Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarza¬ nia nowych peptydów o ogólnym wzorze X-Arg- -Val-Tyir-Ifle-HisHPro-Y, w którym X oznacza rod¬ nik pochodzacy z alifatycznego kwasu a-hydroksy- ikarboiksylowego, a Y oznacza rodnik pochodzacy z alifatycznego kwasu a-aiminokarboksylowego, oraz ich soli addycyjnych z kwasami i polaczen kompleksowych.Rodnik X korzystnie oznacza grupe hydroksy- acetylowa lub cnhydiroiksypropionylowa, natomiast Y korzystnie oznacza grupe leucylowa, izoleucylo- wa, alanylowa lub treonylowa.Peptydy wytwarzane sposobem wedlug wyna¬ lazku stanowia analogi angiiotensyny II i wykazu¬ ja dzialanie do miej antagomistyczne.Angioitensyna II jest wytwarzanym w ustroju oktapeptydem odznaczajacym sie silnym dziala¬ niem podwyzszajacym cisnienie tetnicze kirwi. W ustroju powstaje najpierw angiotenzyna I przez dzialanie obecnego w nerkach enzymu proteoli¬ tycznego reniny na a-globuline wytwarzana w watrobie. W warunkach inoirmalnych angiiotenisy- na I ulega przemianie enzymatycznej na oiktapep- tyd — angiotensyne II.Pierwszy analog amigiotensyny II opisano w 1970 roiku. Stwierdzono, ze zwiazek ten dziala jato specyficzny inhibitor angiotensyny II na za¬ sadzie wypierania (ikookuirencji), zarówno w te¬ stach ki vivo jaik równiez iin vitro (G. R. Mar¬ io 15 20 25 30 shall ei al. Proc, Natl. Acad. Sci, USA 67, 1624, (1970) P. A. Khairallaih et al.: J. Med. Chem. 13, 181 (1970).Doimiesienia .powyzsze ^powodowaly szeroikie za¬ interesowanie tymi zwiazkami i pociagnely za soiba w wielu laboratoriach i|race nad synteza oraz badaniem nowych analogów angiotensyny II o dzialaniu anitagoinistycznym, dzieiki któremu moga byc stosowane w celach diagnostycznych lub do leczenia nadeisameniia nerkowego. J.uz w poczatko¬ wych pracach stwierdzono, ze najbardziej obiecu¬ jace pod tym wzglejdeim analogi uzyskuje sie przez zastapienie reszty 8-fenyloalanioowej w lancuchu angiotensyny II reszta alifatycznego aminokwasu. .Zastapienie 'to powoduje zmiane wiasciwoisci. pep- tydu z agooistyczinych na antaigoiniistyczne (D. Gag- non et al.: Bn J. Pharmacol. 43, 409 (1971); D. T.Pals et al.: Circ. Res. 29, 664, (1971).Znaczne wzmocnienie dzialania antagonistyczne- go 'mozna uzyskac przez zastapienie oprócz Phe8 rów/niez reszty Asp1 reszta sarkozyny (D. T. Pals el al.: Circ. Res. '29, 673 i(197,l). Otrzymana w ten sposób (Sar1, Ala8) angioitensyna II jesit juz sto- isowana. Zalety tego zwiazku zwiazane sa z mniej¬ szym in vivo 'rozkladem anzymatycznym i duzym powinowactwem do punktów receptorowych.Pi-zyipuszozeiriiie, ze aintagomiisityczne analogi an- gioitemisyny II moga iznalezc zastosowainie w diag¬ nostyce oraz w niektórych przypadkach w lecze- 111964niu aiadcismieiiia nerkowego — (D. Ganlen i F.GRoss: Med. Klin. 71, 2043, {1976); J. L. Macrx.: Science, 194, 821," (1976); P. Needleman i G. R.Marshall.: Fed. Proc. 35, 2486, 1(1976 r.) zostalo po¬ twierdzone w badaniach klinicznych (H. R. Brun- ner el al.: Lanicet 1045, (1973); A. J. M. Domker et al.r Lancet, 1535 (1974); T. Ogihara et al. Lan¬ cet, 219, (1974); J. H. Larach et al.: New Bngl. J.Med., 292, 695 (1975); W. A. Pettiiigeir et al.: New Engl J. Med. 292, 1214 (1975); D. H. P. Sitreeten et al.: Circ. Res. 36, Suppl. 1, 125 (1975X; H. R. Brun- 'ner i H. Gav±as: Schwedtz, nned. • Wschr. 106, 1791 (1976).Porównanie budowy i -aiktywnoisci biologicznej Otrzymanych dotychczas analogów angiotenisyny II dostarczylo bardzo waznych informacji dla inter¬ pretacji aktywnosci agonistyczno^antag omastycznej (M. C. Khosla et al.r Handbook oi Expetnimeintal Phairmacology, tom 37 wydawnictwo I. H. Page i F. H. Bumpus 1974; G. R. Marshall: Fed. Proc. 35, 2494 (1976).Zadaniem wynalazku jest otrzymanie nowych antagonistów pozbawionych niepozadanych dzialan ubocznych i odznaczajacych sie dluzszym biolo¬ gicznym okresem póltrwania (M. C. Khosla et al.: J. Med. Ghem. 19, 224 (1976) i to samb 20, 253 (1077)).Stwierdzono, ze przy 'jednoczesnym zastapieniu w czasteczce angiotensyny II reszty 8-fenyloalani-. nowej/ Teszta alifatycznego kwasu a-aminokarbo- ksylowego i (przylaczeniu w polozeniu 1 alifatycz¬ nego kwasu a-hydroksykailboksylowego otrzymuje sie nowe konkurencyjne inhibitory angiotensyny II, 'które w testach in vivo (nawet przy podaniu podskórnie) znacznie zmniejszaja nadcisnienie wy¬ wolane przez angiotensyne II.Sposób wedlug wynalazku wytwarzania zwiaz¬ ków o ogólnym wzorze X-Arg-Val-Tyr-Ile-His- -Pro-Y, w którym Y i X maja wyzej okreslone znaczenie, .polega na tym, ze reaktywna pochodna, heptapeptyclu o ogólnym wzorze H-Atrg -Tyr{B)-Ile-His(E)-iPro-Y-OG, w którym A ozna¬ cza grupe odpowiednia do okresowej ochrony gru¬ py guanidynowej argininy, B oznacza grupe od- - powiednia do okresowej ochrony aromatycznej grupy hydroksylowej tyroniny, E oznacza grupe odpowiednia do okresowej ochrony grupy imida- zolowej histydyny, G oznacza grupe odpowiednia do ochrony grupy karboksylowej koncowego weg¬ la alifatycznego aminokwasu, trwala w" lagodnie kwasowych warunkach ale odszczepiaina przez sil¬ ne kwasy 'lub .zasady, albo na drodze 'uwodornienia katalitycznego, a Y ma wyzej okreslone * znacze¬ nie, poddaje v isie Teakcji z reaktywna pochodna kwasu aminoiksykarboksylowego o ogólnym wzo¬ rze W-X'hM, w którym- X' oznacza gruipe a-amano- ksyacylowa pochodzaca z alifatycznego kwasu 'kar- boksylowegO:.W oznacza grupe ochronna odszczepiaina przez hydrolize kwasna lulb katalityczne uwodornienie, a M oznacza grupe hydroksylowa lub grupe akty¬ wujaca, odszczepia sie grupe ochronna E z otrzy¬ manego zwiazku o ogólnym wzorze W-X'-Arg -Vai-TyrCB)-iae-KE^(E)-Pro-Y-OG,w (którym B,W, 1 964 4 X/,Y,A,E i G maja wyzej xokreslorie znaczenia, d nastepnie .pozostale grupy ochronne ^ancuchów bocznych i grup koncowych, przy czym te pozo¬ stale grupy uisuwa sie przez uwodornienie kata- 5 lityczne i ewentualnie przeksztalca tak otrzymany zwiazek o ogólnym wzorze X-Arg-Val-Tyr-Ile-His- -Pro-Y- w sól addycyjna z kwasem lub w pola¬ czenie kompleksowe. 10 W zwiazkach o ogólnym wzorze H-Airg(A)-Val- Tyr(B)-IileHHisi(E)-Pro-Y^OG, A oznacza korzystnie grupe nitrowa lub tosylowa, B oznacza korzyst¬ nie ewentualnie podstawiona grupe benzylowa, a E oznacza korzystnie grupe dwuniitrofenylowa. W 15 zwiazkach wyjsciowych o ogólnym wzorze W-X'-M, W oznacza korzystnie grupe benzylloksykaiilbanylo- \ wa lub Illirz.-butoksykairbónyiowa, X' oznacza ko¬ rzystnie grupe aiminoksyaicetylowa lub a-aminok- sypropionylowa, a M oznacza korzystnie grupe pi- 20 waloiloksylowa, nitrofenoksylowa, pieciofluorofe- noksylowa, N^sukcynimidoiksylowa, azydowa, 2,3,5- -trójchlorofenoksylowa lub pieciochlorafenoksylo- wa.Grupe ochronna E odszczepia sie korzysltnie za 25 pomoca 2^merkaiptoetanolu, natomiast pozostale grupy ochronne lancuchów bocznych, grup kon¬ cowych usuwa sie przez uwodornienie katalitycz¬ ne. Oznacza to, ze wszystkie grupy ochronne z wyjatkiem E mozna usunac w jednym etapie. W 30 wyniku usuniecia grupy aminowej w postaci amo¬ niaku z N-koncowego «-aminoksykwasu otrzymu¬ je sie a-hydroksykwas. Ten sposób usuwania gru¬ py aminowej z uwolnieniem a-nydroksykwasu jest tutaj przedstawiony po raz pierwszy. 35 Reaktywne pochodne heptapeptydu o ogólnym m wzorze H-Arg-(A)-Val-Tyo:(B)-Ile-His(E)HPro-Y-OG, stosowane jako zwiazki wyjsciowe w (Sposobie we¬ dlug wynalazku, mozna otrzymac metodami zna¬ nymi w chemii peptydów. Odpowiednia metoda 40 jest opisana na przylklad w wegierskim opisie pa¬ tentowym nr 168431. Polega ona na tym, ze gru¬ py funkcyjne lancuchów bocznych chromi sie gru^ parni trwalymi w warunkach kwasnej hydrolizy prowadzonej przy eliminacji grupy ochronnej po 45 sprzeganiu.W konzysitnej realizacji sjposobu wedlug wyna¬ lazku do okresowej ochrony grupy kanboiksylowej koncowego wegla aminokwasu stosuje sie grupe 50 p^rnitrobenzylowa i(NB), grupe guanidynowa argi- ' niny chroni sie grupa nitrowa, natomiast grupe hydroksylowa tyrozyny chroni sie gmupa benzylo¬ wa (Bzl), a grupe chTOniaca pierscien tijmidazolo- wy histydyny stanowi grupa dwunitrofenylowa 55 (Dnp).W-szysitkie te grupy ochronne sa trwale w sro¬ dowisku slabo kwasnym, zatem Nnkoncowa grupa t-butoksykambonylowa i(Boc) moze byc usunieta bez niebezpieczenstwa ich odszczepiemia. Przed- , 60 stawiona specjalna kombinacja grup ochronnych umozliwia .usuniecie w pierwszym rzedzie girupy dwunitrofenylowej, a nastepnie wytworzenie zwiazków o ogólnym wzorze X-Aa:g-Val^Ile-His- -Pxo-Y w jednoetapowej reakcji przez uwodoiinie* 6* nie katalityczne.111 064 Zwiazki wytwarzane sposobam wedlluig wynalaz¬ ku mozna oczyszczac znanymi metodami, korzyst¬ nie metoda chromatografii # g'onoiwymiennej na karboiksymetyloceTulozie. Stosujac te technologie wytwarzane zwiazki otrzymuje sie w .postaci zlio- 5 filizowanego proszku i. mozna je latwo przepro¬ wadzic w rózne sole • lub polaczenia kompleksowe.Aktywnosc amtagomistyczina zwiazków o ogól¬ nym wzorze K-Arg-yal-Tyr-Ile-His-Pro-Y testo¬ wano na samcach kota. Cisnienie krwi mierzono f W na tetnicy szyjnej. Zwierzetom podawano „Hiper- tensim" (firmy Ciba) przez WiStrzykniecie do bocz- 6 danych zwiazków. „Saralasin" uzyto dla porówna¬ nia. Wyniki podane w tablicy stanowia srednia wyników z 6 doswiadczen. Wielkosc bledu okres¬ la rozrzut wartosci podstawowej.Z powyzszej tablicy wyruika, ze kazdy z analo¬ gów angioltensyny II zawierajacy w jpolozeaiiiu 1 reszte alifatycznego kwasu hyidrolksykarbakisylowe- go wykazuje znaczne dzialanie obnizajace cisnienie krwi. Dzialanie to jest proporcjonalne do poda¬ nej dawki.Tesity te przeprowadzono irówniez przy podaniu zwiazków podskórnie. Nalezy zwrócic uwage na Wplyw róznych Tablica 1 analogów angiotensyny II, podawanych dozylnie, na cisnienie /krwi wyste¬ pujace po wstrzyknieciu dozylnym angiotensyiny II • Zwiazek badany [Hydroiksyacetylo1, Deu8]-Ang II [Hydrokisyacetyilo1, Ile8]-Anjg II {Hydroksyacetyilo1, Thr/Me/8]-Ang II {L^a-ihydroiksypropionylo1, Leu8]-Ang II [L-a-hydiroksypropionylo1, Ile8]-Ang II „Saralasin" Spadek cisnienia krwi w 102 Pa po podaniu dozylnym dawki 10 f*g/kg —41,3±6^a5 —32,0+2,26 —44,0+7,05 -^,2,7+4,92 —41,3+4,39 —54,7±3,32 - 20 //g/kg , —56,9±3,72 -^39,9+3,06 ^50,5+5,45 ^53,2±3,59 —50,5+5,45 ¦ nej zyly udowej z iszybkoiscia 0,5 //g/kg/min. Po ustabilizowaniu sie podwyzszonego cisnienia krwi podawano wodny, fizjologiczny lub zawierajacy nosnik roztwór testowanego zwiazku „Saralasin", w jednakowej dawce, dozylnie lub podskórnie, po czym mierzono .spadek cisnienia krwi.W tablicy 1 przedstawiono otrzymane w testach spadki cisnienia krwi po dozylnym podaniu ba- 35 40 fakt, ze ta droga podawania angiotensyny II lub jej analogów .nie zostala dotychczas opisana. Do podawainila podisikórmielgio uzyto rioizitiwóir fiizjoloigilcz- nej solanki zawierajacej badany zwiazek oiraz do¬ datek karboiksymetyloceluilozy lub zelatyny. Wy¬ niki testu podane w tablicy 2 stanowia srednia wyników z 5 osobnych prób. Wielkosc bledu o- kresla rozrzut wartosci podstawowej.Tablica 2 Wplyw róznych analogów angiotensyny II, podawanych podskórnie, na cisnienie krwi wystepu¬ jace po wstrzyknieciu dozylnie angiotensyny II . 1 Zwiazek badany [L-cHhydroksypriopio- nylo1, Leu8]-Ang II [L-a-hydroksypropio- nylo1, Ile8]-Amg II 200 200 Rozpusz¬ czalnik roztwór CMC w fizjolo¬ gicznym roztworze isolanki zelatyna w fizjo¬ logicznym roztworze isolanki Spadek cisnienia krwi w 10* Pa po uplywie 15 minut —37,2+4,13 % —37,2±13,3 30 minut ^50,5+4,19 —37,2±9,59 60 minut —33,2±1,90 ^33,2±7,98 120 minut —5,65±2,39 —5,65±9,71 CMC = karboksymetyloceluloza111 964 8 Z danych przedstawionych w tablicy 2 wynika, ze nowe zwiazki wytwarzane 'Sposobem wedlug wynalazku zmniejszaja sztucznie wywolane wy¬ sokie cisnienie krwi.Okreslenie „polaczenie kompleksowe" peptydów wytwarzanych w sposób wedlug wynalazku odnosi sie w tym opisie do polaczen kompleksowych z niektórymi substancjami organicznymi, które po¬ woduja opóznione dzialanie peptydów. Typowe przyklady 'tego rodzaju substancji organicznych stanowia: zelatyna, karboksymetyloceluloza, estry* kwasu alginowego, poliufluoroetanofoisfiorany, po¬ limery aminokwasów lub inne .polimery albo ko¬ polimery.Peptydy wytwarzane w sposób wedlug wynalaz¬ kioraz ich dopuszczalne farmaceutycznie sole ad¬ dycyjne i polaczenia kompleksowe stosuje sie w postaci typowych isrodków farmaceutycznych.Srodki te zawieraja zwiazki wytwarzane w spo¬ sób wedlug wynalazku z dodatkiem nieorganicz¬ nych nosników odipow-iednich do podawania doje- litowo lulb poza jelitowe (Moga one byc "w po¬ staci stalych liofiiji zatorów ^zawierajacych rózne obojetne zwiazki nie reagujace z pelptydami, np. weglowodory uzyte jako nosniki, albo w postaci rozcienczonych lub stezonych zawiesin albo emul¬ sji, które z kolei zawieraja równiez srodki kon¬ serwujace i srodki stabilizujace. .Srodki farmaceutyczne -zawierajace zwiazki wy¬ twarzane w sposób wedlug wynalazku moga byc stosowane diagnostycznie od odróznienia nadcis¬ nienia nerkowego lub leczniczo przy syndromach wywolanych zwiekszonym nerkowym cisnieniem krwi.Dalsze iszczególy isposobu wedlug wynalazku ilu¬ struja ponizsze przyklady. Skróty stosowane w .przykladach odpowiadaja powszechnie stosowa¬ nym w literaturze biochemicznej (J._Biol. Chem. 247, 977/1972). Symbolem „O" przed 'symbolem a-aminokwasu oznaczono odpowiedni a^aminoksy- kwas, np. OGly oznacza kwas aminoksyootowy, OAla oznacza kwas a-aminoksypropionowy itd.Dalsze skróty to na przyklad PFP — pieciofluoro- fenyl i Z — karbometokisyl.Prowadzac reakcje w siposób wedlug wynalaz¬ ku do odparowywania zawisze stosowano obroto¬ wa wyparke prózniowa jflirmy Biichi. Temperatu¬ ry topnienia okreslano w aparacie dr. Tottoli (pro¬ dukowanym .przez Biichi). Chromatografie cienko¬ warstwowa wykonywano na przyklad z zelem krzemionkowym ;,Kieselgel G nach Stahl" firmy E. Merck. Ghromatogramy, rozwijano w nastepuja- ,cych mieszaninach rozpuszczalników: 1) octan ety¬ lu: {mieszanina purydyna/kwas octowy/woda 20 : 6 : : 11] = 95 :5; 2) ta sama 90 : 10; 3) ta sama 80 : 20; 4) ta .sama 70:30; 5) mieszanina n-4utanoiyikwas octowy/woda 4:1:5; 6) mieszanina n^Dutanol/ /kwas octowy/pirydyina/woda 30 : 6 : 20 : 24; 7) mie¬ szanina n^butanol/octan etylu/kwas octowy/woda 1:1:1:1. W podanych przykladach górny indeks przy wairtosci R* oznacza numer uzytego ukladu rozwijajacego. ~ Elektroforez^ bibulowa przeprowadzono iw po¬ ziomym aparacie srednionapieciowym LMIM na 10 15 30 39 40 45 50 55 60 bibule MN 214, w roztworze buforu pH 1,9, oprócz kwasu glutaminowego. Napiecie: 450 V, czas: 3 go¬ dziny.Chromatogiramy wywolywano czesciowo roztwo¬ rem ninhydtryny, a czesciowo typowa metoda chlo¬ rowania przy uzyciu roztworu o-toiiuidyna^KJ.Produkt koncowy oczyszczano w nastepujacy. sposób: 0,5 g wolnego peptydu rozipuszczono w 4 ml 0,01 N buforu z octanu amonu i otrzymany roztwór naniesiono na kolumne z karbokisymetylo- celuloza l(CMC 52) o pojemnosci 0,5 litra. Ko¬ lumne równowazono uprzednio tym samym bu¬ forem. Wymywanie prowadzono w gradiencie 'ste¬ zenia mieszajac 1,5 litra 0,01 M i 1,5 litra 0,4 M roztworu octanu amonu w mieszalniku gradien¬ tu, pnzy szyb/kosci wyiplywu 25 ml/h,. zbierajac frakcje po 10 ml. Wyciek z kolumny analizowano w swietle UV za pomoca spektrofotometru Uvi- cord II firmy LKB i okreslone na podstawie o- tnzymanej' krzywej glówne frakcje liofilizowane w Mofilizatorze iLeybold — Hereus, Liofilizat re- chTomatografowano stosujac te sama metode gra¬ dientu stezen i otrzymany eluat ponownie liofili¬ zowano.Przyklad I. ifHydroksyacetylo1, Deu8]-angio- tensynaII - . ' Etap 1. Boc-Arg(N02)-Val-Tyr -Plro^Leu-ONB. Do roztworu * 4,2 g (12 mmoli) Leu-ONB. HBr w .50 ml chloroformu dodaje sie 1,08 ml trójetyloaminy i 3,ai (10 mmoli) Boc-Pro- -OPFP. Calosc miesza sie w temperaturze poko¬ jowej w ciagu 20 minut, wytrzasa z woda, a na¬ stepnie z 10°/a wodnym roztworem kwasu cytry¬ nowego i suszy. Roztwór chloroformowy odparo¬ wuje sie. Otrzymany chroniony dwupeptyd (Rj = = 0,8) rozpuszcza sie w 20 ml 8 M roztworze kwasu solnego w dioksanie. Po 10 miinultach, roz¬ twór ien rozciencza sie suchym eterem i odpa¬ rowuje. Chlorowodorek dwuipeptydu (Rj = 0,56) rozpuszcza sie w 50 ml chloroformu, doprowadza wartosc pH iroztworu do 8 za pomoca trójetylo¬ aminy i dodaje 6,8 g (15 mmoli) Boc-His(Dnp)- ^OPFP. Roztwór miesza .sie w temperaturze poko¬ jowej w ciagu jednej godziny utrzymujac wartosc pH arówna '8. Nastepnie do roztworu dodaje sie 1,65 ^ ml N.NHdwumetylo-aminoetyloaminy w celu usuniecia nadmiaru aktywnego estru i po 10 mi-" nutach mieszanine te wytrzasa sie z Kfi/o Wod¬ nym roztworem kwasu cytrynowego, 1 N wod¬ nym roztworem kwasu solnego i 5vo wodnym roztworem- wodoroweglanu ¦• sodowego. Po osusze¬ niu roztwór odparowuje sie.Otrzymany chroniony trójpeptyd (Rf = 0,65) rozpuszcza sie w 25 ml 8 M roztworu kwasu sol¬ nego w diojksanie i po 15 minutach wytraca sie .trój-peptyd (R*. = 0,47) przez dodanie suchego ete¬ ru. Osad odsacza sie i zaraz rozpuszcza w miesza¬ ninie 50 ml. chloroformu i 20 ml dwumetylofor- maimidu. Wartosc pH doprowadza sie trójetylo- amina do 8 i dodaje 6,0 g <15 mmoli) Boc-IJe- -OPiFP. Po uplywie 30 miniut mi'e(sizanine reakcyj¬ na odiparowuje sie do sucha, pozostalosc rozpusz¬ cza w 100.ml octanu etylu. Rozltwór octanowy ek-lii 9 9 strahuje sie iwodnym iroztworem kwasu cytryno¬ wego, 1 N wo'dnym roztworem kwaisu solnego i na koncu z woda. Po osuszeniu odparowuje sie oc¬ tan etylu, a pozostalosc zadaje .mieszanina eteru i heksanu 1:9.Uzyskamy chroniony tetraipeptyd (Rf = 0,64) wy¬ odrebnia sie i roizpuslzcza w 25 ml 8 M roztworu kwasu solnego w dioksanie. Po 15 minutach po¬ wstaly tetrapeptyd (R* =0,40) wytraca sie su- 10 chym eterem i odsacza. jChloirowodorek tefcrapep- tydu 'rozpuszcza sie w mieszaninie 50 ml chloro¬ formu i 30 ml dwumetyloformamidu i doprowa¬ dza wartosc pH iro'7ltwoinu do 8 za pomoca irójety- loaminy, po czym • dodaje sie 6,0 g (11,5 mola) 15 Boc-Tyr(Bzl)-OPFP. Po 15 minutach roztwór pd- . parowuje sie, pozostalosc rozpuszcza w octanie etylu i dodaje 0,66 ml NjN-dwumetj^o-aminoetylo- anriny. Calosc pozostawia sie na 10 miniut, po czym wytrzasa iz 10®/q wodnym roztworem kwasu *• cytrynowego, z 1 N wodnym roztworem kwasu solnego i v woda, suszy i odparowuje. Pozosta¬ losc po odparowaniu "zadaje isie suchym eterem i odsacza chroniony peirutapeptyd (R? =0,8). Pro^ duktt ten rozpuszcza sie w 25 mil 8 N rozStwo.ru **' kwasu (solnego w dioksanie i po 15 minutach wy¬ trzasa sie otrzymany pentapeptyd (Rf — 0,8) do¬ dajac suchy ©ter. Osad odsacza sie ;po czym prze¬ mywa eitarem i zaraz rozpuszcza w 50 ml dlwu- 30 metylofoirmamidu, doprowadza sie trójetyloamina wartosc pH roztworu do 8 i dodajac 4,2 g (II mmoli) Boc-Val-OPFP: Calosc miesza peraturze pokójowej w ciagu jednej gadziny, po czym odparowuje, a otrzymana pozostalosc roz¬ puszcza sie w chloiroformie i wytrzasa kolejno z 10% wodnym roztworem kwasu cytrynowego, 1 N wodnym roztworem kwasu solnego i z woda. Na¬ stepnie roztwór osusza sie i odparowuje, a pozo¬ stalosc zadaje etereim. 2 Wytworzony chroniony heksapeptyd (Rf = 0,82) odsacza sie, rozpuszcza, w 25 ml 8 N roztworu kwasu solnego w dioksanie i po 15 minutach wy- 3 traca sie suchym eterem heksapeptyd (R 'f •= 0,55).Osad odsacza sie i przemywa eterem i zaraz roz¬ puszcza w 50 ml dwumetyloformamidu, doprowa-^. dza sie trójetyloamina wartosc pH roztworu do 8 i dodaje'4,8 g i(10 mmoilii) Boc-Arg(NO?)^OPFP. Po . uplywie 30 minut rozpuszczalnik wymienia sie na chloroform i roztwór „chloroformowy wyttrzasa'sie z 1 N wodnym roztworem kwasu isolnego i iz woda.Z kolei roztwór osusza sie, odparowuje i otrzy¬ mana pozostalosc traktuje etanolem. Wyodrebnia sie chroniony Ihe/ptapeptyd '(Rf r= 0,8) (uzyskujac 5g 7,6 g (53% w przeliczeniu na wyjsciowa Boc-Prb-* -OPFP). Temperatura topniiemia 192-^105OC.. Etap 2. Z-OGly-Arg(N02)-Val-Tyr(Bzl)-Ile-Hjjs (Dnjp)-Pro-Deu-ONB. 1,8 g i(l,35 ' mmola) Boc-Arg (N02-Val-Tyr puszcza isde w 10 ml 8 M roztworu kwaisu solme- " go w dioksanie. Po 15' minutach chlorowodorek wodnego heptaipeptydu wyitraca .sie suchym ete¬ rem, odisacza i przemywa suchylm eterem. Otrzy¬ many produkt (R? =0,36) Tozipuszoza isie od razu « 10 w 20 ml dwumetyloformamidu, doprowadza trój- etyiloamina wartosc pH do 8 i dodaje 0,9 g (2,3 mmola) Z-OGly^OPFP.Po 15 minutach rozpuszczalnik wymienia sie na chloroform, po czym roztwór chloroformowy wytrzasa isie (z 1' N wodnym (roztworem kwasu solnego i z woda, isuszy i odparowuje. Pozostalosc traktuje isie mieszanina etanolu * i eteru (2: 8), a nastepnie odsacza produkt otrzymujac 1,6 g l(85*/o) Z-OGly-Arg(N02)-Val-Tyr(Bzl)^Ile^Hi9(Dnip)KPro- -Leu-ONB, a temperatura topnienia 165—174°C (R * =o,80).Etap 3. Usuwanie grup ochronnych. 1,6 g (1,0 mmola) Z-OGly-Aeg-(N02)-Vail-Tyr(Bzl)-Ile-His (Dnip)-Pro-Leu-ONB rozpuszcza sie w 5 ml dwu- metyloformamidu i dodaje 3,5 mil 2jmerkaptoeta- nolu. Roztwór miesza sie w temperaturze pokojo¬ wej w ciagu godziny, nastepntie dodaje suchy eter i odsacza wytracony osad. Osad ten przemy¬ wa sie dwoma iporcjami po 10 ml eteru i oczysz¬ cza przez wytracanie iz mieszaniny metanolu i eteru; Otrzymuje sie 1,3 g (95%) Z-OGly-Arg(NOo)- -Val-Tyr(Bzl)-Ile-His-Pro-Leu-ONB, Rf? = 0,2.Wyzej otnzymany peptyd rozpuszcza sie w 30 ml mieszaniny metanolu, kwasu octowego i wo¬ dy (5:1:1), dodaje 0,5 g !()*/•. palladu na weglu- i przepuszcza przez roztwór wodór, przy silnym mieszaniu, w ciagu 20 godzin. Przebieg treakcji kontroluje sie metoda chromatografii cienkowar¬ stwowej. Po zakonczeniu reakcji odsacza sie ka¬ talizator, przemywa go 20 ml mieszaniny o ta¬ kim samym skladzie jak uzyta do (reakcji i prze¬ sacz odparowuje do sucha.Pozostalosc rozpuszcza sie w mieszaninie eta¬ nolu i wody ipo czym odparowuje, powtarzajac te operacje kilkakrotnie w celu Usuniecia kwasu oc¬ towego. Nastepnie wyodirejbnia sie peptyd przez zadanie suchym etanolem i odsaczenie. Otrzymuje sie 0,8 g (67*7oi) Ihydtroksyacetyllo1;, Leu8]^amgioten- syny II. Oczyszczanie prowadzi sie jak wyzej o- pisano. R? = 0,41, R* = 0,59, rJ = 0,60, EGm (pH .== 1,9) = 0,98. Analiza aminokwasów: Pro 1,0 (1), Vel 1,0I1<1)„ Ile 1,02(1), Arg 1%Ó!1.(1), His 1,0(1), Leu 1,02(1), Tyr 0,73(1).Przyklad II. fL-anhydroksypropionylo1, Leu9]- angiotenisyna II Etap 1. Z-OAla-ArgKN02)-Val-Tyr^B(zl)^Ile-Hiis (Dmp)^Pro-Leu-OMB. 1,8 g (1,25 mmola) Boc- -Arg otrzymanej w etapie 1 przykladu I rozpuszcza sie w 8 ml 8 ,M roztworu kwasu solnego w dioksa¬ nie. Wolny heptapeptyd wytraca sie z roztworu eterem, po czym odisacza i przemywa suchym ete¬ rem. Otrzymany zwiazek (Rf = 0,36) rozpuszcza sie od raizu w 20 ml dwumetyloformamidu, do¬ prowadza trójetyloamina wartosc pH do 8 i do- daje 0,93 g (2,3 mMa) Z^OALa-OPFP. Po 15 mi¬ nutach rozpuszczalnik wymienia isie na chloroform i otrzymany roztwór wytrzasa z IN wodnym roz¬ tworem ikiwasu solnego i iz woda, a nastepnie osu¬ sza i odparowuje. Pozostalosc traktuje sie miesza¬ nina/etanolu i eteru (4:1) otrzymujac 1,75 g11 1)1964 12 (93%) Z-OALa-ArgCNOzJ-Yal-TyjKB^J-Ile-HisCDnp)- -Pro-Leu-ONB.Etap 2. Usuwanie igrup ochronnych 1,6 g Z- -OAla-Ar.g(I^2)-Vaa-Tyr(Bza)-Ile-Hdis(Inp " -Leu-ONB rozpuszcza sie "w 5 ml dwunietyiofor- mamidu, dodaje 3,5 ml 2-merkaptoetanolu i ca¬ losc miesza w ciajgu godziny w temperaturze po¬ kojowej. Nastepnie dodaje sie suchego eteru i od¬ sacza wytracony osad, który dalej oczyszcza sie przez wytracanie z mieszanliny metanolu i eteru.Otrzymuje sie 1,3 g (92%) Z-0Ala-Arg(NO2)-Val- -Tyr(Bza)-Ile-His^Pro-Leu^ONB, R? =0,27.Peptyd ten rozpusizciza sie- w mieszaninie meta- noiki, kwasu octowego i wody '(5:1:1), dodaje -0,5 g 10% pallladu na weglu i przepuszcza przez roztwór wodór, pirzy pilnym wmieszaniu, w ciagu 20 godzin. Przebieg reakcji kohltroluje sie metoda chromatografii cienkowarstwowej. Po zakonczeniu reakcji katalizator odsacza- sie, przemywa i prze¬ sacz odparowuje do sucha.. Pozostalosc kilkakrot¬ nie rozpuszcza sie w mieszaninie etanolu z Wo¬ da i odparowuje, ,po czym sucha pozostalosc tra¬ ktuje sie suchym etanolem, otrzymujac [L-a-hy- drofcsypropionylo1; Leu^-angiotensyne II. Wydaj¬ nosc 0,65 g (70%). Produikt ten oczyszcza sie jak wyzefj opisano R, = 0,36, R? = 0,57, R ] = 0,60, Eom (pH = 1,0) = 0,97. Analiza aminokwasów: Pro 0,98(1), Val 1,0(1), Ile 1,1(1), Arg 1,0(1), His 0,98(1^ Leu 0,98, Tyx 0,56(1).Przyklad III. [Hydroksyacetylo1,l Il^jangio- tensyna II Etap 1. Boic-A^g(N02)-Val-Tyr(Bza)-Ile-Hiis(Dnp)- -Pro-Ile-ONB. Do roztworu 4,15 g (15 mmoli) Ile- -ONB.HC1 w 50 ml chlorotfoinmu dodaje sie 2,1 ml trójetyloaminy, a nastepnie 3,81 g (10 mmoli) Boc- -Pro-OPFP. Calosc miesza sie w temjperaturze po¬ kojowej w ciagu 20 minut. Mieszanine poreakcyj- na wytrzasa sie z woda i z 10% wodnym roztwo- . rem kwasiu cytrynowego, po czym osusza i odpa¬ rowuje. Otrzymany chroniony dwupeptyd (Rf = = 0,9) rozpuszcza isie w 20 ml & M roztworu kwasu solnego w dioksanlie, po ilO minutach roz¬ ciencza suchym eterem i odparowuje.Chlorowodorek wolnego dwuparitydu (R* = 0,44) rozpuszcza sie, w 30 nil chloroforimu, doprowadza trójetyloamina wartosc pH do 8 a dodaje 8,8 g (15 mmoWi) Boc-Hds(Dnp)^OiPFP. Po uplywie go¬ dziny do mieszaniny reakcyjnej dodaje sie 1,65 ml N^N^dwumetyilo-aminoetyloaminy^ a po dalszych 15 minutach calosc wytrzasa sie z 10% wodnym roztworem ikwasu cytrynowego, z 1 N wodnym roztworem Ikwasu solnego i z woda. Ekstrakt osu¬ sza sie i odparowuje. Chroniony trójpeptyd (Rxt = = 0,50) bez wyodrebniania rozpuszcza sie w 20 ml 8* M roztworu kwasu solnego w dioksanie. Po 15 minutach trójpeptyd (Rf = 0,25) wytraca sie su¬ chym eterem, odsacza i przemywa suchym ete¬ rem po czym zaraz rozpuszcza sie w mieszani¬ nie 60 ml ohkroformu i 20 ipfl. dwumetyloforma¬ midu.Wartosc pH otrzymanego roztworu doprowadza sie trójetyloamina do 8 i dodaje 6,0 (g (15 mmo¬ li) Boc-Ile-OPFP, Calosc pozostawlia sie na 30 mi¬ nut, a nastepnie wymienia rozpuszczalnik na oc¬ tan etylu i otrzymany rozWór wytnzasa sie z 10% wodnym roztworem kwasu cytrynowego z 1 N wodnym (roztworem Ikwasu solnego i z woda. 5 Ekstrakt osusza sie, odparowuje i z "pozostalosci wyodrebnia chroniony tetrapeptyd przez ekstrak¬ cje mieszanina n-iheksanu i eteru (9:1).Chroniony tetrapeptyd '{Rf =x 0,65) rozpuszcza 10 sie w" 25 ml 8 M roztworu Ikwasu solnego w (diok¬ sanie. Po uiplywie 30 imiinut otrzymany tetraipep- tyd (R* = 0,41) wytraca sie dodajac suchy eter, odsacza i przemywa, a nastepnie zaraz rozpusz¬ cza w 70 mil mieszaniny dwumetyloformamiidu i 15 chloroformu (1:1). Wartosc pH roztworu .dopro¬ wadza sie trójetyloamina do 8 i dodaje 6,0 g (11,5 mmola) Boe-Tyr(Bzil)-OPFP. Po 15 minutach roz¬ puszczalnik wymienia sie na ocltan etylu i dodaje 0,66 ml N,NHdwumatylo-ammoetyloaniiny. Po u- 2o plywie kolejnych* Ifr miinut mieszanine wytrzasa sie z 10% wodnym rozitworem kwasu cytrynowe¬ go, z 1 ,N wodnym roztworem kwasu solnego i z woda, nastepnie osusza i odparowuje. Otrzymany pentapeptyd (Rf1 = 0,-59) wydziela sie dodajac su7 25 chy eter. Z (kolei rozpuszcza sie jgo w 20 ml diok- . synowego roztworu kwasu solnego i (po 15 mi¬ nutach wytraca suchym eterem chlorowodorek pentapeptydu (Rf' = 0,4), odsacza i przemywa 20 ml suchego eteru, po czyni zaraz (rozpuszcza w 5U ml dwumetyloformamidu. Wartosc pH roztworu doprowadza sie 'trójetyloamina do 8 i dodaje 4,62 g (12 mimoli) Boc-Val^OPFP.Po uplywie godziny •rozpuszczalnik wymienia sie na chloroform i otrzymany roztwór wytrzasa z 10% wodnym roztworem ikwasu cytrynowego, z 1 N wodnym roztworem ikwasu solnego i z woda.Ekstrakt osusza sie, odparowuje i pozostalosc traktuje suchym eterem w celu wytracenia "chro¬ nionego heksapeptydu (Rf = 0,50). Peptyd ten rozpuszcza sie nastepnie w 20 ml 8 M roztworu kwasu solnego w dioiksanie i po 15 mamutach wy¬ traca suchym eterem hdksapeiptyd Heksapeptyd odsacza sie i .przemywa 20 ml su¬ chego eteru, po czym zaraz rozpuszcza sie w 50 ml dwumietyloformamidu, wartosc pH roztworu do¬ prowadza trójetyloamina do 8' i dodaje 5,38 g (12 mmoli) Boc-Arg(N02)-OPFP.Mieszanine pozostawia sie na olkres 30 minut, a nastepnie wymienia rozpuszczalnik na chloro¬ form ii otrzymany roztwór wytrzasa z 1 ^N wod¬ nym roztworem kwasu .solnego i z woda. Ekstrakt osusza sie, odparowuje i^ wyodrebnia chroniony heptaipeptyd iza pomoca etanolu. Otrzymuje sie 9,7 g (68% w przeliczeniu na wyjsciowa BocnPro- * -OPFP) Boc-Argi(N02)-Val-Tyr(iBzl)-Ile-His(Dnp)- -Pro-Ile^ONB. Rf =.0,67.Etap 2. Z-OGay-Arg(N02)-Val-Tyr(Bzl)-Ile-p[is (Dnp)nPro-Ile-ONB. Heptapeptyd rozpuszcza sie w 8 ml 8 M roztworu ikwasu solnego w dioksanie.Roztwór poozstawia sie na ilS minut, po czym wy¬ traca suchym eterem chlorowodorek heptapepty- du (Rf4 = 0,45), odsacza i przemywa 20 ml suche¬ go eteru, Osad rozpuszcza sie zaraz w 10 mfc dwu- 30 35 40 5510 15 -20 mm \ ii metyiaforniaimddu, doprowadza trójetyloamina wartosc ipH roztworu* do 8 i dodaje 0,6 g (1,5 mmola) Z-OGly-OPFP.Po uplywie 30 minut rozpuszczalnik wymienia sie na chloroform i rozltwór ten wytrzasa z 1 N wodnym iroztworem kwasu solnego 1 z woda.Ekstrakt osusza sie, odparowuje ^po czym wyod¬ rebnia chroniony peptyd suchym eterem. Otrzy¬ muje sie 1,45 g (85%) Z-OGly-Arg(N02)-Val- -Tyr(Bzl)^le-His(Dnp)HPro-Ile-ONB. Temperatura topnienia 151—tf58°C, Rf = 0,68.Etap 3. Usuwanie grup oclhronnych, 1,45 g (0,94 mmola) Z-OGly-Airg(N02)-Val-Tyr(Bzl)-Ile-His (Dnp)-Pro-Ile^ONB (rozpuszcza sie w 5 ml dwu- metyloformamddu, dodaje 3,5 ml 2-me^kaptoetano- lu, calosc miesza w ciagu jednej godziny, po czym suchym eterem wytraca isie Z-0Gly-Argi(NO2)-Val- -Tyr(Bzl)-Ile-Hiis^Pro-Ile-ONB. Po stracaniu w u- kladzie metanol-eter otrzymuje sie 1,015 g (82P/0) peptydu (R? = 0y10). Pepltyd ten rozpuszcza sie w 30 ml mieszaniny metanolu, ikwasu octowego i wody (5:1: IX idodaje 0,5 g 10f/ft palladu na we¬ glu i przepuszcza wodór przez roztwóir w ciagu 21 godzin przy sfflnym mieszaniu.Przetoieg reakcji (kontroluje sie metoda chroma¬ tografii cienkowarstwowej. Po zakonczeniu reak¬ cji katalizator odsacza sie, przesacz odparowuje do sucha ii wyodrebnia wolny peptyd. suchym eta¬ nolem. Otrzymuje sie 0,48 g (64,52) [hyd tylo1, Ile8] angiotensyny II. Produkt oczyszcza sie znanymi metodami. Rf = 0,29, R® = 0,57, r/= = 0,58, EGm(pH = 1,9) = 1,03, Analiza aminokwa¬ sów/Pro 0",99(1), Val 1,15(1), He .2,06(2), Tyr 0,74(1), His 0,98(1), Arg 0,95.Przyklad IV. (L-a-hydroksypropionylo1, Ile8]- -anigiotensyina II Etap 1. Z-OAla-Arg(N02)-Val-Tyr(Bzl)-Ile-His (Dnp)-Pro-Iile-ONB. 1,6 {g (1,1 mmola) Boc- -Arg(N02)-Val-TyGn(Bzl)-Ile-His(Dnp)-Pro-Ile-ONB rozpuszcza sie w 8 ani 8 M roztworu ikwasu sol¬ nego w dioksanie. Roztwór pozostawia sie na 15 minut, po czym suchym eterem wytraca sie hep-. tapeptyd (Rf = 0,45), odsacza i przemywa, a na¬ stepnie od razu rozpuszcza w 10 ml dwumetylo- formamidu. Wantosc pH roztworu doprowadza sie trójetyloamina do 8 i dodaje 0,61 g (1,5 mmola) Z-OAla-OPUP. Po upl-ywiie 30 minut rozpuszczalnik wymienia sie na chloroform i -roztwór chlotrofor- mowy wytrzasa z 1 N wodnym roztworem kwasu solnego i z woda; Po osuszeniu i odparowaniu u- zyskany chroniony ipeptyd (Rf = 0,63) wyodreb¬ nia sie eterem. Otrzymuje siie 1,4 g (83%i) Z-OAla- rArg(N02)-Val-Ty3T(Bzl)^l'erHis(Dnip)-Pro-iae-ONB.Temperatura (topnienia 164^-168°C.Etap 2. Usuwanie grup ochronnych, 1,4 g "(0,9 mmola) Z-OAla-Arg(N02)-Val-Tyfr(Bzil)-Ile-HLS (Dnp)-Pro-Iie-QNB rozpuszcza sie w 5 nul dwume- tyloformamidu i dodaje 3,5 ml 2^merkaptóetanolu.Rozitwór pozostawia sie na jedna godzine, pp- czym wytraca eiterem Z-OAla-A!ng|(,N02)-Vail-Tyr(Bzl)- -Ile-HisPro-Ile^ONB i oczyszcza pnzez wytracanie w ukladzie meitanol-eter. Wydajnosc 0,8 g (G5*Vo), Hf = 0,13,. rJ = 0,27. Talk otrzymany chroniony st 35 40 . 45 50 55 1* peptyd rozpuszcza sie w 10 ml mieszaniny meta¬ nolu, ikwasu octowego: wody (5:1: 1), do roztwo¬ ru dodaje 0,5 g lO^/o palladu na weglu po czym przy mieszaniu przepuszcza sie przez roztwór wo¬ dór .iw ciagu 16 godzin. Po zakonczeniu reakcji katalizator odsacza sie, przesacz zaweza i wyodreb¬ nia produkt siuchym etanolem.' Otrzymuje sie 0,4 g (65%) [L-cc-hydroiksypropionylo1, iIle8]-amgioten- tysyny II. Oczyszczanie przeprowadza sie wyzej opisana metoda. Rf i= 0,30, Rf 0,30, R? =? 0,58, 65 B] = 0,58, EGm nokwasów: Pro 1,04(1), Val 0,98(1), Ile 1,98(2), Tyr 0,98(1), His 1,05(1), Arg 1,0(1).Przyklad V. [Hydroiksyacetylo1, Ala8]-angio- tensyna II Etap 1. Boc-Arg(N02)-Val-Tyr(Bzil)-Ile-Htó(Inp)- ^Pro-Ala-ONB. Do rozrtTworu il,21 g (4 immole) Ala- -ONB. HBr w ,15 mil ichlorotformiu dodaije sie 0,56 ml trójejtyloaminy i 0,76 g (2 mmole) Boc-iPro- -OPFP. Roztwór miesza sie w temperaturze poko¬ jowej w ciagu 20 iminut, eksttrahuje woda i liO^/o wodnym roztworem ikwasu cytrynowego, osusza i odparowuje. Otrzymany crironiony, dwupeptyd (Rj = 0,64) bez wyodrebniania rozpuszcza sie w 4 ml 8 M roztworu ikwasu ,soikiego w dioksanie.Roztwór pozostawfia sie na ilO (minut, po czym roz¬ ciencza eterem i odparowuje.Chlorowodorelk dwupepftydu (R* = 0,65) roz¬ puszcza sie w ,15 iml chloroformu, wartosc ipH roz¬ tworu doprowadza itrójetyloamina do 8 i dodaje 1,76 g (3 mmole) Boc-His(Inp)^OPFP. Po upiywie 30 minut do roztworu dodaje sie 0,44 iml iN,N-dwu- metyloamiinoetyloaminy, pozostawia na 5 minut, po czym wytrzasa z lOtya wodnym roztworem kwa¬ su cytrynowego, z 1 N wodnym roztworem ikwa¬ su solnego i z 5% wodnym iroztworem wodorowe¬ glanu sodowego. Ekstrakt osusza sie, odparowuje i uzyskany chroniony trójpeptyd i(Rjf = 0,57) roz¬ puszcza isie w 4 ml 8 M roztworem ikwasu solne¬ go-w dioksanie. Nasitepnie po 10 minujtacn trój- peptyd i(R? = 0,28) wytraca sie suchym eterem, odsaaza i przemywa eterem, ipo czym od razu- roz¬ puszcza w i20 ml mieszaniny lohloroformu i dwu- matylofoirmamidju (1:1).Wartosc pH roztworu doprowadza sie itrójetylo¬ amina do . 8 i dodaje 1,58 g (4 mmole) Boc-Ile- -OPFP. Po uplywie 20 minut rozpóiszczailni/k wy¬ mienia sie na octan etylu i ro'zitwór ocitanowy wy¬ trzasa z 10°/o wodnym roztworem kwasu cytry¬ nowego, a nastepnie z woda. Po osuszeniu, odpa- rowandu roztworu chroniony tertapeptyd '(Rf ^= = 0,57) laczy sie z mieszanina eteru i n-heksanu (1:9), a nastepnie "odsacza. Z kolei rozpuszcza sie go w 4 nil 8 M roztworu ikwasu solinego w dioksa¬ nie, pozostawia na 115 minut, wytraca Iteitrapeptyd (Rf = °38) suchym eterem, odsacza, przemywa i od razu rozpuszcza w 15 .ml mieszaniny chloro¬ formu i dwumeityiófoTmamiidu (2 : 1). Wartosc pH roztworu 'doprowadza sie trójetyloamina do 8 i dodaje 1,66 g (3 mmole) Boc-Tyr(Bzil)HÓPFP. Po 15 minutach xozpuszczalniJk% wymienia sie na oc¬ tan etylu i dodaje 0,22 ml N,N-dwumetyloaimino*-15 mm 16 eiyioaminy. Po dalszych 5 minutach mieszaniny wytrzasa sie z lb°/o wodnym roztworem kwasu cytrynowego, z 1 N wodnym roztworem kwasu solnego i iz woda. Po osuszeniu i odparowaniu uzyskany chroniony pentapeptyd (R^ = 0,60) przenosi sie do eteru, odsacza i przemywa eterem.Nastepnie rozpuszcza sie go w 4 mil 8 M roztworu kwasu solnego w dioksanie i po 10 iminutaeh wy¬ traca eterem pentapeptyd (R* = 0,62), odsacza, przemywa suchym eterem i od razu rozpuszcza w 20 mil mieszaniny chloroformiu i dwiumettyloforma- midti (1 : 1). Wartosc ipH roizltwonu doprowadza sie trójeityloamina do 8 i dodaje 1,6 g (4 mmoile) Boc- --Val-OPFP. Mieszanine pozositawia sie na 20 mi¬ nut, po ozym rozpuszczalnik wymienia na octan etylu i rozitwór octanowy wytrzasa, 'z woda i z 10% wodnym 'roztworem Ikwaisu cytrynowego. Eks¬ trakt osusza sie, odparowuje i uzyskamy chroniony heksapeptyd (Rf = 0,65) przenosi do eteru, saczy, przemywa eterem i od razu 'rozpuszcza w 20 ml dwuimety.lofoirmamidu.Wartosc pH roztworu doprowadza sie trójetylo- amina do 8 i dodaje 2,9 g (6 mamoli) Boc-Arg(N02)- -OPFP. Po uplywie 20 *rninut rozpuszczalnik wy¬ mienia sie na chloroform i roztwór chloroformowy wytrzasa z 10% wodnym roztworem kwasu cy¬ trynowego i z woda, osusza i odparowuje. Pozo¬ stalosc 'uciera sie :z "mieszanina octanu etylu i e- teru (1 : 2), saczy i przemywa ;ta sama mieszanina rozpuszczalników. Otrzymuje sie 2,0 g (<72°/o) od¬ powiedniego chronionego heptapeptydiu. Tempera¬ turatopnienia 185—ii87°C, Rf2 = 0,70.Etap 2. Z-OGly-Arg(N02)-Vail-Tyr(Bzl)-Ile-His (Dnp)-Pro-Ala-ONB. 1,35 g (1 ramol) Boc-Arg(N02)- -Val-Tyr(Bzl)-Ile-His(Dnp)-Pro-Ala-ONB rozpusz¬ cza £ie w 4 ml 8 M roztworu kwasu solnego w dioksanie i pozostawia na 15 minut. Nastepnie su¬ chym eterem wytraca sie chlorowodorek hapta- peptydu (Rj. = 0,63), odsacza, przemywa eterem i od razu rozpuszcza w 15 ml dwumetyloformami- du.Wartosc pH roztworu doprowadza sie trójetylo- amina do 8 i dodaje 0,96 g (2,5 mmola) Z-OGly- -OPFP. Po, 20 minutach .rozpuszczalnik wymienia sie na chloroform i roztwór chloroformowy wy¬ trzasa z woda. Ekstrakt osusza sie, odparowuje i wyodrebnia 'chroniony peptyd etanolem^ Wydaj-' nosc 1,16 g (83°/o). Temperatura topnienia 133— ^L35°C, R f = 0,72.Etap 3. Usuwanie grup ^ochronnych. 1,5 g (1 mimol) Z-OQly-Arg (Dnp)-Pro-Ala-ONB rozpuszcza sie w 5 ml dwu- metyloformamidiuj dodaje 2,95 ml 2Hmerkaptoeta- nolu. Roztwór pozostawia sie na jedna godzine, po czyim dodaje suchy eter, odsacza wytracony o- sad ii przemywa go etanolem./Otrzymuje sie 1,1 g (82%) Z-OG.ly-Arig(N02)-Val-Tyr(Bzl)-Ile-Hi,s-Pro- -Ala-ONB. Rf — 0,15 Rf = 0,40. Tak otrzymany chroniony peptyd rozpuszcza sie w mieszaninie metanolu, Ikwasu octowego i wody (5 : 1 : 1), dodaje 0,5 g lOM ipalladu na weglu, po czym przy sil¬ nym mieszaniu przepuszcza isie przez te mieszani¬ ne wodór w ciagu 24 godzin. 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Przebieg reakcji kontroluje sie metoda chroma¬ tografii cienkowarstwowej. Po zakonczeniu reakcji katalizator odsacza sie, przemywa 15 ml miesza¬ niny o .takim samym okladzie .jak uzyta do reak¬ cji, nastepnie przesacz odparowuje sie do sucha, uzyskana pozostalosc przenosi sie do mieszaniny etanol/woda i odparowuje kilkakroitnie.Produkt wyodrebnia sie suchym etanolem. O- trzymuje sie 0,55 g (80%) [ihydroksyacetylo1, Ala8]- -angiotensyny II, iktóra ' oczyszcza sie nastepnie jak wyzej opasano Rf = 0,28, Rf ,= 0,48, Rf = = 0,50, Eoin i(pH —¦ 1,9) = 1,0. Analiza aminokwa¬ sów: Pro 0,95(1), Ala l,li(l), Val 1,0(1), Ile 1,0(1), His ,1,0(1), Arg 1,0,(1), Tyir 0,9(1).Przy k lad VI. [Hydroksyaeetylo1, Thr(Me)?]- -angiotensynaII " Etap 1. Boc-Arg(N02)-yal-Tyr(Bal)-Ile-HLs(Dnp)- -Pro-Thr(Me)-OMe. 0,69 g (3 nimolej Thr (Me)- -OMe.HBr rozpusizcza sie w i30 ml chloroformu i dodaje 0,42 mil trójetyloaminy oraz 1,7 g (4,5 mmo- la) BocnPro-^PFP. Roztwór pozostawia sie na o- kres dwóch godzin, po czym dodaje 0,33 ml N,N- -dwumetyloaminoetyloaminy. Po 15 minutach roz-. puszczalnik wymienia sie na octan etylu i rozitwór octanowy wytrzasa z lO^t wodnym roztworem kwasu cytrynowego, . z 1 N wodnym roztworem kwasu solnego,, iz woda i z 5% wodnym roztwo¬ rem wodoroweglanu sodowego. Po osuszeniu i od¬ parowaniu uzyskany chroniony dwupeptyd = 0,76) rozpuszcza sie bez' wyodrebniania w 2 ml 8 M roztworu kwasu solnego w dioksanie. Po 15 minutach roztwór rozciencza sie eterem i odparo¬ wuje. o Powstaly dwupeptyd (Rf = 0,18) rozpuszcza sie w 20 ml chloroformiu, wartosc pH roztworu dopro¬ wadza trójetyloamina do 8 i dodaje 2,6 g (4,5 mmoli) Boc-Hiis(Dnp)-OPFP. Calosc miesza sie w temperaturze pokojowej w ciagu dwóch godzin, a nastepnie dodaje 0,22 iml N,N-dwumatyloamiinoety- loaminy i po 15 minutach wytrzasa z 10p/o wod¬ nym roztworem ikwasu cytrynowego, 1 N wodnym roztworem ikwasu isolnego i z woda. Po osuszeniu i odparowaniu uzyskany trójpeptyd (Rf = 0,5) rozpuszcza sie bez wyodrebniania w 4 ml 8 N wodnego Toztworu kwasu solnego i po ojplywie- 15 minut itrójpeptycl chym eterem, osa/d odsacza sie, przemywa eterem i od razu rozpuszcza w 120 iml mieszaniny chloro¬ formu i dwumetyloformamidu (1; 1). Wartosc pH roLtworu doprowadza sie trójetyloamina do 8 i dodaje 1,6 g (4 mmole) Boc-Ile-OPFP. Po 30 minu¬ tach rozpuszczalnik wymienia sie na octan etylu i roztwór oiotancwy wytrzasa z 10% wodnym roz¬ tworem ikwasu .cytrynowego, z IN wodnym roz¬ tworem Ikwasu so/inego i z woda, osusza i odparo¬ wuje. Pozostalosc traktuje sie mieszanina etpru i n-heksanu ii : 9 i wyodrebnia .chroniony tetra- peptyd.. Nastepnie rozpuszcza sie go w 7 ml 8 M roztworu kwasu solnego, w dioksanie, roztwór po¬ zostawia na 15 minut, po czym straca suchym e- terem tetrapeptyd (Rf = 0,27) i od razu irozpusz- - cza w 20 mil mieszaniny chloroformiu i dwumetyilo- ' formamidu (1:1).17 Wartosc pH roztworu doprowadza isie trójetylo- amina do 8 i dodaje 1,6 g i(3 mmole) Boc-Tyr(Bzil)- -OPFP. Po uplywie 30 minut rozpuszczalnik wy¬ mienia sie na ootan etylu ii dodaje 0,22 ml N,N- -dwumetyloaminoetylloaniiny. Roztwór pozostawia sie na 15 iminut, a nastepnie wyltrzasa z lO^/o wod¬ nym roztworem kwasu cytrynowego, z 1 N wod¬ nym roztworem (kwasu /solnego i z woda. Eks¬ trakt osusza sie, odparowuje i eterem wyodrebnia chroniony pentapeptyd (R* = 0,63). Otrzymuje sie 0,4 g chronionego. pentapeptydu. Zwiazek ten rozpuszcza sie w 1 mil 8 M "roztworu kwasu sol¬ nego w dioksanie i po. 15 minutach wytraca su¬ chym eterem pentapeptyd (Rf = 0,47), odsacza go i przemywa eterem, po czym zaraz rozpuszcza w 10 ml dwumetyloformamidu. Wantosc pjl roztwo¬ ru doprowadza isie trójetyloamina do 8 i dodaje 0,4 g (1 mmol) Boc-Val-OPFP.Po uplywie godziny .rozpuszczalnik wymienia sie na chloroform i otrzymany roztwór wytrzasa z 10*/o wodnym roztworem ikwasu cytrynowego, z 1 N wodnym roztworem ikwasu soflnego i z woda, po czym osusza, odparowuje i -eterem wyodreb¬ nia chroniony iheksapeptyd (R? '= 0,65). Produkt ten rozpuszcza sie w U,5 ml 8 M roztworu kwasu solnego "w dioksanie, roztwór pozostawia na 15 minut, a nastepnie wytraca isucihym eterem neiksa- peptyd i(r5 ^ 0,48). Osad odsacza sie, przemywa eterem i od razu rozpuszcza w 10 ml dwuimetylo- formamiidu. Wantosc pH roztworu doprowadza sie trójetyloamina do 8 i dodaje 0,45 g (1 mmoil) Boc- -Arg(N02)-OPFP. Po uplywie godziny rozpuszczal¬ nik wymienia isie na ootan etylu i iroiztwór octa¬ nowy wstrzasa z MPfa wodnym roztworem kwasu cytrynowego, z 1 N wodnym roztworem kwasu solnego i iz Woda. Ekstrakt osusza sie, odparowuje i pozoistalosc traktuje mieszanina eterii z *etaino- lem (9: 1) otrzymujac 0,45 g (11,3%) chronionego o heptapeptydu. Rf = - 0,38, temperatura topnienia 199—203°C (rozklad).Etap 2. Z-OGly-Arg(N02)-Val-Tyir(Bzl)-Ile-His (Dnp)-Pro-Thr(Me)^OMe. 0,45 g (0,34 immola) Boc- -Arg(N02)-Val-Tyr(BzlHle-His(Dmp)-Pro-Thr(Me)- -OMe rozpuszcza isie w 2 mil 8 M roztworu kwasu solnego w dioksanie. Roztwór pozostawia sie na 15 minut po czym wytraca sie heptapeptyd (Rf = = 0,35) suchym eterem. Osad zaraz rozpuszcza sie w 10 ml dwumetyloformamiidu, wartosc pH roz¬ tworu doprowadza tirójetyloamina do 8 i dodaje 0,4 g (1 mmol) Z-OGly-OPEP.Po uplywie godziny mieszanine reakcyjna roz¬ ciencza sie 30 iml chloroformu, a nastepnie wy¬ trzasa ;z woda. Po oisuszeniuv i odparowaniu eks¬ traktu chroniony peptyd wyodrebnia sie miesza¬ nina eteru i etanolu (9:1).Wydajnosc 0,45 g (93%), temperatura topnienia 158-^162°C, R? = 0,44.Etap 3. Usuwanie grup ochronnych. 0,45 g (0,31 mmola) Z-OGly-Arg(N02)-Val-Tyr(BzlK[le-His (Dnp)-Pro-Thr(Me)-OMe rozpuszcza sie w 1,5 ml dwumetyloformamkiu n. dodaje 1 ml 2-merlkapto- etanolu. Po uplywie godziny peptyd wytraca sie L 964 18 suchym eterem, rozpuszcza w metanolu, odbarwia mala ilosca wegla i na koniec, odparowuje. Po¬ zostalosc traktuje sie eterem i saczy/ Otrzymuje sie 0,38 g (98°/o) Z-OGly-Arg(N02)-Val-Ty.r(Bzl)- 5 -lie-His-Pro-Thjr(MeOMe. R? = 10,16, R* = 0,52.Produkt ten przeprowadza sie w 'zawielsine w 5 ml dioksanu i dodaje 1,2 ml fi N wolnego roztworu wodoroitlenku sodowego. Roztwór pozostawia sie na jedna godzine, po czym doprowadza wartosc pH do 3 za ,pomoca 1 N wodnego roztworu tawasu solnego.Otrzymany osad rozipuszciza sie w mieszaninie chloroformu i dwumetylofoiimamidu. Po osuszeniu 15 i odparowaniu otrzymany peptyd wolny na C-ikon- cu traktuje sie eterem. Otrzymuje sie 0J26 g (7i(M) wolnego peptydu o Rj = 0,25. Peptyd ten roz¬ puszcza sie w 10 ^ml (mieszaniny metanolu, kwasu octowego i wody (5 : 1:1) i dodaje 0,1 g palladu 20 na weglu, po czym przez roztwór przepuszcza sie przy mieszaniu wodór w ciagu 16 godzin. Prze¬ bieg reakcji ikonJtrolluje sie metoda chromatogirafii clenkowarstwowejj. Po .zalkoniozeniu reakcji kata¬ lizator odsacza sie, a przesacz odparowuje do su- 25 cha. Pozostalosc rozpuszcza sie w mieszaninie wo¬ dy z etanolem i-odparowuje kilkakrotnie. Otrzy¬ muje sie 0,16 g (8Q|%) {hydrolksyacetylo1, Thr(Me)8]- -angioltenisyny II, (która oczyszcza jak wyzej opi¬ sano. R5{ •= 0,22, R| ^ 0,5i3, Rj =0,50, EGm('pH.=: 30 = 1,9) = 0,98.Analiza aminokwasów: Thr 0,6(1), Pro 170(1), Val 1,0(1), Ile 1,02(1), Tyr 0,85(1), His 1,0(1), Arg 0,96(1).Zastrzezenia patentowe * 1. Sposób wytwarzania nowych peptydów o o- gólnym wzorze X-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Y, w 40 którym X oznacza rodnik pochodzacy z alifatycz¬ nego ikwasu a-hydroksykarboksylowego, a Y ozna¬ cza rodnik pochodzacy z alifatycznego kwasu a^a- minoikarbokisyloweigo, oraz, ich soli addycyljnyich z kwasami i polaczen ikompldksowych, znamienny 45 tym, ze (reaktywna pochoidna heiptapepltydu o ogól¬ nym wzorze H-ArgH(A)-Val-Tyr(B)-Ile-His(E)^Pro- -Y-OG, w iktórym A oznacza grupe odpowiednia do okrelsowej ochrony grupy guanidynowej argi- - niny, B oznacza grupe odpowiednia do okresowej 50 ochrony aromatycznej grupy hyidrolksyilowej tyro- niny, E oznacza grupe odpowiednia do oikresowej ochrony grupy imidazoiowej hisltydyny, G oznacza grupe odpowiednia do ochrony grujpy karboksylo¬ wej koncowego wegla aminokwasu, trwala w la- 55 godnie kwasowych warunkach, ale odszczepialna przez silne Ikwasy lub zasady albo na drodze uwo¬ dornienia katalitycznego, a Y ma wyzej okreslone znaczenie, poddaje sie reakcji z reaktywna po¬ chodna kwasu amiinoksylkariboksylowego o ogól-' 60 nym wzorze W-X'-M, w którym X' oznacza gru¬ pe a-aminoksyacylowa poiohodzaca z alifatycznego kwasu 'kanboksylowego, W oznacza grupe ochron¬ na odszczepialna przez hydrolize (kwasna lub ka¬ talityczne uwodornienie, a M oznacza grupe hy- 65 droksylowa lub grupe aktywujaca, odsaczepia sie19 111 964 20 grupe ochronna E z otrzymanego zwiazku o ogól¬ nym wzorze W-X/-ATg(A)-Va;l-Tyr(B)-Ile-Hisi(E) Fro-Y-OG? w którym B, W, X', Y, A, E i G ma¬ ja wyzej okreslone 'znaczenia, a nastepnie-'odszcze- pia sie pozostale grupy ochronne lancucha boez-[ 5 nago i gruip koncowych, przy czym te pozostale grupy usuwa sie przez uwodornieniie katalityczne, i ewentualnie przeksztalca tak oltrzymany.zwiazek o ogólnym wzorze X-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Y w sól addycyjna z kwasem lub polaczenie komplekso-) (1° we. 2. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze jako zwiazek wyjsciowy istosuje sie zwiazek o o- gólnym wzorze H-Arg(A)-Val-Tyr(B)-Ile-His(E)- -Pro-Y^OG, w którym A oznacza grupe nitrowa ^ lub tosylowa, B oznacza ewentualnie podstawio¬ na grupe benzylowa, a E oznacza grupe dwunitro- fenylowa, oraz zwiazek wyjsciowy o ogólnym wzo¬ rze W-X'-M, w którym W oznacza grupe benzylo- ksykarbonylowa lub IIIirz.-foutoksykaTfoonylowa, X' oznacza grupe amiinoiksyacetylowa lub a-amino- ksyprópionylowa, a M odznacza grupe piwaloilo- ksylowa, nitrofenoksylowa, 2,3,5^tróijehlon:ofenoksy- lowa, pieciochlorafenolksylowa, pieciofluorofeno- ksylowa, Nnsulkcynimidoksylowa lufo azydowa. 3. Sposób wedlug zaatnz. 1, znamienny tym, ze grupe ochronna E usuwa isie za pomoca 2^mer- kaptoeitainollu. ¦ 4. sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze jako zwiazek wyj.sciowy sitosuje sie zwiazek o o- gólnym wzorze H-Arg(A)-Val-Tya::(B)-Ile-His(E)- -Pro-Y-OG, w którym Y Oiznacza korzystnie gru¬ pe leucylowa, izoleucylowa, alanyllowa lufo ifcreo- nylowa.DN-3, zam. 635/81 Cena 45 zl PL PL PL