Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung neuer Hepta- bzw. Octapeptide der Formel I
EMI1.1
worin R Wasserstoff, ss -Carboxypropionyl, a -L-Aspartyl, Sarcosyl, L-Seryl, Succinamyl, L-Propyl, Glycyl, D-Asparaginyl oder L-Asparaginyl, R1 den L-Alanin-, L-Leutin, D-Leucin-, Glycin L-Isoleucin- oderss-Alaninrest und R2 den L Valin-, L-Isoleucin- oder L-Alaninrest bedeuten. Die erfindungsgemäss erhältlichen Verbindungen hemmen bei intravenöser Applikation die Blutdruckwirkung von Angiotensinamid.
Die erfindungsgemäss erhältlichen Verbindungen weisen pharmakologische Wirksamkeit auf. Sie verhindern den blutdruckerhöhenden Einfluss von Angiotensinamid. Wenn man daher Ratten, denen das Rückenmark durchtrennt wurde, die erfindungsgemäss erhältlichen Verbindungen in so kleinen Mengen wie 20 ,zug intravenös verabreicht, dann wird die blutdruckerhöhende Wirkung von Angiotensinamid, das in ähnlicher Weise verabreicht worden ist, gehemmt. Wegen dieser Hemmwirkung auf durch Angiotensinamid hervorgerufene Blutdruckerhöhung sind die erfindungsgemäss erhältlichen Peptide wertvolle Mittel zur Verhinderung der durch Angiotensinamid verursachten Blutdruckerhöhung. Sie sind ausserdem geeignet, bei intravenöser Applikation die Blutdruckerhöhung bei akut einseitig renal-hypertensiven Ratten zu verhindern.
Das erfindungsgemässe Verfahren zur Herstellung der neuen Hepta- bzw. Octapeptide ist dadurch gekennzeichnet, dass man die entsprechenden Aminosäuren und gegebenenfalls die Bernsteinsäure bzw. das Bernsteinsäuremonoamid oder deren aktivierte Derivate in beliebiger zeitlicher Reihen folge und unter intermediärem Schutz von jeweils von der Reaktion auszuschliessenden reaktiven funktionellen Gruppen miteinander kondensiert.
Die Herstellung eines Peptids der Formel I kann beispiels.
weise erfolgen, indem a) eine geschützte Aminosäure an einen Träger gebunden wird, b) die schützende Gruppe unter sauren Bedingungen ent fernt wird, gefolgt von Neutralisation, wobei jede Stufe
Waschungen mit Lösungsmitteln unterworfen ist, c) in Gegenwart eines Lösungsmittels oder einer anderen geeignet aktivierten geschützten Aminosäure ein nächst folgender geschützter Aminosäurerest unter Verwendung eines Peptidbindungen ausbildenden Mittels eingeführt wird, d) die Stufen b und c wiederholt werden, bis die oben in
Formel I dargestellten Verbindungen in geschütztem Zu stand gebildet worden sind und e) die schützenden Gruppen durch freisetzende Mittel abge trennt werden.
Im folgenden werden an Hand von Beispielen bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung näher erläutert.
L-Asparaginyl -L-arginyl-L-valyl-L-tyrosyl-L-valyl-L-histi- dyl-L-propyl-L -alanin: BOC-Asn-Arg(NO2)Val-Tyr(OBzl)-Val-His(Nim -Bzl) Pro-Ala-polymer (A)
BOC-Ala-Harzester (5 g, 0,5 mMol/g) wurde in ein 200-ml-Merrifield-Schüttelreaktionsgefäss gegeben. Das Harz wurde durch zwanzig Minuten dauerndes Schütteln in Chloroform (pro analysi) gequellt und dann dreimal mit je 50 ml Eisessig gewaschen. Jeder Waschvorgang dauerte drei bis fünf Minuten. Die tert. -Butoxycarbonyl-(BOC-)-Schutz- gruppe wurde durch 40 Minuten dauerndes Schütteln mit In Chlorwasserstoff in wasserfreier Essigsäure abgespalten. Das Harz wurde nacheinander je dreimal mit Essigsäure, absolutem Äthanol und N,N-Dimethylformamid gewaschen.
Das erhaltene Hydrochlorid des Alanyl-Harzesters wurde durch zehn Minuten Schütteln mit einer zehnprozentigen Lösung von Triäthylamin in Dimethylformamid neutralisiert. Danach wurde das Harz je dreimal mit Dimethylformamid, absolutem Äthanol, Chloroform und Methylenchlorid gewaschen, und eine Lösung von 8,5 mMol (dreifacher Überschuss) BOC- Prolin in 40 ml Methylenchlorid wurde zugegeben. Durch zwanzig Minuten dauerndes Schütteln sollte erreicht werden, dass das Aminosäurederivat in das Harz eindrangt. Dann wurden 8,5 mMol N,N'-Dicyclohexylcarbodiimig (DDC) in 10 ml Methylenchlorid zugegeben, und durch zwölf Stunden dauerndes Schütteln wurde die Kupplung durchgeführt.
Danach wurde das Harz je dreimal mit Methylenchlorid, absolutem Äthanol und Essigsäure gewaschen und wurde so für die nächste Abspaltung der schützenden Gruppe mit Chlorwasserstoffsäure in Essigsäure vorbereitet, wie oben beschrieben wurde. Die Wasch-, Neutralisations- und Kupplungsstufen wurden nach den beschriebenen Metboden durchgeführt, wobei BOC-His(N-Bzl)-OH, BOC-Val-OH, BOC-Tyr(O Bzl)-OH und BOC-Arg(No2)-OH verwendet wurden. Bei den Kupplungsstufen des BOC-His(Nim-Bzl)-OH und BOC Arg(NO2)-OH wurden veränderte Bedingungen angewendet, indem eine D imethylformamid/Methylenchlorid -Mi- schung (2:1) als Lösungsmittel verwendet wurde.
Das Kuppeln von Asn mit dem von der Schutzgruppe befreiten Harz Heptapeptid wurde unter Verwendung von BOC-Asn;ONP (BOC-Asparagin-p-nitrophenylester) in Dimethylformamid durchgeführt, indem die Mischung 72 Stunden lang geschüttelt wurde.
Nach der letzten Kupplungsstufe wurde das Harz-Peptid mit Dimethylformamid, Äthanol, Essigsäure und Äthanol gewaschen und im Vakuum über Phosphortentoxyd getrocknet. Das Gewicht des Harz-Peptids betrug 7,3 g.
H-Asn -Arg(NO2) -Val-Tyr(O -Bzl)-Val-His(N -Bzl) Pro-Ala-OH- 2HBr (B)
7,3 g des wie oben beschrieben hergestellten Harz-Peptids wurden in 25 ml trockener Trifluoressigsäure suspendiert, und ein langsamer Strom trockenen Bromwasserstoffs wurde durch die Suspension geleitet. Nach zwanzig Minuten wurde das Harz abfiltriert und noch einmal 40 Minuten lang mit Bromwsserstoff/Trifluoressigsäure behandelt. Die Filtrate wurden bei 20 im Vakuum zur Trockne eingedampft, die öligen Rückstände wurden mit Äther ausgefällt, und das Produkt wurde im Exsikkator über Kaliumhydroxyd getrocknet.
Die Gesamtausbeute an mit Schutzgruppe versehenem Octapeptiddihydrobromid betrug 1,980 g (59,8 %).
H-Asn -Arg-Val-Tyr-Val-His -Pro -Ala-OH (C)
1,0 g des mit Schutzgruppe versehenen Peptids (B) wurde in 20 ml einer Mischung von Essigsäure, Dioxan und Wasser (4:1 :1, Vol./Vol.) gelöst und in Gegenwart eines Pd/
BaSO4-Katalysators (0,5 g 10%iger Katalysator) 48 Stunden lang bei Atmosphärendruck hydriert. Dann wurde eine neue
Katalysatormenge (0,2 -g) zugegeben, und die Hydrierung wurde weitere 24 Stunden lang fortgesetzt. Die firtrierte und verdünnte Lösung wurde gefriergetrocknet. Die Ausbeute be trug 750 mg (Schmelzpunkt F. 150 bis 165". Der Brom gehalt, der für das Dihydrobromid berechnet wurde, betrug
15,32%, gefunden wurden 13,36% Br.
Das Rohprodukt wurde durch Gel-Verteilungs-Chromatographie an Spehadex G-25 in 0,2 m Essigsäure gereinigt. Die Fraktionen, die das reine Peptid enthielten, wurden vereinigt und gefriergetrocknet. Die gereinigte Verbindung enthielt lediglich eine Spur Halogen.
Dünnschichtchromatographie:
Merck Cellulose -F-Platten, n -Butanol/Essigsäure/W asser (6:2:3, Vol./Vol.) als Lösungsmittelsystem, RF-Wert 0,35; bei Verwendung von Merck Silikagel-F-254-Platten mit demselben Lösungsmittelsystem war der RF-Wert 0,13.
[a]D20 = -59,4 (c = 0,2; in AcOH); [α]57820=-61,1 (c = 0,2; 1n AcOH)
Aminosäureanalyse:
Ala: 1,00;Arg: 1,00;Asn: 1,09;His: 0,90;Pro: 1,04;
Tyr: 0,75; Val: 1,94.
In ähnlicher Weise wurden nach dem erfindungsgemässen
Verfahren andere Peptide hergestellt, indem die erforderliche
Peptideinheit in der geeigneten Stufe eingeführt wurde. Die so erhaltenen Peptide sind in den folgenden Tabellen an gegeben.
Tabelle I Peptid Spezifische DC auf DC auf
Drehung Merck Merck
Silikagel-F- Cellulose-F
254-Platten 254-Platten Formel, Mol.-Gew. (Konzentration Butanol/ und Lösungsmittel) Essigsäure/
Wasser (6:2:3 v/v);
Detektions mittel
Ninhydrin
RF
H-asn-Arg-Val-Tyr-Val-His-Pro-Ala-OH [α]D23=-81,33 0,20 0,50 [C43Hs6N14O11; Mol.-Gew. 955,1] (c = 0,22; in AcOH) H-Asn-Arg-Val-Tyr-Val-His-Pro-Leu-OH [α]D23=-70,55 0,15 0,65 [C46H72N14O11; Mol. -Gew. 997,2] (c = 1;
in AcOH) H-san-Arg-Val-Tyr-Val-His-Pro-Leu-OH [α]D26= -87,32 0,10 0,60 [C46H72N14O11;Mol.-Gew. 997,2] (c = 0,2; in AcOH)
Succinyl-Arg-Val-Tyr-Val-His-Pro-Ala-OH [z]n23 = -64,90 0,40 0,70 (Pauly's (Pauly's
Reagenz) Reagenz) [C43H64N12O12; Mol.-Gew. 941,1] (c-1;in AcOH) H-Asp-Arg-Val-Tyr-Val-His-Pro-Ala-OH [α]D23=-101,62 0,03 0,45 [C43Hs5N13O12;Mol.-Gew. 956,1] (c = 0,3; 1nAcOH) H-Arg-Val-Tyr-Val-His-Pro-Ala-OH [a]D24=-68,31 0,02 0,20 [C39Hs0N12O9;
Mol.-Gew. 841,0] (c = 0,24; 1n AcOH)
Tabelle II Peptid Spezifische DC auf Merck Silikagel-F-254
Drehung Platten (Detektionsmittel Ninhydrin) Formel, Mol.-Gew. (Konzentration, Butanol/ Butanol/
Lösungsmittel) Essigsäure/ Essigsäure/
Wasser Pyridin/Wasser (6:2:3; v/v) (9:2:7:6; v/v) H-Sar-Arg-Val-Tyr-Val-His-Pro-Ala-OH [α]D23=-84,41 0,05 0,30 (C42H65N13O10; Mol.-Gew. 912,11) (c = 0,24; 1n AcOH) H-Ser-Arg-Val-Tyr-Val-His-Pro-Ala-OH [a]D24=-69,00 0,02 0,38 (C42H65N13O11; Mol.-Gew. 928,11) (c = 0,2; 1n AcOH) H-Asn-Arg-Val-Tyr-Val-His -Pro -leu-OH [α]D19=-54,40 0,15 0,50 (C46H72N14O11;
Mol.-Gew.997,22) (c=0,25; 1n AcOH) Succin amyl-Arg-Val-Tyr -Val-His -Pro -Ala -OH [α]D21=-83,14 0,10 0,20 (C43H65N13O11;Mol.-Gew. 940,12) - (c = 0,25; In AcOH) H-Asn-Arg-Val-Tyr-Val-His-Pro-Gly-OH la]D23 = -54,90 0,10 0,25 (C42Hs4N14O11; Mol.-Gew. 941,11) (c = 1,0; In AcOH) H-Asn-Arg-Vai-Tyr-Val-His-Pro-He-OH [α]D17=-55,33 0,09 0,40 (C46H72N14O11;Mol.-Gew. 997,22) (c=0,3; 1n AcOH)
Tabelle III Peptid Spezifische DC auf Merck Silikagel-F-254
Drehung Platten (Detektionsmittel:
Pauly's
Reagenz)
Formel, Mol.-Gew. (Konzentration, Butanol/ Butanol/
Lösungsmittel) Essigsäure/ Essigsäure/
Wasser Wasser/Pyridin (6:2:3; v/v) (9:2:6:7; v/v) H-Sar-Arg-Val-Tyr-Val-His-Pro-Gly-OH [a]D26 = -74,6 0,15 0,25 (C41H63N13O10; 898,10) (c = 0,57; in AcOH) H-Pro-Arg-Val-Tyr-Val-His-Pro-Gly-OH [α]D21=-81,0 0,10 0,35 (C43HssN13O10; 924,12) (c = 0,53; 1n AcOH) H-Asn-Arg-Val-Tyr-Val-His-Pro-Gly-OH [α]D21=-67,0 0,15 0,32 (C42H65N13O10; 941,11) (c=0,51; 1n AcOH) H-Sar-Arg-Val-Tyr-Val-His-Pro-ss-Ala-OH [α]D22=-59,0 0,05 0,25 (C42Hs5N13O10; 912,10 (c = 0,52;
1n AcOH) H-Asn-Arg-Val-Tyr-Val-His-Pro-ss-Ala-OH [α]D22=-53,7 0,15 0,45 (C43H66N14O11;955,10) (c=0,53;1n AcOH) H-Gly-Arg-Val-Tyr-Val-His-Pro-Ala-OH [α]D22 = -80,3 0,25 0,32 (C41H63N13O10; 898,09) (c=0,56; 1n AcOH) H-Sar-Arg-Val-Tyr-He-His-Pro-Leu-OH [α]D17=-56,7 0,15 0,45 (C46H73N13O10; 968,22) (c=0,30; 1n AcOH) H-Asn-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Leu-OH [α]D21 = -77,5 0,25 0,35 (C47H74Nl4Oll; 1011,25) (c = 0,54; 1n AcOH) H-Sar-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Ala-OH [α]D21=-80,5 0,28 0,35 (C43H67N13O10; 926,14) (c=0,54; 1n AcOH)
Tabelle III (Fortsetzung) Peptid Spezifische DC auf Merck Silikagel-F-254
Drehung Platten (Detektionsmittel:
Pauly's
Reagenz) Formel, Mol.-Gew. (Konzentration, Butanol/ ButanoV
Lösungsmittel) Essigsäure/ Essigsäure/
Wasser Wasser/Pyridin (6:2:3; v/v) (9:2:6:7; v/v) H-Asn-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Ala-OH [a]D22 = -63,7 7 0,10 0,38 (C44H8N14011; 969,17) (c = 0,52; 1n AcOH) H-Asn-Arg-Val-Tyr-Val-His -Pro-Ala-OH [a]D19 = -48,4 0,05 0,30 (C43H66N14011; 955,14) (c = 0,25; 1n AcOH) H-Asn-Arg-Val-Tyr-Ala-His-Pro-AlaflH [a]D22 = -68,2 0,10 0,35 (C41Hs2N14O11; 927,03) (c = 0,50;
; 1n AcOH)
In Übereinstimmung mit den Regeln der IUPAC-Nomenklatur zur Unterscheidung von Aminosäuren der D- und L Reihe in Polypeptiden werden Aminosäuren der L-Reihe durch einen grossen Anfangsbuchstaben, Aminosäuren der D -Reihe durch einen kleinen Anfangsbuchstaben gekennzeichnet.
PATENTANSPRUCH 1 Verfahren zur Herstellung von Hepta- bzw. Octapeptiden der Formel I
EMI4.1
worin R Wasserstoff, ss-Carboxypropionyl, a-L-Aspartyl, Sar cosyl, L-Seryl, Succinamyl, L-Prolyl, Glycyl, D-Asparaginyl oder L-Asparaginyl, R1 den L-Alanin-, L-Leucin-, D-Leucin-, Glycin-, L-Isoleucin- oderss-Alaninrest und R2 den L Valin-, L-Isoleucin- oder L-Alaninrest bedeuten, dadurch gekennzeichnet, dass man die entsprechenden Aminosäuren und gegebenenfalls die Bernsteinsäure bzw. das Bernsteinsäuremonoamid oder deren aktivierte Derivate in beliebiger zeitlicher Reihenfolge und unter intermediärem Schutz von jeweils von der Reaktion auszuschliessenden reaktiven funktionellen Gruppen miteinander kondensiert.
UNTERANSPRÜCHE
1. Verfahren gemäss Patentanspruch I, dadurch gekennzeichnet, dass eine Verbindung der Formel I, worin R Wasserstoff, R1 der L-Alanin- und R2 der L-Valinrest ist, hergestellt wird.
2. Verfahren gemäss Patentanspruch I, dadurch gekennzeichnet, dass eine Verbindung der Formel I, worin R L-Asparaginyl, R1 den L-Alanin- und R2 den L-Valinrest bedeuten, hergestellt wird.
3. Verfahren gemäss Patentanspruch I, dadurch gekennzeichnet, dass eine Verbindung der Formel I, worin R D-Asparaginyl, R1 den L-Alanin- und R2 den L-Valinrest bedeuten, hergestellt wird.
4. Verfahren gemäss Patentanspruch I, dadurch gekenn zeichnet, dass eine Verbindung der Formel I, worin R L-As paraginyl, R1 den L-Leucin- und R2 den L-Valinrest bedeu ten, hergestellt wird.
5. Verfahren gemäss Patentanspruch I, dadurch gekenn zeichnet, dass eine Verbindung der Formel I, worin R D-As paraginyl, R1 den L-Leucin- und R2 den L-Valinrest bedeu ten, hergestellt wird.
6. Verfahren gemäss Patentanspruch I, dadurch gekenn zeichnet, dass eine Verbindung der Formel I, worin R a -L Aspartyl, R1 den L-Alanin- und R2 den L-Valinrest bedeuten, hergestellt wird.
7. Verfahren gemäss Patentanspruch I, dadurch gekennzeichnet, dass eine Verbindung der Formel I, worin Rss-Carb- oxy-propionyl, R1 den L-Alanin- und R2 den L-Valinrest bedeuten, hergestellt wird.
8. Verfahren gemäss Patentanspruch I, dadurch gekennzeichnet, dass eine Verbindung der Formel I, worin R Sarcosyl, R1 den L-Alanin- und R2 den L-Valinrest bedeuten, hergestellt wird.
9. Verfahren gemäss Patentanspruch I, dadurch gekennzeichnet, dass eine Verbindung der Formel I, worin R L-Seryl, R1 den L-Alanin- und R2 den L-Valinrest bedeuten, hergestellt wird.
10. Verfahren gemäss Patentanspruch I, dadurch gekennzeichnet, dass eine Verbindung der Formel I, worin R L-As
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