NO148070B

NO148070B - Analogifremgangsmaate ved fremstilling av nye, terapeutisk aktive angiotensin ii analoger

Info

Publication number: NO148070B
Application number: NO782464A
Authority: NO
Inventors: Lajos Kisfaludy; Gyoergy Nyeki; Laszlo Szirmai; Egon Karpati; Katalin Gidai; Laszlo Szporny
Original assignee: Richter Gedeon Vegyeszet
Priority date: 1977-07-18
Filing date: 1978-07-17
Publication date: 1983-04-25
Also published as: DE2831271C2; AT360678B; ATA518378A; FI782216A; GB2002779A; SE7807824L; CH637916A5; SU913940A3; NL7807627A; GB2002779B; AU520176B2; BE869076A; FR2398049A1; JPS5831337B2; AU3800978A; CS201013B2; YU41315B; IN149852B; HU177134B; US4209442A

Description

Foreliggende oppfinnelse angår en analogifremgangsmåte ved fremstilling av et terapeutisk aktivt peptid av generell formel I

hvor X er hydroxyacetyl eller ct-hydroxypropionyl,

Y er leucyl, isoleucyl eller methylthreonyl

og syreaddisjonssalter og komplekser derav.

Angiotensin II er et octapeptid med en hypertensiv

aktivitet. I organismen fremstilles angiotensin I fra a-globulin produsert av leveren ved hjelp av et enzym kalt renin, som frigis fra nyren. I organismen omdannes denne forbindelse til angio-

tensin II.

Den første angiotensin.il analog ble rapportert for

første gang i 1970. Det ble funnet at denne forbindelse virket som en spesifikk konkurrerende inhibitor av angiotensin II i in vivo og in vitro tester (G. R. Marshall et al.: Proe. Nati. Acad,

Sei. USA 67_, 1624 (1970); P.A. Khairallah et al.: J. Med. Chem. 13,

181 ([1970]). Denne observasjon har ført til en stor interesse og stimulert et stort antall laboratorier til å syntetisere og observere nye angiotensin II analoger som utviser antagonistiske egenskaper og som således kan anvendes for å diagnostisere eller til og med behandle hypertensjoner som skyldes renin. Det viste seg allerede i starten av forskningsarbeidet at analoger i hvilke 8-Phe-gruppen var substituert med en aminosyre med en alifatisk sidekjede, var de mest lovende forbindelser for dette formål.

Denne forandring i strukturen av angiotensin II molekylet betyr

nemlig praktisk talt fravær av agonistisk aktivitet og tilsyne-

komst av den sterke antagoniske aktivitet (D. Gagnon et al.: Br.

J. Pharmacol., 4_3 , 409 [1971]; D.T. Pals et al.: Circ. Res., 29,

664 [1971]). Den antagonistiske aktivitet kan betydelig økes når,

i tillegg til den modifikasjon som utføres i 8-stillingen, 1-Asp-gruppen erstattes med en Sar-gruppe (D.T. Pals et al.: Circ. Res., _29, 673 [1971]). (Sar<1>, Ala<8>)- Angiotensin II fremstilt på denne måte har allerede kommet på markedet. De fordelaktige egenskaper innen denne forbindelse skyldes nedsettelse i den in vivo enzymatiske spaltning og dens store affinitet overfor resep-torsteder.

Antagelsen av at antagonistiske analoger av angiotensin II kan finne anvendelse innen diagnose, og i enkelte tilfeller behandling av hypertensjoner som skyldes renin (D. Ganten and F. Gross: Med. Klin. 71/ 2043 [1976]; J.L. Marx: Science 194, 821 [1976]: 821 [1976]; P. Needleman and G.R. Marshall: Fed. Proe. 35, 2486

[1976]) har blitt bevist ved kliniske tester (H.R. Brunner et al.: Lancet, 1045 [1973]); A.J.M. Donker et al.: Lancet, 1535 [1974];

T. Ogihara et al.: Lancet, 219 [1974]; J.H. Laragh et al.: New Engl. J. Med., 292, 695 [1975]; W.A. Pettinger et al.: New Engl.

J. Med., 292, 1214 [1975]; D.H.P. Streeten et al.: Circ. Res. 36, Suppl. 1., 125 [1975]; H.R. Brunner and H. Gavras: Schweitz, med. Wschr. 10J5, 1791 [1976]).

Sammenligningen av strukturen og den biologiske aktivitet av angiotensin II analoger fremstilt hittil har gitt meget viktig informasjon når det gjelder forklaringen av agonistisk-antagonistisk aktivitet (M.C. Khosla et al.: "Handbook of Experimental Pharmacology" vol. 37, I.H. Page and F.H. Bumpus

eds. 1974 ; G.R. Marshall: Fed. Proe, 35 , 2494 [1976]).

Sentralt i det nåværende forskningsarbeide er fremstil-lingen av nye antagonister som er fri for uønskede bivirkninger og utviser en lengre biologisk halveringsperiode (M.C. Khosla et al.: J.Med. Chem. , 1_9, 244 [1976]; ibid., 20, 253 [1977]).

Det er funnet at når 8-fenylalanindelen i molekylet av angiotensin II erstattes med en alifatisk a-amino-carboxylsyre-radikal og det samtidig foretas binding av et alifatisk ct-hydroxy-carboxylsyreradikal til 1-stillingen erholdes nye angiotensin II konkurrerende inhibitorer som betydelig nedsetter hypertensjonen fremkalt av angiotensin II i in vivo tester selv når det gjelder subcutan administrering.

Analogifremgangsmåten ifølge oppfinnelsen er kjenne-tegnet ved at et reaktivt heptapeptidderivat av generell formel II

hvori

A betegner en gruppe som er egnet for temporær beskyttelse av

guanidingruppen av Arg,

B betegner én gruppe som er egnet for temporær beskyttelse av

den aromatiske hydroxylgruppe i Tyr,

E er en gruppe som er egnet for temporær beskyttelse av imidazol-gruppen i His, og

G betegner en gruppe som er egnet for beskyttelse av carboxyl-gruppen i den C-terminerte alifatiske aminosyre, hvilken beskyttende gruppe er stabil under milde sure betingelser men som kan splittes av ved hjelp av sterke syrer eller baser eller ved

katalytisk hydrogenering, og

Y er som tidligere definert,

omsettes med et reaktivt aminooxycarboxylsyrederivat av generell formel III

hvori

X' er en a-aminooxyacetyl- eller a-aminooxypropionylgruppe,

W er en beskyttende gruppe som kan fjernes ved acidolyse eller

katalytisk hydrogenering,

M betegner en hydroxylgruppe eller en aktiverende gruppe, hvoretter den beskyttende gruppe E avsplittes og deretter den andre sidekjede og endebeskyttende grupper fra forbindelsene av generell formel IV

W-X'-Arg(A)-Val-Tyr(B)-Ile-His(E)-Pro-Y-OG (IV) hvori

B, W, X<1>, Y, A, E og G er som tidligere angitt, de sistnevnte ved katalytisk hydrogenering, og, om ønsket, en forbindelse av generell formel I omdannes til et syreaddisjonssalt eller et kompleks derav.

I forbindelsene av generell formel II betegner A fortrinnsvis en nitro- eller tosylgruppe, B betegner fortrinnsvis en benzyl- eller substituert benzylgruppe, og E betegner fortrinnsvis en dinitrofenylgruppe. I utgangsforbindelsene av generell formel III betegner W fortrinnsvis en benzyloxycarbonyl eller en tertiær-butyloxycarbonylgruppe, X' betegner en aminooxy-

acetyl- eller a-aminooxypropionylgruppe og M betegner fortrinnsvis en pivaloyloxy, nitrofenoxy, pentafluorfenoxy, N-succinimidoxy-azido, 2,3,5-triklorfenoxy- eller pentaklorfenoxygruppe.

Den beskyttende gruppe merket E splittes fortrinnsvis av ved hjelp av 2-mercaptoethanol mens den gjenværende sidekjede og endebeskyttende grupper fjernes ved katalytisk hydrogenering. Dette betyr også at alle sidekjeder og endebeskyttende grupper, bortsett fra den beskyttende gruppe E, kan fjernes i et enkelt reaksjonstrinn. Som et resultat av fjerningen av aminogruppen fra N-ende-a-aminooxysyren i form av ammoniakk erholdes en a-hydroxysyre. Denne måte å fjerne a-hydroxysyregruppen på, er tidligere ikke beskrevet i litteraturen.

De reaktive heptapeptidderivater av generell formel II som anvendes som utgangsmaterialer ved syntesen av forbindelsene ifølge oppfinnelsen, kan fremstilles ved en hvilken som helst kjent måte innen peptidkjemien. En hensiktsmessig metode er beskrevet for eksempel i ungarsk patentskrift 168 431. Ifølge denne metode beskyttes de funksjonelle grupper i sidekjedene med grupper som er stabile under de acidolysebetingelser som anvendes når den beskyttende gruppe fjernes etter kobling.

Ifølge en foretrukket utførelsesform av fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen for den temporære beskyttelse av carboxyl-gruppen i C-terminalaminosyre, anvendes p-nitrobenzylgruppe (Nb), guanidingruppen i arginin beskyttes med en nitrogruppe mens hydroxylgruppen i tirozin beskyttes med en benzylgruppe (Bzl) og den beskyttende gruppe for imidazolringen i histidin er en dinitrofenylgruppe (Dnp). Alle disse beskyttende grupper er stabile under milde sure betingelser, følgelig kan den N-terminale t-butoxycarbonylgruppe (Boe) fjernes uten noen sjanse for avsplit-ing av disse grupper. Denne spesielle kombinasjon av beskyttende grupper gjør det mulig å fjerne dinitrofenylgruppen og deretter fremstille forbindelser av generell formel I i et enkelt reaksjonstrinn ved katalytisk hydrogenering.

Forbindelsen av generell formel I kan renses på i og for seg kjent måte, fortrinnsvis ved carboxymethylcelluloseione-byttekromatografi. Som et resultat av denne teknologi erholdes generelt forbindelser som lyofiliserte pulvere som lett kan over-føres til de forskjellige salter eller komplekser.

Den antagonistiske aktivitet til forbindelsene av generell formel I ble testet på hannkatter. Blodtrykket ble målt på halsarterien. Testene ble utført ved innføring av en Hypertensin (CIBA) infusjon i en lateral lårvene med en hastighet på 0,5 mikrogram/kg/min. Når økningen i blodtrykk var stabilisert, ble de vandige, fysiolgiske eller bærer-holdige løsninger av testfor-bindelsene og Saralasin administrert i en enkel dose, intravenøst eller subcutant, og nedsettelsen i blodtrykk ble målt.

I tabell I er nedsettelsen i det arterielle blodtrykk vist under innflytelsen av en intravenøs administrering av test-forbindelsene. For sammenligning ble anvendt Saralasin. De resultater som er oppført i tabell I ble erholdt ved beregning av det gjennomsnittlige resultat i 6 forsøk. Feilmarginene angir spredningen av hovedverdien.

Nedsettelse i blodtrykk , etter administrering av Analoge etter ^ 30 yg/kg 20 yg/kg i.v. doser

(Hydroxyacetyl<1>, Leu<8>)-AngII -31+4,7 -42+2,8 (HydroxyacetyI°,Ile<8>)-Angll -24+1,7 -30+2,3 (Hydroxyacetyl<1>,Thr(Me)<8>)-AngII -33+5,3 -38+4,1 (L-a-hydroxypropionyl 1 ,Leuif)-Angll -3 2+3,7 -4 0+2,7 (L-a-hydroxypropionyl<1>,Ile<8>)-Angll -31,3,3 -38+4,1 Saralasin -41+2,5

Fra de data som er angitt i tabellen fremgår det klart

at hver angiotensin II analoge substituert med et radikal avledet fra hydroxyeddlksyre eller a-hydroxypropionsyre i 1-stilling utviser en betydelig blodtrykksnedsettende aktivitet. Graden av aktiviteten er proporsjonal med den anvendte dose.

Tester ble også utført med subcutan administrering. Det skal bemerkes at denne administreringsmåte for angiotensin II

eller analoger derav ikke har vært publisert tidligere. For subcutan administrering ble en fysiologisk saltvannsløsning inneholdende den forbindelse som skulle testes supplert med carboxymethylcellulose og gelatin. Resultatene svarende til gjennomsnittet av fem separate tester er angitt i etterfølgende tabell 2. Feilmar-gin refererer til hovedverdien.

Ifølge de ovenfor angitte data oppnås det ved subcutan administrering av de nye forbindelser en nedsettelse av det høye blodtrykk som ble indusert, i en betydelig grad selv 60 minutter etter administreringen.

Uttrykket "komplekser av peptidene fremstilt ifølge oppfinnelsen" anvendes her for å angi kompleksforbindelser dannet med visse organiske materialer, som gir peptidene en forsinket effekt. Typiske representanter for disse organiske forbindelser er gelatiner, carboxymethylcellulose, alginsyreestere, poly-(fluorethinfosfater), aminosyrepolymerer eller andre polymerer og copolymerer.

Peptidene fremstilt ifølge oppfinnelsen såvel som farma-søytisk akseptable salter og komplekser derav anvendes for farma-kologiske formål i form av konvensjonelle farmasøytiske preparater. Disse farmasøytiske preparater inneholder forbindelsene fremstilt ifølge oppfinnelsen i blanding med organiske eller uorganiske bærere som er egnet for enteral eller parenteral administrering. Således kan farmasøytiske preparater formuleres som faste lyo-filisater hvori forskjellige inerte forbindelser som ikke rea-gerer med peptider, f.eks. hydrocarboner, kan anvendes som bærere. Når det farmasøytiske preparat formuleres som fortynnede eller konsentrerte suspensjoner eller emulsjoner, inneholder de også forskjellige konserverende og stabiliserende midler.

Farmasøytiske preparater inneholdende forbindelsene fremstilt ifølge oppfinnelsen, kan anvendes for differensiert be-stemmelse av renal hypertensjoner såvel som for behandling av ethvert syndrom bevirket av et øket renalt blodtrykk.

Ytterligere detaljer fremgår fra de etterfølgende eksemp-ler. De forkortelser som anvendes i eksemplene svarer til de som generelt anvendes i litteraturen (J. Biol. Chem. 247, 977 (1972)). a-aminosyrene betegnes ved stavelsen "0" foran symbolet svarende til den angjeldende aminosyre. Således betegner f.eks. OGly amino-oxyeddiksyre, OAla betegner ot-aminooxypropionsyre etc. Ytterligere forkortelser er for eksempel: PFP = pentafluorfenyl og Z = carbo-methoxy.

Ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen ble fordampningen alltid utført på et Biichi Rotavapor-apparat. Smeltepunktene ble bestemt i et Dr. Tottoli-apparat. Tynnskiktskromatografi ble utført på "Kieselgel G nach Stahl" silicagelplater. Kromatogram-

mene ble fremkalt med følgende løsningsmiddelblandinger:

1. ethylacetat: (20:6:11 blanding av pyridin/eddiksyre/vann) = 95:5 2. ethylacetat: (20:6:11 blanding av pyridin/eddiksyre/vann) = 90:10 3. ethylacetat: (20:6:11 blanding av pyridin/eddiksyre/vann) = 80:20 4. ethylacetat: (20:6:11 blanding av pyridin/eddiksyre/vann) = 70:30

5. 5:1:5 blanding av n-butanol/eddiksyre/vann

6. 30:6:20:24 blanding av n-butanol/eddiksyre/pyridin/vann

7. 1:1:1:1 blanding av n-butanol/ethylacetat/eddiksyre/vann

Når det i eksemplene er angitt R^-verdier er det referert til nummer på de ovenfor angitte løsningsmiddelsystemer.

Papirelektroforese ble utført i et LMIM, horisontalt middelsspent anlegg, på et MN 214 papir, i en pH = 1,9 pufferløs-ning ved siden av glutaminsyre. Spenning: 4 50 V, tid: 3 timer.

Tynnskiktskromatogrammene ble fremkalt delvis med en ninhydrinløsning, delvis med en konvensjonell kloreringsteknikk utført med en o-tolidin-KJ-løsning.

Sluttproduktet_ble renset som beskrevet i det etter-følgende : 0,5 g av et fri peptid ble deretter løst i 4 ml av en 0,01 n ammoniumacetatbuffer. Den erholdte løsning ble helt over på en carboxymethylcellulosesøyle (CMC 52) på 0,5 liter. Kolonnen ble på forhånd bragt i likevektstilstand med den ovenfor beskrevne bufferløsning. 1,5 liter av en 0,01 M ammoniumacetatløsning og 1,5 liter av en 0,4 M ammoniumacetatløsning ble blandet med en gradientomrører og gradienteluering ble utført. Strømningshastig-heten ble justert til 25 ml/time og 10 ml's fraksjoner ble oppsam-let. Eluatet fra kolonnen ble kontinuerlig registrert ved hjelp av et LKB Uvicord-II apparat og på basis av den erholdte kurve ble hovedfraksjonene lyofilisert i en Leybold-Hereus lyofiliserings-apparatur. Lyofilisatet fremstilt på denne måte ble omkromatogra-fert under anvendelse av den samme gradierte elueringsteknikk og eluatet ble igjen lyofilisert.

Eksempel 1

.( Hydroxyacetyl 1 , Leu 8)- angiotensin II

Trinn 1

Boc-Arg(H02)-Val-Tyr(Bzl)-Ile-His(Dnp)-Pro-Leu-ONB

Til en løsning av 4,2 g (12 mmol) Leu-ONB HBr i 5M

ml kloroform ble 1,68 ml triethylamid og 3,81 g (10 mmol) Boc-Pro-OPFP tilsatt. Reaksjonsblandingen ble omrørt ved romtemperatur i 20 minutter, ristet med vann og derpå med en 10 %-ig vandig sitronsyreløsning og tørket. Kloroformløsningen ble fordampet.

Det beskyttede peptid (R^ = 0,8) som ble erholdt ble oppløst i

20 ml av en 8M løsning av saltsyre i dioxan. Etter 10 minutter ble løsningen fortynnet med tørr ether og fordampet. Dipeptid-klorhydratet fremstilt på denne måte (R^ 4 = 0,56) ble løst i 50'ml kloroform, pH-verdien på løsningen ble innstilt til 8 med triethylamin og 8,8 g (15 mmol) Boc-His(Dnp)-OPFP ble tilsatt. Løsningen ble omrørt ved romtemperatur i 1 time idét man passet på at nivået på løsningen ble holdt på en verdi på 8. Deretter ble 1,65 ml N,N-dimethyl-aminoethylamin tilsatt til løsningen for å fjerne over-skudd av aktiv ester og etter 10 minutter ble reaksjonsblandingen ristet med en 10 %-ig vandig løsning av sitronsyre, 1 N vandig saltsyreløsning og en 5 %-ig vandig natriumhydrocarbonatløsning. Etter tørking ble løsningen fordampet. Det gjenværende beskyttede tripeptid (R^ = 0,65) ble løst i 25 ml av en 8M løsning av saltsyre i dioxan og etter 15 minutter ble det erholdte tripeptid (R^ 4= 0,47) utfelt ved tilsetning av tørr ether. Bunnfallet ble filtrert fra og umiddelbart løst i en blanding av 50 ml kloroform og 20 ml dimethylformamid. pH-verdien ble justert til 8 med triethylamin og 6,0 g (15 mmol) Boc-Ile-OPFP ble tilsatt. 30 minutter senere ble reaksjonsblandingen fordampet til tørrhet og residuet ble løst i 100 ml ethylacetat. Ethylacetatløsningen ble ekstra-hert med en vandig sitronsyreløsning, IN vandig saltsyreløsning og tilslutt med vann. Etter tørking ble ethylacetat fjernet ved fordampning og residuet ble behandlet med en 1:9 blanding av ether og n-hexan. Det erholdte beskyttede tripeptid (R£<1>= 0,64) ble isolert og løst i 25 ml av en 8M løsning av saltsyre i dioxan. Etter 15 minutter ble tetrapeptidet (R^ 4= 0,40) utfelt med tørr ether og deretter filtrert fra. Det erholdte tetrapeptidklorhydrat ble løst i en blanding av 50 ml kloroform og 30 ml dimethylformamid og pH-verdien på løsningen ble justert til 8 med triethylamid. 6,5 g (11,5 mmol) Boc-Tyr(Bzl)-OPEP ble tilsatt. Etter 15 minutter ble løsningen fordampet, residuet ble løst i ethylacetat og 0,66 ml N,N-dimethyl-aminoethylamin ble tilsatt. Etter 10 minutters hen-stand ble ethylacetatløsningen ristet med en 10 %-ig vandig sitronsyreløsning, med IN vandig saltsyreløsning og tilslutt med vann, tørket og fordampet. Fordampningsresten ble behandlet med tørr ether og det beskyttede pentapeptid (Rf 2 = 0,8) ble isolert ved filtrering. Produktet ble løst i 25 ml av en 8N løsning av saltsyre i dioxan og etter 15 minutter ble det erholdte pentapeptid (R^ 4 = 0,8) utfelt med tørr ether, filtrert og vasket med ether. Bunnfallet ble deretter umiddelbart løst i 50 ml dimethylformamid, pH-verdien ble justert til 8 med triethylamin og 4,2 g (11 mmol) Boc-Val-OPFP ble tilsatt. Etter omrøring ved romtemperatur i 1 time ble løsningen fordampet, residuet ble løst i kloroform og ristet med en 10 %-ig vandig sitronsyreløsning, deretter med en IN vandig saltsyreløsning og til slutt med vann. Løsningen ble tørket, fordampet og residuet ble behandlet med ether. Det erholdte beskyttede hexapeptid (R^ 2 = 0,82) ble isolert ved filtrering. Produktet ble løst i 25 ml av en 8N løsning av saltsyre i dioxan, og etter 15 minutter ble hexapeptid (R^ 3 = 0,55) utfelt med tørr ether, filtrert og vasket med ether. Hexapeptidet ble umiddelbart løst i 50 ml dimethylformamid, pH-verdien ble justert til 8 med triethylamin og 4,8 g (10 mmol) Bos-Arg(N02)-OPEP ble tilsatt. Etter 30 minutter ble løsningsmidlet erstattet med kloroform og løsningen ble ristet med en IN vandig saltsyreløs-ning og deretter med vann. Løsningen ble tørket, fordampet og residuet ble behandlet med ethanol. Det beskyttede heptapeptid (R^ 2 = 0,8) ble isolert under dannelse av 7,6 g (53 % beregnet med.hensyn på Boc-Pro-OPEP)-utgangsmaterialet. Smeltepunkt: 192-195° C.

Trinn 2

Z-OGly-Arg (N02)-Val-Tyr(Bzl)-Ilo-His(Dnp)-Pro-Leu-ONB

1,8 g (1,25 mmol) Boc-Arg(N02)-Val-Tyr(Bzl)-I1o-his(Dnp)-Pro-Leu-ONB ble løst i 10 ml av en 8M løsning av saltsyre i dioxan. Etter 15 minutter ble det fri heptapeptidklorhydrat utfelt med tørr ether, filtrert og vasket med tørr ether (R^ 3 = 0,36). Produktet ble umiddelbart løst i 20 ml dimethylformamid, pH-verdien

ble justert til 8 med triethylamid og 0,9 g (2,3 mmol) Z-OGly-OPFP ble tilsatt. Etter 15 minutter ble løsningsmidlet erstattet med kloroform, løsningen ble ristet med en IN vandig saltsyreløs-ning og vann. Etter tørking og fordampning ble residuet behandlet med en 2:8 blanding av ethanol og ether, produktet ble isolert ved filtrering, 1,6 g (85 %) av tittelforbindelsen ble erholdt. Smeltepunkt: 165 - 174° C (Rf<2> = 0,80).

Trinn 3

Fjerning av de beskyttende grupper

1,6 g (1,0 mmol) Z-OGly-Arg(N02)-Val-Tyr(Bzl)-Ile-His-(Dnp)-Pro-Leu-ONB ble løst i 5 ml dimethylformamid og 3,5 ml 2-mercaptoethanol ble tilsatt. Løsningen ble omrørt ved romtemperatur i 1 time. Deretter ble tørr ether tilsatt til blandingen og det utfelte materiale ble filtrert fra, vasket med to 10 ml<1>s porsjoner av ether og renset ved utfelling fra methanol-ether.

1,3 g (95 %) Z-OGly-Arg(N02)-Val-Tyr(Bzl)-Ile-His-Pro-Leu-ONB ble erholdt, Rf<2> = 0,2.

Det ovenfor erholdte peptid ble løst i 3 0 ml av en 5:1:1 blanding av methanol, eddiksyre og vann. 0,5 g av en 10 %-ig palladium-på-benkull-katalysator ble tilsatt og hydrogen ble boblet gjennom den kraftig omrørte løsning i 20 timer. Reaksjons-forløpet ble overvåket ved tynnskiktskromatografi. Når reaksjonen avsluttes filtreres katalysatoren av,'vasket med 20 ml av en 5:1:1 blanding av methanol, eddiksyre og vann, og løsningen ble fordampet til tørrhet. Residuet ble løst i en ethanol/vannblan-ding og fordampet igjen for å fjerne eddiksyre. Peptidet ble deretter isolert ved behandling med tørr ethanol og filtrert fra.

0,8 g (67 %) av hydroxyacetyl 1 ,Leu 8-angiotensin II ble erholdt. Rensing ble utført som tidligere beskrevet. Rf<5> = 0,41, Rf^ = 0,59, Rf7 = 0,60, EQlu/pH = 1,9 / = 0,98.

Aminosyreanalyse: Pro : 1,0/1/;

Val: 1,01 /l/;Ile: 1,02/1/; Arg: 1,01/1/; His: 1,0/1/; Leu: 1,02/1/; Tyr: 0,73/1/.

E ksempel 2

( L- a- hydroxypropionyl 1 , Leu 8)- angiotensin II

Trinn 1

2-OAla-Arg(N02)-Val-Tyr(Bzl)-Ile-His(Dnp)-Pro-Leu-ONB

1,8 g (1,25 mmol) Boc-Arg(N02)-Val-Tyr-(Bzl)-Ile-His-(Dnp)-Pro-Leu-ONB erholdt i trinn 1 i eksempel 1 ble løst i 8 ml av en 8M løsning av saltsyre i dioxan. Det fri heptapeptid ble utfelt fra. løsningen med tørr ether, ble deretter filtrert fra og vasket med tørr ether (R^ = 0,36). Forbindelsen ble umiddelbart løst i 20 ml dimethylformamid, pH-verdien ble justert til 8 med triethylamin og 0,93 g (2,3 mmol) Z-OAla-OPFP ble tilsatt. Etter 15 minutter ble løsningsmidlet erstattet med kloroform og den erholdte løsning ble ristet med en IN vandig saltsyreløsning og deretter med vann. Ekstraktet ble tørket og fordampet. Residuet ble behandlet med en 4:1 blanding av ethanol og ether under dannelse av 1,75 g (93 %) av tttelforbindelsen. Smeltepunkt: 164 - 172° C, Rf<2> = 0,85.

Trinn 2

Fjerning av de beskyttende grupper

1,6 g Z-OAlal-Arg(N02)-Val-Tyr(Bzl)-Ile-His(Dnp)-Pro-Leu-ONB ble løst i 5 ml dimethylformamid, 3,5 ml 2-mercaptoethanol ble tilsatt og blandingen ble omrørt 1 time ved romtemperatur. Deretter ble tørr ether tilsatt og det erholdte bunnfall ble filtrert fra og renset med methanol-etherutfelling. 1,3 g (92 %) Z-OAla-Arg(N09)-Val-Tyr(Bzl)-Ile-His-Pro-Leu-ONB ble erholdt, 2 =0,27. Dette peptid ble løst i en 5:1:1 blanding av methanol, eddiksyre og vann, 0,5 g av en 10 %-ig palladium-på-trekullkata-lysator ble tilsatt og hydrogengass ble boblet gjennom løsningen i 20 timer under kraftig omrøring. Reaksjonsforløpet ble overvåket ved tynnskiktskromatografi. Når reaksjonen var fullført ble katalysatoren filtrert fra, vasket og løsningen ble fordampet til tørrhet. Oppløsning av residuet i en ethanol/vannblanding og fordampning ble gjentatt flere ganger. Residuet ble deretter behandlet med tørr ethanol under dannelse av (L-a-hydroxypropyl - Leu Q)-angiotensin II. Utbytte: 0,65 g (0%). Det erholdte pro-dukt ble renset som ovenfor beskrevet. R^ = 0,36; R^ = 0,57;

Rf<7> = 0,60; EGlu(pH = 1,9) = 0,97.

Aminosyreanalyse: Pro: 0,98(1); Val: 1,0(1); Ile: 1,1(1);

Arg: 1,0(1); His: 0,98(1); Leu: 0,98; Tyr: 0,56(1).

Eksempel 3

( Hydroxyacetyl 1 , Ile 8)- angiotensin II

Trinn 1

Boc-Arg (N02 )-Val-Tyr(Bzl) -Ile-His (Dnp) -Pro-Ile-ONB

Til en løsning av 4,15 g (15 mmol) Ile-ONB • HCl i 50 ml kloroform ble 2,1 ml triethylamin tilsatt fulgt av tilsetning av 3,81 g (10 mmol) Boc-Pro-OPFP. Reaksjonsblandingen ble omrørt i 20 minutter ved romtemperatur. Den ble deretter ristet med vann og med en 10 %-ig vandig sitronsyreløsning, tørket og fordampet. Det erholdte beskyttede dipeptid (Rf<1> = 0,9) ble løst i 20 ml av en 8 M løsning av saltsyre i dioxan, og etter 10 minutter ble reaksjonsblandingen fortynnet med tørr ether og fordampet. Det fri dipeptidhydroklorid (R^ 4 = 0,44) ble løst i 30 ml kloroform, pH-verdien ble justert til 8 med triethylamin og 8,8 g (15 mmol) Boc-His(Dnp)-OPFP ble tilsatt. Etter 1 time ble 1,65 ml N,N-dimethyl-aminoethylamin tilsatt til reaksjonsblandingen, som ble ristet etter 15 minutter med en 10 %-ig vandig sitronsyreløsning,

med en IN vandig saltsyreløsning og tilslutt med vann. Ekstraktet ble tørket og fordampet. Det beskyttede tripeptid (Rj"'" = 0,50)

ble løst i 20 ml av en 8M løsning av saltsyre i dioxan uten isolering. Etter 15 minutter ble tripeptidet (R^ = 0,25) utfelt med tørr ether, filtrert og vasket med tørr ether. Det ble deretter umiddelbart løst i en blanding av 50 ml kloroform og 20 ml di-methylf ormamid . pH-verdien på løsningen ble justert til 8 med triethylamin og 6,0 g (15 mmol) Boc-Ile-OPFP ble tilsatt. Blandingen fikk stå i 30 minutter, deretter ble løsningsmidlet erstattet med ethylacetat og løsningen ble ristet med en 10 %-ig vandig løsning av sitronsyre, IN vandig saltsyreløsning og tilslutt med vann. Det kombinerte ekstrakt ble tørket, fordampet og det gjenværende beskyttede tetrapeptid ble isolert ved ekstraksjon med en 9:1 blanding av n-hexan og ether. Det beskyttede tetrapeptid

d(Riof r x2a= n. 0,E6t5t) ebr le 30 lmøsint uti te2r 5 mbll e av deet n er8M holldøtse nintg etrav apespatltid syr(e R^ 4i= 0,41) utfelt ved tilsetning av tørr ether, filtrert fra og vasket.

Det ble umiddelbart løst i 70 ml av en 1:1 blanding av dimethylformamid og kloroform. Deretter ble pH-verdien på løsningen justert til 8, og 6,0 g (11,5 mmol) Boc-Tyr-(Bzl)-OPFP ble tilsatt. Etter 15 minutter ble løsningsmidlet erstattet med ethylacetat,

og 0,66 ml N,N-dimethyl-aminoethylamin ble tilsatt. Etter 15 minutter ble det ristet med en 10 %-ig vandig sitronsyreløsning, IN vandig saltsyreløsning og tilslutt med vann. Etter tørking og fordampning ble det erholdte beskyttede pentapeptid (R^ 2 = 0,59) isolert ved tilsetning av tørr ether. Det ble deretter løst i 20 ml saltsyre i dioxan. Etter 15 minutter ble pentapeptidhydro-kloridet (R^ 4= 0,4) utfelt ved tilsetning av ether, filtrert og vasket med 20 ml tørr ether. Det ble umiddelbart løst i 50 ml dimethylformamid, pH-verdien ble justert til 8 med triethylamin og 4,62 g (12 mmol) Boc-Val-OPFP ble tilsatt. Etter 1 time ble løs-ningsmidlet erstattet med kloroform og løsningen ble ristet med en 10 -ig vandig sitronsyreløsning, IN vandig saltsyreløsning og tilslutt med vann. Det erholdte ekstrakt ble tørket, fordampet og fordampningsresten ble behandlet med tørr ether for å utfelle det beskyttede-hexapeptid (Rf 2 = 0,50). Dette ble deretter løst i 20 ml av en 8M løsning av saltsyre i dioxan, og etter 15 minutter ble det fra løsningen erholdte hexapeptid (Rj^ =' 0,47) utfelt ved tilsetning av tørr ether. Hexapeptidet ble filtrert fra og vasket med 20 ml tørr ether. Det ble umiddelbart løst i 50 ml dimethylformamid, pH-verdien ble justert til 8 med triethylamin og 5,38 g (12 mmol) Boc-Arg-(N02)-OPFP ble tilsatt. Blandingen fikk stå i 30 minutter. Deretter ble løsningsmidlet erstattet med kloroform og løsningen ble ristet med IN vandig saltsyreløsning og vann. Ekstraktet ble tørket, fordampet og det beskyttede heptapeptid ble isolert ved hjelp av ethanol. 9,7 g (68 % beregnet med hensyn på Boc-Pro-OPFP )-utgangsf orbindelsen av titbelf orbindelsen ble erholdt Rf2 = 0,67.

Trinn 2

Z-OGly-Arg(N02)-Val-Arg(N02)-Val-Tyr(Bzl)-Ile-His(Dnp)-Pro-Ile-ONB

1,6 g (1,1 mol) Boc-Arg(N02)-Val-Tyr(Bzl)-Ile-His(Dnp)-Pro-Ile-ONB ble løst i 8 ml av en 8M løsning av saltsyre i dioxan. Løsningen fikk stå i 15 minutter, deretter ble det erholdte heptapeptid-hydroklorid (R^ 4= 0,45) utfelt med tørr ether, filtrert og vasket med 20 ml tørr ether. Det ble deretter umiddelbart løst i 10 ml dimethylformamid, pH-verdien ble justert til 8 med triethylamin og 0,6 g (1,5 mmol) Z-OGly-OPFP ble tilsatt. Etter 3 0 minutter ble løsningsmidlet erstattet med kloroform, og løsningen ble ristet med IN vandig saltsyreløsning og vann. Ekstraktet ble tør-ket og fordampet og det beskyttede peptid ble isolert med tørr ether. 1,45 g (85 %) av tittel f orbindelsen ble erholdt. Smeltepunkt: 151 - 158° C, Rf<2> = 0,68.

Trinn 3

E liminering av de beskyttede grupper

1,45 g (0,94 mmol) Z-OGly-Arg(N02)-Val-Tyr(Bzl)-Ile-His (Dnp)-Pro-Ile-ONB ble løst i 5 ml dimethylformamid. 3,5 ml 2-mercaptoethanol ble tilsatt, løsningsmidlet ble omrørt i 1 time og Z-OGly-Arg(N02)-Val-Tyr(Bzl)-Ile-His-Pro-Ile-ONB ble utfelt med tørr ether. Etter en methanol-etherutfelling ble 1,05 g (82 %)

av peptid (Rf<2> = 0,10) erholdt. Dette ble løst i 30 ml av en 5:1:1 blanding av methanol, eddiksyre og vann, 0,5 g av en 10 %-ig palladium-på-benkull-katalysator ble tilsatt og hydrogengass ble boblet gjennom den kraftig omrørte reaksjonsblanding i 21 timer. Reaksjonsforløpet ble overvåket ved tynnskiktskromatografi. Katalysatoren ble filtrert fra, løsningen ble fordampet til tørrhet og det erholdte fri peptid ble isolert med tørr ethanol. 0,48 g (64,5 %) (hydroxyacetyl 1 ,Ile 8)-angiotensin II ble erholdt. Produktet ble renset på i og for seg kjent måte. R =0,29; R,.

7 t f

0,57; Rf =0,58; EGlu (pH = 1,9) = 1,03. Aminosyreanalyse: Pro: 0,99(1); Val: 1,15(1); Ile: 2,06(2); Tyr: 0,74(1);

His: 0,98(1); Arg: 0,95.

E ksempel 4

( L- a- hydroxypropionyl 1 , Ile 8)- angiotensin II

Trinn 1

Z-OAla-Arg(NO2)-Val-Tyr(Bzl)-Ile-His(Dnp)-Pro-Ile-ONB

1,6 g (1,1 mmol) Boc-Arg(N02)-Val-Tyr(Bzl)-Ile-His-(Dnp)-Pro-Ile-ONB ble løst i 8 ml av en 8M løsning av saltsyre i dioxan. Løsningen fikk stå i 15 minutter og heptapeptidet ble utfelt ved tilsetning av ether (Rf 4 = 0,45), filtrert og vasket. Den ble umiddelbart løst i 10 ml dimethylformamid, pH-verdien ble justert til 8 med triethylamin og 0,61 g (1,5 mmol) Z-OAla-OPFP ble tilsatt. Etter 30 minutter ble løsningsmidlet erstattet med

kloroform, og løsningen ble ristet med en IN vandig saltsyreløs-ning og vann. Etter tørking og fordampning ble det erholdte beskyttede peptid (R^ 2 = 0,63) isolert med ether. 1,4 g (83 %)

av tittelforbindelsen ble erholdt. Smeltepunkt: 164 - 168° C.

Trinn 2

Fjerning av beskyttende grupper

1,4 g (0,9 mmol) Z-OAla-Arg(N02)-Val-Tyr(Bzl)-Ile-His (Dnp) -Pro-Ile-ONB ble løst i 5 ml dimethylformamid og 3,5 ml 2-mercaptoethanol ble tilsatt. Løsningen fikk stå i 1 time og deretter ble Z-OAla-Arg(N02)-Val-Tyr(Bzl)-Ile-His-Pro-Ile-ONB utfelt med ether og renset ved methanol-etherutfelling. Utbytte: 0,8 g (65 %), Rf<2> = 0,13; Rf<3> = 0,27. Det erholdte beskyttede peptid ble løst i 10 ml av en 5:1:1 blanding av methanol, eddiksyre og vann. Til løsningen ble 0,5 g tilsatt av en 10 %-ig palladium-på-benkull-katalysator og hydrogengass ble boblet gjennom blandingen i 16 timer under omrøring. Når reaksjonen avtok ble katalysatoren filtrert fra, løsningen ble fordampet og produktet ble isolert ved hjelp av tørr ethanol. 0,4 g (0,65 %) (L-a-hydroxy-propionyl - Ile g)-angiotensin II ble erholdt. Rensingen ble utført som tidligere beskrevet. Rf<5> = 0,30; Rf<6> = 0,58; Rf<7> = 0,58;

EGlu (pH = 1,9) = 1'07- Aminosyreanalyse: Pro: 1,04(1);

Val: 0,98(1); Ile: 1,98(2); Tyr: 0,98(1); His: 1,05(1);

Arg: 1,0(1).

E ksempel 5

1 8

( Hydroxyacetyl , Thr( Me) )- angiotensin II

Trinn 1

Boc-Arg(N02)-Val-Tyr(Bzl)-Ile-His(Dnp)-Pro-Thr (Me)-OMe

0,69 g (3 mmol) Thr(Me)-OMe • HBr ble løst i 30 ml kloroform, 0,42 ml triethylamin og 1,7 g (4,5 mmol) Boc-Pro-OPFP ble tilsatt. Løsningen fikk stå i 2 timer hvorpå 0,33 ml N,N-dimethylaminoethylamin ble tilsatt. Etter 15 minutter ble løs-ningsmidlet erstattet med ethylacetat, og den erholdte løsning ble ristet med en 10 %-ig vandig sitronsyreløsning, IN vandig salt-syreløsning, vann og tilslutt med en 5 %-ig vandig natriumhydro-

gencarbonatløsning. Etter tørking og fordampning ble det beskyttede dipeptid (R^<1> = 0,76) løst i 2 ml av en 8M løsning av saltsyre i dioxan.uten isolering. Etter 15 minutter ble løsningen fortynnet med ether og fordampet. Rest-dipeptidet (R^ 3 = 0,18) ble løst i 20 ml kloroform, pH-verdien ble justert til 8 med triethylamin og 2,6 g (4,5 mmol) Boc-His(Dnp)-OPFP ble tilsatt.

Etter omrøring i 2 timer ved romtemperatur ble 0,22 ml N,N-dimethyl-aminoethylamin tilsatt til løsningen som ble ristet etter 15 minutter med en 10 %-ig vandig sitronsyreløsning, IN vandig saltsyre-løsning og med vann. Etter tørking og fordampinng ble det beskyttede tripeptid (R^ = 0,5) løst i 4 ml av en 8N vandig saltsyre-løsning uten isolering, og etter 15 minutter ble tripeptidet (R^ 3 = 0,3) utfelt med tørr ether, filtrert og vasket med ether. Det ble umiddelbart løst i 2 0 ml av en 1:1 blanding av kloroform og dimethylformamid, pH-verdien på løsningen ble justert til 8 med triethylamin og 1,6 g (4 mmol) Boc-Ile-OPFP ble tilsatt. Etter 2 0 minutter ble løsningsmidlet erstattet med ethylacetat, og ethyl-acetatløsningen ble ristet med en 10 %-ig vandig sitronsyreløs-ning, IN vandig saltsyreløsning og tilslutt med vann. Etter, tørk-ing og fordampning ble residuet behandlet med en 1:9 blanding av ether og n-hexan, og det beskyttede tetrapeptid ble isolert. Det ble deretter løst i 7 ml av en 8M løsning av saltsyre i dioxan, løsningen fikk stå i 15 minutter hvorpå tetrapeptidet (Rf 4 = 0,27) ble utfelt med tørr ether. Det ble umiddelbart løst i 20 ml av en 1:1 blanding av kloroform og dimethylformamid, pH ble justert til 8 med triethylamin og 1,6 g (3 mmol) Boc-Tyr(Bzl)-OPFP ble tilsatt. Etter 3 0 minutter ble løsningsmidlet erstattet med ethylacetat og 0,22 ml N,N-dimethylaminoethylamin ble tilsatt. Løsningen fikk stå i 15 minutter hvorpå det ble ristet med en 10 %-ig vandig sitronsyreløsning, IN vandig saltsyreløsning og tilslutt med vann. Ekstraktet ble tørket og fordampet og det beskyttede pentapeptid (Rf<2> = 0,63) ble isolert ved hjelp av ether. 0,4 g av det beskyttede pentapeptid ble erholdt. Den erholdte forbindelse ble løst i 1 ml av en 8M løsning av saltsyre og dioxan og etter 15 minutter ble pentapeptidet (Rf<4> = 0,47) utfelt med tørr ether, filtrert og vasket med ether. Det ble umiddelbart løst i 10 ml dimethylformamid , pH-verdien for løsningen ble justert til 8 med triethylamin og 0,4 g (1 mmol) Boc-Val-OPFP ble tilsatt. Etter 1 time ble løsningsmidlet erstattet med kloroform og den erholdte løsning ble ristet med en 10 %-ig vandig sitronsyreløsning, IN vandig saltsyreløsning og vann. Etter tørking og fordampning ble det beskyttede hexapeptid (Rf<2> = 0,65) isolert ved hjelp av ether. Deretter ble produktet løst i 1,5 ml av en 8M løsning av saltsyre

i dioxan, løsningen fikk stå i 15 minutter hvorpå hexapeptidet (Rf 4 = 0,48) ble utfelt med tørr ether. Bunnfallet ble filtrert fra, vasket med ether og umiddelbart løst i 10 ml dimethylformamid. pH-verdien for løsningen ble justert til 8 med triethylamin og 0,45 g (1 mmol) Boc-Arg(N02)-OPFP ble tilsatt. Etter 1 time ble løsningsmidlet erstattet med ethylacetat og løsningen ble ristet med en 10 % vandig sitronsyreløsning, med en IN vandig løsning av saltsyre og tilslutt med vann. Det erholdte ekstrakt ble tørket, fordampet og behandlet med en 9:1 blanding av ether og ethanol under dannelse av 0,45 g (11,3 %) av et beskyttet heptapeptid Rf<2> = 0,38, med smeltepunkt 199 - 203° C (spaltning).

Trinn 2

Z-OGly-Arg(N02)-Val-Tyr(Bzl)-Ile-His(Dnp)-Pro-Thr(Me)-OMe

0,45 g (0,34 mmol) Boc-Arg(N02)-Val-Tyr(Bzl)-Ile-His-(Dnp)-Pro-Thr (Me)-Olle ble løst i 2 ml av en 8M løsning av saltsyre i dioxan. Løsningen fikk stå i 15 minutter hvorpå heptapeptidet ble isolert ved tilsetning av tørr ether (R^ 4 = 0,35). Det ble umiddelbart løst i 10 ml dimethylformamid, pH-verdien på løsningen ble justert til 8 med triethylamin og 0,4 g (1 mmol) Z-OGly-OPFP ble tilsatt. Etter 1 time ble reaksjonsblandingen fortynnet med 30 ml kloroform og ristet med vann. Etter tørking og fordampning ble det beskyttede peptid isolert ved hjelp av en 9:1 blanding av ether og ethanol. Utbytte: 0,45 g (93 %), smeltepunkt: 158 -

162° C , (Rf<2> = 0,44).

Trinn 3

Fjerning av de beskyttende grupper

0,45 g (0,31 mmol) Z-OGly-Arg(N02)-Val-Tyr(Bzl)-Ile-His (Dnp)-Pro-Thr(Me)-OMe ble løst i 1,5 ml dimethylformamid og 1

ml 2-mercaptoethanol ble tilsatt. Etter 1 time ble materialet utfelt med tørr ether, løst i methanol, avfarvet med en liten mengde benkull og tilslutt fordampet. Fordampningsresten ble triturert med ether og filtrert fra. 0,38 g (98 %) Z-OGly-Arg-(N02)-Val-Tyr(Bzl)-Ile-His-Pro-Thr(Me)-OMe ble erholdt. Rf 3 = 0,16; Rf<4> = 0,52. Produktet ble suspendert i 5 ml dioxan og 1,2 ml av en IN vandig natriumhydroxydløsning ble tilsatt. Løsningen fikk stå i 1 time hvorpå pH-verdien ble justert til 3 med IN vandig saltsyreløsning. Det erholdte bunnfall ble løst i en 3:1 blanding av kloroform og dimethylformamid. Etter tørking og fordampning ble peptidet med fri C-avsluttende ende behandlet med ether. 0,26 g (70 %) av det fri peptid ble erholdt, Rf 4 0,25. Det ble deretter løst i 10 ml av en 5:1:1 blanding av methanol, eddiksyre og vann, 0,1 g palladium-på-benkullkatalysa-tor ble tilsatt og hydrogengass ble boblet gjennom løsningen i 16 timer under omrøring. Reaksjonsforløpet ble overvåket ved tynnskiktskromatografi. Når reaksjonen var avsluttet ble katalysatoren filtrert fra og løsningen ble fordampet til tørrhet. Residuet ble løst i en vann/ethanolblanding og fordampet flere ganger. 0,16 g (80 %) (hydroxyacetyl"'" ,Thr (Me) ) -angiotensin II ble erholdt som kan renses som tidligere beskrevet. R,."<*> = 0,22;

6 7

Rf = 0,53; Rf = 0,50; Rq1u <Ph = 1#9) = 0,98. Aminosyreanalyse: Thr: 0,6(1); Pro: 1,0(1); Val: 1,0(1); Ile: 1,02(1); Tyr: 0,85(1); His: 1,0(1); Arg: 0,96(1).

Claims

Analogifremgangsmåte ved fremstilling av et terapeutisk aktivt peptid av generell formel I

hvor X er hydroxyacetyl eller oi-hydroxypropionyl,

Y er leucyl, isoleucyl eller methylthreonyl

og syreaddisjonssalter og komplekser derav, karakterisert ved at et reaktivt heptapeptidderivat av generell formel II

hvori

A betegner en gruppe som er egnet for temporær beskyttelse av

guanidingruppen av Arg,

B betegner en gruppe som er egnet for temporær beskyttelse av

den aromatiske hydroxylgruppe i Tyr,

E er en gruppe som er egnet for temporær beskyttelse av imidazol-

gruppen i His, og

G betegner en gruppe som er egnet for beskyttelse av carboxyl-

gruppen i den C-terminale alifatiske aminosyre, hvilken beskyttende gruppe er stabil under milde sure betingelser men som kan splittes av ved hjelp av sterke syrer eller baser eller ved katalytisk hydrogenering, og

Y er som tidligere definert,

omsettes med et reaktivt aminooxycarboxylsyrederivat av generell formel III

hvori

X<1> er en ct-aminooxyacetyl- eller a-aminooxypropionylgruppe,

W er en beskyttende gruppe som kan fjernes ved acidolyse eller

katalytisk hydrogenering,

M betegner en hydroxylgruppe eller en aktiverende gruppe, hvoretter den beskyttende gruppe E avsplittes og deretter den andre sidekjede og ende-beskyttende grupper fra forbindelsene av generell formel IV

hvori

B, W, X', Y, A, E og G er som tidligere angitt, de sistnevnte ved katalytisk hydrogenering, og om ønsket, en forbindelse av generell formel I omdannes til et syreaddisjonssalt eller et kompleks derav.