-Y-OG (IV)

zuerst die Schutzgruppe E, dann die übrigen Schutzgruppen entfernt

und gewünschtenfalls das erhaltene Peptid der allgemeinen Formel I in ein Säureadditionssalz oder einen Komplex über fuhrt.

9o Verfahren nach Anspruch 8, dadurch g e kennzeichnet , daß man die]Schutzgruppe E

t5 durch Behandlung mit 2-Mercaptoäthanol durchführte

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