FI68246B

FI68246B - Analogifoerfarande foer framstaellning av nya cyklopeptider

Info

Publication number: FI68246B
Application number: FI782907A
Authority: FI
Inventors: Hans Rink; Bruno Kamber; Peter Sieber
Original assignee: Ciba Geigy Ag
Priority date: 1977-09-28
Filing date: 1978-09-25
Publication date: 1985-04-30
Also published as: DE2861672D1; FI68246C; IE781931L; JPS5459293A; NO148957C; IL55643A; CA1111841A; EP0001295A2; IE47380B1; EP0001295A3; DK428478A; HU184612B; AU4022978A; JPS6218560B2; NO148957B; US4238481A; NO783268L; EP0001295B1; DD140142A5; IL55643A0

Description

IT :τ „ KUULUTUSJULKAISU

jSfa B 11 UTL·*eGNlNGSSKRi_FT_ 6 82 4 6 C ^ Patentti oySnnetty 12 08 1985 Patent ceddelct ^ ^ ' (51) Kv.ik.*/int.a.4 c 07 K 7/64, 7/26 SUOMI—FINLAND (21) Patenttihakemus — Patentansflkning 782907 (22) Hakemispäivä— Ansökningsdag 25.09.78 (23) Alkupäivä — Gilcighetsdag 25 09 78 (41) Tullut julkiseksi — Bllvit offentiig 2g qj 79

Patentti- ja rekisterihallitus Nghtäväkslpanon ja kuul.julkaisun pvm__ ,n η-

Patent- och registerstyrelsen ' ' Ansökan utlagd och utl.skriften publlcerad JU.U4.Ö5 (32)(33)(31) Pyydetty etuoikeus — Begird prioritet 28.09.77 Luxemburg(LU) 78191 (71) Ciba-Geigy AG, CH-4002 Basel, Sveitsi-Schweiz(CH) (72) Hans Rink, Riehen, Bruno Kamber, Arlesheim, Peter Sieber, Reinach,

Svei tsi-Schweiz(CH) (7*0 Oy Jalo Ant-Wuorinen Ab (54) Anal ogiamenetelniä uusien syklopeptidien valmistamiseksi -Analogiförfarande för framställning av nya cyklopeptider

Keksintö koskee analogiamenetelmää uusien syklopeptidien valmistamiseksi, joissa on somatostatiinin oleellisimpia tunnusmerkkejä, kuten aminohappojen 5-11 osasekvenssi tai vastaava sekvenssi, mutta jotka ovat rikittömiä. Keksinnön mukaiset somatostatii-nianalogiset syklopeptidit käsittävät yhdisteet, joiden kaava on Γϋ - Phe - Phe- trp - Lys- Thr- Phe(W) - X - Y (I) 5 6 7 8 9 10 11 12 13 jossa R on Asn, Ala tai des-R, trp on D-Trp tai L-

Trp, jonka bentseenirengas voi olla substituoitu halogeeniatomeilla, kuten erityisesti kloorilla tai fluorilla tai nitroryhmillä, W tarkoittaa L-fenyylialaniinitähteen bentseenirenkaassa substituenttina läsnäolevaa, mahdollisesti eetteröityä hydroksiryhmää tai halogeeni- 2 TT“ _____:_7^r— 68246 atomia, kuten erityisesti jodiatomia tai vetyä, X tarkoittaa ω-ami-noalempialkaani-(mono tai di)-karbonihapon tähdettä tai des-X ja Y tarkoittaa ω-aminoalempialkaani-(mono tai di)-karbonihapon tähdettä tai des-Y, sekä niiden happoadditiosuolojen ja kompleksien valmistamiseksi.

g

Tryptofaani -tähteen bentseenirenkaassa mahdollisesti läsnäolevat halogeeniatomit ovat mieluimmin 5-asemassa, nitroryhmä mieluimmin 6-asemassa; mainittakoon erityisesti 5-bromi-L-tryptofäänistä, 5-fluori-D-tryptofaanista ja 6-nitro-D-tryptofäänistä johdetut tähteet. L-fenyylialaniini11-tähteen substituentti W on mieluimmin bentseeni-renkaan p-asemassa; erityisen edullisia substituoimattoman L-fenyy-lialaniini-tähteen ohella ovat myös p-jodi-L-fenyylialaniinin ja p-hydroksi-L-fenyylialaniini-tähde. Viimemainitun tähteen hydroksi-ryhmä (ts. L-tyrosiinitähteen hydroksiryhmä) voi myös olla eetteröi-dyssä muodossa; tähän sopivat alempialkyylit, sekä erilaiset pep-tidikemiassa tavanomaiset eettereitä muodostavat hydroksyyli-suoja-ryhmät, esim. seuraavassa mainitut; erityisen edullinen on tert.-butyyliryhmä ja edullinen aminohappo'1' -tähde on peräisin p-tert. butoksifenyylialaniinista (ts. tyrosiini-tert.butyylieetteristä).

ω-aminoalempialkaanimonokarbonihapon tähde on mieluimmin tähde jonka kaava on - NH - (CH2)n - CO - jossa n tarkoittaa kokonaislukua 1-7, mieluimmin 2-4. Erityisen edullinen on γ-aminovoihapon tähde, jota merkitään symbolilla Gaba.

ω-aminoalempialkaanidikarbonihapon tähde on mieluimmin peräisin tähteestä, jonka kaava on - NH - CH - (CH0) . - CO - , £ n-i

COOH

jossa n tarkoittaa samaa kuin edellä ja karboksvyliryhmä voi olla myös jossain funktionaalisesti muunnetussa muodossa, esim. esterinä tai amidina, kuten jonain peptidikemiassa tavanomaisista estereistä tai substituoitumattomana amidina. Erityisen edullinen on L- tai erityisesti D-glutamiinihapon tähde, jonka kaava on - NH - CH - (CH2)2 - CO -

COOH

68246 3 tai vastaava tähde,jossa karboksyyliryhmän asemasta on karbamoyyli-ryhmä.

Yleisen nomenklatuurin mukaan tarkoittaa etuliite "des" merkityn symbolin puuttumista; niinpä tarkoittaa esim. sanonta "des-X", että symbolilla X on merkitys (x)m, jossa m = 0, ja näinollen jätetään pois vastaavasti kaavasta.

Edullisissa keksinnön mukaisesti saatavissa scmatostatiinianalogeissa R

g mieluimmin on Asn tai des-R, tryptofaani -tähteellä on D-konfiguraa-tio ja -X-Y- on yhdessä -(Gaba) -, jossa p on 0, 1 tai 2. Erityisen r edullisia ovat yhdisteet, joiden kaava on ^-Asn-Phe-Phe-(D-trp) -Lys-Thr-Phe- (Gaba) (IA) 5 6 7 8 9 10 11 jossa p = 2 tai erityisesti p = 1. Kaikki nämä edulliset somatosta-tiinianalogit voivat olla myös happoadditiosuolojen tai kompleksien muodossa.

Happoadditiosuoloina tulevat kysymykseen erityisesti tavallisten terapeuttisesti käyttökelpoisten happojen fysiologisesti hyväksyttävät suolat; epäorgaanisista hapoista mainittakoon halogeenive-tyhapot, kuten kloorivetyhappo, mutta myös rikkihappo ja fosfori-vast. pyrofosforihappo, orgaanisista hapoista mainittakoon ensisijassa sulfonihapot, kuten bentseeni- tai p-tolueeni-sulfonihappo tai alempialkaanisulfonihapot, kuten metaanisulfonihappo, lisäksi karbo-nihapot, kuten etikkahappo, maitohappo, palmitiini- ja steariinihap-po, omenahappo, viinihapot, askorbiinihappo ja sitruunahappo.

Komplekseilla tarkoitetaan rakenteeltaan puutteellisesti selvitettyjä yhdisteitä, jotka muodostuvat lisättäessä tiettyjä epäorgaanisia tai orgaanisia aineita peptideihin ja tekevät näistä pitkävaikutteisempia. Tällaisia aineita on kuvattu esimerkiksi ACTH:lie ja muille adrenokortikotrooppisesti vaikuttaville peptideille. Mainittakoon esim. epäorgaaniset yhdisteet, jotka ovat peräisin metalleista, kuten kalsiumista, magnesiumista, alumiinista, koboltista ja erityisesti sinkistä, ennenkaikkea näiden metallien vaikealiukoiset suolat, kuten fosfaatit, pyrofosfaatit ja polyfosfaatit sekä hydroksidit, lisäksi alkalimetallipolyfosfaatit, esim. "Calgon N", "Calgon 322","Calgon 188" tai "Polyron B 12". Orgaanisia aineita, jotka pidentävät vaikutusta, ovat esimerkiksi ei-antigeeniset liiva-telajit, esim. polyoksiliivate, polyvinyylipyrrolidoni ja karboksi-metyyliselluloosa, lisäksi algiinihapon sulfonihappo- tai fosfori- 4 68246 happoesterit, dekstraani, polyfenolit ja polyalkoholit, ennenkaikkea polyfloretiinifosfaatti ja fytiinihappo, sekä emäksisten ja ennenkaikkea happamien aminohappojen polymeraatit ja kopolymeraatit, esim. protamiini- tai polyglutamiinihappo.

Mikäli toisin ei ole mainittu, tarkoittaa "alempi" silloin kun sitä on käytetty orgaanisen tähteen tai yhdisteen yhteydessä enintään 7, mieluimmin kuitenkin enintään 4 hiiliatomia sisältävää tähdettä tai yhdistettä.

Uusilla keksinnön mukaisesti saatavilla syklopeptideillä on fysiologinen vaikutus, joka luonteeltaan ja intensiteetiltään on ekvivalentti somatostatiinin vaikutuksen kanssa. Niitä voidaan näinollen käyttää edullisesti vastaaviin terapeuttisiin indikaatioihin, esim. toimintahäiriöiden hoitoon, joissa kasvuhormonin tai insuliinin ja gluka-konin eritys on normaalia suurempi, kuten akromegaliassa tai nuoruusiän sokeritaudissa.

Somatostatiini, joka on syklinen tetradekapeptidi, jonka kaava on i-1

H-Ala-Gly-Cys-Lys-Asn-Phe-Phe-Tro-Lys-Thr-Phe-Thr-Ser-Cys-OH

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 (Science 179, 77 (1973)) estää tunnetusti kasvuhormonin (somatotro-piini) hypofyysi-ohjatun erityksen. Lisäksi se estää haiman sisä-eritysaktiviteetin, kuten insuliinin ja glukagonin erityksen.

Näitä arvokkaita ominaisuuksia ei kuitenkaan voida käyttää täysin hyväksi itsensä somatostatiinin kohdalla, koska tämän yhdisteen monimutkainen kemiallinen rakenne estää sen teknisen syntetisoinnin. Aminohappojen suuren lukumäärän ohella haittaa myös kastiinin läsnäolo erityisesti; rikkipitoisuutensa vuoksi tämä aminohappo estää erityisen edullisten hyd-rogenolyyttisesti lohkaistavissa olevien suojaryhmien käytön. Lisäksi on puolella somatostatiinin aminohapoista (7/14:sta) muita funktionaalisia ryhmiä sivuketjussa; nämä ryhmät tarvitsevat toisaalta erityisen väliaikaisen suojan, toisaalta ne lisäävät huomattavasti rasemoitumisvaaraa ja hankaloittavat näinollen vieläkin enemmän synteesin olosuhteita.

Yllättävästi on nyt todettu, että somatostatiinin molekyylissä useat näistä substituoiduista aminohapoista, erityisesti myös kystiini, voidaan jättää pois tai korvata yksinkertaisilla, optisesti inaktiivisilla aminohapoilla, jolloin fysiologinen aktiviteetti 68246 5 pysyy ennallaan.

SE-patenttijulkaisusta 419 440 tunnetaan somatostatiini-analogi^ syk-lopeptidejä, joilla on täysi lukumäärä somatostatlinin aminohappotähteitä (so. 12 renkassa ja 2 eksosyklistä). SE-patenttijulkaisussa 409 703 (vastaa DE-OS 26 56 849) esitetään somatostatiinianalogeja, joissa on 11 rengasjäsentä, so. sellaisia, joista puuttuu kysteiinitähde. Keksinnön mukaisesti saatavissa yhdisteissä on sen sijaan korkeintaan 9 (ja vähintään 6) aminohappotähdettä renkaassa; on sen vuoksi hyvin yllättävää, että keksinnön mukaiset yhdisteet, huolimatta niiden huomattavasti yksinkertaisemmasta rakenteesta, ovat yhdenveroisia luonnollisen somatosta-tiinin kanssa.

Somatostatiini-aktiivisten aineiden syntetisoimiseksi esitetyn keksinnön mukaisen menetelmän tekninen etu ilmenee selvästi siitä, että somatostatlinin synteesiin tarvitaan välttämättömästi 13 optisesti aktiivista aminohappoa (joista seitsemässä on edelleen suojattu funktionaalinen ryhmä) rakenneosiksi, kun taas keksinnön mukaisesti saatavien yhdisteiden ollessa kysymyksessä selvitään enintään seitsemällä optisesti aktiivisella aminohapolla (joista vain kahdessa on edelleen suojattu funktionaalinen ryhmä).

Keksinnön mukaisesti saatavat yhdisteet voidaan valmistaa sinänsä tunnetuilla menetelmillä, erityisesti niitä saadaan siten, että yhdisteestä, jonka kaava on ^-R-Phe-Phe-trp-Lys (A) -Thr (B) -Phe (W) -X-Y -I (II) jossa R, W, X, Y ja trp tarkoittavat samaa kuin edellä, A tarkoittaa ε-aminosuojaryhmää tai vetyä ja B hydroksyylisuojaryhmää tai vetyä, jolloin vain toinen symboleista A ja B voi tarkoittaa vetyä, lohkaistaan suojaryhmä(t).

e-aminosuojaryhminä voidaan käyttää kaikkia peptidikemiassa tavallisia aminosuojaryhmiä, joita on yhteenvetona kuvattu eri hakuteoksissa, esim. Houben-Weyl: Methoden der organischen Chemie; 4. painos, nide 15/1, E. WUnsch (julkaisija): Synthese von Peptiden (Georg Thieme Verlag, Stuttgart; 1974). Edullisia ovat asidolyyt-tisesti lohkaistavissa olevat ryhmät, kuten ensisijassa tert.-butok-sikarbonyyliryhmä ja analogiset ryhmät, esim. tert.-amyylioksikarbo-nyyli-, isopropyylioksikarbonyyli-, di-isopropyyli-metoksikarbonyy-li-, allyylioksikarbonyyli-, syklopentyylioksikarbonyyli-, syklo-heksyylioksikarbonyyli-,.d-isobornyylioksikarbonyyli- ja adamantyy-lioksikarbonyyliryhmä, sekä myös aralkyylityyppiset ryhmät, kuten bentshydryyli ja trifenyylimetyyli (trityyli) tai tietyt 2-(p-bife-nylyyli)-2-propyylioksikarbonyyli-tyypin aralkoksikarbonyyliryhmät, joita on kuvattu sveitsiläisessä patenttijulkaisussa 509 266.

Lisäksi voidaan käyttää myös pelkistävästi tai emäksisesti lohkaistavissa olevia amino-suojaryhmiä, esim. erityisesti bentsyyli-oksikarbonyyliryhmää tai bentsyylioksikarbonyyliryhmiä, jotka aromaattisessa osassaan ovat substituoituja halogeeniatomeilla, nitro-ryhmillä, alempialkoksiryhmillä ja/tai alempialkyylitähteillä, kuten p-kloori- ja p-bromibentsyylioksikarbonyyli-, p-nitrobentsyylioksi-karbonyyli-, p-metoksibentsyylioksikarbonyyli-, p-tolyylioksikarbo-nyyliryhmä tai myös isonikotinyylioksikarbonyyliryhmää, lisäksi myös 68246 6 asyyliryhmiä, kuten p-toluolisulfonyyliä, bentseenisulfenyyliä, o-nitrobentseenisulfenyyliä vast, myös formyyliä, trifluoriasetyyliä tai ftaloyyliä.

Erityisen edullinen ε-aminosuojaryhmä on etoksikarbonyyliryh-mä, joka β-asemassa sisältää kolmella hiilivetytähteellä substituoi-dun silyyliryhmän, kuten trifenyylisilyyli-, diraetyyli-butyyli-si-lyyli- tai ennenkaikkea trimetyylisilyyliryhmän. Tällainen 3-(tri-hydrokarbyylisilyyli)-etoksikarbonyyliryhmä, kuten β-(trialempialkyy-lisilyyli)-etoksikarbonyyli-, esim. erityisesti β-(trimetyylisilyy-li)-etoksikarbonyyliryhmä, muodostaa suojattavan ε-aminoryhmän kanssa vastaavan β-trihydrokabyylisilyyli-etoksikarbonyyliaminoryhmän (esim. β-trimetyylisilyylietoksikarbonyyliaminoryhmän), joka kestää happamen hydrolyysin ja hydrogenolyysin olosuhteita, mutta joka voidaan lohkaista aivan spesifisissä, erittäin lievissä olosuhteissa fluoridi-ionien avulla. Tässä suhteessa se käyttäytyy vastaavalla tavalla kuin seuraavassa karboksyyli-suojaryhmäksi kuvattu β-silyy-lietyyliesteriryhmä. (Tämä yhtäläisyys on otettava huomioon synteesissä erikoisesti: jossakin yksittäistapauksessa estää yhden tällaisen suojaryhmän käyttö jonkin toisen suojaryhmän samanaikaisen käytön) . Muita yksityiskohtia on mainittu seuraavassa karboksyyliryhmän suojauksen yhteydessä β-silyylietyyliesterillä.

Hydroksyyli-suojaryhmänä voidaan käyttää kaikkia tähän tarkoitukseen peptidikemiassa käytettyjä ryhmiä, vrt. edellämainittuun teokseen (Houben-Weyl). Edullisia ovat asidolyyttisesti lohkaistavat ryhmät, kuten 2-tetrahydropyranyyli ja aivan erityisesti tert.-butyyli, sekä myös tert.-butoksikarbonyyli. Lisäksi voidaan käyttää myös pelkistävästi tai emäksisestä lohkaistavissa olevia hydroksyyli-suo jaryhmiä, esim. bentsyyli- ja bentsyylioksikarbonyvliryhmiä, jotka aromaattisessa osassa voivat olla substituoituja halogeenilla, nitrolla ja/tai alempialkoksilla, vast, alempialkanoyylitähteitä, kuten asetyyliä tai aroyylitähteitä, kuten bentsoyyliä.

Suojaryhmät A ja B valitaan mieluimmin siten, että ne ovat lohkaistavissa samoissa olosuhteissa; erityisen edullisia ovat tällöin jo edellämainitut asidolyyttisesti lohkaistavissa olevat ryhmät. Molempien suojaryhmien lohkaisu tapahtuu tällöin edullisesti yhdessä ainoassa työvaiheessa; voidaan kuitenkin käyttää myös erityyppisiä ryhmiä ja lohkaista nämä yksitellen.

Suojaryhmien lohkaisu tapahtuu yleisesti tunnetulla tavalla; hapan hydrolyysi (atsidolyysi) suoritetaan esim. trifluorietikka- 68246 7 hapolla, suolahapolla tai fluorivedyllä, happoherkkien suojaryhraien ollessa kysymyksessä myös jollakin alempialifaattisella karbonihapol-la, kuten muurahaishapolla ja/tai etikkahapolla, käyttämällä mukana vettä ja mahdollisesti jotakin polyhalogenoitua alempialkanolia tai alempialkanonia, kuten 1,1,1,3,3,3-heksafluoripropan-2-olia tai hek-safluoriasetonia. Pelkistävästi lohkaistavissa olevat ryhmät, erityisesti sellaiset, jotka sisältävät bentsyylitähteitä, lohkaistaan mieluimmin hydrogenolyyttisesti, esim. hydraamalla palladium-katalyysillä. Isonikotinyylioksikarbonyyliryhmä lohkaistaan mieluimmin edullisesti sinkki-pelkistyksellä.

Keksinnön mukaiset lopputuotteet saadaan aina riippuen eris-tämistavasta, esim. emäksenä tai happoadditiosuoloina; nämä voidaan jälkeenpäin sinänsä tunnetulla tavalla muuttaa toisikseen.

Myös edellämainittujen kompleksien muodostus tapahtuu tunnetuilla tai ekvivalenttimenetelmillä.

Kompleksit epäorgaanisten aineiden kanssa muodostetaan kuten vaikealiukoisten metalli-, esim. alumiini- tai sinkkiyhdisteiden kanssa, valmistetaan edullisesti vastaavalla tavalla kuin ACTH:lle on tunnettua, esim. reaktiolla vastaavan metallin liukoisen suolan, esim. sinkkikloridin tai sinkkisulfaatin kanssa ja saostamalla al-kalimetallifosfaatilla ja/tai -hydroksidilla. Kompleksit orgaanisten yhdisteiden, kuten polyoksiliivatteiden, karboksimetyylisellu-loosan, polyvinyylipyrrolidonin, polyfloretiinifosfaatin, polyglu-tamiinihapon jne. kanssa valmistetaan sekoittamalla nämä aineet peptidin kanssa vesiliuoksessa. Samalla tavalla voidaan valmistaa myös liukenemattomia yhdisteitä alkalimetallipolyfosfaattien kanssa.

Edellä luonnehditut, kaavan II mukaiset yhdisteet ovat uusia ja ne ovat keksinnön mukaisen vaihtoehtomenetelmän välituotteita, jossa menetelmässä syklisoidaan vastaava lineaarinen peptidi, jonka kaava on H - (II') - C (III) jossa II' tarkoittaa kaavaa II vastaavaa tähdettä, jossa amidisidos peptidirenkaan kahden mielivaltaisen vierekkäisen aminohappotähteen välillä on katkaistu, ja C vapaata hydroksyyliryhmää, aktivointiryhmällä muunnelta hydroksyyliryhmää tai hydratsinoryhmää -NH-Nl·^, ja saatu kaavan II mukainen, edellä selitetyn ensimmäisen menetelmävaihtoehdon mukainen välituote työstetään edelleen.

Kaavan III mukaisista lineaarisista peptideistä pidetään edullisina peptidejä, joissa vähintään toinen tähteistä X ja Y tähteessä (il1) muodostaa pääteaminohapon. Nämä edulliset lähtöaineet vastaa- 8 68246 vat kaavoja H-X-Y-R-Phe-Phe-trp-Lys(A)-Thr(B)-Phe-C (lila) H-Y-R-Phe-Phe-trp-Lys(A)-Thr(B)-Phe-X-C (Illb) ja erityisesti H-R-Phe-Phe-trp-Lys(A)-Thr(B)-Phe-X-Y-C (IIIc) joissa A, B, C, trp, R, X ja Y tarkoittavat samaa kuin edellä. Aivan erityisen edullisia ovat kaavojen IIIa-c mukaiset yhdisteet, joissa R tarkoittaa amino-suojaryhmää, ennenkaikkea asidolyyttisesti lohkaistavissa olevaa amino-suojaryhmää, B tarkoittaa hydroksyyli-suo-jaryhmää, ennenkaikkea asidolyyttisesti lohkaistavissa olevaa hyd-roksyyli-suojaryhmää ja C vapaata hydroksyyliryhmää.

Symbolilla C merkitty funktionaalinen ryhmä täydentää C-ter-minaalisen aminohappotähteen karbonyyliryhmän ja muodostaa yhdessä tämän kanssa vapaan karboksyyliryhmän, aktivoidun esteriryhmän, vastaavasti karbatsoyyliryhmän.

Aktivointiryhmä, jolla hydroksyyliryhmä on muunnettu, on erityisesti N-hydroksisukkiini-imidin, 1-hydroksibentsotriatsolin, N,N'-disykloheksyyli-isovirtsa-aineen, 2,4,5-trikloorifenolin, 2-nitrofenolin, 4-nitrofenolin, pentakloorifenolin tai pentafluori-fenolin kanssa aktivoidun esterin muoctetava, mutta voi myös olla jokin toinen peptidikemiasta tunnettu tämän tyyppinen aktivointi-ryhmä, vrt. Houben-Weyl, nide 15/11.

Kaavan III mukaisten lineaaristen peptidien keksinnönmukainen syklisointi tapahtuu sinänsä tunnetulla tavalla tavanomaisilla, ami-disidoksen muodostamiseen käytetyillä kytkentämenetelmillä, jolloin peptidisiä lähtöaineita kuitenkin käytetään erittäin pieniä pitoisuuksia ja kytkentäreaktion siirtämiseksi intramolekulaarista syk-lisointia kohti poispäin intermolekulaarisesta polykondensaatiosta.

Lineaaristen peptidien edulliset käyttöpitoisuudet ovat noin -5 -3 -4 1.10 - 1.10 mol/1, mieluimmin noin 1.10 mol/1, joka vastaa noin 0,01-1,0 %:n, mieluimmin 0,1 %:n paino/tilavuus-konsentraatiota. Reaktioseosta voidaan alusta alkaen laimentaa vastaavasti, tai myös lisäämällä reaktioseokseen hitaasti lähtöainetta tipoittain ja mahdollisesti muita reagensseja jatkuvasti.

Syklisointi tapahtuu edullisesti käsittelemällä jossain edellämainituista alkupitoisuuksista a) kaavan III mukaista lähtöainetta, jossa C tarkoittaa vapaata hydroksyyliryhmää ja jossa sekä ly-siinitähteen e-aminoryhmä että treoniinitähteen hydroksyyliryhmä ovat suojatut, karbodi-imidillä, mahdollisesti käyttämällä mukana aktiiviesteriä muodostavaa komponenttia, tai b) kaavan III mukaista li 68246 9 lähtöainetta, jossa C tarkoittaa aktivoiduksi esteriksi muutettavissa olevaa hydroksyyliryhmää, ja pääteaminoryhmä on protonoidussa muodossa, jolloin ainakin lysiinitähteen e-aminoryhmä on suojattu, orgaanisella emäksellä, tai c) kaavan III mukaista lähtöainetta, jossa C tarkoittaa ryhmää -NHNH2 ja ainakin lysiinitähteen e-aminoryhmä on suojattu, ensin happamissa olosuhteissa typpihapokkeella tai sen alempialkyyliesterillä ja sen jälkeen syklisoimalla jossakin edellämainitussa alhaisessa pitoisuudessa orgaanisen emäksen ylimäärällä.

Syklisointi suoritetaan sopivissa liuottimissa; esimerkkeinä voidaan mainita dioksaani, tetrahydrofuraani, asetonitriili, pyri-diini, dimetyyliformamidi, dimetyyliasetamidi, dimetyylisulfoksidi, N-metyylipyrrolidoni, heksametyylifosforitriamidi sekä myös kloroformi ja metyleenikloridi ja niiden seokset.

Menetelmämuunnoksessa a) suoritetaan syklisointi karbodi-imi-dillä, mieluimmin N,N'-disykloheksyylikarbodi-—imidillä, jota edullisesti käytetään ylimäärin; voidaan olettaa että kun kyseessä on kaavan III mukainen lähtöaine, jossa on vapaa karboksyyliryhraä, muodostuu ensin disykloheksyyli-isovirtsa-aineen (vast, analogisen iso-virtsa-aineen) aktivoitu esteri ja tämä in situ muodostunut aktiivinen esteri reagoi heti edelleen. Aktiivisen esterin muodostuminen välituotteena perustuu epäilemättä aktiiviesteriä muodostavan komponentin lisäämiseen apureagenssiksi; näinä voivat toimia peptidi-kemiassa tavanomaiset aktiiviestereitä muodostavat komponentit, kuten erityisesti 2,4,5-trikloorifenoli, 2- tai 4-nitrofenoli, penta-kloori- ja pentafluorifenoli, mutta ennenkaikkea N-hydroksiyhdisteet, joista voidaan erityisen edullisina mainita N-hydroksisukkiini-imidi, N-hydroksipiperidiini ja ennenkaikkea 1-hydroksibentsotriatsoli.

Tässä muunnoksessa on työskentelylämpötila yleensä 0-70°C, mieluimmin 35-55°C.

Muunnoksessa b), jossa käytetään valmiita aktiiviestereitä, erityisesti edellämainittuja, tapahtuu syklisointi spontaanisti kun pääteaminoryhmästä poistetaan protoni orgaanisen emäksen avulla. Käytetyt emäkset ovat mieluimmin kvaternäärisiä tai ennenkaikkea tertiäärisiä amiineja, esim. trietyyliamiini tai N-etyylimorfOliini. Työskennellään edullisesti 10-30°C:n, erityisesti huoneen lämpötilassa .

Menetelmämuunnoksessa c) voi ensimmäinen vaihe, ts. happoatsi-din muodostus typpihapokkeella tai sen esterillä käsittelemällä tapahtua edullisesti käyttämällä oleellisesti korkeampaa lähtöaine- ίο 68246 pitoisuutta kuin jälkeenpäin seuraavassa syklisoinnissa. Tarkoituksenmukaisesti työskennellään tällöin käyttäen noin ekvivalenttia määrää alempialkyylinitriittiä, kuten etyyli-, isoamyyli- ja erityisesti tert.-butyyli-nitriittiä, suolahappamessa väliaineessa noin -30 - -5°C:n, mieluimmin noin -20°C:n lämpötilassa; voidaan myös käyttää pientä nitriittiylimäärää. Senjälkeen tehdään muodostuneen atsidin liuos emäksiseksi välttämättömän laimennuksen jälkeen noin 0-35°C:n lämpötilassa käyttäen ylimäärin esim. jotakin edellä mainittua orgaanista emästä ja syklisoidaan sen jälkeen spontaanisti, kuten edellä muunnoksessa b).

Kaavan III mukaiset lineaariset peptidit sekä näiden synteesiin tarvittavat välituotteet ovat uusia ja hyvin käyttökelpoisia myös muiden somatostatiini-analogien, esim. pidemmän aminohapposarjän sisältävien analogien syntetisoimiseksi. Ne saadaan sinänsä tunnetuilla menetelmillä, kondensoimalla niiden rakenteeseen tarvittavat aminohapot tai pienemmät peptidiyksiköt muodostaen CONH-sidoksia mielivaltaisessa aikajärjestyksessä keskenään, jolloin reaktioon osaaottamattomat funktionaaliset ryhmät voivat olla väliaikaisesti suojattuja.

Valmistettaessa näitä lähtöaineita, kuten myös kaikkia muita tarvittavia välituotteita tulevat α-amino- ja karboksyylipääteryh-mien suojaryhminä kysymykseen erityisesti pitkäketjuisten peptidien synteesissä tavanomaiset suojaryhmät, jotka voidaan lohkaista, esim. solvolyysillä tai pelkistyksellä, helposti ja selektiivisesti.

α-amino-suojaryhminä mainittakoon esimerkiksi: mahdollisesti esim. halogeenilla, nitrolla, alempialkyylillä tai alempialkoksil-la substituoidut di- tai triaryylialempialkyyliryhmät, kuten dife-nyylimetyyli- tai trifenyylimetyyliryhmät, esim. bentshydryyli, tri-tyyli- di-(p-metoksi)-bentshydryyli tai ennenkaikkea hiilihaposta johdettavat hydrogenolyyttisesti lohkaistavissa olevat ryhmät, kuten mahdollisesti aromaattisessa tähteessä halogeeniatomeilla, nit-roryhmillä, alempialkyyli- tai alempialkoksiryhmillä substituoidut bentsyylioksikarbonyyliryhmät, esim. bentsyylioksikarbonyyli (ts. karbobentsoksi), p-bromi- tai p-klooribentsyylioksikarbonyyli, p-nitrobentsyylioksikarbonyyli, p-metoksibentsyylioksikarbonyyli; lisäksi myös 2-(p-bifenylyyli)-2-propyylioksikarbonyyli ja vastaavat sveitsiläisessä patentissa 509 266 kuvatut aryyliokslkarbonyyliryh-mät. Tällöin on otettava huomioon että α-amino-suojaryhmän on olta 68246 11 va lohkaistavissa selektiivisesti samalla kun mahdollisesti läsnäoleva lysiinitähteen ε-amino-suojaryhmä jää ennalleen. On yleensä myös edullista, että tämän lohkaisun aikana myös mahdollisesti läsnäoleva karboksyyli- ja hydroksyylisuojaryhmä jää ennalleen.

Karboksyyliryhmät suojataan mieluimmin esimerkiksi hydratsidi-muodostuksella tai esteröinnillä. Esteröintiin sopivia ovat esim. alemmat, mahdollisesti substituoidut alkanolit, kuten metanoli, etanoli, syaanimetyylialkoholi, 2,2,2-trikloorietanoli, bentsoyylime-tyylialkoholi tai erityisesti tert.-butyylialkoholi, mutta myös mahdollisesti substituoitu bentsyylialkoholi. Erityisen edullinen ryhmä substituoituja alkanoleja ovat etyylialkoholit, jotka β-asemassa sisältävät trisubstituoidun silyyliryhmän, kuten trifenyylisilyyli-, dimetyyli-butyyli-silyyli- tai ennenkaikkea trimetyylisilyyliryhmän. Kuten esim. belgialaisessa patentissa 851 756 on kuvattu, sopivat nämä alkoholit erityisen hyvin karboksyyliryhmien suojaamiseksi, koska vaikka vastaavilla β-silyylietyyliestereillä, esim. 8-(tri-metyylisilyyli)-etyyliesterillä, onkin tavallisten alkyyliestereiden stabiliteetti, ne ovat kuitenkin lohkaistavissa lievissä olosuhteissa fluoridi-ioneilla samalla kun kaikki muut suojaryhmät pysyvät muuttumattomina.

Aktivoitujen estereiden muodostamiseksi, kuten esim. kaavan III mukaisissa yhdisteissä, sopivat esim. mahdollisesti elektroneja puoleensa vetävillä substituenteilla substituoidut fenolit ja tio-fenolit, kuten fenoli, tiofenoli, tiokresoli, p-nitrotiofenoii, 2,4,5- ja 2,4,6-trikloorifenoli, pentakloorifenoli, p- ja p-nitro-fenoli, 2,4-dinitrofenoli, p-syanofenoli, lisäksi esim. N-hydroksi-sukkiini-imidi, N-hydroksiftalimidi ja N-hydroksipiperidiini.

Treoniinitähteen hydroksyyliryhmä voidaan suojata esteröimäl-lä tai eetteröimällä, kuten jo edellä mainittiin, tai se voi myös pysyä vapaana.

Nämä suojaryhmät voidaan lohkaista sinänsä tunnetulla tavalla. Niinpä bentsyylioksikarbonyyliryhmä voidaan lohkaista hydrogenolyy-sillä, N-trityyliryhmä mineraalihapoilla, kuten halogeenivetyhapoil-la, esim. fluorivedyllä tai mieluimmin kloorivedyllä tai orgaanisella hapolla, kuten muurahaishapolla, etikkahapolla, kloorietikkaha-polla tai trifluorietikkahapolla, vesipitoisen tai absoluuttisen tri-fluorietanolin toimiessa liuottimena (vrt. DE OS 2 346 147) tai vesipitoisella etikkahapolla, tert.-butyylioksikarbonyyliryhmä voidaan lohkaista trifluorietikkahapolla tai suolahapolla, 2-(p-bife- nylyyli)-isoprcpyylioksikarbonyyliryhmä vesipitoisella etikkahapolla y ' 12 68246 tai esim. jääetikan, muurahaishapon (82,8 %:nen) ja veden (7:1:2) seoksella tai DT OS 2 346 147 menetelmän mukaan.

8-silyylietyyliesteriryhmät lohkaistaan edullisesti fluoridi-ioneja luovuttavilla reagensseilla, esim. kvaternääristen orgaanisten emästen fluorideilla, kuten tetraetyyliammoniumfluoridilla. Ne voidaan kuitenkin lohkaista samoin kuin tavalliset alkyyliesterit, alkalisella hydrolyysillä, esim. alkalimetallihydroksideilla, -karbonaateilla tai -bikarbonaateilla, tai muuttaa hydratsinolyysillä, esim. hydratsiinihydraatilla vastaaviksi karbatsoyyliryhmiksi.

Tert.-butyyliestereiden lohkaisemiseksi käytetään mieluimmin asido-lyysiä, bentsyyliestereille sitten hydrogenolyysiä.

Kaavan III mukaisten lineaaristen peptidien valmistamiseksi suoritettava aminohappo ja/tai peptidiyksikköjen kondensaatio tapahtuu sinänsä tunnetulla tavalla, kytkemällä mieluimmin yksi aminohappo tai peptidi, jossa on suojattu α-aminoryhmä ja mahdollisesti aktivoitu päätekarboksyyliryhmä (= aktiivi komponentti) aminohappoon tai peptidiin, jossa on vapaa α-aminoryhmä ja vapaa tai suojattu, esim. esteröity päätekarboksyyliryhmä (= passiivinen komponentti) , vapauttamalla muodostetussa tuotteessa terminaalinen aminoryh-mä ja saattamalla tämä peptidi, joka sisältää vapaan a-aminoryhmän ja mahdollisesti suojatun päätekarboksyvliryhmän, reagoimaan edelleen jonkun toisen aktiivisen komponentin, ts. aminohapon tai peptidin kanssa, jossa on aktiivinen päätekarboksyyliryhmä ja vapaa a-aminoryhmä jne. Karboksyyliryhmä voidaan aktivoida esim. muuttamalla se happoatsidiksi, -anhydridiksi, -imidatsolidiksi, -isoksatso-lidiksi tai aktivoiduksi esteriksi, kuten joksikin edellämainituk-si, tai reaktiolla karbodi-imidin, kuten N,N'-disykloheksyylikarbo-di-imidin kanssa, mahdollisesti lisäten N-hydroksisukkiini-imidiä tai substituoimatonta tai esim. halogeenilla, metyylillä tai nietoksilla substituoitua 1-hydroksibentsotriatsolia tai 4-hydroksi-bent-so-l,2,3-triatsiini-3-oksidia (mm. vrt. DT 1 917 690, DT 1 937 656, DT 2 202 613) tai N,N1-karbonyylidi-imidatsolilla. Käyttökelpoi-simpana kytkentämenetelmänä mainittakoon karbodi-imidimenetelmä, lisäksi myös atsidimenetelmä, aktivoitujen estereiden menetelmä ja anhydridimenetelmä sekä Merrifield-menetelmä ja N-karboksianhydri-dien tai N-tiokarboksianhydridien menetelmä.

Kaavan II mukaisten lineaaristen peptidien eräässä erityisen edullisessa valmistusmenetelmässä käytetään kytkentämenetelmänä karbodi-imidimenetelmää N,N'-disykloheksyylikarbodi-imidillä käyt- 11 68246 13 tämällä mukana 1-hydroksibentsotriatsolia. Päätekarboksyyliryhmä suojataan tällöin 8-(trimetyyli-silyyli)-etyyliesterin muotoon, aktiivisen komponentin α-aminoryhmä suojataan bentsyylioksikarbonyyli-ryhmällä, joka kunkin kytkentävaiheen jälkeen lohkaistaan hydroge-nolyysillä. Lysiinitähteen ε-aminoryhmän suojaksi käytetään asyloin-nissa tert.-butoksikarbonyyliryhraää ja treoniinitähteen hydroksyyli-ryhmälle eetteröinnissä tert.-butyyliryhmää. Tällöin molemmat suo-jaryhmät voidaan haluttaessa lohkaista viimeisinä, yhdessä vaiheessa happamella hydrolyysillä, esim. trifluorietikkahapolla, suolahapolla tai fluorivetyhapolla.

Aina työskentelytavasta riippuen saadaan yhdisteen emästen tai niiden suolojen muodossa. Suoloista voidaan sinänsä tunnetulla tavalla saada emäkset. Viimemainitusta voidaan puolestaan reaktiolla happojen kanssa, esim. sellaisten happojen kanssa, jotka muodostavat edellämainittuja suoloja, valmistaa terapeuttisesti käyttökelpoisia happoadditiosuoloja.

Koska uudet yhdisteet vapaassa muodossa ja suolojensa muodossa ovat hyvin samankaltaisia, on edelläolevassa ja seuraavassa vapailla yhdisteillä tai niiden suoloilla samanaikaisesti ja tarkoituksenmukaisesti ymmärrettävä mahdollisesti tarkoitettavan myös vastaavia suoloja, vast, vapaita yhdisteitä.

Keksintö koskee myös niitä menetelmän suoritusmuotoja, joissa lähtöaine käytetään suolan muodossa.

Keksinnön mukaisessa menetelmässä käytetään mieluimmin sellaisia lähtöaineita, joista saadaan alussa erityisen arvokkaiksi kuvattuja yhdisteitä.

Tämän keksinnön mukaisella menetelmällä saatuja tuotteita voidaan käyttää farmaseuttisina valmisteina, jotka sisältävät kaavan I mukaisia yhdisteitä tai sen farmaseuttisesti käyttökelpoisia suoloja. Näitä farmaseuttisia valmisteita voidaan käyttää erityisesti edeilämainittuihin indikaatioihin, antamalla niitä intraperitoneaalisesti, kuten suoneen, lihakseen tai subkutaanises-ti tai myös intranasaalisesti. Tarvittava annos riippuu erityisesti hoidettavasta sairaudesta, sen vaikeusasteesta ja hoidon kestoajasta. Yksittäisannosten lukumäärä ja määrä sekä annostuskaavio voidaan parhaiten määrittää tutkimalla erikseen kukin potilas yksilöllisellä tutkimuksella. Menetelmä näiden tekijöiden määrittämi 68246 14 seksi on asiantuntijalle tunnettu. Tavallisesti kuitenkin annettaessa ruiskeena terapeuttisesti tehokas määrä tällaista yhdistettä on annosalueella noin 0,001-0,2 mg/kg kehon painoa. Edullinen alue on noin 0,0015-0,15 mg/kg kehon painoa ja annostus tapahtuu infuusiol-la suoneen tai ruiskuttamalla subkutaanisesti. Näinollen sisältävät farmaseuttiset valmisteet annostusta varten yksittäisannosmuodossa tapahtuvaan parenteraaliannostukseen riippuen käyttötavasta annosta kohti noin 0,08-15 mg keksinnön mukaista yhdistettä. Tehoaineen ohella ne sisältävät yleensä jotakin puskuria, esim. fosfaattipuskuria, jonka on pidettävä pH-arvo välillä noin 3,5-7, ja lisäksi nat-riumkloridia, manniittia tai sorbiittia isotonian säätämiseksi. Ne voivat olla pakkaskuivatussa tai liukoisessa muodossa, jolloin liuokset edullisesti voivat sisältää antibakteraalisesti tehokasta säilöntäainetta, esim. 0,2-0,3 % 4-hydroksi-bentsoehappo-metyyliesteriä tai -etyyliesteriä. Mikäli näissä valmisteissa tehoaineen tulisi olla pidennetyn vaikutuskeston omaavan kompleksin muodossa, voidaan nämä muodostaa suoraan lisäämällä komplekseja muodostavia komponentteja ruiskutettavaan liuokseen, joka on valmistettu esim. edellä mainituilla toimenpiteillä. Lisäaineiksi sopivat esim. 0,1-1,0 paino-% sinkki(II)-suolaa (esim. sulfaatti) yhdessä 0,5-5,0 paino-%:n kanssa protamiinia (esim. sulfaattina) suhteessa injektioliuoksen kokonaistilavuuteen. Tämä valmistetaan liuoksena, jonka pH on 3,5-6,5 tai suspensiona jonka pH on noin 7,5-8,0.

Intranasaalista annostusta varten tarkoitettu valmiste voi olla vesiliuoksena tai geelinä, öljymäisenä liuoksena tai suspensiona tai vaikka rasvapitoisena salvana. Vesiliuoksen muodossa oleva valmiste saadaan esim. liuottamalla kaavan I mukaista tehoainetta tai sen terapeuttisesti käyttökelpoista happoadditiosuolaa vesipitoiseen puskuriliuokseen, jonka pH on enintään noin 7,2 ja lisäämällä isc-toniaa aikaansaavaa ainetta. Vesipitoiseen liuokseen lisätään tarkoituksenmukaisesti polymeeristä tartunta-ainetta, esim. polyvinyy-lipyrrolidonia, ja/tai säilöntäainetta. Yksittäisannos on noin 0,08-15 mg, mieluimmin 0,25-10 mg, joka sisältyy noin 0,05 mlraan liuosta vast. 0,05 g geeliä.

öljymäinen käyttömuoto intranasaalista annostusta varten saadaan esim. suspendoimalla kaavan I mukaista peptidiä tai sen terapeuttisesti käyttökelpoista happoadditiosuolaa öljyyn, mahdollisesti lisäämällä paisunta-aineita, kuten alumiinistearaattia, ja/tai pinta-aktiivisia aineita (tensidejä), joiden HLB-arvo ("hydrophilic-lipophilic-balance") on alle 10, kuten moniarvoisten alkoholien 68246 15 rasvahappomonoestereitä, esim. glyseriinimonostearaattia, sorbitaa-nimonolauraattia, sorbitaanimonostearaattia tai sorbitaanimono-ole-aattia. Rasvapitoinen salva saadaan esim. suspendoimalla keksinnön mukaista tehoainetta sivellettävään rasvaperusmassaan, mahdollisesti lisäten tensidiä, jonka HLB-arvo on alle 10. Emulsiosalva saadaan hiertämällä peptidipitoisen tehoaineen vesiliuos pehmeään, sivellettävään rasvaperusmassaan, samalla lisäten tensidiä, jonka HLB-arvo on alle 10. Kaikki nämä intranasaaliset käyttömuodot voivat sisältää myös säilöntäainetta. Yksittäisannokset sisältävät tehoainetta noin 0,08-15 mg, mieluimmin 0,25-10 mg, joka sisältyy noin 0,05-0,1 g:aan perusmassaa.

Intranasaaliseen annostukseen sopivat lisäksi myös inhalaatio-vast. insuflaatiovalmisteet, kuten insuflaatiokapselit, jotka sisältävät tehoainetta jauheen muodossa, jota voidaan hengittää sisään hengitysilman kanssa tai aerosolit tai sumutteet, jotka sisältävät farmakologisen tehoaineen jauheen muodossa tai liuos- tai suspensio-pisaroiksi jaettuna. Jauhejakoiset valmisteet sisältävät tehoaineen ohella tavanomaisia apuaineita: insuflaatiokapselit sisältävät esim. kiinteitä kantaja-aineita, kuten laktoosia; aerosoli- ja sumute-valmisteet sisältävät esim. nestemäistä ponnekaasua, jonka kiehuma-piste on huoneen lämpötilan alapuolella, sekä haluttaessa muita lisäaineita, kuten nestemäisiä tai kiinteitä ei-ionisia tai anioni-sia tensidejä ja/tai kiinteitä laimennusaineita. Valmisteet, joissa farmakologinen tehoaine on liuoksena, sisältävät tämän ohella sopivaa ponneainetta, lisäksi tarvittaessa vielä jotakin toista liuotinta ja/tai stabilaattoria. Ponnekaasun ohella voidaan käyttää myös paineilmaa, joka tarpeen mukaan kehitetään käyttämällä sopivaa tiivistys- ja paineenpoistolaitetta.

Kaavan I mukaisten uusien yhdisteiden ja niiden terapeuttisesti käyttökelpoisten happoadditiosuolojen tärkein käyttötapa on niiden käyttö farmakologisesti aktiivisina yhdisteinä, erityisesti somatcstatii-nille tavanomaisissa indikaatioissa, mieluimmin farmaseuttisten valmisteiden muodossa. Päivittäinen annos, joka annetaan lämminveriselle, jonka paino on noin 70 kg, on noin 0,1-120 mg.

Seuraavissa esimerkeissä havainnollistetaan keksintöä kuitenkaan sitä mitenkään rajoittamatta. Lämpötilat on annettu Celsius-steina; lyhenteinä esim. aminohappojen, peptidien, suojaryhmien jne. merkitsemiseksi käytetään tavanomaisia, esim. julkaisussa "Synthese von Peptiden" (julkaisija: E. Wiinsch) , nide XV "Methoden der org.

68246 16

Chemie" (Houben-Weyl) (1974; G.Thieme, Stuttgart) yhteenvetona esitettyjä lyhenteitä. Erityisesti käytetään seuraavia lyhenteitä:

Boc - tert.-butoksikarbonyyli

Bpoc - 2-(p-bifenylyyli)-2-propyylioksikarbonyyli But - tert.-butyyli (eetterin muodostavana ryhmänä) DCCI - N,N'-disykloheksyylikarbodi-imidi

Gaba - 4-aminovoihappo-tähde, -NH-(CH2)3-CO- OBzl - bentsyylioksi (esterin muodostavana ryhmänä) ONP - p-nitrofenoksi (esterin muodostavana ryhmänä) ONSu - sukkiini-imido-N-oksi OTmse - 2-(trimetyylisilyyli)-etoksi (esterin muodostavana ryhmänä) SEOC - 2-(trimetyylisilyyli)-etoksikarbonyyli Z - bentsyylioksikarbonyyli(karbobentsoksi) DC - ohutkerroskromatografia

Ohutkerroskromatografiässä käytetään, ellei toisin ole mainittu, absorbenssina piihappogeeliä ja seuraavia systeemejä eluointiaineena: Systeemi 45 : sek.-butanöli-3 %:inen vesipitoinen ammoniakki (7:3) Systeemi 52 : n-butanoli-etikkahappo-vesi (71,5:7,5:21)

Systeemi 101 : n-butanoli-pyridiini-etikkahappo-vesi (38:24:8:30) Systeemi 101B: n-butanoli-pyridiini-25 %:nen vesipitoinen ammoniakki-vesi (40:24:6:30)

Systeemi 112A: n-butanoli-pyridiini-muurahaishappo-vesi (42:24:4:20) Systeemi 157 : kloroformi-metanoli-etikkahappo-vesi (70:42:0,5:10) Systeemi 157A: kloroformi-metanoli-etikkahappo-vesi (90:10:0,5:1) Systeemi 157B: kloroformi-metanoli-etikkahappo-vesi (85:13:0,5:1,5) Systeemi 157C: kloroformi-metanoli-etikkahappo-vesi (75:26:0,1:5) Esimerkki 1: ^-Asn-Phe-Phe- (D-trp) -Lys-Thr-Phe-Gaba 195 mg suojattua oktapeptidiä, jonka kaava on L-Asn-Phe-Phe- (D-trp) -Lys (Boc) -Thr (But) -Phe-Gaba-ί liuotetaan 5°:ssa typpiatmosfäärissä 1,5 mi:aan seosta, jossa on 89 tilavuus-% trifluorietikkahappoa, 10 tilavuus-% vettä ja 1 tilavuus-% tioglykolihappoa, liuos lämmitetään heti 25°:seen ja 90 minuutin kuluttua saostetaan huoneen lämpötilassa typpiatmosfäärissä 15 ml:11a eetteriä. Muodostuva raaka lopputuotteen trifluoriasetaatti kuivataan tyhjössä, liuotetaan 5 ml:aan IN etikkahappoa ja suodatetaan 15 ml:n läpi astaattimuodossa olevaa AG®1-X8 (Rio-Rad) . Eluaatti haihdutetaan tyhjössä ja jäännökselle suoritetaan vastavirtajako sys- 17 68246 teemissä n-butanoli-etikkahappo-vesi (2400:600:3000) 200 vaiheessa. Elementtien 168-183 sisältämät faasit (K = 5,9) kerätään, haihdutetaan tyhjössä ja lyofilisoidaan tert.-butanoli-vedestä (1:1).

Saatu, otsikossa mainittu yhdiste on ohutkerroskrdmatograafi-sesti yhtenäinen kolmessa systeemissä.

DC (Selluloosa, Merck): systeemi 101 : R^ 0,9 111B: Rf 0,9 112A: Rf 0,8

Peptidilähtöaine voidaan valmistaa seuraavalla tavalla:

Vaihe 1.1 H-Phe-OTmse-hydrokloridi

Liuokseen, jossa on 2,50 g Z-Phe-OTmse:a 25 ml:ssa metanolia, lisätään 0,25 g palladiumhiiltä (10 %) ja hydrataan huoneen lämpötilassa ja normaalipaineessa 3 tuntia, jolloin reaktioseoksen pH pidetään arvossa 5,5 lisäämällä IN kloorivedyn metanoliliuosta. Käsitellään edelleen liuottamalla katalysaattori pois ja suodos haihdutetaan tyhjössä. Raakatuotetta voidaan käyttää seuraavassa vaiheessa ilman enempää puhdistamista.

Vaihe 1.2 Z-Thr(But)-Phe-OTmse

Liuokseen, jossa on 10,30 g Z-Thr(But)OH:a 120 ml:ssa vedetöntä tetrahydrofuraania ja 4,20 ml:ssa N-etyylimorfoliinia, lisätään 3 minuutin aikana -15°:ssa liuos, jossa on 4,43 ml kloorimuurahais-happo-isobutyyliesteriä 20 ml:ssa tetrahydrofuraania. 10 minuutin kuluttua -10 - -15°:ssa lisätään -15°:ssa liuos, jossa on 10,05 g H-Phe-OTmse--hydrokloridia (katso vaihetta 1.1) 40 ml:ssa tetrahydrofuraania ja lisätään vielä 4,20 ml:n ero N-etyylimorfoliinia ja reak-tioseosta pidetään kulloinkin 1 tunti -15°:ssa, 0°:ssa ja huoneen lämpötilassa. Käsitellään edelleen suodattamalla saostunut N-etyy-limorfoliini-hydrokloridi pois, suodos haihdutetaan tyhjössä, jäännös liuotetaan etyyliasetaattiin ja pestään kulloinkin kolmasti 1N-sitruunahapolla, lN-natriumvetykarbonaatilla ja vedellä. Orgaaninen faasi kuivataan natriumsulfaatilla, haihdutetaan tyhjössä ja viimeiset liuotinainejäännökset poistetaan suurtyhjössä. Tuote saadaan jäykkäliikkeisenä kellertävänä öljynä, joka on ohutkerroskromatogra-fisesti puhdas.

DC: (kloroformi-metanoli (9:1)) R^ 0,83 (etyyliasetaatti-petrolieetteri (7:3)) R^ 0,77

·; S

68246 18

Vaihe 1.3 H-Thr(But)-Phe-OTmse

Liuokseen, jossa on 8,84 g Z-Thr(But)-Phe-OTmse:a (vaihe 1.2) 325 ml:ssa metanolia, lisätään 880 mg palladium-hiiltä (10 %) ja hydrataan 5 tunnin ajan normaalipaineessa ja huoneen lämpötilassa. Käsitellään edelleen suodattamalla katalysaattori pois ja haihdutetaan tyhjössä. Tuotteen öljymäinen jäännös on.ohutkerroekroraatograafi-sesti puhdas ja käytetään ilman puhdistamista vaiheessa 1.4.

DC: (kloroformi-metanoli (9:1)) Rf 0,62 Vaihe 1.3A

Z-(D-trp)-Lys(Boc)-OH

Liuokseen, jossa on 33,84 g Z-(D-trp)-OH:a ja 17,42 g 8-hyd-roksi-kinoliinia 50 ml:ssa asetonitriiliä, lisätään tipoittain 0-5°: ssa liuos, jossa on 21-87 g DCCT:a 100 ml:ssa asetonitriiliä 45 minuutin aikana. Pidetään vielä 30 minuuttia 5°:ssa, minkä jälkeen saostunut disykloheksyylivirtsa-aine poistetaan suodattamalla ja pesemällä 50 ml :11a asetonitriiliä. Suodokseen lisätään liuos, jossa on 27,09 g H-Lys(Boc)-OH:a 25,9 ml:ssa 4,25N kaliumhydroksidia ja 80 ml:ssa asetonitriiliä ja annetaan seistä 15 tuntia huoneen lämpötilassa. Käsitellään edelleen haihduttamalla reaktioseos tyhjössä, jäännös liuotetaan 1 litraan etyyliasetaattia, pestään kolmesti, kulloinkin 200 ml:11a lN-suolahappoa 0°:ssa ja kolmesti kulloinkin 200 ml:lla vettä, orgaaninen faasi kuivataan natriumsulfaa-tilla ja haihdutetaan tyhjössä. Saatu ruskea öljy liuotetaan 150 ml:aan kloroformia ja samalla voimakkaasti hämmentäen se tiputetaan 1,5 litraan heksaania. Höytyväinen, tahmea sakka suodatetaan pois, pestään 500 ml:11a heksaania ja kuivataan tyhjössä. Puhdistetaan edelleen liuottamalla aine 150 ml:aan hiilitetrakloridi-etyyliase-taattia (6:4 tilavuusosaa) ja kromatografoidaan piihappogeelillä samalla liuotinaineseoksella. Sopivat ohutkerroskromatograafisesti yhtenäiset reaktiot haihdutetaan tyhjössä, jolloin puhdas tuote saadaan vaahtomaisena massana.

DC: (kloroformi-metanoli-vesi (14:6:1)) 0,61

Vaihe 1.4 Z-(D-trp)-Lys(Boc)-Thr(But)-Phe-OTmse

Liuokseen, jossa on 7,24 g raakaa (87 %:ista trituroinnin mukaan) H-Thr(But)-Phe-OTmse:a (vaihe 1.3) ja 8,45 g A-(D-trp)-Lys(Boc)-OH:a (vaihe 1.3A) 100 ml:ssa dimetyyliformamidia, lisätään 5°:ssa 2,28 g:aan N-hydroksi-bentsotriatsolia ja 3,38 g DCCI:a ja reaktio- 68246 19 seosta hämmennetään 1 tunti 5°:ssa edelleen 15 tuntia huoneen lämpötilassa. Käsitellään edelleen suodattamalla saostunut disyklohek-syylivirtsa-aine pois ja haihduttamalla suodos suurtyhjössä. Jäännös kiteytetään kahdesti uudelleen etyyliasetaatti-petrolieetteris-tä ja kuivataan tyhjössä, sul.p. 114-120°.

DC: (kloroformi-etyyliasetaatti (1:1)) 0,23; (toluoli-asetoni (1:1)) R^ 0,70 Vaihe 1.5 H-(D-trp)-Lys(Boc)-Thr(But)-Phe-OTmse

Liuokseen, jossa on 5,00 g Z-(D-trp)-Lys(Boc)-Thr(But)-Phe-OTmse^ (vaihe 1.4) 300 ml:ssa metanolia, lisätään 0,50 g palladium-hiiltä (10 %), minkä jälkeen hydrataan huoneen lämpötilassa ja normaalipaineessa 5 tuntia. Käsitellään edelleen suodattamalla katalysaattori pois ja saattamalla suodoksen haihduttamisen jälkeen jäljelle jäävä jäännös reagoimaan edelleen vaiheessa 1.6.

Vaihe 1.5Λ

Z-Asn-Phe-Phe-OH

Suspensioon, jossa on 2,95 g H-Phe-Phe-OH:a 30 ml:ssa dimetyy-liformamidia ja 6 ml:ssa vettä, lisätään 2,36 ml 4N-natriumhydrok-sidia ja sen jälkeen 5,29 g Z-Asn-ONP:a ja hämmennetään huolellisesti 20 tuntia 35°:ssa. Käsitellään edelleen lisäämällä reaktio-liuokseen 5°:ssa 2,36 ml 4N-suolahappoa, heikosti samea liuos suodatetaan ja suodos haihdutetaan suurtyhjössä noin 15 ml:n tilavuuteen. Lisäämällä 150 ml vettä saostetaan hyytelömäinen raakatuote, suodatetaan ja kuivataan suurtyhjössä fosforipentoksidilla. Tämä aine saostetaan vielä kahdesti, kulloinkin 20 ml:sta metanolia ja 50 ml:sta eetteriä, suodatetaan ja kuivataan tyhjössä. Raseemiko-keen mukaan (täyshydrolyysi, aminohappojohdannaisten muodostaminen ja kaasukromatografinen erotus) on tässä tuotteessa alle 2 % aminohapoista D-konfiguraatiossa.

DC: (kloroformi-metanoli-etikkahappo-vesi (70:40:0,5:10)] R^ 0,50

Vaihe 1.6 Z-Asn-Phe-Phe-(D-trp)-Lys(Boc)-Thr(But)-Phe-OTmse

Liuokseen, jossa on 632 mg Z-Asn-Phe-Phe-OH:a (vaihe 1.5A) ja 862 mg H-(D-trp)-Lys(Boc)-Thr(But)-Phe-OTmse:a (vaihe 1.5) 5 ml:ssa dimetyyliformamidia, lisätään 210 mg N-hydroksi-bentsotriatsolia ja 276 mg DCCI:a ja annetaan olla 15 tuntia huoneen lämpötilassa. Käsitellään edelleen suodattamalla saostunut disykloheksyylivirtsa-aine ja suodos haihdutetaan suurtyhjössä. öljymäinen jäännös hier- li _____ 20 68246 retään 5 ml :11a metanolia ja imetään pois. Liukenematon aines puhdistetaan hiertämällä vielä kerran 5 ml:n kanssa metanolia 50°:ssa, imusuodatetaan, pestään metanolilla ja kuivataan suurtyhjössä. Tuote on ohutkerroskromatograafisesti puhdas.

DC: (kloroformi-metanoli (85:15)) 0,85 (kloroformi-metanoli-vesi (14:6:1)) 0,90

Vaihe 1.7

Z-Asn-Phe-Phe-(D-trp)-Lys(Boc)-Thr(But)-Phe-OH

Z-Ans-Phe-Phe-(D-trp)-Lys(Boc)-Thr(But)-Phe-OTmse:a (vaihe 1.6) (940 mg) liuotetaan 23 ml:aan vastavalmistettua vedetöntä 0,15M-tetraetyyliammoniumkloridin dimetyyliformamidiliuosta ja pidetään 30 minuuttia 25°:ssa. Jäähdyttämisen jälkeen 5°:seen reaktioseok-seen lisätään samalla huolellisesti hämmentäen 0,68 ml IN vesipitoista suolahapon vesiliuosta ja tuote saostetaan lisäämällä 70 ml vettä. Suodatettu aines pestään 5 ml :11a vettä, kuivataan tyhjössä fosfori-pentoksidilla ja käytetään suoraan vaiheessa 1.8.

Vaihe 1.7A

H-Gaba-OBzl-p-toluolisulfonaatti

Seos, jossa on 30,94 g 4-aminovoihappoa ja 68,48 g p-toluoli-sulfonihappo-monohydraattia 311 ml:ssa bentsyylialkoholia ja 300 ml:ssa bentseeniä tislataan hitaasti normaalipaineessa, kunnes 5 tunnin aikana on saatu yhteensä 200 ml fraktiota, jonka sul.p. on 70-90°. Kirkas reaktioliuos väkevöidään vesisuihkutyhjössä ja sen jälkeen suurtyhjössä noin 60°:ssa 150 ml:aan. Saostunut kidetahdas hämmennetään 250 ml:aan eetteriä, kiteet suodatetaan ja pestään 200 ml :11a eetteriä. Puhdistetaan edelleen hämmentämäl lä saostunut kidetahdas 250 ml:aan eetteriä, kiteet suodatetaan ja pestään 200 ml: 11a eetteriä. Tämä aine puhdistetaan edelleen sekoittamalla 500 ml:aan eetteriä huoneen lämpötilassa, suodattamalla, pesemällä eetterillä ja kuivaamalla tyhjössä, sul.p. 106-107°c.

DC: (kloroformi-metanoli-17 %:nen vesipitoinen ammoniakki-vesi (50:40:6:4)) Rf 0,39 Vaihe 1.8 Z-Asn-Phe-Phe-(D-trp)-Lys(Boc)-Thr(But)-Phe-Gaba-OBzl

Seokseen, jossa on 430 mg Z-Asn-Phe-Phe-(D-trp)-Lys(Boc)-Thr(But)-Phe-OH:a (vaihe 1.7) ja 82 mg Gaba-bentsyyiiesteriä (vapautettu lisäämällä 0,046 ml N-metyyli-morfoliinia 152 mg:aan vastaavaa p-to-lueenisulfonaattia,(kts. vaihe 1.7A) 2 ml:ssa dimetyyliformamidia, lisätään 61 mg N-hydroksibentsotriatsolia ja 93 mg DCCI:a ja annetaan 68246 21 seistä 20 tuntia huoneen lämpötilassa. Käsitellään edelleen lisäämällä seokseen 10 ml jääkylmää metanolia ja suodatetaan. Saatu kiinteä aines puhdistetaan edelleen hämmentämällä sitä 5 ml:n kanssa lämmintä metanolia 10 minuutin ajan, suspensio jäähdytetään 0°:seen, puhdas tuote suodatetaan ja kuivataan tyhjössä.

DC: (kloroformi-metanoli(85:15)) 0,85

Vaihe 1.9 H-Asn-Phe-Phe-(D-trp)-Lys(Boc)-Thr(But)-Phe-Gaba-OH Liuokseen, jossa on 380 mg Z-Asn-Phe-Phe-(D-trp)-Lys(Boc)-Thr(But)-Phe-Gaba-OBzl:a (vaihe 1.8) 25 ml:ssa dimetyyliformamidia, lisätään noin 50 mg palladium-hiiltä (10 %) ja hydrataan sen jälkeen 6 tuntia huoneen lämpötilassa ja normaalipaineessa. Käsitellään edelleen katalysaattorin poissuodattamisen jälkeen suurtyhjössä vä-kevöiden suurtyhjössä 2 ml:ksi ja saostetaan tuote 25 ml :11a perok-sidivapaata eetteriä, suodatetaan ja kuivataan tyhjössä. Raakatuo-te saatetaan ilman enempää puhdistamista seuraavaan käsittelyvaiheeseen 1.10 (syklisointi).

Vaihe 1.10 ^-Asn-Phe-Phe- (D-trp) -Lys (Boc) -Thr (But) -Phe-Gaba-^

Liuos, jossa on 297 mg raakaa H-Asn-Phe-Phe-(D-trp)-Lys(Boc)-Thr(But)-Phe-Gaba-OH:a (vaihe 1.9), 324 mg N-hydroksibentsotriatso-lia ja 495 mg DCCI:a 240 ml:ssa dimetyyliformamidia, pidetään 20 tuntia 50°:ssa. Käsitellään edelleen haihduttamalla liuotin pois suur-tyhjössä noin 30°:ssa ja hiertämällä jäännös 10 ml:n kanssa etyyliasetaattia. Saostunut disykloheksyylivirtsa-aine poistetaan suodattamalla, suodos laimennetaan etyyliasetaatilla 50 mlrksi, pestään kolmesti kulloinkin 20 ml :11a IN oksaalihapon vesiliuosta, ja sen jälkeen vedellä neutraaliksi, kuivataan natriumsulfaatilla ja haihdutetaan tyhjössä. Raakatuote puhdistetaan vastavirtajakamalla systeemissä metanoli-vesi-kloroformi-hiilitetrakloridi (2700:675:900: 1575 tilavuusosaa) 460 vaiheessa. Elementtien 198-240 sisältämät jakeet (K = 0,88) yhdistetään ja haihdutetaan tyhjössä. Jäännös liuotetaan 20 ml:aan tert.-butanolia, ly.ofilisoidaan, jolloin saadaan edellämainitun kaavan mukaista ohutkerroskromatograafisesti yhtenäistä ainetta.

DC: (kloroformi-metanoli (85:15)) Rf 0,18 (kloroformi-metanoli-vesi (14:6:1)) R^ 0,77 68246 22

Esimerkki 2;

L Asn-Phe-Phe- (D-trp) -Lys-Thr-Phe-Gaba-Gaba-I

Vastaavalla tavalla kuin esimerkissä 1 on kuvattu käsitellään suojattu nonapeptidi, jonka kaava on ^-Asn-Phe-Phe- (D-trp) -Lys (Boc) -Thr (But) -Phe-Gaba-Gaba-J trifluorietikkahapolla ja käsitellään edelleen. Vastavirtajakamalla (K = 5,45) 200 elementtiin saadaan haluttu tuote ohutkerroskroma-tograafisesti yhtenäisenä, amorfisena aineena.

DC: Selluloosa, Merck;

Systeemi 101 : Rf 0,90 111B: Rf 0,75 112A: Rf 0,93 Lähtöaineena käytetty suojattu nonapeptidi voidaan saada seu-raavalla tavalla:

Vaihe 2.1

Boc-Gaba-OH

Liuoksen, jossa on 41,25 g H-Gaba-OH:a 320 ml:ssa dioksaani-vettä (1:1 tilavuusosaa), pH säädetään 20,5 ml:11a 4N-natriumhydrok-sidia arvoon 10,1 ja siihen lisätään 63,0 g Boc-atsidia. Lisäämällä hitaasti 4N-natriumhydroksidia (yhteensä 185 ml) 24 tunnin kuluessa huoneen lämpötilassa pidetään pH arvossa 10,0. Käsitellään reak-tioliuosta edelleen pesemällä kolmesti, kulloinkin 250 ml:11a eetteriä, säätämällä vesifaasin pH arvoon 3,0 5°:ssa ja lisäämällä 192 g sitruunahappoa. Saostunut aine liuotetaan kolmessa erässä 400 ml: aan eetteriä ja yhdistetyt orgaaniset faasit pestään neutraaliksi, kuivataan natriumsulfaatilla ja haihdutetaan tyhjössä. Jäännös liuotetaan 50 ml:aan eetteriä ja kiteytetään lisäämällä 100 ml petroli-eetteriä, sul.p. 60-62°.

DC: (kloroformi-metanoli-vesi (14:6:1)) R^ 0,83 (bentseeni-asetoni (7:3)) R^ 0,21 Vaihe 2.2

Boc-Gaba-Gaba-OBz1

Liuokseen, jossa on 2,03 g Boc-Gaba-OH:a (vaihe 2.1) 20 ml:ssa vedetöntä tetrahydrofuraania, lisätään -15°:ssa ensin 1,39 ml tri-etyyliamiinia, sen jälkeen 1 minuutin aikana 1,31 ml kloorimuurahais-happo-isobutyyliesteriä. 10 minuutin kuluttua -10 - -15°:ssa lisä tään -15°:ssa liuos, jossa on 3,65 g H-Gaba-OBzl-p-toluolisulfo- 68246 23 naattia (esimerkki 1.7A) ja 1,39 ml trietyyliamiinia 10 ml:ssa di-metyyliformamidia ja reaktioseosta pidetään kulloinkin 1 tunti -10°: ssa, 0°:ssa ja huoneen lämpötilassa. Käsitellään edelleen lisäämällä seokseen 150 ml etyyliasetaattia ja pestään kulloinkin kolmesti lN-sitruunahapolla, lN-NaHCO^:11a ja vedellä. Orgaaninen faasi kuivataan natriumsulfaatilla ja haihdutetaan sen jälkeen tyhjössä ja jäljelle jäävästä, heikosti kellertävästä öljystä poistetaan liuotinaine j äännökset suurtyhjössä. Tuote on ohutkerroskromatograafi-sesti yhtenäinen.

DC: [kloroformi-metanoli (85:15)) 0,60 (toluoli-asetoni (7:3)) 0,17

Vaihe 2.3 H-Gaba-Gaba-OBzl-hydrokloridi 2,00 g Boc-Gaba-Gaba-OBzl:a (vaihe 2.2) liuotetaan 15 ml:aan 2N-kloorivedyn etyyliasetaattiliuosta ja annetaan seistä tunti huoneen lämpötilassa. Reaktioseoksen jäähdyttämisen jälkeen 0°: seen saostunut tuote suodatetaan pois, pestään 20 ml :11a eetteriä ja kuivataan tyhjössä, sul.p. 80-83°.

DC: (kloroformi-metanoli-vesi (14:6:1)) 0,29

Vaihe 2.4 Z-Asn-Phe-Phe-(D-trp)-Lys(Boc)-Thr(But)-Phe-Gaba-Gaba-OBzl

Liuokseen, jossa on 430 mg Z-Asn-Phe-Phe-(D-trp)-Lys(Boc)-Thr(But)-Phe-OH:a (esimerkki 1.7) ja 142 mg H-Gaba-Gaba-OBzl-hydro-kloridia (vaihe 2.3) 3 mlrssa dimetyyliformamidia, lisätään 45 mg trietyyliamiinia, 61 mg 1-hydroksi-bentsotriatsolia sekä 93 mg N,N'~ disykloheksyylikarbo-di-imidia ja annetaan seistä 24 tuntia huoneen lämpötilassa. Reaktioseokseen lisätään 15 ml vettä ja saostunut aine suodatetaan ja kuivataan tyhjössä fosforipentoksidilla. Puhdistetaan hiertämällä raakatuotetta 5 ml :11a kuumaa metanolia, imu-suodatetaan ja kuivaamisen jälkeen tyhjössä saostetaan 2 ml dimetyyliformamidia sisältävästä liuoksesta 10 ml :11a metanolia. Saostuma suodatetaan, pestään pienellä määrällä metanolia ja kuivataan tyhjössä, jolloin saadaan ohutkerroskromatograafisesti yhtenäinen tuote.

DC: (kloroformi-metanoli (85:15)) R^ 0,80 Vaihe 2.5

H-Asn-Phe-Phe-(D-trp)-Lys(Boc)-Thr(But)-Phe-Gaba-Gaba-OH

Tämä yhdiste saadaan vastaavalla tavalla kuin esimerkissä 1.9 hydraamalla Z-Asn-Phe-Phe-(D-trp)-Lys(Boc)-Thr(But)-Phe-Gaba-Gaba-OBzl :a (vaihe 2.4) ja käytetään edelleen ilman enempää puhdistamis- 24 68246 ta vaiheessa 2.6.

Vaihe 2.6 ^•Asn-Phe-Phe- (D-trp) -Lys (Boc) -Thr (But) -Phe-Gaba-Gaba-^ Tämä yhdiste valmistetaan vastaavalla tavalla kuin esimerkissä 1.10 syklisoimalla H-Asn-Phe-Phe-(D-trp)-Lys(Boc)-Thr(But)-Phe-Gaba-Gaba-OH:a (vaihe 2.5) DCCI:lla ja 1-hydroksibentsotriatsolil-la. Raakatuote puhdistetaan vastavirtajakamalla (K = 1,1).

DC: (kloroformi-metanoli (85:15)) 0,06 (kloroformi-metanoli-vesi (14:6:1)) R^ 0,69 Esimerkki 3: ^-Asn-Phe- (D-Trp) -Lys-Thr-Phe-^

Vastaavalla tavalla kuin esimerkissä 1 on kuvattu käsitellään suojattua peptidiä, jonka kaava on ^Asn-Phe-Phe- (D-Trp) -Lys (Boc) -Thr (But) -Phe-^ trifluorietikkahapolla ja käsitellään edelleen. Vastavirtajakamalla (K = 3,4) 220 vaiheessa saadaan haluttu tuote amorfisena aineena.

DC: Systeemi 101 : R^ 0,60 111B: Rf 0,37 112A: Rf 0,50 Lähtöaineena käytetty, suojattu, edellämainitun kaavan mukainen peptidi saadaan seuraavalla tavalla: 1,10 g Z-Asn-Phe-(D-Trp)-Lys(Boc)-Thr(But)-Phe-OH:a (esimerkki 1.7) hydrataan 30 ml:ssa di-metyyliformaroidia lisäämällä 100 mg Pd-hiiltä (10 %), kunnes Z-ryhmä on lohjennut täydellisesti (noin 4 tuntia, ohutkerroskromatografoin-tikontrolli). Katalysaattorin poissuodattamisen jälkeen suodos vä-kevöidään suurtyhjössä 15 ml:ksi ja saatu peptidiliuos, jonka kaava on

H-Asn-Phe-Phe-(D-Trp)-Lys(Boc)-Thr(But)-Phe-OH

syklisoidaan suoraan esimerkkiä 1,10 vastaavasti DCCI:lla ja N-hyd-roksibentsotriatsolilla. Raakatuote puhdistetaan vastavirtajakamalla (K = 0,71), jolloin saadaan haluttu suojattu syklopeptidi, jonka kaava on ^-Asn-Phe-Phe- (D-Trp) -Lys (Boc) -Thr (But) -Phe-^ DC: (kloroformi-metanoli-vesi (14:6:1)) R^ 0,83 il 68246 25

Esimerkki 4; ^Asn-Phe-Phe- (D-Trp) -Lys-Thr-Phe-NH (CH2) 4C0-^

Vastaavalla tavalla kuin esimerkissä 1 on kuvattu käsitellään suojattua peptidiä, jonka kaava on ^-Asn-Phe-Phe- (D-Trp) -Lys (Boc) -Thr (But) -Phe-NH- (CH2) 4~CO-^ trifluorietikkahapolla ja käsitellään edelleen. Vastavirtajakamal-la (K = 3,31) 220 vaiheessa saadaan haluttu tuote amorfisena aineena. DC: systeemi 101 : 0,29 111B: Rf 0,34 112A: Rf 0,47 Lähtöaineena käytetty, suojattu peptidi saadaan seuraavalla tavalla:

Vaihe 4.1 H-Asn-Phe-Phe-(D-Trp)-Lys(Boc)-Thr(But)-Phe-ORmse 942 mg Z-Asn-Phe-Phe-(D-Trp)-Lys(Boc)-Thr(But)-Phe-OTmse:a (esimerkki 1.6) hydrataan 50 ml:ssa dimetyyliformamidia lisäten 100 mg Pd-hiiltä (19 %), kunnes Z-ryhmä on lohjennut täydellisesti (noin 2 tuntia, ohutkerroskromatografointikontrolli). Katalysaattori suodatetaan, minkä jälkeen suodos väkevöidään suurtyhjössä 4 ml:ksi ja käytetään suoraan seuraavissa vaiheissa.

Vaihe 4.2 Z-NH-(CH2)4-Asn-Phe-Phe-&D-Trp)-Lys(Boc)-Thr(But)-Phe-OTmse Liuokseen, jossa on 188 mg 5-bentsyylioksikarbonyyliaminopen-taanihappoa, 847 mg raakaa heptapeptidiä edellisestä vaiheesta 4.1 ja 101 mg hydroksibentsotriatsolia 4 ml:ssa dimetyyliformmaidia, lisätään 0-5°:ssa liuos, jossa on 182 mg DCCI:a 1 mltssa dimetyyliformamidia. Pidetään seosta 15 minuuttia 0-5°:ssa ja sen jälkeen vielä 18 tuntia huoneen lämpötilassa, minkä jälkeen saostunut di-sykloheksyylivirtsa-aine suodatetaan pois. Suodos väkevöidään suur-tyhjössä 3 ml:ksi ja raakatuote saostetaan lisäämällä 60 ml vettä. Suodattamisen ja kuivaamisen jälkeen saostuma puhdistetaan kahdesti hämmentämällä kulloinkin sitä 20 ml:n kanssa metanolia 40°:ssa ja suodattamalla.

DC: (kloroformi-metanoli (85:15)) R^ 0,61 (kloroformi-metanoli-vesi (14:6:1)) Rf 0,89 26 68246

Vaihe 4.3

Z-NH-(CH2)4CO-Asn-Phe-Phe-(D-Trp)-Lys(Boc)-Thr(But)-Phe-OH

760 mg Z-NH(CH2)4-CO-Asn-Phe-Phe-(D-Trp)-Lys(Boc)-Thr(But)-Phe-OTmse:a liuotetaan 17,1 ml:aan vastavalmistettua, vedetöntä 0,15M-tetraetyyliammoniumkloridin metyyliformamidiliuosta ja pidetään 40 minuuttia huoneen lämpötilassa. Jäähdyttämisen jälkeen 0-5°:seen reaktioseokseen lisätään samalla huolellisesti hämmentäen 0,51 ml lN-suolahapon vesiliuosta ja tuote saostetaan lisäämällä 30 ml vettä. DC: (kloroformi-metanoli (35:15)) R^ 0,13 (kloroformi-metanoli-vesi (14:6:1)) R^ 0,65 Vaihe 4.4

NH2~(CH2)4CO-Asn-Phe-Phe-(D-Trp)-Lys(Boc)-Thr(But)-Phe-OH

696 mg A-NH(CH2)4CO-Asn-Phe-Phe-(D-Trp)-Lys(Boc)-Thr(But)-Phe-OH: a (vaihe 4.3) hydrataan 70 ml:ssa dimetyyliformaraidia lisäten 80 mg Pd-hiiltä (10 %), kunnes Z-ryhmä on lohjennut tähdellisesti (noin 2 tuntia, ohutkerroskromatografointikontrolli). Katalysaattorin poissuodattamisen jälkeen suodos väkevöidään suurtyhjossa noin 3 ml:ksi ja tuote saostetaan 50 ml :11a peroksidivapaata eetteriä.

DC: (kloroformi-metanoli-vesi (14:6:1)) R^ 0,46 Vaihe 4.5

l-Asn-Phe-Phe- (D-Trp) -Lys (Boc) -Thr (But) -Phe-NH- (CH2) 4CO-J

Syklisoimalla lineaarinen oktapeptidi, jonka kaava on NH2(CH2)4~ CO-Asn-Phe-Phe-(D-Trp)-Lys(Boc)-Thr(But)-Phe-OH (vaihe 4.4) esimerkissä 1.10 kuvatulla tavalla saadaan DCCI:lla ja N-hydroksibentso-triatsolilla haluttu syklinen peptidi. Raakatuote puhdistetaan vas-tavirtajakamalla (K = 0,66).

DC: (kloroformi-metanoli (85:15)) 0,50 (kloroformi-metanoli-vesi (14:6:1)) R^ 0,77 Esimerkki 5: ^-Asn-Phe-Phe- (D-Trp) -Lys-Thr-Phe- (8-Ala) -1

Vastaavalla tavalla kuin esimerkissä 1 on kuvattu käsitellään suojattu peptidi, jonka kaava on L-Asn-Phe-Phe- (D-Trp) -Lys (Boc) -Thr (But) -Phe- (6-Ala) 4 trifluorietikkahapolla ja käsitellään edelleen. Vastavirtajakamalla (K = 5,0) 170 vaiheessa haluttu tuote saadaan armofisena aineena.

68246 27 DC: systeemi 101 : R^ 0,53 111B: Rf 0,32 112A: Rf 0,39 Lähtöaineena käytetty suojattu syklopeptidi valmistetaan seu-raavalla tavalla:

Vaihe 5.1 H- (β-ala) -OBzl. p-toluolisulfonaatt.i

Vastaavalla tavalla kuin esimerkissä 1.7A on kuvattu saadaan esteröimällä β-alaniinia bentsyylialkoholilla p-tolueenisulfonihapon läsnäollessa p-tolueenisulfonaatin haluttua esteriä, sul.p. 94,5-101°.

DC: (kloroformi-metanoli-vesi (14:6:1)) R^ 0,38

Vaihe 5.2 Z-Asn-Phe-Phe-(D-Trp)-Lys(Boc)-Thr(But)-Phe-(β-ala)-OBzl Vastaavalla tavalla kuin esimerkissä 1.8 saatetaan 1,09 g Z-Asn-Phe-Phe-(D-Trp)-Lys(Boc)-Thr(But)-Phe-OH:a (esimerkki 1.7) reagoimaan 0,33 g:n kanssa H-(β-ala)-OBzl.p-toluolisulfonaattia DCCI: 11a käyttämällä mukana N-metyylimorfoliinia ja N-hydroksibentsotriat-solia ja käsitellään edelleen.

DC: (kloroformi-metanoli (85:15)) R^ 0,69 (kloroformi-metanoli-vesi (14:6:1)} R^ 0,89 Vaihe 5.3 H-Asn-Phe-Phe-(D-Trp)-Lys(Boc)-Thr(But)-Phe-(β-ala)-OH Vastaavalla tavalla kuin esimerkissä 1.9 on kuvattu muutetaan H-Asn-Phe-Phe-(D-Trp)-Lys(Boc)-Thr(But)-Phe-(β-ala)-OBzl (vaihe 5.2) hydraamalla vastaavaksi vapaaksi hapoksi.

DC: (kloroformi-metanoli-vesi (14:6:1)) Rf 0,52 Vaihe 5.4 LAsn-Phe-Phe- (D-Trp) -Lys (Boc) -Thr (But) -Phe- (β-ala) -*

Vastaavalla tavalla kuin esimerkissä 1.10 on kuvattu syklisoi-daan vapaa happo H-Asn-Phe-Phe-(D-Trp)-Lys(Boc)-Thr(But)-Phe-(β-ala)-OH DCCI:11a ja N-hydroksibentsoatriatsolilla. Raakatuote puhdistetaan vastavirtajakamalla (K = 0,71).

DC: (kloroformi-metanoli (85:15)) R^ 0,65 (kloroformi-metanoli-vesi (14:6:1)) R^ 0,80 Esimerkki 6: | i

LAsn-Phe-Phe-(D-Trp)-Lys-Thr-Phe-(D-Glu)-OH

Vastaavalla tavalla kuin esimerkissä 1 on kuvattu käsitellään 68246 28 suojattu peptidi, jonka kaava on 1--— ‘ LAsn-Phe-Phe-(D-Trp)-Lys(Boc)-Thr(But)-Phe-(D-Glu)-OBut trifluorietikkahapolla ja käsitellään edelleen. Vastavirta-jakamalla (K = 4,26) 300 vaiheessa saadaan haluttu tuote amorfisena aineena.

DC: 101 : Rf 0,53 111B: Rf 0,40 112A: Rf 0,31 (symboli -Glu-OH tarkoittaa tähdettä, jonka kaava on -NH-CH- (CH2) 2-CO·^ ).

CO-OH

Lähtöaineena käytetty suojattu peptidi valmistetaan seuraaval-la tavalla:

Vaihe 6.1 H-(d-G1u(OBzl))-OBut.hydrokloridi

Seosta, jossa on 5,00 g H-(D-Glu(OBzl))-OH:a ja 40 ml nestemäistä isobutaania, sekoitetaan 4 ml:n kanssa väkevää rikkihappoa 40 ml:ssa dioksaania, suljetussa astiassa, huoneen lämpötilassa, kunnes muodostuu kirkas liuos, ja pidetään vielä 4 tuntia huoneen lämpötilassa. Käsitellään edelleen kaatamalla -20°:seen jäähdytetty reaktioseos jääkylmään seokseen, jossa on 300 ml eetteriä ja 203 ml IN natriumhydroksidia. Eetterifaasi pestään kolmesti kulloinkin 50 ml :11a vettä. Vesipitoisen faasin jälkiuuton jälkeen vielä 300 ml :11a eetteriä yhdistetyt orgaaniset faasit kuivataan natriumsui-faatilla, väkevöidään tyhjössä 10 ml:ksi ja 0°:ssa, samalla huolellisesti hämmentäen siihen lisätään 30 ml 7-N kloorivedyn metanoliliuos-ta. Saatu liuos haihdutetaan tyhjössä ja jäännös hierretään 20 ml:n kanssa petrolieetteriä, kunnes kiteytyminen tapahtuu. Poissuodatet-tu tuote, jonka kaava on CO-OBut HC1.NH2-CH(CH2)2-CO-OBz1 puhdistetaan kromatografoimalla piihappogeelipylväässä (170 g) klo-

Ό E

roformi-metanolilla (85:15), sul.p. 107-108° (hajoten), (ct)D : -15° + 1° (etanoli, 2 %).

DC: (kloroformi-metanoli (85:15)) R^ 0,60 68246 29

Vaihe 6.2 Z-Asn-Phe-Phe-(D-Trp)-Lys(Boc)-Thr(But)-Phe-D-Glu(OBzl)-OBut

Liuokseen, jossa on 1,09 g Z-Asn-Phe-Phe-(D-Trp)-Lys(Boc)-Thr(But)-Phe-PH:a (esimerkki 1.7), 0,31 g HCl'(d-G1u(OBzl))-OBut:a (vaihe 6.1), 0,13 g N-hydroksibentsotriatsolia ja 95 mg N-metyyli-morfoliinia 8 ml:ssa dimetyyliformamdidia, lisätään 0-5°:ssa liuos, jossa on 0,21 g DCCIra 2 ml:ssa dimetyyliformamidia, ja pidetään 30 minuuttia 0-5°:ssa ja sitten vielä 15 tuntia huoneen lämpötilassa. Saostunut disykloheksyylivirtsa-aine suodatetaan pois ja suo-dos haihdutetaan suurtyhjössä. Jäännös hierretään 30 ml:n kanssa vettä, suodatetaan, kuivataan ja puhdistetaan hämmentäen vielä kahdesti, kulloinkin 10 ml:n kanssa metanolia ja suodatetaan.

DC: (kloroformi-metanoli (85:15)) R^ 0,85 (kloroformi-metanoli-vesi (14:6:1)) 0,91

Vaihe 6.3 H-Asn-Phe-Phe-(D-Trp)-Lys(Boc)-Thr(But)-Phe-(d-G1u)-OBut

Vastaavalla tavalla kuin esimerkissä 1.9 on kuvattu hydrataan kaavan H-Asn-Phe-Phe-(D-Trp)-Lyd(Boc)-Thr(But)-Phe-(d-G1u(OBzl))-OBut (vaihe 6.2) mukainen yhdiste halutuksi tuotteeksi.

DC: (kloroformi-metanoli(85:15)) Rf 0,13 (kloroformi-metanoli-vesi (14:6:1)) R^ 0,65 Vaihe 6.4

I ... " — I

*-Asn-Phe-Phe- (D-Trp) -Lys (Boc) -Thr (But) -Phe- (d-G1u) -OBut

Vastaavalla tavalla kuin esimerkissä 1.10 on kuvattu syklisoi-daan kaavan H-Asn-Phe-Phe-(D-Trp)-Lys(Boc)-Thr(But)-Phe-(d-G1u)-OBut mukainen happo DCCI:lla ja N-hydroksibentsotriatsolilla. Raa-katuote puhdistetaan vastavirtajakamalla (K = 0,52).

DC: (kloroformi-metanoli (85:15)) R^ 0,54 (kloroformi-metanoli-vesi (14:6:1)) Rf 0,83 Esimerkki 7:

Lphe-Phe- (D-Trp) -Lys-Thr-Phe-^ 235 mg:sta suojattua heksapeptidiä, jonka kaava on ^-Phe-Phe- (D-Trp) -Lys (Boc) -Thr (But) -Phe-^ poistetaan suojaryhmät esimerkkiä 1 vastaavasti trifluorietikkahapol-la ja puhdistetaan asetaattina vastavirta jakamalla soimassa systeemissä kuin esimerkissä 1. Puhdas tuote eristetään arvossa K = 5,4.

68246 30 DC (piihappogeeli, Merck): systeemi 45 : 0,2 52 : Rf 0,35 157 : Rf 0,5 Lähtöaine saadaan seuraavalla tavalla:

Vaihe 7.1 Z-Phe-Phe-(D-Trp)-Lys(Boc)-Thr(But)-Phe-OTmse

Liuokseen, jossa on 2,84 g H-(D-Trp)-Lys(Boc)-Thr(But)-Phe-OTmse^ (esimerkki 1.5) ja 1,52 g Z-Phe-Phe-OH:a 12 ml:ssa dimetyy-liformamidia, lisätään 0°:ssa 0,62 g N-hydroksibentsotriatsolia ja 0,98 g DCCI:a ja annetaan olla 16 tuntia 0°:ssa. Disykloheksyyli-virtsa-aineen poissuodattamisen jälkeen tuote saostetaan tiputtamalla se laimeaan natriumvetykarbonaattiliuokseen. Tuote kiteytetään vesipitoisesta metanolista.

DC (piihappogeeli, Merck): systeemi 157A, R^ 0,6.

Vaihe 7.2

Z-Phe-Phe-(D-Trp)-Lys(Boc)-Thr(But)-Phe-OH

Liuokseen, jossa on 2,86 g Z-Phe-Phe-(D-Trp)-Lys(Boc)-Thr(But)-Phe-OTmse:a 13,5 ml:ssa dimetyyliformamidia lisätään 30°:ssa 6,1 ml 1,12-M tert.butyyliammoniumkloridin dimetyylisulfoksidiliuosta ja annetaan olla 5 minuuttia tässä lämpötilassa. Tuote saostetaan tiputtamalla se jääkylmään laimeaan suolahappoon ja puhdistetaan saos-tamalla uudestaan asetonitriili-liuoksesta laimealla suolahapolla.

DC: systeemi 157A, R^ 0,35.

Vaihe 7.3

Lphe-Phe- (D-Trp) -Lys (Boc) -Thr (But) -Phe-^

Liuos, jossa on 870 mg Z-Phe-Phe-(D-Trp)-Lys(Boc)-Thr(But)-Phe-OH:a 20 ml:ssa dimetyyliformamidia hydrataan käyttämällä mukana 90 mg Pd-hiiltä (10 %) 2 tuntia huoneen lämpötilassa. Katalysaattorin poissuodattamisen jälkeen suodos väkevöidään suurtyhjössä muutamaksi millilitraksi, lisätään 790 ml dimetyyliformamidia, 1,2 g N-hydroksibentsotriatsolia ja 1,6 g DCCI:a ja annetaan seistä 15 tuntia 50°:ssa. Lisätään 2 ml 5-M oksaalihapon dimetyyliformamidiliuos-ta, minkä jälkeen se väkevöidään suurtyhjössä noin 10 ml:ksi, disyk-loheksyylivritsa-aine imusuodatetaan pois ja tuote saostetaan tiputtamalla se laimeaan natriumvetykarbonaattiliuokseen. Kromatografoi-malla piihappogeelillä eluoidaan puhdas tuote kloroformilla lisäämällä 3-5 % metanolia.

DC: systeemi 157A, R^ 0,5.

68246 31

Esimerkki 8: t-Phe-Phe- (D-Trp) -Lys-Thr-Phe-Gly-^ 450 mg ‘-Phe-Phe- (D-Trp) -Lys (Boc) -Thr (But) -Phe-GlyJ:a käsitellään esimerkkiä 1 vastaavasti trifluorietikkahapolla. Raakatuote muutetaan ioninvaihtajalla asetaatiksi ja tämä puhdistetaan vastavirta jakamalla systeemissä n-butanoli-etikkahappo-vesi-toluoli (4:1:5:4) 420 vaiheessa. Puhdas tuote (K = 1,5) eristetään tavalliseen tapaan.

DC (piihappogeeli, Merck): systeemi 157C, 0,25.

Lähtöaine valmistetaan seuraavalla tavalla:

Vaihe 8.1 Z-Phe-Phe-(D-Trp)-Lys(Boc)-Thr(But)-Phe-Gly_OBzl

Liuokseen, jossa on 800 mg Z-Phe-Phe-(D-Trp)-Lys(Boc)-Thr(But)-Phe-OH:a (esimerkki 7.2), 290 mg H-Gly-OBzl.p-toluolisulfonaattia ja 130 mg N-hydroksibentsotriatsolia 4 ml:ssa dimetyyliformamidia, lisätään 0°:ssa 0,095 ml N-metyylimorfoliinia ja 200 mg DCCI:a ja annetaan olla 16 tuntia 0°:ssa. Disykloheksyylivirtsa-aineen pois-suodattamisen jälkeen tuote saostetaan tiputtamalla se laimeaan nat-riumvetykarbonaattiliuokseen. Raakatuote puhdistetaan kiteyttämällä uudestaan metanoli-vedestä (9:1) ja asetonitriili-vedestä (1:1). DC: (kloroformi-metanoli (95:5)) : R^ 0,55 systeemi 157A : Rf 0,75

Vaihe 8.2

Lphe-Phe-(D-Trp)-Lys(Boc)-Thr(But)-Phe-GlyJ

Liuos, jossa on 780 mg Z-Phe-Phe-(D-Trp)-Lys(Boc)-Thr(But)-Phe-Gly-OBzl:a (vaihe 8.1) 15 ml:ssa dimetyyliformamidia, hydrataan käyttämällä mukana 80 mg palladium-hiiltä (10 %) 6 tuntia. Katalysaattorin poissuodattamisen jälkeen suodosta väkevöidään voimakkaasti, siihen lisätään 115 ml dimetyyliformamidia, 910 mg N-hydroksibentsotriatsolia ja 1,22 g DCCI:a ja annetaan sitä 20 tuntia 50°:ssa. Käsitellään edelleen kuten esimerkissä 7.3 on kuvattu. Raakatuote puhdistetaan vastavirtajakamalla 460 vaiheessa samassa systeemissä kuin esimerkissä 1.10 on kuvattu (K = 0,4).

DC: systeemi 157A : R^ 0,4.

Esimerkki 9:

Lphe-Phe- (D-Trp) -Lys-Thr-Phe-Gaba-^ 260 mg LPhe-Phe- (D-Trp) -Lys (Boc) -Thr (But) -Phe-Gaba-1: a käsitel- 32 68246 esimerkkiä 1 vastaavasti trifluorietikkahapolla. Ioninvaihtajalla tuote muutetaan asetaatiksi, joka puhdistetaan vastavirtajakamalla 300 vaiheessa systeemissä sek.-butanoli-vesi-etikkahappo (100:100:1). Puhdas tuote (K = 4,5) eristetään tavanomaiseen tapaan.

DC (piihappogeeli, Merck): systeemi 157, 0,5.

Lähtöaine valmistetaan seuraavalla tavalla:

Vaihe 9.1 Z-Phe-Phe-(D-Trp)-Lys(Boc)-Thr(But)-Phe-Gaba-OBzl

Liuokseen, jossa on 420 mg Z-Phe-Phe-(D-Trp)-Lys(Boc)-Thr(But)-Phe-OH:a (esimerkki 7.2), 165 mg H-Gaba-OBzl.p-toluolisulfonaattia ja 70 mg N-hydroksibentsotriatsolia 2 ml:ssa dimetyyliformamdiia, lisätään 0°:ssa 0,05 ml N-metyylimorfoliinia ja 100 mg DDCI:a ja annetaan olla 20 tuntia 0°:ssa. Disykloheksyylivirtsa-aineen pois-suodattamisen jälkeen tuote saostetaan tiputtamalla se natriumkarbonaatti liuokseen.

DC: systeemi 157A : 0,65.

Vaihe 9.2

Lphe-Phe- (D-Trp) -Lys (Boc) -Thr (But) -Phe-Gaba-I

Liuos, jossa on 500 mg Z-Phe-Phe-(D-Trp)-Lys(Boc)-Thr(But)-Phe-Gaba-OBzl:a 20 ml:ssa dimetyyliformamidia, hydrataan käyttämällä mukana 50 mg palladium-hiiltä (10 %) 2 tuntia. Katalysaattorin poissuodattamisen jälkeen suodosta väkevöidään huomattavasti suur-tyhjössä, jäännökseen lisätään 370 ml dimetyyliformamidia, 560 mg N-hydroksibentsotriatsolia ja 760 mg DCCI:a ja annetaan seistä 18 tuntia 50°:ssa. Tuotteen edelleenkäsittely ja puhdistus tapahtuu esimerkkiä 8.2 vastaavasti, K = 0,3.

DC: systeemi 157A : 0,45.

Esimerkki 10: ^Asn-Phe-Phe- (D-Trp) -Lys-Thr-Phe-Gly-^ 600 mg uAsn-Phe-Phe-(D-Trp)-Lys(Boc)-Thr(But)-Phe-Gly-*:a käsitellään esimerkkiä 1 vastaavasti trifluorietikkahapolla ja puhdistetaan, K = 3,5.

DC: systeemi 157C : R^ 0,15 Lähtöaine valmistetaan seuraavalla tavalla:

Vaihe 10.1 Z-Asn-Phe-Phe-(D-Trp)-Lys(Boc)-Thr(But)-Phe-Gly-OBzl

Liuokseen, jossa on 230 mg Z-Asn-Phe-(D-Trp)-Lys(Boc)-Thr(But)-Phe-OH:a (esimerkki 1.7), 77 mg H-Gly-OBzl.p-toluolisulfonaattia ja 11 68246 33 35 mg N-hydroksibentsotriatsolia 1 mltssa dimetyyliformamidia, lisätään 0°:ssa 0,025 ml N-metyylimorfoliinia ja 53 mg DDCIra. 16 tunnin jälkeen käsitellään edelleen esimerkkiä 7.1 vastaavasti ja kiteytetään uudestaan asetonitriili-vedestä (4:1).

DC: systeemi 157A: Rf 0,65.

Vaihe 10.2 l-Asn-Phe-Phe- (D-Trp) -Lys (Boc) -Thr (But) -Phe-GlyJ Liuos, jossa on 200 mg Z-Asn-Phe-Phe-(D-Trp)-Lys(Boc)-Thr(But)-Phe-Gly-OBzl:a (vaihe 10.1) 15 mlrssa dimetyyliformamidia, hydrataan käyttämällä mukana 50 mg palladium-hiiltä (10 %). Katalysaattorin poissuodattamisen jälkeen suodos väkevöidään suurtyhjössä, jäännökseen lisätään 140 ml dimetyyliformamidia, 215 mg N-hydroksibentsotriatsolia ja 290 mg DCCIra ja annetaan olla 20 tuntia 50°:ssa. Edelleenkäsittely ja puhdistus tapahtuu kuten esimerkissä 8.2, K = 0,8.

DC: systeemi 157B : 0,45.

Esimerkki 11: ^-Äsn-Phe-Phe- (D-Trp (F)) -Lys-Thr-Phe-Gaba 4 340 mg '-Asn-Phe-Phe- (D-Trp (F) J -Lys (Boc) -Thr (But) -Phe-Gaba-1:a käsitellään esimerkkiä 1 vastaavasti trifluorietikkahapolla, ionin-vaihtajalla se muutetaan asetaatiksi ja puhdistetaan vastavirtajakamalla systeemissä tert..-butanoli-tolueeni-metanoli-puskuri (0,05M ammoniumasetaatti + 0,05M etikkahappo) (7:7:3:10) 500 vaiheessa (K = 0,14) .

(Symboli (ϋ-Trp(F)) tarkoittaa 5-fluori-D-tryptofaania).

DC: systeemi 157 : R^ 0,36.

Lähtöaine saadaan seuraavalla tavalla:

Vaihe 11.1

Z-(D-Trp(F))-OH

Liuokseen, jossa on 2 g 5-fluori-DL~tryptofaania 9 ml:ssa 1-N natriumlipeää, lisätään samalla jäällä jäähdyttäen ja voimakkaasti hämmentäen samanaikaisesti 1,4 ml kloorimuurahaishappobentsyylieste-riä ja 10,5 ml 1-N natriumhydroksidia. 2 tunnin kuluttua lisätään 50 ml etyyliasetaattia, kaksifaasisen seoksen pH säädetään suolahapolla arvoon 1, orgaaninen faasi erotetaan, pestään vedellä, kuivataan natriumsulfaatilla ja haihdutetaan. Jäännös liuotetaan 9,5 ml:aan vettä ja 5 ml:aan 2-N natriumhydroksidia, lisätään 1,5 ml ani- 68246 34 liinia, 100 mg L-kysteiini-hydrokloridia ja 34 ml 0,2M sintraatti-puskuria (pH 5), jolloin lähtöaine saostuu osittain uudestaan; suspension pH säädetään 2-N suolahapolla arvoon 6,3. 260 mg papaiinia lietetään 2 ml:aan vettä 40°:ssa, liukenemattomat aineosat sentri-fugoidaan pois, 1,9 ml päällä olevaa liuosta lisätään edellämainittuun suspensioon ja tätä hämmennetään 20 tuntia 40°:ssa. Samalla jäällä jäähdyttäen seoksen pH säädetään arvoon 8 2-N natriumhydroksidilla, liukenematon Z- (L-Trp (F)) -anilidi suodatetaan, suodoksen pH säädetään 5-N suolahapolla arvoon 5,3 ja edelläkuvatulla tavalla siihen lisätään kysteiini-hydrokloridia ja papaiinia. 20 tunnin kuluttua muodostunut anilidi suodatetaan jälleen pois ja suodosta käsitellään vielä 3 vuorokautta samalla tavalla kuin edellä on kuvattu, jolloin muodostuu vain hivenmääriä anilidia. Suodoksen päälle kaadetaan etyyliasetaattia, hapotetaan pH-arvoon 1-2; orgaaninen kerros pestään vedellä, kuivataan natriumsulfaatilla ja haihdutetaan. Jäännös kiteytetään uudestaan di-isopropyylieetteri-heksaanista.

DC: systeemi 157B ; 0,3.

Vaihe 11,2

Z-(D-Trp(F))-Lys(Boc)-OH

1,15 g Z-(D-Trp(F))-OH:a muutetaan esimerkissä 1.3A kuvatulla tavalla otsikossa mainituksi dipeptidiksi.

DC: systeemi 157B : 0,33.

Vaihe 11.3 Z-(D-Trp(F))-Lys(Boc)-Thr(But)-Phe-OTmse

Liuokseen, jossa on 380 mg Z-(ϋ-Trp(F))-Lys(Boc)-OH:a, 300 mg Η-Thr(But)-Phe-OTmse:a (esimerkki 1.3) ja 110 mg N-hydroksibentso-triatsolia 2,5 ml:ssa dimetyyliformamidia, lisätään 0°:ssa 170 mg DCCI:a. 15 tunnin kuluttua käsitellään edelleen esimerkkiä 7.1 vastaavasti ja tuote puhdistetaan kiteyttämällä uudestaan etyyliasetaat-ti-petrolieetteristä.

DC: systeemi 157A : R^ 0,76.

Vaihe 11.4 Z-Asn-Phe-Phe-(ϋ-Trp(F))-Lys(Boc)-Thr(But)-Phe-OTmse

Liuos, jossa on 490 mg Z-(ö-Trp(F))-Lys(Boc)-Thr(But)-Phe-OTmse :a 15 ml:ssa metanoli-vettä (9:1), hydrataan käyttämällä mukana 50 mg palladium-hiiltä (10 %), jolloin pH jatkuvasti pidetään arvossa 5 lisäämällä samanaikaisesti 0,2N suolahappoa edellämainitussa liuottimessa. Reaktioseos suodatetaan, suodos väkevöidään ja vesi poistetaan haihduttamalla kdmesti dimetyyliformamidin kanssa.

68246 35 Jäljelle jäävään liuokseen (1,2 g) lisätään 305 mg Z-Asn-Phe-Phe-OH:a, 83 mg N-hydroks.ibentsotriatsolia, 0,06 ml N-metyylimorfoliinia ja 1,2 ml dimetyyliformamidia. -5°:ssa siihen lisätään 130 mg DCCI:a ja annetaan seistä 16 tuntia tässä lämpötilassa. Käsitellään edelleen kuten esimerkissä 7.1, minkä jälkeen tuote kiteytetään uudestaan asetonitriili-vedestä.

DC: systeemi 157A : 0,6.

Vaihe 11.5 Z-Asn-Phe-Phe-(D-Trp(F))-Lys(Boc)-Thr(But)-Phe-OH Liuokseen, jossa on 600 mg Z-Asn-Phe-Phe-(D-Trp(F))-Lys(Boc)-Thr(But)-Phe-OTmse:a 4,2 mlrssa dimetyyliformamidia lisätään 30°: ssa 3,8 ml 0,34M tetraetyyliammoniumfluoridin dimetyylisulfoksidi-liuosta ja annetaan seistä 30 minuuttia 30°:ssa. Liuos tiputetaan samalla jäällä jäähdyttäen 50 ml:aan vettä ja 0,65 ml:aan 2-N suolahappoa ja saostuma suodatetaan pois. Tuote puhdistetaan kiteyttämällä asetonitriili-vedestä.

DC: systeemi 157A : 0,35.

Vaihe 11.6 Z-Asn-Phe-Phe-(D-Trp(F))-Lys(Boc)-Thr(But)-Phe-Gaba-OBzl Liuokseen, jossa on 470 mg Z-Asn-Phe-Phe-(D-Trp(F))-Lys(Boc)-Thr(But)-Phe-OH:a, 165 mg H-Gaba-OBzl.p-toluolisulfonaattia ja 66 mg N-hydroksibentsotriatsolia 2 ml:ssa dimetyyliformamidia, lisätään -5°:ssa 0,05 ml N-metyylimorfoliinia ja 100 mg DCCI:a. 16 tunnin jälkeen tässä lämpötilassa käsitellään edelleen esimerkkiä 7.1 vastaavasti. Tuote saadaan puhtaana lukuunottamatta pieniä määriä disykloheksyylivirtsa-ainetta.

DC: systeemi 157A : Rf 0,55.

Vaihe 11.7 1-Asn-Phe-Phe- (ϋ-Trp (F) ) -Lys (Boc) -Thr (But) -Phe-Gaba-^

Liuos, jossa on 520 mg Z-Asn-Phe-Phe-(D-Trp(F))-Lys(Boc)-Thr-(but)-Phe-Gaba-OBzl:a 20 ml:ssa dimetyyliformamidia, hydrataan käyttämällä mukana 50 mg palladium-hiiltä (10 %) 2 tuntia. Katalysaattorin poissuodattamisen jälkeen suodos väkevöidään suurtyhjössä ja siihen lisätään 350 ml dimetyyliformamidia, 540 mg N-hydroksibentsotriatsolia ja 720 mg DCCI:a. 20 tunnin jälkeen 50°:ssa käsitellään edelleen esimerkkiä 8.2 vastaavasti ja puhdistetaan; K = 1,1.

DC: systeemi 157A : R^ 0,35.

68246 36

Esimerkki 12:

L-Asn-Phe-Phe- (D-Trp (NO) 2)) -Lys-Thr-Phe-Gaba-I

Vastaavalla tavalla kuin esimerkissä 1 on kuvattu käsitellään suojattua.peptidiä, jonka kaava on ^-Asp-Phe-Phe- (ϋ-Trp (N02)) -Lys (Boc) -Thr (But) -Phe-Gaba-^ trifluorietikkahapolla ja käsitellään edelleen. Vastavirtajakamalla 220 vaiheessa (K = 4,5) saadaan haluttu tuote ohutkerroskromato-graafisesti yhtenäisenä, amorfisena aineena.

DC: systeemi 101 : R^ 0,58 111B: Rf 0,40 112A: Rf 0,45 (Symboli (D-Trp(N02)) tarkoittaa 6-nitro-D-tryptofaania).

Lähtöaine saadaan seuraavalla tavalla:

Vaihe 12.1 Z-Gaba-OTmse

Liuos, jossa on 5,93 g Z-Gaba-OH:a ja 3,84 g trimetyylisilyy-lietanolia 10 ml:ssa asetonitriiliä ja 6 ml:ssa pyridiiniä jäähdytetään 5°:seen ja siihen lisätääh samalla hämmentäen 5,70 g DCCI:a. Tunnin kuluttua 5°:ssa pidetään reaktioseosta vielä 15 tuntia huoneen lämpötilassa. Saostunut disykloheksyylivirtsa-aine suodatetaan ja pestään etyyliasetaatilla ja suodos haihdutetaan. Jäännös kromatografoidaan piihappogeelipylväässä (450 g), jolloin eluoimis-aineena käytetään hiilitetrakloridi-etyyliasetaatin (6:4)-seosta. Tuotetta sisältävät fraktiot yhdistetään ja haihdutetaan. Saatu väritön öljy kuivataan suurtyhjössä.

DC: (kloroformi-metanoli (85:15)) R^ 0,69 (toluoli-asetoni (7:3)) R^ 0,59 Vaihe 12.2 H-Gaba-OTmse

Liuokseen, jossa on 4,70 g Z-Gaba-OTmse:a (vaihe 12.1) 50 ml: ssa isopropanolia, lisätään 0,5 g palladiumhiiltä (10 %), minkä jälkeen sen läpi johdetaan vetyä, kunnes ohutkerroskromatograafises-ti (kloroformi-metanoli (85:15)) ei ole enää osoitettavissa lähtöainetta. Katalysaattori suodatetaan pois ja suodos haihdutetaan tyhjössä. Saatua öljymäistä raakatuotetta käytetään suoraan seuraa-vassa vaiheessa.

68246

Vaihe 12.3 Z-Phe-Gaba-OTmse

Liuokseen, jossa on 4,60 g Z-Phe-OH:a ja 2,83 g H-Gaba-OTmse:a (vaihe 12.2) 15 mlrssa metyleenikloridia, lisätään 0-5°:ssa liuos, jossa on 3,75 g disykloheksyylikarbodi-imidiä 5 ml:ssa metyleenikloridia. Reaktioseosta pidetään vielä 15 minuuttia 5°:ssa ja sen jälkeen 2 tuntia huoneen lämpötilassa, jolloin saostunut DCH suodatetaan pois ja suodos haihdutetaan. Jäännös puhdistetaan kiteyttämällä kolmesti etyyliasetaatista (12 ml) ja petrolieetteristä (60 ml), sul.p. 88-93,5° (hajoten). (DCH = disykloheksyylivirtsa-aine).

DC: (kloroformi-metanoli (85:15)) 0,72 (toluoli-asetoni (7:3)) R^ 0,44.

Vaihe 12.4 Z-Thr(But)-Phe-Gaba-OTmse

Liuos, jossa on 3,93 g H-Phe-Gaba-OTmse:a (saatu 5,42 g:sta Z-Phe-Gaba-OTmse:a (vaihe 12.3) hydraamalla vaihetta 12.2 vastaavasti) ja 5,45 g Z-Thr(But)-ONSu:a 25 ml:ssa dimetyyliformamidia, pidetään 15 tuntia huoneen lämpötilassa, siihen lisätään 0,34 ml di-metyyliaminopropyyliamiinia ja pidetään vielä tunti huoneen lämpötilassa. Reaktioseos haihdutetaan suurtyhjössä, jäännös liuotetaan noin 200 ml:aan etyyliasetaattia ja pestään kolmesti, kulloinkin 3 ml:ssa 5 %:ista viinihapon vesiliuosta ja kolmesti, kulloinkin 30 ml :11a vettä. Natriumsulfaatilla kuivatut orgaaniset faasit haihdutetaan tyhjössä ja jäännös kiteytetään uudestaan kahdesti etyy-liasetaatti-petrolieetteristä (10 ml + 80 ml), sul.p. 114-117° (hajoten) .

DC: (kloroformi-metanoli (85:15)) Rf 0,75 (hiilitetrakloridi-etyyliasetaatti (6:4)) Rf 0,39 Vaihe 12.5 Z-Lys(Boc)-Thr(But)-Phe-Gaba-OTmse

Liuokseen, jossa on 2,37 g Η-Thr(But)-Phe-Gaba-OTmse:a (saatu 3,00 g:sta Z-Thr(But)-Phe-Gaba-OTmse:a hydraamalla vaihetta 12.2 vastaavasti), 1,96 g Z-Lys(Boc)-OH:a ja 0,70 g N-hydroksibentsotri-atsolia 10 ml:ssa metyleenikloridia, lisätään 0-5°:ssa liuos, jossa on 1,25 g DCCI:a 5 ml:ssa metyleenikloridia. 15 minuutin jälKeen 0,5°:ssa seosta pidetään 15 tuntia huoneen lämpötilassa. Saostunut disykloheksyylivirtsa-aine suodatetaan pois, suodos haihdutetaan tyhjössä ja jäännös saostetaan uudestaan kolmesti etyyliasetaatti-pet-rolieetteristä (20 ml; 100 ml) .

68246 38 DC: (kloroformi-metanoli (85:15)) 0,73 (kloroformi-metanoli-vesi (14:6:1)) 9,87

Vaihe 12.5A

Bpoc-Phe-(D-Trp(N02))"OH

Suspensiota, jossa on 0,50 g 6-nitro-D-tryptofaania ja 1,10 g Bpoc-Phe-ONSu:a 10 ml:ssa dimetyyliformamidi-vesi (8:2)-seosta käsitellään huoneen lämpötilassa 0,1-N natriumhydroksidillä siten, että pH pysyy arvossa 7,5. 2,5 tunnin jälkeen on natriumhydroksidin kokonaiskulutus 31,5 ml. Reaktioseos jäähdytetään 0-5°:seen ja siihen lisätään hitaasti 3,5 ml 1-N suolahappoa. Saostuva raakatuote suodatetaan pois, kuivataan ja kromatografoidaan kahdesti piihappo-geelipylvään läpi (kulloinkin 60 g adsorbenssia) kloroformi-metano-lin (85:15)-seoksella ja hiilitetrakloridi-etyyliasetaatin (6:4)-seos eluointiaineena.

DC: (kloroformi-metanoli (85:15)) R^ 0,12 (kloroformi-metanoli-vesi (14:6:1)) R^ 0,50 Vaihe 12.6

Bpoc-Phe-(D-Trp(NC^))-Lys(Boc)-Thr(But)-Phe-Gaba-OTmse

Liuokseen, jossa on 1,08 g H-Lys(Boc)-Thr(But)-Phe-Gaba-OTmse:a (saatu 1,30 g:sta Z-Lys(Boc)-Thr(But)-Phe-Gaba-OTmse:a (vaihe 12.5) hydraamalla vaihetta 12.2 vastaavasti), 0,93 g Bpoc-Phe-(D-Trp(NO2))-OH:a (vaihe 12.5A) ja 0,22 g N-hydroksibentsotriatsolia 8 ml:ssa me-tyleenikloridia, lisätään 0-5°:ssa liuos, jossa on 0,36 g DCCI:a 2 ml:ssa metyleenikloridia. 15 minuutin kuluttua 0-5°:ssa pidetään seosta 4 tuntia huoneen lämpötilassa. Käsitellään edelleen suodattamalla saostunut disykloheksyylivirtsa-aine pois, haihduttamalla suodos tyhjössä ja saostamalla jäännös etyyliasetaatin (10 ml) ja petrolieetterin (70 ml) seosta ja hiertämällä sen jälkeen metano-lilla (10 ml).

DC: (toluoli-asetoni (7:3)) R^ 0,20 (kloroformi-metanoli-vesi (14:6:1)) R^ 0,90 Vaihe 12.7 HC1.H-Phe-(D-Trp(NO2))-Lys(Boc)-Thr(But)-Phe-Gaba-OTmse 1,27 g Bpoc-Asn-Phe-Phe-(D-Trp(N02))-Lys(Boc)-Thr(But)-Phe-Gaba-OTmse^ sisältävän liuoksen pH, joka on valmistettu seokseen, jossa on 27 ml trifluorietanolia ja 3 ml vettä, pidetään arvossa 1,5 lisäämällä vähitelleen trifluorietanolin ja väkevän suolahapon (9:1)-seosta (lasielektrodi, automaattinen titrauslaite). Reaktion päättymiseen asti kuluu 1,5 tunnissa huoneen lämpötilassa noin 0,76 ml 68246 39 reagenssia. Tyhjössä haihduttamalla saatua raakatuotetta hämmennetään tunnin ajan 30 ml:n kanssa eetteriä ja suodatetaan.

DC: (kloroformi-metanoli (85:15)) 0,55.

Vaihe 12.7A

2-trimetyylisilyylietyyli-N-hydroksi-sukkiini-imidokarbonaat-ti (SEOC-ONsu)

Liuokseen, jossa on 100 g kloorimuurahaishappo-N-hydroksi-suk-kiini-imidiesteriä ja 73,2 g 2-trimetyylisilyylietanolia 160 ml:ssa metyleenikloridia, lisätään tipoittain 0-5°:ssa 15 minuutin kuluessa 62,6 g N-metyylimorfoliinia. Seosta hämmennetään 2 tuntia 0-5°: ssa, käsitellään edelleen lisäämällä litra eetteriä ja pestään kahdesti, kulloinkin 200 ml:lla IN HCl:a, 200 ml:lla vettä, 200 ml:lla 5 %:ista natriumvetykarbonaattiliuosta ja kolmesti 200 ml :11a vettä. Vesifaasit jälkiuutetaan 0,5 litralla eetteriä ja yhdistetyt orgaaniset faasit kuivataan natriumsulfaatilla ja haihdutetaan. Jäännös kiteytetään uudestaan 360 ml:sta di-isopropyylieetteriä ja muodostuneet kiteet suodatetaan pois ja pestään 150 ml:11a heksaania, sul.p.

101-102°.

Vaihe 12.7B

SEOC-Ans-OH

2,64 g L-asparagiinia sisältävän liuoksen pH, joka on valmistettu 80 ml dimetyyliformamidi-veden (6:2)-seokseen, pidetään arvossa 7,5 lisäämällä 0,21 ml 1-N natriumhydroksidia, ja sen jälkeen samalla kun pH pidetään arvossa 7,5, lisäämällä enemmän 1-N natriumhydroksidia automaattisella titrauslaitteella, siihen lisätään tipoittain liuos, jossa on 5,19 g SE0C-0Nsu:a (vaihe 12.7A) 10 ml:ssa di-metyyliformamidia tunnin aikana. 2,5 tunnin kuluttua suodatetaan pieni määrä liukenematonta ainesta pois ja suodokseen lisätään laimeaa suolahappoa määrä, joka on ekvivalentti kulutetun 1-N natrium-hydroksidimäärän kanssa (noin 20 ml). Liuos haihdutetaan suurtyh-jössä ja jäännös hierretään 30 ml :11a kylmää vettä ja suodatetaan, sul.p. 144,5-146,5° (hajoten).

DC: (kloroformi-metanoli-vesi (14:6:1)) 0,15

Vaihe 12.7C

SEOC-Asn-ONSU

Liuokseen, jossa on 1,72 g SEOC-Asn-OH:a (vaihe 12.7B),20 ml etyyliasetaattia ja 10 ml dimetyyliformamidia sisältävässä seoksessa, lisätään 0,79 g N-hydroksi-sukkiini-imidia ja 0-5°:seen jäähdytettyyn liuokseen lisätään 1,54 g DCCI:a. 2 tunnin kuluttua 0-5°: ssa saostunut disykloheksyylivirtsa-aine suodatetaan pois, suodos 68246 40 laimennetaan 150 ml:11a etyyliasetaattia ja pestään kolmesti, kulloinkin 50 ml:lla 1 %:ista oksaalihappoliuosta ja neljästi, kulloinkin 50 ml:lla vettä. Orgaaninen faasi kuivataan natriumsulfaatilla ja haihdutetaan tyhjössä; saatua vaahtoa käytetään ilman enempää puhdistamista seuraavassa vaiheessa.

DC: (kloroformi-metanoli-vesi (14:6:1)) 0,75.

Vaihe 12.7D

SEOC-Asn-Phe-OH

0,64 g fenyylialaniinia ja 1,44 g SEOC-Asn-ONSu:a (vaihe 12.7C) sisältävään suspensioon, joka on valmistettu 5 ml dimetyyliformami-dia ja 5 ml vettä sisältävään seokseen, lisätään puolen tunnin aikana huoneen lämpötilassa 1-N natriumhydroksidia automaattisella tit-rauslaitteella sellaisella nopeudella, että pH pysyy arvossa 7,5. Käsitellään edelleen suodattamalla pieni määrä liukenematonta ainesta pois ja lisäämällä suodokseen 0-5°:ssa laimeaa suolahappoa (noin 4,2 ml 1-N liuosta) ekvivalenttinen määrä kulutetun natriumhydrok-sidimäärän kanssa. Saostunut raakatuote kuivataan fosforipentok-sidilla ja kiteytetään uudestaan 40 ml:sta etyyliasetaattia; sul.p. 156-158° (hajoten).

DC: (kloroformi-metanoli-vesi (14:6:1)) 0,33

Vaihe 12.8 SEOC-Asn-Phe-Phe-(ϋ-Trp(N02))-Lys(Boc)-Thr(But)-Phe-Gaba-OTmse Liuos, jossa on 500 mg HCl.H-Phe-(D-Trp(N02))-Lys(Boc)-Thr(But)-Phe-Gaba-OTmse:a (vaihe 12.7), 202 mg SEOC-Asn-Phe-OH:a (vaihe 12.7D), 65 mg N-hydroksibentsotriatsolia ja 44 mg N-metyylimorfoliinia 5 ml: ssa dimetyyliformamidia, jäähdytetään 0°:seen ja siihen lisätään 116 mg DCCI:a, pidetään 15 minuuttia 0-5°:ssa ja 6 tuntia huoneen lämpötilassa. Saostunut disykloheksyylivirtsa-aine suodatetaan pois, suodos haihdutetaan suurtyhjössä ja jäännös hierretään 20 inl:n kanssa vettä ja imusuodatetaan. Raakatuote hierretään vielä kahdesti, kulloinkin 4 ml :11a metanolia ja suodatetaan.

DC: (kloroformi-metanoli (85:15)) R^ 0,80 (kloroformi-metanoli-vesi (14:6:1)) R^ 0,90 Vaihe 12.9

H-Asn-Phe-Phe-(D-Trp(N02))-Lys(Boc)-Thr(But)-Phe-Gaba-OH 530 mg SEOC-Asn-Phe-Phe-(D-Trp(N02))-Lys(Boc)Thr(But)-Phe-Gaba-OTmse^ (vaihe 12.8) liuotetaan 46,7 ml:aan vastavalmistettua vedetöntä 0,15M-tetraetyyliammoniumfluoridin dimetyyliformamidiliuos-ta ja pidetään tunti huoneen lämpötilassa. Liuos jäähdytetään 0-5°: seen, samalla huolellisesti hämmentäen siihen lisätään 0,70 ml 1-N

68246 41 suolahapon vesiliuosta ja väkevöidään suurtyhjössä 3 ml:ksi. Tuote saostetaan lisäämällä 30 ml vettä.

DC: (kloroformi-metanoli-vesi (14:6:1)) 0,45

Vaihe 12.10 ^-Asn-Phe-Phe- (ϋ-Trp (NO2) ) -Lys (Boc-The (But) -Phe-Gaba-^ Vastaavalla tavalla kuin esimerkissä 1 on kuvattu saadaan H-Asn-Phe-Phe-(ϋ-Trp(NOj))-Lys(Boc)-Thr(But)-Phe-Gaba-OH:a (vaihe 12.9) syklisoimalla DCCI:llaja N-hydroksibentsotriatsolilla. Raakatuote puhdistetaan vastavirtajakamalla (K = 1,08) .

DC: (kloroformi-metanoli (85:15)) R^ 0,45 (kloroformi-metanoli-vesi (14:6:1)) R^ 0,60 Esimerkki 13: *-Asn-Phe-Phe- (Trp (Br) ) -Lys-Thr-Phe-Gaba-^ (Symboli (Trp(Br)) tarkoittaa 5-bromi-L-tryptofaania). Otsikossa mainitun yhdisteen synteesi tapahtuu samoissa olosuhteissa kuin edellä esimerkissä 12, kuitenkin käyttämällä 5-bromi-L-trypto-faania 6-nitro-D-tryptofaanin asemesta vastaaviin lähtöaineisiin ja välituotteisiin. Vastavirtajako: 320 vaihetta, K = 9,0.

DC: systeemi 101 : R^ 0,60 111B: Rf 0,40 112A: Rf 0,52 Lähtöaine, jonka kaava on L-Asn-Phe-Phe- (Trp (Br)) -Lys (Boc) -Thr (But) -Phe-Gaba-1 valmistetaan seuraavalla tavalla.

Vaihe 13.1

Bpoc-Phe-(Trp(Br))-OH

Vastaavalla tavalla kuin esimerkissä 12.5A on kuvattu saatetaan 0,57 g 5-bromi-L-tryptofaani reagoimaan 1,00 g:n kanssa Bpoc-Phe-ONSu:a DC: (kloroformi-metanoli(85:15)) R^ 0,15 (kloroformi-metanoli-vesi (14:6:1)) Rf 0,55 Vaihe 13.2

Bpoc-Phe-(Trp(Br))-Lys(Boc)-Thr(But)-Phe-Gaba-OTmse Seos, jossa on 0,57 g Bpoc-Phe-(Trp(Br))-OH:a (vaihe 13.1), 0,63 g H-Lys(Boc)-Thr(But)-Phe-Gaba-OTmse:a (esimerkki 12.5), 0,13 g N-hydroksibentsotriatsolia ja 0,21 g DCCI:a saatetaan reagoimaan 42 68246 vastaavalla tavalla kuin esimerkissä 12.6 on kuvattu. Raakatuote puhdistetaan liuottamalla se 10 mlraan kuumaa metanolia ja saoste-taan jäähdyttämällä.

DC: (kloroformi-metanoli (85:15)) 0,80 (kloroformi-metanoli-vesi (14:6:1)] R^ 0,90 Vaihe 13.3 HCl.H-Phe-(Trp(Br))-Lys(Boc)-Thr(But)-Phe-Gaba-OTmse Esimerkkiä 12.7 vastaavasti käsitellään 0,84 g Bpoc-Phe-(Trp(Br))-Lys(Boc)-Thr(But)-Phe-Gaba-OTmse:a.

DC: (kloroformi-metanoli (85:15)) R^ 0,65 (kloroformi-metanoli-vesi (14:6:1)) Rf 0,90.

Vaihe 13.4 SEOC-Asn-Phe-Phe-(Trp(Br))-Lys(Boc)-Thr(But)-Phe-Gaba-OTmse Vastaavalla tavalla kuin esimerkissä 12.8 on kuvattu kytketään 700 mg HCl.H-Phe-(Trp(Br))-Lys(Boc)-Thr(But)-Phe-Gaba-OTmse:a (vaihe 13.3) ja 250 mg SEOC-Asn-Phe-OH:a (esimerkki 12.7D) 146 mg :11a DCCI:a käyttämällä mukana 88 mg N-hydroksibentsotriatsolia ja 60 mg N-metyylimorfoliinia.

DC: (kloroformi-metanoli (85:15)) R^ 0,77 (kloroformi-metanoli-vesi (14:6:1)) R^ 0,85.

Vaihe 13.5 H-Asn-Phe-Phe-(Trp(Br))-Lys(Boc)-Thr(But)-Phe-Gaba-OH Esimerkkiä 12.9 vastaavasti lohkaistaan 500 mg:sta SEOC-Asn-Phe-Phe-(Trp(Br))-Lys(Boc)-Thr(But)-Phe-Gaba-OTmse:a (vaihe 13.4) SEOC- ja Tmse-ryhmä samanaikaisesti.

DC: (kloroformi-metanoli-vesi (14:6:1)) R^ 0,50.

Vaihe 13.6 ^Asn-Phe-Phe- (Trp (Br)) -Lys (Boc) -Thr (But) -Phe-Gabä-^ Syklisoimalla H-Asn-Phe-Phe-(Trp(Br))-Lys(Boc)-Thr(But)-Phe-Gaba-OH :a DCCI:11a ja N-hydroksibentsotriatsolilla esimerkissä 1.10 kuvatulla tavalla saadaan raakatuote, jota puhdistetaan vastavirta-jakamalla (K = 0,86).

DC: (kloroformi-metanoli (85:15)) R^ 0,06 (kloroformi-metanoli-vesi (14:6:1)) Rf 0,85.

Il 68246 43

Esimerkki 14: ^-Asn-Phe-Phe- (D-Trp) -Lys-Thr- (phe (J)) -Gaba-^ 130 mg ^Asn-Phe-Phe- (D-Trp) -Lys (Boc) -Thr- (Phe (J) j -Gaba-^:a käsitellään esimerkkiä 1 vastaavasti trifluorietikkahapolla ja muutetaan ioninvaihtajalla asetaatiksi. Puhdistus tapahtuu vastavirta-jaolla samassa systeemissä kuin esimerkissä 1 on mainittu; K = 9.

DC; (piihappogeeli, Merck); systeemi 157C : 0,25.

(Symboli Ph(J) tarkoittaa p-jodi-L-fenyylialaniinia).

Lähtöaine valmistetaan seuraavalla tavalla;

Vaihe 14,1 Z-(D-Trp)-Lys(Boc)-Thr-OMe

Liuokseen, jossa on 2,78 g Z-(D-Trp)-Lys(Boc)-OH:a (esimerkki 1.3A), 0,85 g H-Thr-OMe-hydrokloridia ja 0,77 g N-hydroksibentso-triatsolia 16 ml:ssa asetonitriiliä, lisätään -5°:ssa 0,56 ml N-metyylimorfoliinia ja 1,03 g DCCI;a. 15 tunnin kuluttua -5°:ssa seosta käsitellään edelleen vaihetta 14.3B vastaavasti. Tuote kiteytetään uudestaan etyyliasetaatti-heksaanista; sul.p. 120-122°.

DC; systeemi 157A ; R^ 0,47.

Vaihe 14.IA

SEOC-Asn-Phe-Phe-OH

Liuos, jossa on 2,24 g Z-Asn-Phe-Phe-OH:a 40 ml:ssa dimetyyli-formamidia, hydrataan lisäämällä 0,23 g Ph-hiiltä (10 %) 4 tunnin ajan huoneen lämpötilassa. Katalysaattorin poissuodattamisen jälkeen liuos väkevöidään suurtyhjössä noin 5 ml:ksi ja käsitellään edelleen suoraan tässä muodossa. Liuokseen, jossa on 1,71 g saatua H-Asn-Phe-Phe-OH;a 15 ml:ssa dimetyyliformamidia, lisätään 10 ml vettä ja saadun suspension pH pidetään arvossa 7,5 sen jälkeen kun on lisätty 1,04 g SEOC-ONSu:a lisäämällä vähitellen 2-N natriumhyd-roksidia automaattisella titrauslaitteella 2 tunnin ajan (huoneen lämpötilassa). Lisätään vielä 1,04 g SEOC-ONSu:a ja pidetään sitten 4 tuntia pH-arvossa 7,5. Käsitellään edelleen suodattamalla liuoksesta pieni määrä liukenematonta ainesta pois, lisäämällä suo-dokseen 0-5°:ssa kulutetun natriumhydroksidimäärän kanssa ekvivalentti määrä suolahappoa (noin 8,0 ml 2-N liuosta), saostunut tuote suodatetaan ja kuivataan. Raakatuote saostetaan kerran uudestaan 10 ml:sta metanolia 100 ml:ssa eetteriä ja 10 ml:sta metanolia 80 ml:ssa vettä, sul.p. 176-182° (hajoten).

DC; (kloroformi-metanoli-vesi (14:6:1)) R^ 0,30.

44

Vaihe 14.2 68246 SEOC-Asn-Phe-Phe-(D-Trp)-Lys(Boc)-Thr-OMe

Liuos, jossa on 340 mg Z-(D-Trp)-Lys(Boc)-Thr-OMe:a (vaihe 14.1) seoksessa, jossa on 15 ml metanolin ja vedne (9:1)-seosta, hydrataan käyttämällä mukana 50 mg palladium-hiiltä (10 %) ja lisäämällä 0,2-N suolahappoa samassa liuotinaineessa pH-arvossa 4,5. Katalysaattorin poissuodattamisen jälkeen suodos väkevöidään tyhjössä ja haihdutetaan vielä kahdesti dimetyyliformamidilla. Jäljelle jäävään liuokseen (yhteensä 1,5 g) lisätään 285 mg SEOC-Asn-Phe-Phe-OH:a (vaihe 14.IA) ja 90 mg N-hydroksibentsotriatsolia. -5°:ssa lisätään 0,056 mg N-metyylimorfoliinia ja 123 mg DCCI:a ja pidetään 18 tuntia -5°:ssa. Edelleenkäsittely tapahtuu esimerkkiä 7.1 vastaavasti; raakatuote kiteytetään uudestaan vesipitoisesta trifluorieta-nolista.

DC: systeemi 157a : 0,45.

Vaihe 14.3 SEOC-Asn-Phe-Phe-(D-Trp)-Lys(Boc)-Thr-hydratsidi

Liuokseen, jossa on 355 mg SEOC-Asn-Phe-Phe-(D-Trp)-Lys(Boc)-Thr-OMe:a (vaihe 14.2) 1,1 ml:ssa dimetyyliformamidia, lisätään huoneen lämpötilassa 0,16 ml hydratsiinihydraattia. 2 1/2 tunnin kuluttua kiinteä massa hierretään 5 ml:n kanssa vettä, saostuma imu-suodatetaan ja pestään vedellä, kunnes hydratsiini on poistettu täydellisesti. Hiertämisen jälkeen metanolista on saatu yhtenäinen tuote.

DC: systeemi 157B : Rf 0,25.

Vaihe 14.3A

Boc-(phe(J))-OH

Liuokseen, jossa on 2,9 g p-jodi-L-fenyylialaniinia 10 mlrssa 1-N natriumhydroksidia ja 25 ml:ssa tert.-butanolia, lisätään 2,4 ml di-tert.-butyyli-dikarbonaattia ja hämmennetään edelleen huoneen lämpötilassa 3 tuntia ja seisotetaan 20 tuntia. Reaktioliuos jaetaan veteen ja heksaaniin; orgaaninen faasi hävitetään ja vesifaasi hapotetaan samalla jäällä jäähdyttäen, tuote liuotetaan etyyliasetaattiin ja liuotin haihdutetaan tyhjössä. Tuote puhdistetaan kiteyttämällä hiilitetrakloridistä; sul.p. 118-120°.

DC: systeemi 157B : R^ 0,35.

Vaihe 14.3B

Boc-(Phe(J))-Gaba-OTmse

Liuokseen, jossa on 406 mg Η-Gaba-OTmse:a (esimerkki 12.2), 68246 45 782 mg Boc-(phe(J))-OH:a (vaihe 14.3A) ja 306 mg N-hydroksibentso-triatsolia 5 mlrssa asetonitriiliä ja 3 ml:ssa dimetyyliformamidia, lisätään +5°:ssa liuos, jossa on 412 mg DCCI:a 1 ml:ssa dimetyyliformamidia. 20 tunnin kuluttua 5°:ssa saostunut disykloheksyyli-virtsa-aine suodatetaan pois, suodos laimennetaan etyyliasetaatilla ja ravistellaan laimealla suolahapolla ja natriumvetykarbonaattiliuok-sella. Kuivaamisen jälkeen natriumsulfaatilla liuotin haihdutetaan pois ja tuote kiteytetään uudestaan heksaanista; sul.p. 98-100°.

DC: (sykloheksaani-asetoni (7:3)) 0,35 systeemi 157A 0,68.

Vaihe 14.3C

H-(phe(J))-Gaba-OTmse-hydrokloridi

Liuokseen, jossa on 345 mg Noc-(Phe(J)J-Gaba-OTmse:a (vaihe 14.3B) 0,7 ml:ssa trifluorietanoli-veden (9:1)-seoksessa, lisätään huoneen lämpötilassa 1,5 ml 1,2-N suolahappoa samassa liuottimessa.

30 minuutin kuluttua seokseen lisätään 10 ml tert.-butanolia ja vä-kevöidään tyhjössä noin puoleen tilavuuteen. Tämä toimenpide toistetaan vielä kolmesti, minkä jälkeen jäljellä oleva tert.-butanoli poistetaan lyofilisoimalla. Jäännös kiteytetään uudelleen isopro-panoli-eetteristä.

DC: systeemi 157C : R^ 0,68.

Vaihe 14.4 SEOC-Asn-Phe-Phe-(D-trp)-Lys(Boc)-Thr-(Phe(J))-Gaba-OTmse

Liuokseen, jossa on 320 mg SEOC-Asn-Phe-Phe-(D-Trp)-Lys(Boc)-Thr-hydratsidia (vaihe 14.3) 2 ml:ssa dimetyyliformamidia lisätään -15 - -20°:ssa 0,14 ml 5,3-N suolahapon dioksaaniliuosta ja 0,04 ml tert.-butyylinitriittiä ja hämmennetään 15 minuuttia tässä lämpötilassa. Sen jälkeen lisätään -25°:ssa liuos, jossa on 193 mg H-(phe(J))-Gaba-OTmse«hydrokloridia 0,5 ml:ssa dimetyyliformamidia ja 0,18 ml:ssa N-metyylimorfoliinia, lämmitetään hitaasti 0°:seen ja seisotetaan 16 tuntia tässä lämpötilassa. Tuote saostetaan tiputtamalla se veteen ja hiertämällä metanolilla ja asetonitriilillä.

DC: (kloroformi-trilfuorietanoli-metanoli (80:15:5)) R^ 0,43.

Vaihe 14.5

H-Asn-Phe-Phe-(D-Trp)-Lys(Boc)-Thr-(Phe(J))-Gaba-OH

Liuokseen, jossa on 324 mg SEOC-Asn-Phe-Phe-(D-Trp)-Lys(Boc)-Thr-(Phe(J))-Gaba-OTmse:a (vaihe 14.4) 2 mlrssa dimetyyliformamidia, lisätään 12,3 ml 0,34-M tetraetyyliammoninnfluoridin dimetyylisul-foksidiliuosta ja pidetään 1 1/2 tuntia 30°:ssa. Tuote saostetaan tiputtamalla se 40 ml:aan jääkylmää vettä, joka sisältää 0,41 ml 46 68246 l-N suolahappoa, ja käytetään kuivaamisen jälkeen seuraavassa vaiheessa .

DC: systeemi 157 : R- 0,5.

Vaihe 14.6 ^-Asn-Phe-Phe- (D-Trp) -Lys (Boc) -Thr- (Phr (J)) -Gaba-1

Liuos, jossa on 258 mg H-Asn-Phe-Phe-(D-Trp)-Lys(Boc)-Thr-(phe(J))-Gaba-OH:a, 300 mg N-hydroksibentsotriatsolia ja 410 mg DCCI:a 200 ml:ssa dimetyyliformamidia, seisotetaan 20 tuntia 50°: ssa. Edelleenkäsittely ja puhdistus tapahtuu esimerkkiä 8.2 vastaavasti; K = 1,1.

DC: systeemi 157A : 0,22.

Esimerkki 15:

^Asn-Phe-Phe- (D-Trp) -Lys-Thr-Tyr (But) -Gaba-J

Liuokseen, jossa on 350 mg kaavan ^-Asn-Phe-Phe- (D-Trp) -Lys (SEOC) -Thr-Tyr (But) -Gaba-I mukaista yhdistettä 1,2 ml:ssa dimetyyliformamidia, lisätään 0,7 ml 2,1-M tetrabutyyliammoniumfluoridin dimetyylisulfoksidiliuosta ja pidetään 20 tuntia 30°:ssa. Lisätään 20 ml l-N etikkahappoa ja 50 ml etyyliasetaattia, minkä jälkeen vesifaasi erotetaan, orgaaninen faasi uutetaan vielä kahdesti pienellä määrällä vettä ja yhdistetyt vesiliuokset väkevöidään tyhjössä ja lyofilisoidaan. Jäännös, joka koostuu tuotteen ja tetrabutyyliammoniumfluoridin seoksesta, erotetaan preparatiiv.isella ohutkerroskromatografoinnilla piihappogeelil-lä, systeemissä 157C. Piihappogeelistä eristetty, ei vielä täysin puhdas tuote puhdistetaan vastavirtajakamalla systeemissä klorofor-mi-hiilitetrakloridi-metanoli-0,05 M ammoniumasetaatti (9:1:7:3) 460 vaiheessa. Puhdas tuote (K = 0,9) eristetään tavanomaiseen tapaan.

DC: (piihappogeeli, Merck): systeemi 157C : 0,25.

Lähtöaine valmistetaan seuraavalla tavalla:

Vaihe 15.1 Z-(D-Trp)-Lys-OH.trifluoriasetaatti 3,4 g Z-(D-Trp)-Lys(Boc)-OH:a (esimerkki 1.3A) lisätään samalla jäällä jäähdyttäen 34 ml:aan trifluorietikkahappo-veden (9:1)-seosta, joka sisältää 0,5 ml 2-merkaptoetanolia, ja heti kun tämä on liuennut, pidetään vielä 40 minuuttia 23°:ssa. Tiputtamalla 400 ml:aan eetteriä ja 150 ml:aan heksaania saostuu raakatuote ja se

II

68246 47 liuotetaan 30 ml:aan vettä. Annetaan seistä huoneen lämpötilassa 18 tuntia, minkä jälkeen jäännös lyofilisoidaan ja jäännöstä käytetään suoraan seuraavassa vaiheessa.

DC: systeemi 157 : 0,35.

Vaihe 15.2

Z-(D-Trp)-Lys(SEOC)-OH

Liuokseen, jossa on 3,0 g Z-(D-Trp)-Lys-OH*trifiuoriasetaat-tia (vaihe 15.1) ja 1,47 g (2-trimetyylisilyylietyyli)-(N-hydroksi)-sukkiini-imidokarbonaattia (esimerkki 12.7A) 5,2 ml:ssa dimetyyli-formamidia lisätään huoneen lämpötilassa 0,87 ml trietyyliamiinia ja annetaan seistä 15 tuntia. Laimentamisen jälkeen etyyliasetaatilla hapotetaan suolahapolla pH-arvoon 1-2, etyyliasetaattiliuos pestään vedellä, kuivataan natriumsulfaatilla ja haihdutetaan. Raa-katuote puhdistetaan vastavirtajakamalla 140 vaiheessa, esimerkissä 1.10 kuvatussa systeemissä; K = 0,75.

DC: systeemi 157C : Rf 0,55.

Vaihe 15.3 Z-(D-Trp)-Lys(SEOC)-Thr-OMe

Liuokseen, jossa on 3,16 g Z-(D-Trp)-Lys(SEOC)-OH:a (vaihe 15.2), 1,32 g H-Thr-OMe·hydrokloridia ja 0,95 g N-hydroksibentso-triatsolia 25 ml:ssa asetonitriiliä, lisätään -5°:ssa 0,86 ml N-metyylimorfoliinia ja 1,34 g DCCI:a ja annetaan seistä 16 tuntia tässä lämpötilassa. Disykloheksyylivirtsa-aineen poissuodattami-sen jälkeen saatu suodos laimennetaan etyyliasetaatilla, pestään laimealla suolahapolla ja natriumvetykarbonaattiliuoksella ja kuivataan natriumsulfaatilla. Liuottimen poishaihduttamisen jälkeen saatu jäännös kromatografoidaan etyyliasetaatti-heksaanin (7:3)-(9:1)-seoksella piihappogeelipylväässä. Ohutkerroskromatograafisesti puhtaat fraktiot haihdutetaan kuiviin.

DC: systeemi 157A : R^ 0,38.

Vaihe 15.4 Z-Asn-Phe-Phe-(D-Trp)-Lys(SEOC)-Thr-OMe

Liuos, jossa on 1,31 g Z-(D-Trp)-Lys(Boc)-Thr-OMe:a 30 ml:ssa metanoli-vettä (95:5) hydrataan 130 mg:lla palladium-hiiltä (10 %) 2 tunnin ajan. Katalysaattorin poissuodattamisen jälkeen suodos väkevöidään ja haihdutetaan kahdesti dimetyyliformamidilla suurtyh-jössä. Saatuun liuokseen, joka sisältää 3,5 ml dimetyyliformamidia, lisätään 1,01 g Z-Asn-Phe-Phe-OH:a (esimerkki 1.5A) ja 330 mg N-hydroksibentsotriatsolia, jäähdytetään -5°:seen, käsitellään liuoksella, jossa on 440 mg DCCI:a 0,5 ml:ssa dimetyyliformamidia, anne- 68246 48 taan seistä 15 tuntia 0°:ssa ja käsitellään edelleen esimerkkiä 7.1 vastaavasti.

DC: systeemi 157A : 0,45.

Vaihe 15.5 Z-Asn-Phe-Phe-(D-Trp)-Lys(SEOC)-Thr-hydratsidi

Liuokseen, jossa on 2,0 g Z-Asn-Phe-Phe-(D-Trp)-Lys(SEOC)-Thr-OMe:a 6 ml:ssa dimetyyliformamidia lisätään huoneen lämpötilassa 0,85 ml hydratsiinihydraattia. 2,15 tunnin kuluttua käsitellään

edelleen kuten esimerkissä 14.3 on kuvattu. Tuotteen vaikealiukoi-suuden vuoksi sitä ei voida tutkia ohutkerroskromatograafisesti. Vaihe 15.5A

Trt-Tyr(But)-OH•dietyyliammoniumsuola

Liuokseen, jossa on 4,0 g H-Tyr(But)-OH:a 50 ml:ssa kloroformia, lisätään 6,7 ml vettä, 6,7 ml dietyyliamiinia ja samalla jäällä jäähdyttäen 30 minuutin kuluessa 7,05 g trifenyylikloorimetaania. 1 1/2 tunnin kuluttua vesifaasi erotetaan, kloroformiliuosta ravistellaan kahdesti kulloinkin 4 %:sella dietyyliamiinin vesiliuoksella ja kyllästetyllä keittosuolaliuoksella, kuivataan natriumsulfaa-tilla ja liuotin poistetaan tyhjössä. Jäännös kiteytetään eetteri-petrolieetteristä; sul.p. 141-145°.

DC: (toluoli-asetoni (1:1)) 0,48.

Vaihe 15.5B

Trt-Tyr(But)-ONSu 4,7 g Trt-Tyr(But)-OH-dietyyliammoniumsuolaa (vaihe 15.5A) ravistellaan samalla jäällä jäähdyttäen 100 ml:n kanssa etyyliasetaattia ja kulloinkin 10 ml:n kanssa 0,5-M kaliumsulfaatti- ja kaliumve-tysulfaattiliuosta. Etyyliasetaattiliuoksesta poistetaan alempi faasi, minkä jälkeen se pestään vedellä ja kuivataan natriumsulfaa-tilla ja liuotin poistetaan tislaamalla varovasti tyhjössä. Jäännös liuotetaan 50 ml:aan dimetyyliformamidia, siihen lisätään 1,1 g N-hydroksisukkiini-imidiä ja 0°:ssa 1,94 g DCCI:a ja seisotetaan 15 tuntia +5°:ssa. Disykloheksyylivirtsa-aineen poissuodattamisen jälkeen suodoksesta saostetaan vedellä raakatuote, joka kromatografoi-daan piihappogeelipylväässä kloroformilla. Fraktiot, jotka ohutkerroskromatograaf isesti sisältävät tuotteen, yhdistetään ja kiteytetään uudestaan metanolista; sul.p. 163-164°.

DC: (kloroformi-etyyliasetaatti (1:1)) Rf 0,53.

Il 68246 49

Vaihe 15.5C

Trt-Tyr(But)-Gaba-OBzl

Suspensioon, jossa on 580 mg Trt-Tyr(But)-ONSu:a (vaihe 15.5B) ja 730 mg Η-Gaba-OBzl*p-toluolisulfonaattia (esimerkki 1.7A) 1 ml:ssa puhdasta kloroformia, lisätään 0,77 ml N-metyylimorfoliinia ja pidetään 4 vuorokautta huoneen lämpötilassa. Laimentamisen jälkeen etyyliasetaatilla liuosta ravistellaan, samalla jäällä jäähdyttäen, 0,2-N kaliumvetysulfaattiliuoksella ja vedellä, orgaaninen faasi kuivataan natriumsulfaatilla ja liuotin tislataan pois. Raakatuote kro-matografoidaan piihappogeelillä. Puhdas tuote eluoidaan etyyliasetaatin ja heksaanin (1:1)-seoksella ja eristetään tavanomaiseen tapaan. DC: (toluoli-asetoni (8:2)) 0,5.

Vaihe 15.5D

H-Tyr(But)-Gaba-OBzl·hydrokloridi

Liuokseen, jossa on 620 mg Trt-Tyr(But)-Gaba-OBzl:a (vaihe 15.5C) 20 ml:ssa trifluorietanoli-veden (9:1)-seosta, lisätään automaattisella titrauslaitteella pH-arvossa 3,5 1,2-N suolahappoa samassa liuottimessa, kunnes kulutusta ei enää tapahdu. Lisätään 20 ml tert.-butanolia ja haihdutetaan tyhjössä. Tämä toistetaan vielä kahdesti ja jäljellä oleva tert.-butanoli poistetaan lyofilisoimalla. Trifenyylikarbanolin poistamiseksi lyofilisaatti jaetaan veteen ja eetteriin, minkä jälkeen vesiliuos lyofilisoidaan.

DC: systeemi 157B : Rf 0,5.

Vaihe 15.6 Z-Asn-Phe-Phe-(D-Trp)-Lys(SEOC)-Thr-Tyr(But)-Gaba-OBzl

Liuokseen, jossa on 975 mg Z-Asn-Phe-Phe-(D-Trp)-Lys(SFOC)-Thr-hydratsidia (vaihe 15.5) 7 ml:ssa dimetyyliformamidia, lisätään -15 - -20°:ssa 0,47 ml 4,6-N suolahapon dioksaaniliuosta ja 0,11 ml tert.-butyylinitriittiä. 15 minuutin kuluttua lisätään tähän reak-tioseokseen -25°:ssa liuos, jossa on 385 mg H-Tyr(But)-Gaba-OBzl· hydrokloridia (vaihe 15.5D) 0,5 ml:ssa dimetyyliformamidia ja 0,44 ml:ssa N-metyylimorfoliinia ja seoksen annetaan seistä 15 tuntia 0°:ssa. Tuote seostetaan vedellä ja puhdistetaan hiertämällä aseto-nitriilillä ja metanolilla. Tuotteen liukenemattomuuden vuoksi ei ohutkerroskromatografointikontrollia voida suorittaa.

Vaihe 15.7

H-Asn-Phe-Phe-(D-Trp)-Lys(SEOC)-Thr-Tyr(But)-Gaba-OH

Liuosta, jossa on 1,1 g Z-Asn-Phe-Phe-(D-Trp)-Lys(SEOC)-Thr-Tyr (But)-Gaba-OBzl:a 30 ml:ssa dimetyyliformamidia, hydrataan käyttämällä mukana 100 mg palladium-hiiltä (10 %) 3 tuntia. Katalysaat- 68246 50 tori imusuodatetaan pois, suodos väkevöidään ja tuote saostetaan vedellä. Puhdistetaan liuottamalla se 5 ml:aan dimetyyliformamidia ja saostamalla 15 ml :11a metanolia.

DC: systeemi 157 : 0,55.

Vaihe 15.8 ^-Asn-Phe-Phe- (D-Trp) -Lys (SEOC) -Thr-Tyr (But) -Gaba-I Liuosta, jossa on 700 mg H-Asn-Phe-Phe-(D-Trp)-Lys(SEOC)-Thr-Tyr (But)-Gaba-OH:a (vaihe 15.7), N-hydroksibentsotriatsolia ja 1,11 g DCCI:a 540 ml:ssa dimetyyliformamidia, syklisoidaan 21 tuntia 50°:ssa. Käsitellään edelleen esimerkkiä 7.3 vastaavasti. Puhdistetaan pylväskromatografoimalla piihappogeelillä, puhdas aine elu-oidaan kloroformi-trifluorietanoli-metanolin (87:5:8)-seoksella.

DC: systeemi 157B : R^ 0,38.

Claims

51 68246

1. Menetelmä terapeuttisesti aktiivisten syklopeptidien valmistamiseksi, joiden kaava on Lr - Phe - Phe - trp - Lys - Thr - Phe (W) - X - Y I 56 7 8 9 10 11 12 13 jossa R on Asn, Ala tai des-R-, trp on D-Trp tai L-Trp, jonka bentsee-nirengas voi olla substituoitu halogeeniatomeilla tai nitroryhmillä, W tarkoittaa L-fenyylialaniinitähteen bentseenirenkaassa substituent-tina läsnäolevaa, mahdollisesti eetteröityä hydroksyyliryhmää tai halogeeniatomia tai vetyä, X tarkoittaa ω-amino-(C^-C^)-aikaani-(mono tai di)-karboksyylihapon tähdettä, tai on des-X, ja Y tarkoittaa ω-amino-(C^-C^)-aikaani-(mono- tai di-)karboksyylihapon tähdettä tai on des-Y, sekä näiden happoadditiosuolojen ja kompleksien valmistamiseksi, tunnettu siitä, että a) yhdisteestä, jonka kaava on L R - Phe -"Phe - trp - Lys(A) - Thr(B) - Phe(W)- X - Y J II jossa R, W, X, Y ja trp tarkoittavat samaa kuin edellä, A tarkoittaa e-aminosuojaryhmää tai vetyä ja B hydroksyylisuojaryhmää tai vetyä, jolloin vain toinen symboleista A ja B voi tarkoittaa vetyä, lohkaistaan suojaryhmä(ryhmät) tai b) lineaarinen peptidi, jonka kaava on H - (il'j - C III jossa II' tarkoittaa edellä määriteltyä kaavaa II vastaavaa tähdettä, jossa amidisidos kahden mielivaltaisen, vierekkäisen peptidiren-kaan aminohappotähteen välillä on katkaistu, ja C tarkoittaa vapaata hydroksyyliryhmää, aktivointiryhmällä muunneltua hydroksyyliryhmää tai hydratsinoryhmää -NH-NH2, syklisoidaan samalla suojaten lysiini-tähteen ε-aminoryhmä, ja sen jälkeen lohkaistaan suojaryhmät ja haluttaessa vapautetaan saadusta happoadditiosuolasta vastaava emäs ja/tai muutetaan saatu emäs happoadditiosuolaksi.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu ]Γ 52 68246 siitä, että kaavan II mukainen lähtöaine, jossa A tarkoittaa tert.-butoksikatbonyyliryhmää ja B tert.-butyyliryhmää, käsitellään tri-fluorietikkahapolla.

3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että valmistetaan yhdiste, jossa ω-amino-(C^-C^)-alkaanimono-karboksyylihapon tähde vastaa kaavaa - NH - (CH2)n - CO -jossa n on kokonaisluku 2-4.

4. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että valmistetaan yhdiste, jossa R tarkoittaa Asn tai des-R, Q tryptofaani -tähteellä on D-konfiguraatio ja -X-Y- yhdessä tarkoittaa ryhmää - (Gaba) -, jossa p on 0, 1 tai 2.

5. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnett u siitä, että valmistetaan yhdiste, jonka kaava on L Asn - Phe - Phe - (D-Trp) - Lys - Thr - Phe - Gaba -f

6. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että valmistetaan yhdiste, jonka kaava on ^ Asn - Phe - Phe - (D-Trp) - Lys - Thr - Phe - Gaba - Gaba Patentkray: