DE2127393B2

DE2127393B2 - Hepta- und Octapeptide

Info

Publication number: DE2127393B2
Application number: DE2127393A
Authority: DE
Inventors: George Smith Norwich Denning Jun.; Donald Theodore Oxford Pals; Frank East Brunswick N.J. Sipos
Original assignee: Norwich Pharmacal Co Norwich Ny (vsta)
Current assignee: Warner Chilcott Pharmaceuticals Inc
Priority date: 1971-02-12
Filing date: 1971-06-02
Publication date: 1979-09-20
Also published as: ATA483471A; US3751404A; ES391701A1; PH17100A; FR2125248B1; FR2125248A1; DE2127393C3; IL36869A; AT333986B; JPS5414103B1; PH17092A; PH13821A; DE2127393A1; IL36869A0

Description

Die Erfindung betrifft Hepta- und Octapeptide der allgemeinen Formel

R-Arg-Val-Tyr-R²-His-Pro-R' entsprechend der Strukturformel

H₂N-C=NH

NH H₃C CH.,

(CH,)₃ CH CH₁ CH,

I I I I

R — NH—CH-CONH —CH-CONH — CH—CO —R²—NH-CH — CON—CH-CO —R¹

P=N
HN J

in der R ein Wasserstoffatom, eine Succinyl-, Sarcosyl-, L-Seryl-, Succinamyl-, L-Prolyl-, Glycyl- oder D- oder L-Asparaginyl-Gruppe und R² eine L-Valyl- oder L-Isoleucyl-Gruppe oder R eine L-Aspartyl-Gruppe und R² eine L-Valyl-Gruppe bedeuten und R¹ eine L-Alanin-, L- oder D-Leucin, Glycin-, L-Isoleucin- oder j3-Alanin-Gruppe ist.

Die erfindungsgemäßen Peptide besitzen pharmakologische Aktivität Sie hemmen die Pressorwirkung von Angiotensinamid auf den Blutdruck. Wenn sie Ratten mit ausgebohrtem Rückenmark in Mengen von 2(^g/kg/i. v. durch Infusion verabreicht werden, wird die Pressorwirkung von entsprechend verabreichtem Angiotensin gehemmt Aufgrund dieser hemmenden Wirkung auf eine durch Angiotensinamid verursachte Erhöhung des Blutdrucks sind die erfindungsgemäßen Peptide wirksame Mittel, um einer durch Angiotensinamid verursachten Hypertension entgegenzuwirken (Angiotensin-Antagonisten). Sie können auch bei intravenöser Verabreichung die Hypertension bei akut einseitig renal hypertensiven Ratten verhindern.

Die in vitro-Aktivität kann folgendermaßen bestimmt werden: Abschnitte der Brustaorta von Kaninchen werden wie von PaIs et al in »Circulation Research« Bd 29, S. 664-672 (197!) angegeben, präpariert und für die Untersuchungen angewandt Die Wirksamkeit der Verbindungen als Antagonisten gegenüber der zusammenziehenden Wirkung von Angiotensin II auf die Aortenstreifen wird standardisiert durch Bestimmung eines pA2-Wertes, entsprechend dem Verfahren von Schild »British Journal Pharmacology«, Bd. 2, S. 198-206 (1947). Die erhaltenen Werte sind in der Tabelle angegeben.

Die erfindungsgemäßen Hepta- und Octapeptide können leicht entsprechend bekannten Verfahren hergestellt werfen. Derartige Methoden umfassen den Aufbau einer linearen Kette von Aminosäuren durch wiederholte Amidbindungen, wobei bei einer derartigen aufeinanderfolgenden Verknüpfung die notwendigen

Schutz-Gruppen, die leicht durch übliche Verfahren entfernt werden können, angewandt werden. Die Anwendung derartiger Methoden auf die erfindungsgemäßen Peptide wird im folgenden beispielhaft an der folgenden Verbindung beschrieben:

L-Asparaginyl-L-arginyl-L-valyl-L-tyrosyl-L-valyl-L-histidyl-L-prolyl-L-alanin

A) BOC-Asn-Arg(NO₂)-Val-Tyr(O-Bzl)-Val-His(N^im-Bzl)-Pro-Ala-poIymer

BOC-Ala-Harzester (5 g, 0,5 mMol/g) wurden in ein schwenkbares 200 ml Merrifield Reaktionsgefäß gegeben.
Das Harz wurde in analytisch reinem Chloroform gequollen, indem man es 20 min hin- und herschwenkte, und anschließend dreimal mit je 50 ml Eisessig gewaschen. Die t-Butoxycarbonyl (BOC) Schutzgruppe wurde durch 1 n-HCl in wasserfreier Essigsäure durch 40 min langes Schwenken entfernt Das Harz wurde nacheinander dreimal jeweils mit Essigsäure, absolutem Äthanol und mit Ν,Ν-Dimethylformamid gewaschen. Das entstehende Hydrochloric! des Alanylharzesters wurde mit einer 10%igen Lösung von Triäthylamin in Dimethylformamid durch 10 min langes Schwenken neutralisiert. Anschließend wurde das Harz mit drei Anteilen von jeweils Dimethylformamid, abs. Äthanol, Chloroform und Methylenchlorid gewaschen und die Lösung von 8,5 mMol (dreifacher Überschuß) von BOC-Prolin in 40 ml Methylenchlorid wurde zugegeben.

Während des 20 min langen Schwenkens konnte das Aminosäurederivat das Harz durchdringen. Dann wurden 8,5 mMol N.N-Dicyclohexylcarbodiimid (DDC) in 10 ml Methylenchloriid zugegeben, wobei innerhalb von 12 h unter Schwenken die Kupplung eintreten

hj konnte. Anschließend wurde das Harz mit jeweils drei Anteilen von Methylenchlorid, abs. Äthanol und Essigsäure gewaschen und für den nächsten Schritt, bei dem die Schutzgruppe mit HCl in Essigsäure, wie oben

beschrieben, abgespalten wurde, vorbereitet Das Wascheii, Neutralisieren und Kuppeln wurde auf die beschriebene Weise durchgeführt, wobei

BOC-His(N™-Bzl)~OH,

BOC-VaI-OH,

BOC -Tyr(O - BzI)-OH und BOC-Arg(NO2)-OH

verwendet wurden. Eine Änderung wurde bei dem Kupplungsschritt mit

BOC - HiS(Ni" - BzI)- OH und
BOC - Arg(NO₂) - OH

vorgenommen, wobei ein Dimethylformamid-Methylenchlorid (2 :1) Gemisch als Lösungsmittel verwendet wurde. Die Kupplung von Asn zu dem vor» der Schutzgruppe befreiten Harz-Heptapeptid wurde unter Verwendung von BOC-Asn-ONP (BOC-Asparagin-pnitrophenylester) in Dimethylformamid unter 72 h langem Schwenken des Gemisches durchgeführt

Nach dem letzten Kupplungsschritt wurde das Harz-Peptid mit Dimethylformamid, Äthanol, Essigsäure und Äthanol gewaschen und im Vakuum über P2O5 getrocknet Das Gewicht des Harz-Peptides betrug 7,3 g.

B) H-Asn-Arg(NO₂)-Val-Tyr(O-Bzl)-Val-His(N^im-Bzl)-Pro-Ala-OH · 2 HBr

Die 73 g des oben erhaltenen Harzpeptides I wurden in 25 ml trockener Trifluoressigsäure suspendiert und ein Strom von trockenem HBr wurde mit langsamer Geschwindigkeit durch die Suspension hindurchgeleitet Nach 20 min wurde das Harz abfiltriert und nochmals 40 min lang mit HBrZCF₃COOH behandelt Die Filtrate wurden im Vakuum bei 20° zur Trockne eingedampft Die öligen Rückstände wurden mit abs. Äther ausgefällt und das Produkt im Exsikkator über Kaliumhydroxid getrocknet. Die Gesamtausbeute betrug 1980 mg (593%) des schutzgruppenhaltigen Octapeptiddihydrobromids.

C)H-Asn-Arg-Val-Tyr-Val-His-Pro-Ala-OH
5

1,0 g des schutzgruppenhaltigen Peptids (B) wurde ia

20 ml eines Essigsäure-Dioxan-Wasser-Gemisches (4:4:1 VoL/VoL) gelöst und über PoVBaSO₄ (10%

Katalysator [0,5 g]) 48 h bei Atmosphärendruck hydro-

genolysiert Nach dieser Zeit wurden weitere 0,2 g des

Katalysators zugegeben und die Hydrierung weitere

24 h fortgesetzt Die abfiltrierte und verdünnte Lösung wurde lyophiiisiert Die Ausbeute betrug 750 mg (Fp.

150 bis 165°). (Berechnet für das Dihydrobromid:

1532% Br, gefunden 13,36% Br.)

Das rohe Produkt wurde durch Geldurchdringungs-Chromatographie über Sephadex· G-25 in 0,2 m Essigsäure gereinigt Die Fraktionen, die das reine Peptid enthielten, wurden vereinigt und lyophiiisiert Die gereinigte Verbindung enthält nur eine Spur Halogen.

Aminosäureanalyse:

AIa: 1,00; Arg: 1,00; Asn: 1,09; His: 0,90;
Pro: 1,04; Tyr: 0,75 VaI: 1,94.

Auf ähnliche Weise wurden andere erfindungsgemäße Pep'ide durch Einführung der entsprechenden Einheit bei der entsprechenden Verfahrensstufe hergestellt Die so erhaltenen Peptide sind in der folgenden Tabelle zusammen mit ihren physikalischen und physiologischen Daten angegeben.

Die Rf-Werte wurden auf Merck Silica Gel F-254 Platten bzw. Merck Cellulose F-254 Platten bestimmt Als Lösungsmittelsystem A diente N-Butanol-Essigsäure-Wasser (6:2:3 Vol/Vol) und als Lösungsmittelsystem B n-Butanol-Essigsäure-Wasser-Pyridin (9:2:2:6:7 Vol/Vol). Der Nachweis erfolgte bei den Verbindungen 1 bis 4 und 6 bis 13 mit Ninhydrin und bei

Verbindungen 5 und 14 bis 23 mit Pauly's Reagens.

Tabelle
R-Arg-Val-Tyr-tf-His-Pro-R¹

Ϊ Nr.	2	R	R¹	R²	Molgewicht	Spez. Drehung	Rf-Wert*	Cellulose	0,35	pA₂-Wert
						[«WC	Silicagel,	Lösungsmittel A
':'"■	λ 3					Konz. in 1 η AcOH		0,13	0,50
'·■";		Asn	Ala	VaI	955,1	-59,4/20			6,84
	ΐ; 4					c = 0,2	0,20	0,65
	Asn	Ala	VaI	955,1	-81,33/23			7,62
5					c = 0,22	0,15	0,60
	Asn	Leu	VaI	997,2	-70,55/23			8,26
6					c= 1	0,10	0,70
	Asn	Leu	VaI	997,2	-87,32/26			8,46
7					c = 0,2	0,40	0,45
	Succinyl	Ala	VaI	941,1	-64,9/23			5,68
				c= 1	0,03	0,2
Asp	Ala	VaI	956,1	-101,62/23			7,5
				c = 0,3	0,02
H	Ala	VaI	841,0	-68,31/24		6,10
				c = 0.24

	Sar	5	AIa	VaI	21 27	393	Ό	0,30	Lsgsm. B
							Silicagel		8,61
Fortsetzung	Ser		AIa	VaI			Lsgsm. A	0,38
						0,05		7,35
	Asn	Leu	VaI	912,11	-84,41/23		0,50
8					c = 0,24	0,02		5,93
	Succin-	AIa	VaI	928,11	-69,00/24		0,20
9	amyl				c = 0,2	0,15		6,78
	Asn	GIy	VaI	997,22	-54,40/19		0,25
10					c = 0,25	0,10		6,54
	Asn	He	VaI	940,12	-83,14/21		0,40
11					c = 0,25	0,10		7,9
	Sar	GIy	Va'	941,11	-54,90/23		0,25
12					c =1,0	0,09		8,6
	Pro	GIy	VaI	997,2	-55,33/17		0,35
13					c = 0,3	0,15		6,99
	Asn	GIy	VaI	898,10	-74,6/26		0,32
14					c = 0,57	0,10		7,43
	Sar	jS-Ala	VaI	924,12	-81,0/21		0,25
15					c = 0,53	0,15		7,6
	Asn	>Ala	VaI	941,11	-67,0/21		0,45
16					r = 0,51	0,05		5,08
	GIy	AIa	VaI	912,10	-59,0/22		0,32
17					c = 0,52	0,15		7,93
	Sar	Leu	Ue	955,10	-53,7/22		0,45
18					c = 0.53	0,25		8,87
	Asn	Leu	lie	898,09	-80,3/22		0,35
19					c = 0,56	0,15		8,34
	Sar	AIa	He	968,22	-56,7/17		0,35
20					c = 0,30	0,25		9,18
	Asn	AIa	He	1011,25	-77,5/21		0,38
21					c = 0,54	0,28		6,98
	Vcrgleichssubstanz	Phe⁴-Tyr	⁸-Angiotensin II	926,14	-80,5/21
22				c = 0,54	0,10		6.8
		969,17	-63,7/22
23			c = 0,52

Claims

Patentanspruch:

Hepta- und Octapeptide der allgemeinen Formel: R-Arg-Val-Tyr-R²-His-Pro-R"

in der R ein Wasserstoffatom, eine Succinyl-, Sarcosyl-, L-Seryl-, Succinamyl-, L-Prolyl-, Glycyl oder D- oder L-Asparaginyl-Gruppe und R² eine L-Valyl- oder L-Isoleucyl-Gruppe oder R eine L-Aspartyl-Gruppe und R² eine L-Valyl-Gruppe bedeuten und R¹ eine L-Alanin-, L- oder D-Leucin-, Glycin-, L-Isoleucin- oder ß- Alanin-Giuppe ist