NO148957B

NO148957B - Analogifremgangsmaate til fremstilling av terapeutisk aktive cyklopeptider.

Info

Publication number: NO148957B
Application number: NO783268A
Authority: NO
Inventors: Hans Rink; Bruno Kamber; Peter Sieber
Original assignee: Ciba Geigy Ag
Priority date: 1977-09-28
Filing date: 1978-09-27
Publication date: 1983-10-10
Also published as: DK428478A; NO783268L; IE47380B1; JPS6218560B2; FI782907A; HU184612B; ATA698278A; FI68246C; JPS5459293A; ES473677A1; IE781931L; EP0001295B1; DK151034B; EP0001295A2; AT370090B; NZ188517A; DK151034C; FI68246B; DE2861672D1; LU78191A1

Description

Oppfinnelsen vedrører analogifremgangsmåte til fremstilling av terapeutisk aktive cyklopeptider, som inneholder vesentlige trekk av Somatostatin, som delsekvensen av aminosyrene 5-11, eller en ekvivalent sekvens, imidlertid derved er svovelfri. Somatostatin-analoge cyklopeptider ifølge oppfinnelsen omfatter forbindelser med formel:

hvori R betyr Asn, Ala eller des-R, trp. betyr D-trp. eller L-trp., som kan være substituert i benzenringen med halogenatomer, samt spesielt klor eller fluor, eller nitrogrupper,

W betyr hydrogen eller en fri eller foretret hydroksylgruppe

• eller et halogenatom, spesielt jodatom, som er substituert

på benzenringen i L-fenylalaninresten, X' betyr resten av en w-aminolaverealkan-(mono eller di)-karboksylsyre eller des-X og Y betyr resten av en w-aminolaverealkan-

(mono eller di)-karboksylsyre eller des-Y, med unntak for en forbindelse, hvor R betyr des-R, trp. betyr D-trp. eller L-trp., W betyr hydrogen, et av symbolene X og Y betyr des-X resp. des-Y, og det andre betyr resten av 7-aminoheptansyre, samt syreaddisjonssalter og komplekser herav.

De i benzenringen av tryptofan Q-resten eventuelt tilstedeværende halogenatomer befinner seg fortrinnsvis i 5-stilling, nitrogruppen fortrinnsvis i 6-stilling, spesielt å nevne er restene avledet fra 5-brom-L-tryptofan, 5-fluor-D-tryptofan og 6-nitro-D-tryptofan. Substituenten W av L-fenylalanin^-resten befinner seg fortrinnsvis i p-stilling av benzenringen, spesielt foretrukket ved siden av den usubstituerte L-fenylalanin-rest er også p-jod-L-fenylalanin og p-hydroksy-L-fenylalanin-resten. Hydroksygruppen av sistnevnte rest (dvs.av L-tyrosinresten) kan

også foreligge i en foretret form, hertil er det egnet laverealkyler, samt forskjellig i peptidkjemien vanlige eterdannende hydroksylbeskyttelsesgrupper, f.eks. de videre nedenfor nevnte, spesielt foretrukket er tert.-butylgruppen, og den foretrukne aminosyre"'""'"-resten avleder seg fra p-tert.-butoksyfenylalanin (dvs. tyrosin-tert.-butyleter).

Resten av en oj-aminolaverealkanmonokarboksylsyre er fortrinnsvis en rest med formel:

hvori n betyr et helt tall fra 1 til 7, spesielt 2-4. Spesielt foretrukket er resten av y-aminosmørsyren, som betegnes med symbolet Gaba.

Resten av en w-aminolaverealkandikarboksylsyre avleder seg fortrinnsvis fra en rest med formel: hvori n har ovennevnte betydning og karboksylgruppen også kan fore ligge i en funksjonelt modifisert form, f.eks. som en ester eller et amid, som en i peptidkjemien vanlig ester eller et usubstituert amid. Spesielt foretrukket er en rest av L- eller spesielt D-glutaminsyre med formel:

eller en tilsvarende rest, hvor det i stedet for karboksylgruppen befinner seg karbamoylgruppen.

Overensstemmende med vanlige nomenklatorisk bruk betyr forstavelsen "des" mangelen av et dermed betegnet symbol, således betyr f.eks. uttrykket " des-X", at symbolet X har betydningen /5c7m/ hvori m = 0, og er å utelate i den tilsvarende formel.

De foretrukne Somatostatin-analoge fremstilt ifølge oppfinnelsen er slike, hvori R betyr fortrinnsvis Asn eller des-R, tryptofan g-

resten har D-konfigurasjonen og -X-Y- sammen betyr -/GabaJ7 -,

Cr

hvori p er lik 0, 1 eller 2. Som spesielt foretrukket er å frem-heve forbindelsene med formel:

hvori p = 2 eller spesielt p = 1. Alle disse foretrukne Somatostatin-analoger kan også foreligge i form av syreaddisjonssalter eller komplekser.

Som syreaddisjonssalter kommer det spesielt i betraktning fysiologisk tålbare salter med vanlige terapeutisk anvendbare syrer, av de uorganiske syrer er det å nevne halogen^ hydrogen-syrene som klorhydrogensyre eller også svovelsyre og fosfor- resp. pyrofosforsyre, av de organiske syrer er det i første rekke sulfon-syrene som benzen- eller p-toluen-sulfonsyre eller laverealkan-sulfonsyrer, som metansulfonsyre, videre også karboksylsyrer, som eddiksyre, melkesyre, palmitin- og stearinsyre, eplesyre, vinsyre, ascorbinsyre og sitronsyre.

Med komplekser er det å forstå de i deres struktur

ikke helt avklarte forbindelser som oppstår ved tilsetning av visse uorganiske eller organiske stoffer til peptidene, og gir disse en forlenget virkning. Slike stoffer er eksempelvis omtalt'for ACTH og andre adrenocorticotrop virksomme peptider. Til å nevne er f.eks. uorganiske forbindelser som avleder seg fra metaller som kalsium, magnesium, aluminium, kobolt og spesielt sink, fremfor alt tungtoppløselige salter som fosfater, pyrofosfater og polyfos-fater samt hydroksyder av disse metaller, videre alkalimetallpolyfosfater, f.eks. "Calgon N", "Calgon 322", "Calgon 188" eller "Polyron B 12". Organiske stoffer som frembringer en forlenget virkning er eksempelvis ikke antigene gelatin-typer, f.eks. polyoksygelatiner, polyvinylpyrrolidon og karboksymetylcellulose, videre sulfonsyre- eller fosforsyreester av alginsyre, dextran, polyfenoler og polyalkoholer, fremfor alt polyfloretinfosfat og fytinsyre, samt polymerisater og kopolymerisater av basiske eller fremfor alt sure aminosyrer, f.eks. protamin eller polyglutaminsyre.

Når intet annet er angitt betegner begrepet "lavere", hvor det alltid forekommer i forbindelse med en organisk rest eller forbindelse en slik rest eller forbindelse med maksimalt 7, fortrinnsvis imidlertid med maksimalt 4 karbonatomer.

De nye cyklopeptider fremstilt ifølge oppfinnelsen har en fysiologisk virkning som i karakter og intensitet er ekvivalent virk-ningen av Somatostatin. De kan derfor anvendes i tilsvarende terapeutiske indikasjoner som dette, f.eks. til behandling av funksjonsforstyrrelser, hvori sekresjonen av veksthormonet eller insulinet og glucagon er overnormal, som ved acromegali eller juvenil diabetes.

Somatostatin, et cyklisk tetradecapeptid med formel:

(Science 179, 77 (1973)) hemmer som kjent den hypofysestyrte sekresjon av veksthormonet (Somtatropin). Dessuten hemmer det den sekretoriske" aktivitet av det endocrine Pancreas, som sekresjonen av insulin og glucagon.

Disse verdifulle egenskaper kan ikke komme til full praktisk anvendelse ved Somatostatin selv, da dets kompliserte kjemiske struktur står i veien for en teknisk syntese av denne forbindelse. Ved siden av det høye antall aminosyrer er også nærvær av castin av spesielle ulemper: på grunn av dens svovelinnhold hindrer denne aminosyre anvendelsen av de meget fordelaktige hydrogenolytisk avspaltbare beskyttelsesgrupper. Dessuten har en halv-del (7 av 14) av aminosyrene av Somatostatin ytterligere funksjonelle grupper i sidekjeden, disse grupper krever på en side en spesielt forbigående beskyttelse, på den annen side øker de be-traktelig faren for rasemisering og kompliserer således ytterligere syntesebetingelsene.

Overraskende ble det nu fastslått at man i molekylet av Somatostatin kan utelate flere av disse substituerte aminosyrer, spesielt også cystin, eller også kan erstatte med enkle,optiske inaktive aminosyrer, idet den fysiologiske aktivitet bibeholdes.

Den tekniske fordel for syntesen av Somatostatin-aktive stoffer sees allerede klart derav at for syntesen av Somatostatin 13 er det som byggesten nødvendig optisk aktive aminosyrer (herav 7 med en ytterligere beskyttet funksjonell gruppe), hvorimot man ved forbindelsen ifølge oppfinnelsen kommer ut med maksimalt 7 optisk aktive aminosyrer (herav bare 2 med en ytter-

ligere beskyttet funksjonell gruppe).

Analogifremgangsmåten ifølge oppfinnelsen er i og for seg kjent. Spesielt utføres den således' at man går ut fra en forbindelse med formel:

hvori R, W, X, Y og trp har ovennevnte betydning, A betyr en e-aminobeskyttelsesgruppe eller hydrogen og B betyr en hydroksylbeskyttelsesgruppe eller hydrogen, idet bare ett av symbolene A

og B kan bety hydrogen, avspalter beskyttelsesgruppen eller -gruppene.

Som e-amino-beskyttelsesgrupper kan det anvendes

alle i peptid-kjemien vanlige amino-beskyttelsesgrupper, slik de beskrives sammenfattende i de tilsvarende oppslagsverker, f.eks.i Houben-Weyl:"Methoden der organischen Chemie", 4. opplag, bind

15/1, E. Wunsch (utgiver):"Synthese von Peptiden" (Georg Thieme Verlag, Stuttgart, 1974). Foretrukket er acidolytisk avspaltbare grupper, som i første rekke tert.-butoksykarbonyl-gruppen og'analoge grupper, f.eks. tert.-amyloksykarbonyl-, isopropyloksykarbonyl-, diisopropylmetoksykarbonyl-, allyloksykarbonyl-, cyklopentyloksy-karbonyl-, cyklohexyloksykarbonyl-, d-isobornyloksykarbonyl- og adamantyloksykarbonylgruppene, som også grupper av aralkyl-typen, som benzhydryl og trifenylmetyl (trityl), eller bestemte aralkoksy-karbonyl-grupper av 2-(p-bifenylyl)-2-propyloksykarbonyl-typen, som omtales i sveitsisk patent nr. 509.266.

Videre kan man imidlertid også anvende reduktive eller basisk avspaltbare amino-beskyttelsesgrupper, f.eks. spesielt benzyloksykarbonyl-gruppen og benzyloksykarbonyl-gnuppene, som i den aromatiske del er substituert med halogenatomer, nitrogrupper, laverealkoksygrupper og/eller laverealkylrester, som p-klor- og p-brombenzyloksykarbonyl-, p-nitrobenzyloksykarbonyl-, p-metoksy-benzyloksykarbonyl-, p-tolyloksykarbonyl-gruppen, eller også isonikotinyloksykarbonylgruppen, videre også acylgruppen, som p-toluensulfonyl, benzensulfenyl, o-nitrobenzensulfenyl resp. også formyl, trifluoracetyl eller ftaloyl.

En spesielt fordelaktig e-amino-beskyttelsesgruppe er

en etoksykarbonylgruppe, som i 6-stilling har en med tre hydrokar-bonrester substituert silylgruppe, som trifenylsilyl-, dimetyl-butyl-silyl- eller fremfor alt trimetylsilylgruppen. En slik

g-trihydrokarbylsilyl)-etoksykarbonylgruppe som en 3-(trilavere-alkylsilyl)-etoksykarbonyl-, f.eks. spesielt 6-(trimetylsilyl) etoksykarbonylgruppe, danner med e-aminogruppen som skal beskyttes en tilsvarende 3-trihydrokarbylsilyl-etoksykarbonylaminogruppe, (f.eks. 6-trimetylsilyletoksykarbonylaminogruppen) som er bestan-dig ovenfor betingelsene for sur hydrolyse og hydrogenolyse, men lar seg avspalte under helt spesifikke meget milde betingelser ved innvirkning av fluoridioner. I denne forbindelse forholder den seg analogt de videre nedenfor som karboksylbeskyttelses-grupper omtalte 3-silyletylestergrupper. (Denne likhet må tas spesielt hensyn til ved syntesen: bortsett fra enkelttilfeller utelukker anvendelsen av en av disse beskyttelsesgrupper den sam-tidige anvendelse av den andre beskyttelsesgruppe). Ytterligere detaljer er angitt videre nedenfor ved beskyttelse av karboksylgruppen ved hjelp av 6-silyletylester.

Som hydroksylbeskyttelsesgrupper kan det anvendes

alle for dette formål i peptidkjemien vanlige grupper, sml. ovennevnte siterte verk (Houben-Weyl). Foretrukket er adicolytisk avspaltbare grupper, som 2-tetra-hydropyranyl og helt spesielt tert.-butyl, samt også tert.-butoksykarbonyl. Videre kan man imidlertid også anvende reduktivt eller basisk avspaltbare hydroksylbeskyttelsesgrupper, f.eks. benzyl- og benzyloksykarbonylgrupper, som i den aromatiske del kan være substituert med halogen, nitro og/eller laverealkoksy, resp. laverealkanoylrester som acetyl eller aroylrester, som benzoyl.

Fortrinnsvis velges beskyttelsesgruppene A og B således at de er avspaltbare under tilsvarende betingelser. Spesielt foretrukket er derved de allerede fremhevede acidolytisk avspaltbare grupper. Avspaltningen av begge beskyttelsesgrupper foregår da fortrinnsvis i en eneste operasjon, det kan imidlertid anvendes grupper av forskjellig type, og hver enkelt avspaltes.

Avspaltning av. beskyttelsesgruppen foregår på generelt kjent måte, den sure hydrolyse (acidolyse) gjennomføres f.eks.

ved hjelp av trifluoreddiksyre, saltsyre eller fluorhydrogen, ved syrefølsomme beskyttelsesgrupper også ved hjelp av en lavereali-fatisk karboksylsyre som maursyre og/eller eddiksyre, i nærvær av vann og eventuelt av et polyhalogenert laverealkanol eller lavere-alkanon, som 1,1,1,3,3,3-hexafluorpropan-2-ol, eller hexafluoraceton. De reduktivt avspaltbare grupper, spesielt slike som inneholder

benzylrester, fjernes fortrinnsvis hydrogenolytisk f.eks. ved hydrering under palladium-katalyse. Isonikotinyloksykarbonylgruppen avspaltes fortrinnsvis ved hjelp av sinkreduksjon.

Sluttstoffene ifølge oppfinnelsen fåes alt etter iso-leringstype som baser eller som syreaddisjonssalter, disse kan etterpå omdannes til hverandre på i og for seg kjent måte.

Også dannelsen av de ovennevnte komplekser foregår . etter kjente eller til disse ekvivalente metoder.

Komplekser med uorganiske stoffer som tungtoppløselige metall-, f.eks. aluminium- eller sinkforbindelser, fremstilles fortrinnsvis på analog måte slik det er kjent for ACTH, f.eks. ved omsetning med et oppløselig salt av det angjeldende metall, f.eks. sinkklorid eller sinksulfat, og utfelling med et alkali-metallfosfat og/eller -hydroksyd. Komplekser med organiske forbindelser som polyoksygelatiner, karboksymetylcellulose, polyvinylpyrrolidon, polyfloretinfosfat, polyglutaminsyre etc. fås ved blanding av disse stoffer med peptidet i vandig oppløsning. På samme måte kan det også fremstilles uoppløselige forbindelser med alkalimetallpolyfosfater.

Forbindelsene med den ovenfor karakteriserte formel II er også nye. De fåes idet man sykliserer et tilsvarende lineært peptid med formel:

hvori II' betyr en til formel II svarende rest, hvori den amidiske binding mellom to vilkårlige naboplasserte aminosyrerester av peptidringen er avbrudt, og C betyr en fri hydroksylgruppe, en med en aktiveringsgruppe modifisert hydroksylgruppe eller hydrazino-gruppen -NH-NI^.

Blant de lineære peptider med formel III foretrekkes de, hvori minst en av restene X og Y i resten /II'_7 danner en endeplassert aminosyre. Disse foretrukne utgangsstoffer er karakterisert ved formlene: og spesielt

hvori A, B, C, trp, R, X og Y har ovennevnte betydning. Helt spesielt foretrukket er forbindelsene med formel IIIa-c, hvori A betyr

en amino-beskyttelsesgruppe, fremfor alt en acidblytisk avspaltbar amtno-rbeskyttelsesgruppe, B betyr en hydroksylbeskyttelsesgruppe, fremfor alt en.acidolytisk avspaltbar hydroksylbeskyttelsesgruppe og C betyr en fri hydroksylgruppe.

En ved hjelp av symbolet C vist funksjonell gruppe kompletterer karbonylgruppen av den C-terminale aminosyrerest,

og danner sammen med den en fri karboksylgruppe, en aktivert estergruppe, resp. karbazoylgruppen.

Aktiveringsgruppen, hvorved hydroksylgruppen er modifisert er spesielt en slik, som danner den aktiverte ester av N-hydroksysuccinimid, 1-hydroksybenzotriazol, N,N'-dicyklohexyl-isourinstoff, 2,4,5-triklorfenol, 2-nitrofenol, 4-nitrofenol, pentaklorfenol, eller pentafluorfénol, men også en annen fra peptidkjemien kjent aktiveringsgruppe av denne type, sml. Houben-Weyl, bind 15/11.

Cykliseringen ifølge oppfinnelsen av det lineære peptid med formel III foregår på i og for seg kjent måte ved hjelp av vanlig til dannelse av amidbinding vanlig koblingsmetode, idet imidlertid de peptidiske utgangsstoffer anvendes i en meget lav konsentrasjon for å forskyve koblingsforløpet til gunst av intra-molekulær cyklisering på bekostningav intermolekulær polykonden-sasjon.

De lineære peptider anvendes fordelaktig i et ca. 1.10 -molar til ca. 1.10 -molar , fortrinnsvis et ca. 1.10 molar konsentrasjon som tilsvarer en vekt/volum-konsentrasjon på fra ca. 0,01 til 1,0%, fortrinnsvis 0,1%. En tilsvarende fortynning kan innstilles i reaksjonsblandingen fra begynnelsen eller også dannes ved langsom inndrypning av utgangsstoffet, og eventuelt de øvrige reagenser i reaksjonsblandingen kontinuerlig.

Fortrinnsvis foregår cykliseringen idet man ved en

av de ovennevnte begynnelseskonsentrasjoner behandler a) et ut-gangsstof f med formel III, hvori C betyr en fri hydroksylgruppe og hvori såvel e-aminogruppen av lysinresten som hydroksylgruppen av threoninresten er beskyttet, med et karbodiimid, eventuelt i nærvær av en aktivester-dannende komponent eller omsetter b) et utgangsstoff med formel III, hvori C betyr en til aktivert ester modifisert hydroksylgruppe og den endeplasserte aminogruppe foreligger i protonert form, idet minst £-aminogruppen av lysinresten er beskyttet, med en organisk base eller behandler c) et utgangs-stof f med formel III, hvori C betyr gruppen -NHNH2 og minst e-amino-

gruppen av lysinresten er beskyttet, i første rekke under sure betingelser med salpetersyrling eller en laverealkylester herav og deretter cykliserer ved en av de ovennevnte lave konsentra-sjoner med overskytende organisk base.

Cykliseringen gjennomfører man i egnet oppløsnings-middel, eksempelvis skal det nevnes dioksan, tetrahydrofuran, acetonitril, pyridin, dimetylformamid, dimetylacetamid, dimetylsulfoksyd, N-metylpyrrolidon, hexametylfosfortriamid, samt også kloroform og metylenklorid og blandinger herav.

Ved fremgangsmåtevariant a) tilveiebringes cykliseringen ved hjelp av et karbodiimid, fortrinnsvis N,N'-dicyklohexylkarbodiimid, som man med fordel anvender i overskudd, det er å anta at derved går utgangsstoffet formel III med frie karboksylgrupper primært over i en aktivert ester av dicyklohexyliso-urinstoff (resp. et analogt isourinstoff) og denne in situ dannede aktive ester viderereagerer med en gang.

På en intermediær dannelse av en aktiv ester er utvil-somt å tilbakeføre tilsetning av en aktivesterdannende komponent som hjelpereagens for dette formål kan det tjene i peptidkjemien vanlige aktivester-dannende komponenter som spesielt 2,4,5,-triklorfenol, 2- eller 4-nitrofenol, pentaklor- og pentafluorfenol, men fremfor alt N-hydroksyforbindelser herav som spesielt fordelaktig N-hydroksysuccinimid, N-hydroksypiperidin og fremfor alt 1-hydroksybenzotriazol. Arbeidstemperaturen ved disse varianter utgjør vanligvis 0-70°C, fortrinnsvis 35-55°C.

Ved variant b), som arbeider med ferdige aktivestere, spesielt de allerede fremhevede, foregår cykliseringen spontant,

da den endeplasserte aminogruppe avprotoniseres ved hjelp av den organiske-base. De anvendte baser er fortrinnsvis kvaternære eller fremfor alt tertiære aminer, f.eks. trietylamin eller N-etylmorfolin. Fortrinnsvis arbeider man ved 10-30°C, spesielt ved værelsetemperatur.

Ved variant c) kan første fase, dvs. dannelsen av syre-azidet foregå ved behandling med salpetersyrling eller en ester herav, med fordel ved en vesentlig høyere konsentrasjon av utgangs-stoffene enn den etterfølgende cyklisering. Hensiktsmessig arbeider man med omtrent en ekvivalent av.et laverealkylnitrit, som etyl-, isoamyl- og spesielt tert.-butyl-nitrit, i saltsurt miljø ved tem-peraturer fra ca. -30°C til ca. -5°C, fortrinnsvis ca. -20°C, et lite overskudd av nitrit er tillatelig. Deretter gjøres oppløs-ningen av det dannede azid etter den nødvendige fortynning ved en temperatur fra ca. 0° til ca. 35°C basisk ved hjelp av en overskytende organisk base, f.eks. en av de ovennevnte, og derved bringes som ved fremgangsmåtevariant b) til spontan cyklisering.

De lineære peptider med formel III, samt de til deres syntese tjenende mellomprodukter er nye og anvendbare til syntese også andre Somatostatin-analoge, f.eks. slike med lengere aminosyre-sekvenser med fordel. De er også, samt deres fremstillings-fremgangsmåte, gjenstand for foreliggende oppfinnelse. De fåes etter i og for seg kjente metoder, idet man til deres oppbygning kondenserer nødvendige aminosyrer, resp. mindre peptidenheter under dannelse av CONH-bindinger i vilkårlig tidsmessig rekkefølge med hverandre,idet ikke i reaksjonen deltagende funksjonelle grupper kan beskyttes intermediært.

Ved fremsti11ingBn av disse utgangsstoffer, som også alle nødvendige mellomprodukter, kommer som beskyttelsesgruppe for de endeplasserte a-amino- og karboksylgrupper spesielt de ved syntesen av langkjedede peptider vanlige beskyttelsesgrupper i betraktning, som f.eks. lett eller selektivt kan avspaltes ved solvolyse eller reduksjon.

Som a-amino-beskyttelsesgrupper er det eksempelvis å nevne: eventuelt f.eks. med halogen, nitro, laverealkyl eller laverealkoksy, substituerte di- eller tri-aryl-laverealkylgrupper, som difenylmetyl- eller trifenylmetylgrupper, f.eks. benzhydryl, trityl, di-(p-metoksy)-benzhydryl eller fremfor alt fra karbonsyre avledede hydrogenolytisk avspaltbare grupper, som eventuelt i den aromatiske rest med halogenatomer, nitrogrupper, laverealkyl-eller laverealkoksygrupper substituerte benzyloksykarbonylgrupper, f.eks. benzyloksykarbonyl (dvs. karbobenzoksy), p-brom- eller p-klorbenzyloksykarbonyl> p-nitrobenzyloksykarbonyl, p-metoksy-benzyloksykarbonyl; videre også 2-(p-bifenylyl)-2-propyloksykarbo-nyl og lignende i sveitsisk patent 509.266 omtalte aryloksykarbo-nylgrupper. Dermed er det å påse at a-aminobeskyttelsesgruppen må være selektiv avspaltbar under bibehold av den eventuelt tilstedeværende e-aminobeskyttelsesgruppe av lysinresten. Det er forøvrig også fordelaktig når ved deres avspaltning også en eventuelt tilstedeværende karboksyl- og hydroksylbeskyttelsesgruppe forblir upåvirket.

Karboksylgrupper beskyttes eksempelvis ved hydrazid-dannelse eller ved forestring. Egnet til forestring er f.eks. lavere, eventuelt substituerte alkanoler som metanol, etanol, cyanmetylalkohol, 2,2,2-trikloretanol, benzoylmetylalkohol eller spesielt tert.-butylalkohol, men også en eventuelt substituert benzylalkohol. En spesielt fordelaktig kategori av de substituerte alkanoler er etylalkoholer, som i 8-stilling har en tri-substituert silylgruppe, som trifenylsilyl-, dimetyl-butyl-silyl-eller fremfor alt trimetylsilylgruppe. Slik det f.eks.omtales i belgisk patent nr. 851.576 egner disse alkoholer seg til beskyttelse av karboksylgruppen spesielt godt fordi de tilsvarende g-silyletylestere, f.eks. B-(trimetylsilyl)-etylester, riktignok har stabiliteten av vanlige alkylestere, imidlertid lar seg avspalte selektivt under milde betingelser ved innvirkning av fluoridioner under bibehold av alle andre beskyttelsesgrupper.

For dannelse av aktiverte estere som f.eks. i forbindelser med formel III, egner det seg f.eks. eventuelt med elektronetiltrekkende substituenter substituerte fenoler og tio-fenoler som fenol, tiofenol, tiokresol, p-nitrotiofenol, 2,4,5-

og 2,4,6-triklorfenol, pentaklorfenol, o- og p-nitrofenol, 2,4-dinitrofenol, p-cyanofenol, videre f.eks. N-hydroksysuccinimid, N-hydroksyftalimid og N-hydroksypiperidin.

Hydroksylgruppen av threoninresten kan beskyttes ved forestring eller foretring som allerede angitt ovenfor, den kan imidlertid også bibeholdes fri.

Disse beskyttelsesgrupper kan avspaltes på kjent måte. Således kan man avspalte benzyloksykarbonylgruppen ved hydrogenolyse, N-tritylgruppen med mineralsyrer som halogenhydrogensyrer, f.eks. fluorhydrogen eller fortrinnsvis klorhydrogen, eller en organisk syre som maursyre, eddiksyre, kloreddiksyre eller trifluoreddiksyre, i vandig eller absolutt trifluoretanol som oppløsnings-middel (sml. DOS 2.34 6.147) eller med vandig eddiksyre, tert.-butyloksykarbonylgruppen med trifluoreddiksyre eller saltsyre, 2-(p-bifenylyl)-isopropyloksykarbonylgruppen med vandig eddiksyre eller f.eks. med en blanding av ±seddik, maursyre (82,8%ig) og vann (7:1:2) eller ved.fremgangsmåten ifølge tysk patent nr. 2.346.147.

g-silyletylestergruppene avspaltes fortrinnsvis med fluoridion-avgivende reagenser, f.eks. fluorider av kvaternære organiske baser, som trietylammoniumfluorid. De kan imidlertid også på samme måte som de vanlige alkylestere avspaltes ved hydrolyse, f.eks. ved hjelp av alkalimetallhydroksyder, -karbonater

eller -bikarbonater, eller ved hjelp av hydrazinolyse, f.eks.

ved hjelp av hydrazinhydrat, omdannes til tilsvarende karbazoyl-grupper. Til avspaltning av tert.-butylesterene anvender man fortrinnsvis acidolyse/ for benzylesteren da hydrogenolyse.

Den ved fremstilling av lineære peptider med formel

III gjennomførte kondensasjon av aminosyre- og/eller peptidenheter foregår på i og for seg kjent måte, idet man fortrinnsvis til-knytter en aminosyre eller et peptid med beskyttet a-aminogruppe og eventuelt aktivert terminal karboksylgruppe (=aktiv komponent) til en aminosyre eller et peptid med fri a-aminogruppe og fri "eller beskyttet, f.eks. forestret terminal karboksylgruppe (= pas-siv komponent), i det dannede produkt frigjør den terminal aminogruppe og omsetter dette peptid, inneholdende en fri a-aminogruppe og en eventuelt beskyttet terminal karboksylgruppe igjen med en ytterligere aktiv komponent, dvs. en aminosyre eller et peptid med aktivert terminal karboksylgruppe og fri a-aminogruppe osv. Karboksylgruppen kan eksempelvis aktiveres ved overføring i et syreazid, -anhydrid, -imidazolid, -isoksazolid eller en aktivert ester, som en av de ovennevnte, eller ved reaksjon med et karbodiimid, som N,N'-dicyklohexylkarbodiimid, eventuelt under tilsetning av N-hydroksysuccinimid eller et usubstituert eller f.eks. med halogen, metyl eller metoksy substituert 1-hydroksybenzotriazol eller 4-hydroksy-benzo-l,2,3-triazin-3-oksyd (sml. bl.a. de tyske patenter 1.917.690, 1.937.656, 2.202.613) eller med N,N'-karbonyldiimidazol. Som den vanligste koblingsmetode er det å nevne'karbodiimidmetoden, videre også azidmetoden, metoden av aktiverte estere og anhydridmetoden, samt Merrifield-metoden og metoden av N-karboksyanhydrider eller N-tiokarboksyanhydrider.

Ved en spesielt foretrukket fremstilling av de lineære peptider med formel II anvender man som koblingsmetode karbodiimid-metoden med N,N'-dicyklohexylkarbodiimid i nærvær av 1-hydroksy-benzotriazol. Den terminale karboksylgruppe beskyttes derved i form av 3-trimetyl-silyl)-etylesteren, a-aminogruppen av den aktive komponent beskyttes ved benzyloksykarbonyl-gruppen som etter hvert koblingstrinn avspaltes ved hydrogenolyse. Til beskyttelse av e-aminogruppen av lysinresten anvendes acylering med tert.-butoksykarbonylgruppen og for hydroksylgruppen av threoninresten foretring med tert.-butylgruppen. Disse to beskyttelsesgrupper kan, hvis ønsket til slutt avspaltes i ett trinn ved sur hydrolyse, f.eks. ved hjelp av trifluoreddiksyre, saltsyre eller fluorhydrogen.

Alt etter arbeidsmåte får man forbindelsen i form av baser eller deres salter. Av saltene kan det på i og for seg kjent måte fremstilles basene. Av sistnevnte igjen lar det seg ved omsetning med syrer, f.eks. med slike som danner de ovennevnte salter, utvinne terapeutisk anvendbare syreaddisjonssalter.

På grunn av det snevre forhold mellom de nye forbindelser i fri form og i form av deres salter, forstås i det foregående og følgende med frie forbindelser og deres salter eventuelt også de tilsvarende salter resp. frie forbindelser.

Oppfinnelsen vedrører også de utførelsesformer av fremgangsmåten hvor man går ut fra en på et ønskelig fremgangsmåtetrinn som mellomprodukt dannet forbindelse og utfører de manglende fremgangsmåtetrinn, eller idet et utgangsstoff dannes under reak-sjonsbetingelsene eller anvendes i form av et derivat herav, eventuelt et salt.

Ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen anvendes fortrinnsvis slike utgangsstoffer som fører til de innledningsvis som spesielt verdifulle omtalte forbindelser.

De ifølge oppfinnelsen oppnådde forbindelser anvendes i første rekke som farmasøytiske preparater, som inneholder disse forbindelser med formel I eller farmasøytisk anvendbare salter herav. De farmasøytiske preparater kan spesielt finne anvendelse i de ovennevnte indikasjoner når de administreres parenteralt, som intravenøst, intramuskulært eller subcutant,

eller også intranasalt. Den nødvendige dose avhenger av den spesielle sykdom som skal behandles, dens tyngde og terapiens varighet. Antall og mengde av enkeltdoser, samt administrerings-skjema kan best bestemmes ved hjelp av en individuell undersøkelse av den eventuelle pasient. Metoden til bestemmelse av disse faktorer er vanlig for fagfolk. Vanligvis ligger imidlertid ved en injeksjon en terapeutisk virksom mengde av en slik forbindelse i dosisområdet fra ca. 0,001 til ca. 0,2 mg/kg legemsvekt. Foretrekkes området fra ca. 0,0015 til ca. 0,15 mg/kg legemsvekt og foregår administreringen ved intravenøs infusjon eller subkutan injeksjon. Følgelig inneholder farmasøytiske preparater til paren-teral administrering i enkeltdoseform i avhengighet av applika-sjonstypen pr. dose ca. 0,08 til ca. 15 mg av en forbindelse i følge oppfinnelsen. Ved siden av det virksomme stoff inneholder de vanligvis dessuten en puffer, f.eks. en fosfatpuffer, som skal holde pH mellom ca. 3,5 og 7, videre natriumklorid, mannit eller sorbit til innstilling av isotonien. De kan foreligge i fryse-

tørket eller oppløst form, idet oppløsninger fordelaktig kan inneholde et antibakterielt virkende konserveringsmiddel, f.eks. 0,2-0,3% 4-hydroksy-benzosyre-metylester eller -etylester. Skal i slike preparater det virksomme stoff foreligge i form av et kompleks med forlenget virkningstid, kan dette dannes direkte ved tilsetning av de kompleksdannende komponenter til en injeksjons-oppløsning som f.eks. tilberedes i henhold til de ovennevnte forholdsregler. Som tilsetning egner det seg f.eks. 0,1-1,0 vekt% av et sink(II)-salt (f.eks. sulfat) i forbindelse med 0,5-5,0 vekt% protamin (f.eks. som sulfat), referert til det samlede volum av injeksjonsoppløsningen. Denne tilberedning foreligger som oppløs-ning av pH 3,5 til ca. 6,5 eller som suspensjon av ca. pH 7,5

til 8,0.

Et preparat for intranasal administrering kan foreligge som en vandig oppløsning eller gelé> en oljeaktig oppløsning eller suspensjon, eller også en fettholdig salve. Et preparat i form av en vandig oppløsning får man f.eks. ved at man oppløser det virksomme stoff med formel I, eller et terapeutisk anvendbart syre-addis jonssalt herav i en vandig pufferoppløsning av pH inntil 7,2 og tilsetter et isotoni-frembringende stoff. Den vandige oppløsning

tilsettes hensiktsmessig et polymert klebemiddel, f.eks. polyvinylpyrrolidon, og/eller et konserveringsmiddel. Enkeltdosen utgjør ca. 0,08 til ca. 15 mg, fortrinnsvis 0,25 til 10 mg som er inneholdt i ca. 0,05 ml av en oppløsning resp. 0,05 g av en gelé.

En oljeaktig applikasjons-form for den intranasale administrering får man f.eks. ved suspendering av et peptid med formel I eller et terapeutisk anvendbart syreaddisjonssalt herav i en olje, eventuelt under tilsetning av svellemidler som aluminium-stearat, og/eller grenseflateaktive midler (tensider), hvis HLB-verdi ("hydrophilic-lipophilicpbalance" ligger under 10, som fettsyremonoester av flerverdige alkoholer, f.eks. glycerolmono-stearat, sorbitanmonolaurat, sorbitanmonostearat eller sorbitan-monoleat. En fettholdig salve får man f.eks. ved suspendering av det virksomme stoff ifølge oppfinnelsen i et strykbart fettgrunn-lag, eventuelt under tilsetning av et tensid av HLB-verdi under 10. En emulsjonssalve får man ved utdrivning av en vandig oppløsning

av det peptidiske virksomme stoff i et mykt strykbart fettunderlag under tilsetning av et tensid, hvis HLB-verdi ligger under 10.

Alle disse intranasale applikasjonsformer kan også inneholde kon-serveringsmidler. Enkeltdosene utgjør ca. 0,08 til ca. 15 mg, fortrinnsvis 0,25 til 10 mg, inneholdt i ca. 0,05 til ca. 0,1 g av grunnmassen.

For den intranasale administrering egner det seg

videre også inhalasjons- resp. insufflasjonspreparater, som insufflasjonskapsler, som muliggjør virksomme stoffer i form av et pulver å insufflere med åndedrettet eller aerosoler eller sprays som kan fordele det farmakologiske virksomme stoff i form av et pudder eller i form av dråper av en oppløsning eller suspensjon. Preparater med pudderfordelende egenskaper inneholder foruten det virksomme stoff vanligvis hjelpemidler: insufflasjonskapsler inneholder f.eks. faste bærestoffer som laktose, aerosol- resp. spraytilberedninger inneholder f.eks. en flytende drivgass med et kokepunkt under værelsetemperatur, samt, hvis ønsket, ytterligere bærestoffer som flytende eller faste ikke-ioniske eller anioniske tensider og/eller faste fortynningsmidler. Preparater, hvori det farmakologiske virksomme stoff foreligger

i oppløsning inneholdende foruten dette et egnet drivmiddel ,

videre hvis nødvendig et ekstra oppløsningsmiddel og/eller en stabilisator. I stedet for drivgassen kan også trykkluft anvendes, som frembringes etter behov ved hjelp av en egnet komprimerings-

og avspenningsinnretning.

Oppfinnelsen finner spesielt anvendelse, idet de nye forbindelser med formel I og terapeutisk anvendbare syreaddisjonssalter herav anvendes terapeutisk som farmakologisk aktive forbindelser, spesielt i de for Somatostatin vanlige indikasjoner, fortrinnsvis i form av farmasøytiske preparater. Den daglige dose, som administreres av et varmblodsdyr på ca. 70 kg, utgjør fra ca. 0,1 til ca. 120 mg.

_Oppfinnelsen skal forklares i de følgende eksempler

uten dermed å begrenses. Temperaturene angis i Celsiusgrader.

Som forkortelse, f.eks. til betegnelse av aminosyrer, peptider, beskyttelsesgrupper etc. anvendes de vanlige f.eks. de i "Synthese von Peptiden" (Utgiver: E. Wiinsch) , bind XV fra "Methoden der org. Chemie" (Houben-Weyl) (1974; G. Thieme, Stuttgart), oppstilte forkortelsesbetegnelser. Spesielt anvendes følgende forkortelser:

Boe = tert.-butoksykarbonyl

Bpoc = 2-(p-bifenylyl)-2-propyloksykarbonyl

But = tert.-butyl (som eterdannende gruppe)

DCCI = N,N'-dicyklohexylkarbodiimid

Gaba = 4-aminosmørsyre-rest, -NH-(CH2)^-CO-

OBzl = benzyloksy (som esterdannende gruppe)

ONP = p-nitrofenoksy (som esterdannende gruppe)

ONSu = succinimido-N-oksy

OTmse = 2-(trimetylsilyl)-etoksy (som esterdannende gruppe) SEOC = 2-(trimetylsilyl)-etoksykarbonyl

Z = benzyloksykarbonyl (karbobenzoksy)

DC = tynnsjiktkromatografi

I DC anvender man når intet annet er angitt kiselgel som adsorbens og følgende systemer som elueringsmidler:

System 45: sek-butanol-3%-ig vandig ammoniakk (7:3)

System 52: n-butanol-eddiksyre-vann (71,5:7,5:21)

System 101: n-butanol-pyridin-eddiksyre-vann (38:24:8:30)

System 101B:n-butanol-pyridin-25%ig vandig ammoniakk-vann

(40:24:6:30)

System 112A:n-butanol-pyridin- maursyre -vann (42:24:4:20) System 157: kloroform-metanol-eddiksyre-vann (70:42:0,5:10) System 157A:kloroform-metanol-eddiksyre-vann (90:10:0,5:1) System 157B:kloroform-metanol-eddiksyre-vann (83:13:0,5:1,5). System 157C:kloroform-metanol-eddiksyre-vann (75:26:0,5:5).

Eksempel 1

195 mg beskyttet oktapeptid med formel:

oppløses ved 5 C under N2 i 1,5 ml av en blanding av 8 9 volum% trifluoreddiksyre, 10 volum% vann og 1 volum% tioglycolsyre, oppløsningen oppvarmes med en gang til 25°C og etter 90 minutter utfelles ved værelsetemperatur under N2 med 15 ml eter. Det resulterende rå trifluoracetat av sluttproduktet tørkes i vakuum, oppløses i 5 ml 1 N eddiksyre og filtreres gjennom 15 ml "AG" 1-X8 (Rio-Rad), acetatform. Eluatet inndampes i vakuum og residuet underkastes motstrømsfordeling i systemet n-butanol-eddiksyre-vann (2400:600:3000) over 200 trinn. De i elementene 168 til 183 inneholdte faser (K=5,9) samles, inndampes i vakuum og lyofiliseres fra tert.-butanol-vann (1:1).

Den dannede tittelforbindelse er tynnsjiktkromatografisk enhetlig i tre systemer.

DC (cellulose, Merck): System 101: Rf 0,9

System lllB:Rf 0,9

System 112A:Rf 0,8

Det peptidiske utgangsstoff fåes på følgende måte:

Trinn 1. 1

H- Phe- OTmse- hydroklorid

En oppløsning av 2,50 g Z-Phe-OTmse i 25 ml metanol hydrogeneres etter tilsetning av 0,25 g palladium-kull (10%) ved værelsetemperatur og normaltrykk i tre timer, idet reaksjons-blandingens pH ved hjelp av tilsetning av IN metanolisk klorhydro-genoppløsning holdes på 5,5. For opparbeidelse frafiltreres katalysatoren og filtratet inndampes i vakuum. Råproduktet kan anvendes i neste trinn uten ytterligere rensing.

Trinn 1. 2

Z- Thr( But)- Phe- OTmse

Til en oppløsning av 10,30 g Z-Thr(But)OH i 120 ml vannfritt tetrahydrofuran og 4,20 ml N-etylmorfolin, settes iløpet av 3 minutter ved -15°C en oppløsning av 4,43 ml klormaursyreiso-butylester i 20 ml tetrahydrofuran. Etter 10 minutter ved -10°

til -15°C tilsettes ved -15°C en oppløsning av 10,05 g H-Phe-OTmse-hydroklorid (se trinn 1.1) i 40 ml tetrahydrofuran og en ytterligere porsjon på 4,20 ml N-etylmorfolin, og reaksjonsblandingen holdes iløpet av hver gang én time ved -15°C, ved 0°C og ved værelsetemperatur. For opparbeidelse frafiltreres det utfelte N-etylmorfolinhydroklorid, filtratet inndampes i vakuum, residuet oppløses i etylacetat og vaskes hver gang tre ganger med lN-sitronsyre, lN-natriumhydrokarbonat og vann. Den organiske fase tørkes over natriumsulfat, inndampes i vakuum og befris i høyvakuum for siste spor av oppløsningsmiddel. Produktet fåes som en tyktflytende gul olje som er enhetlig ifølge DC.

DC: /kloroform-metanol(9: 1) J Rf 0,83

/étylacetat-petroleter (7:3)7 Rf 0,77

T rinn 1. 3

H- Thr( But)- Phe- OTmse

En oppløsning av 8,84 g Z-Thr(But)-Phe-OTmse (trinn 1.2) i 32 5 ml metanol hydrogeneres etter tilsetning av 880 mg palladium-kull (10%) i 5 timer ved normaltrykk og værelsetemperatur. For opparbeidelse frafiltreres katalysatoren og filtratet inndampes i vakuum. Det oljeaktige residu av produktet er ifølge DC enhetlig og anvendes uten rensing i trinn 1.4.

DC: /kloroform-metanol (9:1)./ Rf 0,62.

Trinn 1. 3A

Z-( D- trp)- Lys( Boe)- OH

Til en oppløsning av 33, 84 g Z-(D-trp)-OH og 17,42 g 8-hydroksy-kinolin i 50 ml acetonitril tildryppes ved 0° - 5°C

en oppløsning av 21,87 g DCCI i 100 ml acetonitril iløpet av 45 minutter. Etter ytterligere 30 minutter ved 5°C fjernes det utfelte dicyklohexylurinstoff ved filtrering og utvasking med 50 ml acetonitril. Filtratet blander man med en oppløsning av 27,09 g H-Lys(Boe)-OH i 25,9 ml 4,25N-kalilut og 80 ml acetonitril og lar det stå i 15 timer ved værelsetemperatur. For opparbeidelse inndampes reaksjonsblandingen i vakuum, residuet opptas i 1 liter etylacetat, vaskes tre ganger med hver gang 2 00 ml lN-saltsyre ved 0°C og tre ganger med hver gang 20 0 ml vann, den organiske fase tørkes over natriumsulfat og inndampes i vakuum. Den dannede brune olje oppløses i 15 0 ml kloroform og dryppes under sterk omrøring i 1,5 liter hexan. Den fnokkede, klebrige utfelling frafiltreres, vaskes med 500 ml hexan og tørkes i vakuum. For ytterligere rensing oppløses materialet i 150 ml karbontetraklorid-etylacetat (6:4 volumdeler) og kromatograferes på en kisel-gelsøyle med denne oppløsningsmiddelblanding. Egnede tynnsjiktkromatografisk enhetlige fraksjoner inndampes i vakuum, hvorved det rene produkt fåes i form av en skumlignende masse.

DC: /kloroform-metanol-vann (14:6:1)_/ R f 0,61.

Trinn 1. 4

Z-( D- trp)- Lys( Boe)- Thr( But)- Phe- OTmse

En oppløsning av 7,24 g rått (87%-ig ifølge titrering) H-Thr(But)-Phe-OTmse (trinn 1.3) og 8,45 g Z-(D-trp)-Lys(Boe)-OH (trinn 1.3A) i 100 ml dimetylformamid blandes ved 5°C med 2,28 g N-hydroksy-benzotriazol og 3,38 g DCCI og reaksjonsblandingen holdes i én time ved 5°C og ytterligere 15 timer ved værelsetemperatur. For opparbeidelse frafiltreres det utfelte dicyklohexylurinstoff ved frafiltrering og filtratet inndampes i høyvakuum. Residuet omkrystalliseres to ganger fra etylacetat-petroleter og tørkes i vakuum, smp. 114-120°C.

DC: /kloroform-etylacetat (1:1)7 Rf 0,23

/toluen-aceton (1:1)7 Rf 0,70

Trinn 1. 5

H-( D- trp)- Lys( Boe)- Thr( But)- Phe- OTmse

En oppløsning av 5,0 0 g Z-(D-trp)-Lys(Boe)-Thr(But)-Phe-OTmse (trinn 1.4) i 300 ml metanol hydrogeneres etter tilsetning av 0,50 g palladium-kull (10%) ved værelsetemperatur og normaltrykk i 5 timer. Til opparbeidelse frafiltreres fra katalysatoren og det etter inndampning av filtratet gjenblivende residu omsettes med en gang videre i trinn 1.6.

Trinn 1. 5A

Z- Asn- Phe- Phe- OH

Til en suspensjon av 2,95 g H-Phe-Phe-OH i 30 ml dimetylformamid og 6 ml vann tilsettes 2,36 ml 4N-natronlut og deretter 5,29 g Z-Asn-ONP og omrøres godt i 20 timer ved 35°C. For opparbeidelse blandes reaksjonsoppløsningen ved 5°C med

2,36 ml 4N-såltsyre, den svakt uklare oppløsning filtreres og filtratet konsentreres i høyvakuum til ca. 15 ml. Ved tilsetning av 150 ml vann utfeller råproduktet i geléaktig form, frafiltreres og tørkes i vakuum over fosforpentoksyd. Dette materiale gjenutfelles dessuten to ganger fra hver gang 20 ml metanol og 50 ml eter, frafiltreres og tørkes i vakuum. Ifølge racemiseringsprøven (totalhydrolyse,'derivatisering av aminosyrene og oppdeling ved gasskromatografi) foreligger i dette produkt mindre enn 2% av aminosyren i D-konfigurasjonen.

DC: /kloroform-metanol-eddiksyre-vann (70:40:0,5:1017 Rf 0,50

Trinn 1. 6

Z- Asn- Phe- Phe-( D- trp)- Lys( Boe)- Thr( But)- Phe- OTmse

En oppløsning av 6 32 mg Z-Asn-Phe-Phe-OH (trinn 1.5A) og 862 mg H-(D-trp)-Lys(Boe)-Thr(But)-Phe-OTmse (trinn 1.5) i 5 ml dimetylformamid blandes med 210 mg N-hydroksy-benzotriazol og 276 mg DCCI og hensettes 15 timer ved værelsetemperatur. Til opparbeidelse fjernes det utfelte dicyklohexylurinstoff ved frafiltrering og filtratet inndampes i høyvakuum. Det oljeaktige residu utdrives med 5 ml metanol og frasuges. Det uoppløste material utdrives ved rensing igjen med 5 ml metanol ved 50°C, frasuges, vaskes med metanol og tørkes i vakuum. Produktet er enhetlig ifølge DC.

DC: /kloroform-metanol (85:15)7 Rf 0,85

^kloroform-metanol-vann (14:6:1)7 Rf 0,90

Trinn 1. 7

Z- Asn- Phe- Phe-( D- trp)- Lys( Boe)- Thr( But)- Phe- OH

Z-Asn-Phe-Phe-(D-trp)-Lys(Boe)-Thr(But)-Phe-OTmse (trinn 1.6) (940 mg) oppløses i 23 ml av en nyfremstilt vannfri 0,15 molar tetraetylammoniumfluoridoppløsning i dimetylformamid og holdes 30 minutter ved 25°C. Etter avkjøling til 5°C blandes reaksjonsblandingen under god omrøring med 0,68 ml IN vandig saltsyre og produktet utfelles ved tilsetning av 70 ml vann. Det frafiltrerte materiale vaskes med 5 ml vann, tørkes i vakuum over fosforpentoksyd og anvendes direkte i trinn 1.8.

Trinn 1. 7A

H- Gaba- OBzl- p- toluensulfonat

En blanding av 30,94 g 4-aminosmørsyre og 68,48 g p-toluensulfonsyre-monohydrat i 311 ml benzylalkohol og 300 ml benzen destilleres langsomt ved normaltrykk inntil det iløpet av 5 timer tilsammen er oppfanget 200 ml av en fraksjon, kokepunkt 70-90°C. Den klare reaksjonsoppløsning konsentreres i vannstråle-vakuum, og deretter i høyvakuum ved ca. 60°C til 150 ml. Den utfelte krystallgrøt utrøres med 250 ml eter, krystallene frafiltreres og vaskes med 200 ml eter. Til ytterligere rensing utrøres dette materiale med 500 ml eter ved værelsetemperatur. iløpet av én time, frafiltreres, vaskes med eter og tørkes i vakuum. Smp. 106-107,5°C.

DC: /kloroform-metanol-17%ig vandig ammoniakk-vann (50:40:6:4)7

Rf 0,39.

Trinn 1. 8 -

Z- Asn- Phe- Phe-( D- trp)- Lys( Boe)- Thr( But)- Phe- Gaba- OBzl

En blanding av 430 mg Z-Asn-Phe-Phe-(D-trp)-Lys(Boe)-

Thr(But)-Phe-OH (trinn 1.7) og 82 mg Gaba-benzylester (frigjort, ved tilsetning av 0,046 ml N-metylmorfolin til 152 mg tilsvarende p-toluensulfonat, se trinn 1.7A) i 2 ml dimetylformamid blandes, med 61 mg N-hydroksy-benzotriazol og 93 mg DCCI og hensettes 20 timer ved værelsetempratur. Til opparbeidelse blandes blandingen med 10 ml iskold metanol og frafiltreres. Det dannede faste stoff utrøres for ytterligere rensing med 5 ml varm metanol i 10 minutter, suspensjonen avkjøles til 0°C, det rene produkt frafiltreres og tørkes i vakuum.

DC: /kloroform-metanol (85:15)7 Rf 0,85

Trinn 1. 9

H- Asn- Phe- Phe-( D- trp)- Lys( Boe)- Thr( But)- Phe- Gaba- OH

En oppløsning av 380 mg Z-Asn-Phe-Phe-(D-trp)-Lys(Boe)- - Thr(But)-Phe-Gaba-OBzl (trinn 1.8) i 25 ml dimetylformamid hydrogeneres etter tilsetning av 50 mg palladium-kull (10%) i 6 timer ved værelsetemperatur og normaltrykk. For opparbeidelse konsentreres oppløsningen etter frafiltrering av katalysatoren i høyvakuum til 2 ml og produktet utfelles med 25 ml peroksydfri eter, frafiltreres og tørkes i vakuum. Råproduktet underkastes uten ytterligere rensing neste trinn 1.10 (ayklisering).

Trinn 1. 10

En oppløsning av 297 mg rått H-Asn-Phe-Phe-(D-trp)-Lys(Boe)-Thr(BUt)-Phe-Gaba-OH (trinn 1.9) 324 mg N-hydroksybenzotriazol og 495 mg DCCI i 240 ml dimetylformamid holdes i 20 timer ved 50°C. Til opparbeidelse avdampes oppløsningsmidlet i høy--vakuum ved ca. 30°C og residuet utdrives med 10 ml etylacetat.

Det utfelte dicyklohexylurinstoff fjernes ved frafiltrering, filtratet fortynnes med etylacetat til 50 ml, vaskes tre ganger med hver gang 20 ml IN vandig oksalsyre og deretter med vann til nøytralitet, tørkes over natriumsulfat og inndampes i vakuum. Rå-produktet underkastes for rensing av motstrømsfordeling i systemet metanol-vann-kloroform-karbontetraklorid (2700:675:900:1575 volumdeler) over 460 trinn. De i elementene 198 til 240 inneholdte faser (K = 0,88) forenes og inndampes i vakuum. Residuet oppløses i 20 ml tert.-butanol og lyofiliseres, hvormed det fremkommer et.

tynnsjiktkromatografisk enhetlig materiale av ovennevnte formel: DC: /kloroform-metanol (85:15)7 Rf 0,18

/kloroform-metanol-vann (14:6:1)7 Rf 0,77

Eksempel 2

På analog måte som angitt i Eksempel 1 behandler man det beskyttede nonapeptid med formel:

med trifluoreddiksyre og opparbeider. Ved motstrømsfordeling

(K= 5,45) på 200 elementer fåes det ønskede produkt som tynnsjikt-kromatograf isk enhetlig amorft stoff.

DC: Cellulose, Merck>

System 101 :Rf 0,90

111B :Rf 0,75

112A :Rf 0,93

Det som utgangsstoff anvendte beskyttede nonapeptid

er oppnåelig på følgende måte:

Trinn 2. 1

Boc- Gaba- OH

En oppløsning av 41,25 g H-Gaba-OH i 320 ml dioksan-vann (1:1 volumdeler) innstilles ved hjelp av 20,5 ml 4N-natronlut på pH 10,0 og blandes med 63,0 g Boc-acid. Ved langsom tilsetning av 4N-natronlut (tilsammen 185 ml) iløpet av 24 timer ved værelsetemperatur holdes pH på 10,0. Til opparbeidelse vaskes reaksjonsoppløsningen tre ganger med hver gang 250 ml eter og den vandige fase innstilles ved 5°C ved tilsetning av 192 g sitronsyre til pH 3,0. Det utfelte materiale opptas i tre porsjoner 4 00 ml eter og de forenede organiske faser vaskes nøytralt, tørkes over natriumsulfat og inndampes i vakuum. Residuet oppløses i 50 ml eter og krystalliseres ved tilsetning av 100 ml petroleter, smp. 6 0-62°C.

DC: ^kloroform-metanol-vann (14:6:1)_7 Rf 0,8 3

/Benzen-aceton (7:3)7 Rf 0,21.

T rinn 2. 2

Boc- Gaba- Gaba- OBzl

En oppløsning av 2,03 g Boc-Gaba-OH (trinn 2.1)

i 20 ml vannfri tetrahydrofuran blandes ved -15°C først med 1,39 ml trietylamin og deretter iløpet av ett minutt med 1,31 ml klor-, maursyre-isobutylester. Etter 10 minutter ved -10 til -15°C tilsettes ved -15°C en oppløsning av 3,65 g H-Gaba-OBzl-p-toluensulfonat (eksempel 1.7A) og 1,39 ml trietylamin i 10 ml dimetylformamid og reaksjonsblandingen holdes hver gang én time ved -10°C,

0°C og værelsetemperatur. For opparbeidelse blandes blandingen med 150 ml etylacetat og vaskes hver gang tre ganger med 1N-sitronsyre, lN-NaHC03 og med vann. Den organiske fase inndampes etter tørkning over natriumsulfat i vakuum og den gjenblivende svakt gulaktig farvede olje befris i høyvakuum for resten av opp-løsningsmidlet. Produktet er enhetlig ifølge DC.

DC: /kloroform-metanol (85:15)./ Rf 0,60

/toluen-aceton (7:3)./ Rf 0,17

Trinn 2. 3

H- Gaba- Gaba- OBzl- hydroklorid

2,0 0 g Boc-Gaba-Gaba-OBzl (trinn 2.2) oppløses i 15 ml av en 2N-oppløsning av klorhydrogen i etylacetat og hensettes én time ved værelsetemperatur. Etter avkjøling av reaksjonsblandingen til 0°C frafiltreres det utfelte produkt, vaskes med 20 ml eter og tørkes i vakuum, smp. 80-83°C.

DC: /kloroform-metanol-vann (14:6:1)7 Rf 0,29

T rinn 2. 4

, Z- Asn- Phe- Phe-( D- trp)- Lys( Boe)- Thr( But)- Phe- Gaba- Gaba- OBzl

Til en oppløsning av 430 mg Z-Asn-Phe-Phe-(D-trp)-Lys(Boe)-Thr(But)-Phe-OH (eksempel 1.7) og 142 mg H-Gaba-Gaba-OBzl-hydroklorid (trinn 2.3) i 3 ml dimetylformamid tilsettes 45 mg trietylamin, 61 mg 1-hydroksy-benzotriazol samt 93"mg N,N'-dicyklohexylkarbodiimid og hensettes 2 4 timer ved værelsetemperatur.- Reaksjonsblandingen blandes med 15 ml vann og det utfelte materiale frafiltreres og tørkes i vakuum over fosforpentoksyd. For rensing utdrives råproduktet med 5 ml varm metanol, frasuges og etter tørking i vakuum utfelles fra en oppløsning i 2 ml dimetylformamid med 10 ml metanol. Utfellingen frafiltreres, vaskes med litt metanol og tørkes i vakuum, hvorved det fremkommer et tynnsjiktkromatografisk enhetlig produkt.

DC: ^kloroform-metanol (85:15)J7 Rf 0,80

Trinn 2. 5

H- Asn- Phe- Phe-( D- trp)- Lys( Boe)- Thr( But)- Phe- Gaba- Gaba- OH

Denne forbindelse fåes analogt Eksempel 1.9 ved hydrogenering av Z-Asn-Phe-Phe-(D-trp)-Lys(Boe)-Thr(But)-Phe-Gaba-Gaba-OBzl (trinn 2.4) og videreforarbeides uten rensing i trinn 2.6.

Trinn 2. 6

Denne forbindelse fåes analogt Eksempel 1.10 ved cyklisering av H-Asn-Phe-Phe-(D-trp)-Lys(BOc)-Thr(But)-Phe-Gaba-Gaba-OH (trinn 2.5) ved hjelp av DCCI og 1-hydroksybenzotriazol. Råproduktet renses ved motstrømsfordeling (K=l,l).

DC: /kloroform-metanol (85:15)J? Rf 0,06

^/kloroform-metanol-vann (14:6:1)7 R f 0,69

Eksempel 3

Analogt Eksempel 1 behandles det beskyttede peptid med formel

med trifluoreddiksyre og videreforarbeides. Ved motstrømsforde-ling (K = 3,4) over 220 trinn fåes det ønskede produkt som amorft stoff.

DC: System 101 : Rf 0,60

111B : Rf 0,37 112A : Rf 0,50

Den som utgangsstoff anvendte beskyttede peptid med ovennevnte formel er oppnåelig på følgende måte: 1,10 g Z-Asn-Phe-(D-trp)-Lys(Boe)-Thr(But)-Phe-OH (eksempel 1.7) hydrogeneres i -30 ml dimetylformamid under tilsetning av 100 mg Pd-kull (10%) inntil fullstendig avspaltning av Z-gruppen (Ca. 4 timer, DC-kontroll). Etter frafiltrering av katalysatoren konsentreres filtratet i høyvakuum til 15 ml og den dannede opp--løsning av peptidet med formel: H-Asn-Phe-Phe-(D-trp)-Lys(Boe)-Thr(But)-Phe-OH sykliseres direkte analogt det som er angitt i Eksempel l.lo ved hjelp av DCCI og N-hydroksybenzotriazol. Råproduktet renses ved motstrømsfordeling ( K = 0,71), hvormed det fremkommer det ønskede beskyttede cyklopeptid med formel:

DC: /kloroform-metanol-vann (14:6:1)_7 Rf 0,83

Eksempel 4

Analogt Eksempel 1 behandler man det beskyttede peptid med formel:

med trifluoreddiksyre og opparbeider. Ved motstrømsfordeling (K= 3,31) over 220 trinn fåes det ønskede produkt som amorft stoff.

DC: System 101 : Rf 0,29

111B : Rf 0,34

112A : Rf 0,47

Det som utgangsstoff anvendte beskyttede peptid fremstilles som følger:

Trinn 4. 1

H- Asn- Phe- Phe-( D- trp)- Lys( Boe)- Thr( But)- Phe- OTmse

942 mg Z-Asn-Phe-Phe-(D-trp)-Lys(Boe)-Thr(But)-Phe-OTmse

(eksempel 1.6) hydrogeneres i 50 ml dimetylformamid under tilsetning av 100 mg Pd-kull (10%) inntil Z-gruppen er fullstendig avspaltet (ca. 2 timer, DC-kontroll). Etter katalysatorens frafiltrering inndampes filtratet i høyvakuum til 4 ml og anvendes direkte i neste trinn.

Trinn 4. 2

Z-NH-(CH2)4CO-Asn-Phe-Phe-(D-trp)-Lys(Boe)-Thr(But)-Phe-OTmse

En oppløsning av 188 mg 5-benzyloksykarbonylaminopentan-syre, 847 mg rå heptapeptid fra forangående trinn 4.1 og 101 mg hydroksybenzotriazol i 4 ml dimetylformamid blandes ved 0-5°C med en oppløsning av 182 mg DCCI i 1 ml dimetylformamid. Etter 15 min. ved 0-5°C holdes blandingen ennu 18 timer ved værelsetemperatur og deretter frafiltreres fra utfelt dicyklohexylurinstoff. Filtratet konsentreres i høyvakuum til 3 ml og råproduktet utfelles ved tilsetning av 60 ml vann. Etter filtrering og tørking ut-røres utfellingen for rensing to ganger med hver gang 2 0 ml metanol ved 40°C og frafiltreres.

DC: /kloroform-metanol (85:15)./ Rf 0,61

/Kloroform-metanoi-vann (14:6:1)/ Rf 0,89

Trinn 4. 3

Z-NH-(CH2)4CO-Asn-Phe-Phe-(D-trp)-Lys(Boe)-Thr(But)-Phe-OH

760 mg av Z-NH(CH2)4CO-Asn-Phe-Phe-(D-trp)-Lys(Boe)-Thr(But)-Phe-OTmse (trinn 4.2) oppløses i 17,1 ml av en nyfremstilt vannfri 0,15 molar trietylammoniumfluoridoppløsning i dimetylformamid og holdes 40 minutter ved værelsetemperatur. Etter avkjøling til 0-5°C blandes reaksjonsblandingen under god omrøring med 0,51 ml lN-vandig saltsyre og produktet utfelles ved tilsetning av 8 0 ml vann.

DC: /Ttloroform-metanol (85:15)/ Rf 0,13

/kloroform-metanol-vann (14:6:1)/ Rf 0,65

Trinn 4. 4

NH2-(CH2)4CO-Asn-Phe-Phe-(D-trp)-Lys(BOc)-Thr(But)-Phe-OH

696 mg av Z-NH(CH2)4CO-Asn-Phe-Phe-(D-trp)-Lys(Boe)-

Thr(But)-Phe-OH (trinn 4.3) hydrogeneres i 70 ml dimetylformamid under tilsetning av 80 mg Pd-kull (10%) inntil fullstendig avspaltning av Z-gruppen.(ca. 2 timer, DC-kontroll). Etter katalysatorens frafiltrering konsentreres filtratet i høyvakuum til ca.

3 ml og produktet utfelles med 50 ml peroksydfri eter.

DC: /kloroform-metanol-vann (14: 6:1)_7 Rf 0,46

Trinn 4. 5

Ved cyklisering av det lineære oktapeptid med formel NH2(CH2)4CO-Asn-Phe-Phe-(D-trp)-Lys(Boe)-Thr(But)-Phe-OH (trinn 4.4) analogt den i Eksempel 1.10 omtalte fremgangsmåte får man ved hjelp av DCCI og N-hydroksybenzotriazol det ønskede cykliske peptid. Råproduktet renses ved motstrømsfordeling (K= 0,66).

DC: /kloroform-metanol (85:151/ Rf 0,50

/kloroform-metanol-vann (14:6:1)./ Rf 0,77

Eksempel 5

analogt eksempel 1 behandles det beskyttede peptid med formel:

med trifluoreddiksyre og opparbeides. Ved motstrømsfordeling (K= 5,0) over 170 trinn fåes det ønskede produkt som amorft stoff.

DC: System 101 : Rf 0,53

111B : Rf 0,32

112A : Rf 0,39

Det som utgangsstoff anvendte beskyttede cyklopeptid fåes som følger:

Trinn 5. 1

H-( g- Ala)- OBzl.. p- toluensulfonat

Analogt Eksempel 1.7A fåes ved forestring av B-alanin med benzylalkohol i nærvær av p-toluensulfonsyre den ønskede ester som p-toluensulfonat, smp. 94,5-101°C.

DC: /kloroform-metanol-vann (14:6:1)_7 Rf 0,38

Trinn 5. 2

Z- Asn- Phe- Phe-( D- trp)- Lys( Boe)- Thr( But)- Phe-( g- Ala)- OBzl

analogt Eksempel 1.8 omsettes 1,09 g Z-Asn-Phe-Phe-(D-trp)-Lys(Boe)-Thr(But)-Phe-OH (Eksempel 1.7) med 0,33 g H(<g->Ala)-

OBzl . p-toluensulfonat med hjelp av DCCI i inærvær av N-metylmorfolin og N-hydroksybenzotr±azol og opparbeides.

DC: /kloroform-metanol (85:15)J7 Rf 0,69

/kloroform-metanol-vann (14:6:1)/ R^ 0,89

T rinn 5. 3

H- Asn- Phe- Phe-( D- trp)- Lys( Boe)- Thr( But)- Phe-( g- Ala)- OH

Analogt Eksempel 1.9 omdannes benzylesteren av H-Asn-Phe-Phe-(D-trp)-Lys(Boe)-Thr(But)-Phe-(g-Ala)-OBzl (trinn 5.2) ved hydrogenering i den tilsvarende fri syre.

DC: ,/kloroform-metanol-vann (14:6:1)/ Rf 0,52

T rinn 5. 4

Analogt fremgangsmåten i eksempel 1.10 cykliseres den fri syre H-Asn-Phe-Phe-(D-trp)-Lys(Boe)-Thr(But)-Phe-(6-Ala)-OH ved hjelp av DCCI og N-hydroksybenzotriazol. Råproduktet renses ved motstrømsfordeling (K= 0,71).

DC: /kloroform-metanol (85:15)/ Rf 0,65

/kloroform-metanol-vann (14:6:1)/ Rf 0,80

E ksempel 6

Analogt Eksempel 1 behandler man det beskyttede peptid med formel:

med trifluoreddiksyre og opparbeides. Ved motstrømsfordeling (K= 4,26) over 300 trinn fåes det ønskede produkt som amorft stoff. DC: 101 Rf 0,53 111B Rf 0,40 112A Rf 0,31

Det som utgangsstoff anvendte beskyttede peptid fåes på følgende måte:

Trinn 6. 1

H-/ D- G1U ( OBzl)_ 7- OBut. hydroklorid

En blanding av 5,00 g H-/É>-Glu (OBzl)_7~OH og 40 ml flytende isobuten omrøres med 4 ml konsentrert svovelsyre i 40 ml dioksan i et lukket kar ved værelsetemperatur, inntil det oppstår en klar oppløsning og hensettes ytterligere fire timer ved værelsetemperatur. Til opparbeidelse helles den til -20°C avkjølte reak-sjonsblanding i en iskold blanding av 300 ml eter og 203 ml 1-N natriumhydroksyd. Eterfasen vaskes tre ganger med hver gang 50 ml vann. Etter etterekstrahering av den vandige fase med ytterligere 300 ml eter tørkes de forenede organiske faser over natriumsulfat, inndampes i vakuum til 10 ml og blandes ved 0°C under god omrøring med 30 ml 0,7N klorhydrogenoppløsning i metanol. Den dannede oppløsning inndampes i vakuum og residuet utdrives

med 20 ml petroleter, inntil det inntrer krystallisasjon. Det frafiltrerte produkt med formel

renses ved kromatografi på en kiselgelsøyle (170 g) ved hjelp av kloroform-metanol (85:15), smp. 107-108°C (under spaltning), /a/£<5>:-15° - 1° (etanol, 2%).

DC: /kloroform-metanol (85:15)/ Rf 0,60

T rinn 6. 2

Z- Asn- Phe- Phe-( D- Trp)- Lys( Boe)- Thr( But)- Phe- D- Glu( OBzl)- OBut

En oppløsning av 1,09 g Z-Asn-Phe-Phe-(D-trp)-Lys(Boe)-Thr (But)-Phe-OH (eksempel 1.7), 0,31 g HCl . /B-Glu (OBzl l7-OBut (trinn 6.1), 0,13 g N-hydroksybenzotriazol og 95 mg N-metylmorfolin i 8 ml dimetylformamid blandes ved 0-5°C_med en oppløsning av 0,21 g DCCI i 2 ml dimetylformamid og holdes'etter 30 minutter ved 0-5°C ennu 15 timer ved værelsetemperatur. Det utfelte dicyklohexylurinstoff frafiltreres, og filtratet inndampes i vakuum. Residuet utdrives med 30 ml vann, f Utreres, tørkes og utrøres for rensning ennu 2 ganger med hver gang 10 ml metanol og frafiltreres.

DC: /kloroform-metanol(85:15) J Rf 0,85

/kloroform-metanol-vann (14:6:1)/ Rf 0,91

Trinn 6. 3

H- Asn- Phe- Phe- ( D- trp) - Lys ( Boc) r- Thr ( But) - Phe-/ b- Glu/- OBut

Analogt Eksempel 1.9 hydrogeneres forbindelsen med formel H-Asn-Phe-Phe-(D-trp)-Lys(Boe)-Thr(But)-Phe-/D-Glu(OBzlL7" OBut (trinn 6.2) til det ønskede produkt.

DC: /kloroform-metanol (85:15)/ Rf 0,13

/kloroform-metanol-vann (14:6:1)/ Rf 0,65

Trinn 6. 4

På analog måte som i Eksempel 1.10 cykliseres syren med formel H-Asn-Phe-Phe-(D-trp)-Lys(Boe)-Thr(But)-Phe-/D-Glu7~ OBut ved hjelp av DCCI og N-hydroksybenzotriazol. Råproduktet renses ved hjelp av motstrømsfordeling (K= 0,52).

DC: /kloroform-metanol (85:15)/ Rf0,54

/kloroform-metanol-vann (14:6:11/ R f 0,83

E ksempel 7

235 mg beskyttet hexapeptid med formel:

befris analogt Eksempel 1 med trifluoreddiksyre for beskyttelsesgrupper og renses som acetat ved motstrømsfordeling i samme system som i Eksempel 1. Det rene stoff isoleres ved K = 5,4.

DC (kiselgel, Merck): System 45: Rf 0,2

52: Rf 0,35

157: Rf 0,5

Utgangsproduktet fåes som følger:

Trinn 7. 1

Z- PheePhe-( D- trp)- Lys( Boe)- Thr( But)- Phe- OTmse

En oppløsning av 2,84 g H-(D-trp)-Lys(Boe)-Thr(But)-Phe-OTmse (eksempel 1.5) og 1,52 g Z-Phe-Phe-OH i 12 ml dimetylformamid blandes ved 0°C med 0,62 g N-hydroksybenzotriazol og 0,98 g DCCI og hensettes 16 timer ved 0°C. Etter frafiltrering av dicyklohexylurinstoff utfelles produktet ved inndrypning i fortynnet natriumhydrogenkarbonatoppløsning. Produktet omkrystalliseres fra vandig metanol.

DC (kiselgel,Merck): System 157A : Rf 0,6.

Trinn 7. 2

Z- Phe- Phe-( D- trp)- Lys( Boe)- Thr( But)- Phe- OH

En oppløsning av 2,86 g Z-Phe-Phe-(D-trp)-Lys(Boe)-Thr(But)-Phe-OTmse i 13,5 ml dimetylformamid blandes ved 30°C med 6,1 ml av en 1,12 molar oppløsning av tetrabutylammoniumfluorid i dimetylsulfoksyd og hensettes fem minutter ved denne temperatur. Produktet utfelles ved inndrypping i iskold fortynnet saltsyre og renses ved gjenutfelling fra acetonitril-oppløsnlng med fortynnet saltsyre.

DC: System 157A Rf 0,35

Trinn 7. 3 .

En oppløsning av 870 mg Z-Phe-Phe-(D-trp)-Lys(Boe)-Thr(But)-Phe-OH i 20 ml dimetylformamid hydrogeneres i nærvær av 90 mg palladium-kull (10%) 2 timer ved værelsetemperatur. Etter katalysatorens frafiltrering konsentreres filtratet i høyvakuum til noen ml, blandes med 790 ml dimetylformamid, 1,2 g N-hydroksy-benzotriazol og 1,6 g DCCI og hensettes 15 timer ved 5 0°C. Etter tilsetning av 2 ml 5-molar oksalsyreoppløsning i dimetylformamid inndampes i høyvakuum til ca. 10 ml, dicyklohexylurinstoffet frasuges og produktet utfelles ved inndrypping i fortynnet natrium-hydrogenkarbonatoppløsning. Ved kromatografering på kiselgel elueres det rene produkt med kloroform under tilsetning av 3-5% metanol.

DC: System 157A Rf 0,5

Eksempel 8

behandles som angitt i Eksempel 1 med trifluoreddiksyre. Det råe produkt overføres med en ioneutveksler i acetat og dette renses ved motstrømfordeling i systemet n-butanol-eddiksyre-vann-toluen (4:1:5:4) over 420 trinn. Det rene stoff (K=l,5) isoleres på vanlig måte.

DC (kiselgel,Merck) : System 157C Rf 0,25.

Utgangsmaterialet fåes som følger:

Trinn 8. 1

Z- Phe- Phe-( D- trp)- Lys( Boe)- Thr( But)- Phé- Gly- OBzl

En oppløsning av 800 mg Z-Phe-Phe-(D-trp)-Lys(Boe)-Thr(But)-Phe-OH (Eksempel 7.2), 290 mg H-Gly-OBzl . p-toluensulfonat og 130 mg N-hydroksybenzotriazol i 4 ml dimetylformamid blandes ved 0°C med 0,095 ml N-metylmorfolino og 200 mg DCCI og hensettes 16 timer ved 0°C. Etter frafiltrering av dicyklohexylurinstoffet felles produktet ved inndrypning i fortynnet natrium-hydrogenkarbonatoppløsning. Råproduktet renses ved omkrystallisering fra metanol-vann (9:1) og acetonitril-vann (1:1).

DC: /kloroform-methanol (95:5)_7 Rf.0,55

System 157A Rf 0,75

Trinn 8. 2

En oppløsning av 780 mg Z-Phe-Phe-(D-trp)-Lys(Boe)-Thr(But)-Phé-Gly-OBzl (trinn 8.1) i 15 ml dimetylformamid hydrogeneres i nærvær av 80 mg palladium-kull (10%) i 6 timer. Etter katalysatorens frafiltrering inndampes filtratet sterkt, blandes med 115 ml dimetylformamid, 910 mg N-hydroksybénzotriazol og 1,22 g DCCI og hensettes 20 timer ved 50°C. Opparbeidelsen foregår som angitt i Eks. 7.3. For rensning av råproduktet gjennom-føres en motstrømsfordeling over 460 trinn i samme system som omtalt i Eks. 1.10 (K=0,4).

DC: System 157A : Rf 0,4

Eksempel 9•

behandles analogt Eks. 1 med trifluoreddiksyre. Ved hjelp av inoeutveksler overføres produktet i acetatet som renses ved mot-strømsfordeling over 300 trinn i systemet sek-butanol-vann-eddiksyre (100:100:1). Det rene stoff (K=l,5) isoleres som vanlig.

DC: (Kiselgel, Merck): System 157 Rf 0,5

Utgangsmaterialet fåes som følger:

Trinn 9. 1

En oppløsning av 420 mg Z-Phe-Phe-(D-trp)-Lys(Boe)-Thr(But)-Phe-OH (eks. 7.2), 165 mg H-Gaba-OBzl . p-toluensulfonat og 70 mg N-hydroksybenzotriazol i 2 ml dimetylformamid blandes ved 0°C med 0,05 ml N-metylmorfolin og 100 mg DCCI og hensettes 20 timer ved 0°C. Etter frafiltrering av dicyklohexylurinstoff utfelles produktet ved inndrypning i natriumhydrogenkarbonatopp-løsning.

DC: System 157A : Rf 0,65.

T rinn 9. 2

En oppløsning av 500 mg Z-Phe-Phe-(D-trp)-Lys(Boe)-Thr(But)-Phe-Gaba-OBzl i 20 ml dimetylformamid hydrogeneres i nærvær av 50 mg palladium-kull (10%) i 2 timer. Etter katalysatorens frafiltrering inndampes filtratet sterkt i høyvakuum, residuet blandes med 370 ml dimetylformamid, 560 mg N-hydroksybenzotriazol og 76 0 mg DCCI og hensettes 18 timer ved 50°C. Opparbeidelse og rensing av produktet foregår analogt Eksempel 8.2, K=0,3.

DC: System 157A : Rf 0,45

E ksempel 10

behandles som angitt i Eksempel 1 med trifluoreddiksyre, opparbeides og renses, K = 3,5.

DC: System 157C: Rf 0,15

Utgangsmaterialet fåes som følger:

Trinn 10. 1

Z- Asn- Phe- Phe-( D- trp)- Lys( Boe)- Thr( But)- Phe- Gly- OBzl

En oppløsning av 230 mg Z-Asn-Phe-(D-trp)-Lys(Boe)-Thr(But)-Phe-OH (eks. 1.7), 77 mg H-Gly-OBzl . p-toluensulfonat og 35 mg N-hydroksybenzotriazol i 1 ml dimetylformamid blandes ved 0°C med 0,025 ml N-metylmorfolin og 53 mg DCCI. Etter 16 timer opparbeides analogt Eks. 7.1 og omkrystalliseres fra acetonitril-vann (4:1).

DC: System 157A : Rf 0,65.

Trinn 10. 2

En oppløsning av 2 00 mg Z-Asn-Phe-Phe-(D-trp)-Lys(Boe)-Thr (But) ^-Phe-Gly-OBzl (trinn 10.1) i 15 ml dimetyl-f ormamid hydrogeneres i nærvær av 50 mg palladium-kull (10%). ' Etter katalysators frafiltrering inndampes filtratet i høyvakuum, residuet blandes med 140 ml dimetylformamid, 215 mg N-hydroksybenzotriazol og 2 90 mg DCCI og hensettes 2 0 timer ved 50°C. Opparbeidelse og rensing foregår som i Eks. 8.2, K = 0,8.

DC: System 157B : Rf 0,45.

Eksempel 11

behandles som angitt i Eks. 1 med trifluoreddiksyre, overføres ved hjelp av ioneutveksler i acetatet og renses ved motstrømsfor-deling i systemet tert.-butanol-toluen-metanol-puffer (0,05 M ammoniumacetat + 0,05M eddiksyre) (7:7:3:10) over 500 trinn (K=0,14).

(Symbolet /D-trp(F)J7 betyr 5-fluor-D-tryptofan)

DC: System 157: Rf 0,36.

Utgangsmaterialet fåes som følger:

Trinn 11. 1

Z-/b-Trp (F)_7-0H

En oppløsning av 2 g 5-fluor-DL-tryptofan i 9 ml lN-natronlut blandes under isavkjøling og sterk omrøring samtidig med 1,4 ml klormaursyrebenzylester og 10,5 ml lN-natronlut.

Etter ytterligere 2 timer tilsettes 50 ml etylacetat, pH av den tofasede blanding innstilles med saltsyre på 1, den organiske fase adskilles, vaskes med vann, tørkes over natriumsulfat og avdampes. Residuet oppløses i 9,5 ml vann og 5 ml 2N-natronlut, etter tilsetning av 1,5 ml anilin, 100 mg L-cystein-hydroklorid og 34 ml 0,2molar citratpuffer (pH 5) faller utgangsmaterialet delvis igjen ut, suspensjonen bringes med 2N-saltsyre til pH 6,3. 260 mg papain oppslemmes i 2 ml vann av 40°C, det uoppløselige frasentrifugeres, 1,9 ml av den ovenstående oppløsning has til ovennevnte suspensjon og dette omrøres 20 timer ved 40°C. Under isavkjøling bringes blandingens pH med 2-N natronlut til 8, det uoppløselige Z-/L-Trp(F)_7~anilid frafiltreres, filtratet innstilles med 5N saltsyre på pH 5,3 og blandes som nevnt ovenfor med cystein-hydroklorid og papain. Etter ytterligere 20 timer frafiltreres igjen det dannede anilid og filtratet behandles igjen iløpet av tre dager som ovenfor, hvormed det bare dannes spor av anilid. Filtratet overhelles med etylacetat, surgjøres til pH 1-2, det organiske sjikt vaskes med vann, tørkes over natriumsulfat og inndampes. Residuet omkrystalliseres fra diisopropyleter-hexan.

DC: System 157B : Rf 0,3

T rinn 11. 2

Z-/D-Trp(FL7~Lys(Boc)-OH

1,15 g Z-/b-Trp ( F) J- OE overføres ifølge den i eks. 1.3A omtalte fremgangsmåte i det i tittelen nevnte dipeptid.

DC: System 157B : Rf 0,33

Trinn 11. 3

Z-/E>-Trp (F)_/-Lys (Boe) -Thr (But) -Phe-OTmse

En oppløsning av 380 mg Z-/D-Trp(F)_/-Lys(Boe)-OH, 300 mg

H-Thr(But)-Phe-OTmse (eks. 1.3) og 110 mg N-Hydroksybenzotriazol

i 2,5 ml dimetylformamid blandes ved 0°C med 170 mg DCCI. Etter 15 timer opparbeides analogt Eks. 7.1 og produktet renses ved omkrystallisering fra etylacetat-petroleter.

DC: System 157A: Rf 0,76

Trinn 11. 4

Z-Asn-Phe-Phe-/b-Trp (F)_7-Lys (Boe) -Thr (But) -Phe-OTmse

En oppløsning av 490 mg Z-/b-Trp (F)_7-Lys (Boe) -Thr (But) - Phe-OTmse i 15 ml metanol-vann (9:1) hydrogeneres i nærvær av 50 mg palladium-kull (10%), idet det ved en samtidig tilsetning av 0,2N saltsyre stadig i ovennevnte oppløsningsmiddel holdes pH 5. Reaksjonsblandingen filtreres, filtratet inndampes og avvannes tre ganger ved avdampning med dimetylformamid. Til den gjenblivende oppløsning (1,2 g) has 305 mg Z-Asn-Phe-Phe-OH, 83 mg N-hydroksy-benzotriazol, 0,06 ml N-metylmorfolin og 1,2 ml dimetylformamid. Ved -5°C tilsatter man 130 mg DCCI og lar det stå i 16 timer ved denne temperatur. Etter opparbeidelse analogt Eks. 7.1 omkrystalliseres produktet av acetonitril-vann.

DC: System 157A: Rf 0,6.

T rinn 11. 5

Z-Asn-Phe-Phe-/D-Trp (F)_7-Lys (Boe) -Thr (But) -Phe-OH

En oppløsning av 600 mg Z-Asn-Phe-Phe-/b-Trp (F)_/-Lys (Boe)-Thr(But)-Phe-OTmse i 4,2 ml dimetylformamid blandes ved 30°C med 3,8 ml o,34 M trietylammoniumfluorid-oppløsning i dimetylsulfoksyd og hensettes 30 minutter ved 30°C. Oppløsningen dryppes under isavkjøling i 50 ml vann og 0,65 ml 2-N saltsyre og utfellingen frafiltreres. Produktet renses ved omkrystallisering fra acetonitril-vann.

DC: System 157A: Rf 0,35

T rinn 11. 6

Z-Asn-Phe-Phe-/D-Trp(F)y-Lys(Boe)-Thr(But)-Phe-Gaba-OBzl

En oppløsning av 47 0 mg Z-Asn-Phe-Phe-/D-Trp (FjJ^-Lys (Boe)-Thr (But)-Phe-OH, 165 mg H-Gaba-OBzl . p-toluensulfonat

(eks. 1.7A) og 66 mg N-hydroksybenzotriazol i 2 ml dimetylformamid blandes ved -5°C med 0,05 ml N-metylmorfolin og 100 mg DCCI. Etter 16 timer ved denne temperatur opparbeides analogt Eks. 7.1. Produktet fåes rent, unntatt spor av dicyklohexylurinstoff.

DC: System 157A: Rf 0,55

Trinn 11. 7

En oppløsning av 520 mg Z-Asn-Phe-Phe-/D-Tr<p> (F)_7~ Lys(Boe)-Thr(But)-Phe-Gaba-OBzl i 20 ml dimetylformamid hydrogeneres i nærvær av 50 mg palladium-kull (10%) i 2 timer. Etter - katalysatorens frafiltrering inndampes filtratet i høyvakuum og blandes med 350 ml dimetylformamid, 540 mg N-hydroksybenzotriazol og 720 mg DCCI. Etter 20 timer ved 50°C opparbeides analogt Eks. 8.2 og renses, K = 1,1.

DC: system 157A: Rf 0,35.

E ksempel 12

Analogt som angitt i Eks. 1 behandler man det beskyttede peptid med formel

med trifluoreddiksyre og opparbeider. Ved motstrømsfordeling over 220 trinn (K = 4,5) fåes det ønskede produkt som et tynnsjiktkromatografisk enhetlig amorft stoff.

DC: System 101 : Rf 0,58

111B : Rf 0,40

112A : Rf 0,45

(Symbolet /D-Trp (NC^ )_7 betyr 6-nitro-D-tryptof an)

Utgangsmaterialet fåes som følger:

T rinn 12. 1

Z- Gaba- OTmse

En oppløsning av 5,93 g Z-Gaba-OH og 3,84 g trimetyl-silyl-etanol i 10 ml acetonitril og 6 ml pyridin avkjøles til 5°C og blandes under omrøring med 5,70 g DCCI. Etter én time ved 5°C holdes reaksjonsblandingen ennu i 15 timer ved værelsetemperatur. Det utfelte dicyklohexylurinstoff frafiltreres og vaskes med etylacetat og filtratet inndampes. Residuet kromatograferes på

en kiselgelsøyle (350 g), idet en blanding av karbontetraklorid-etylacetat (6:4) tjener som elueringsmiddel. Produktet inneholdende fraksjoner sammenfattes og inndampes. Den dannede farveløse olje tørkes i høyvakuum.

DC: /kloroform-metanol (85:15)} Rf 0,69

/toluen-aceton (7:3)/ Rf 0,5 9

Trinn 12. 2

H- Gaba- OTmse

Gjennom en oppløsning av 4', 70 g Z-Gaba-OTmse (trinn 12.1) 1 50 ml isopropanol føres etter tilsetning av 0,5 g palladium-kull (10%) hydrogen inntil ved tynnsjiktkromatografisk Ckloroform-metanol (85:15)./ ikke mer kan påvises utgangsstoff. Katalysatoren frafiltreres og filtratet inndampes i vakuum. Det oljeaktige råprodukt anvendes direkte for neste trinn.

Trinn 12. 3

Z- Phe- Gaba- OTmse

Til en oppløsning av 4,60 g Z-Phe-OH og 2,83 g H-Gaba-OTmse (trinn 12.2) i 15 ml metylenklorid settes ved 0-5°C en opp-løsning av 3,75 g dicyklohexylkarbodiimid i 5 ml metylenklorid. Reaksjonsblandingen holdes ennu 15 minutter ved 5°C og deretter 2 timer ved værelsetemperatur, frafiltreres fra utfelt DCH og filtratet inndampes. Residuet omkrystalliseres for rensning tre ganger fra etylacetat (12 ml) og petroleter (60 ml), smp. 88-93,5°C.

(under spaltning). (DCH = dicyklohexylurinstoff).

DC: /kloroform-metanol (85:15)/ Rf 0,72

/toluen-aceton (7:3)/ Rf 0,44

Trinn 12. 4

Z- Thr( But)- Phe- Gaba- OTmse

En oppløsning av 3,93 g H-Phe-Gaba-OTmse /"dannet av 5,4 2 g Z-Phe-Gaba-OTmse (trinn 12.3) ved hydrogenering analogt trinn 12.2/ og 5,45 g Z-Thr(But)-ONSu i 25 ml dimetylformamid holdes i 15 timer ved værelsetemperatur, blandes med 0,34 ml dimetylaminopropylamin og hensettes en ytterligere time ved værelsetemperatur. Reaksjonsblandingen inndampes i høyvakuum, residuet oppløses i ca. 20 0 ml etylacetat og vaskes tre ganger med hver gang 30 ml av en 5%-ig vandig vinsyre-oppløsning og tre ganger med hver gang 30 ml vann. Den over natriumsulfat tørkede organiske fase inndampes i vakuum og residuet omkrystalliseres to ganger fra etylacetat (10 ml)-petroleter (80 ml), smp. 114-117°C (under spaltning).

DC: /kloroform-metanol (85:15)/ Rf 0,75

/Rarbontetraklorid-etylacetat (6:4)/ Rf 0,39

Trinn 12. 5

Z- Lys( Boe)- Thr( But)- Phe- Gaba- OTmse

Til en oppløsning av 2,37 g H-Thr(But)-Phe-Gaba-OTmse /dannet av 3,00 g Z-Thr(But)-Phe-Gaba-OTmse ved hydrogenering analogt trinn 12.2/, 1,96 g Z-Lys(Boe)-OH og 0,70 g N-hydroksy-benzotriazol i 10 ml metylenklorid tilsettes ved 0-5°C en opp-løsning av 1,25 g DCCI i 5 ml metylenklorid. Etter 15 minutter ved 0-5°C holdes blandingen i 15 timer ved værelsetemperatur. Det utfelte dicyklohexylurinstoff frafiltreres, filtratet inndampes i vakuum, og residuet gjenutfelles tre ganger fra etylacetat (20 ml)-petroleter (100 ml).

DC: /kloroform-metanol (85:15)/ Rf 0,73

/kloroform-metanol-vann (14:6:1)/ R^ 0,87

Trinn 12. 5A

Bpoc-Phe-/D-Trp(N02 )/-0H

En suspensjon av 0,50 g 6-nitro-D-tryptofan og

1,10 g Bpoc-Phe-ONSu i 10 ml av en blanding av dimetylformamid-vann (8:2) behandles ved værelsetemperatur med 0,1-N natronlut således at pH forblir på en verdi på 7,5. Etter 2\ time utgjør det samlede forbruk av natronlut 31,5 ml. Reaksjonsblandingen avkjøles til 0-5°C og blandes langsomt med 3,5 ml 1-N saltsyre. Det utfelte råprodukt frafiltreres, tørkes og kromatograferes

to ganger gjennom en kiselgelsøyle (hver gang 60 g adsorbens) med en blanding av kloroform-metanol (85:15) og karbontetraklorid-etylacetat (6:4) som elueringsmiddel.

DC: /kloroform-metanol (85:15)/ Rf 0,12

/kloroform-metanol-vann (14:6:1)/ Rf 0,50

Trinn 12, 6

Bpoc-Phe-/b-Trp(N02I/-Lys(Boe)-Thr(But)-Phe-Gaba-OTmse

Til en oppløsning av 1,08 g H-Lys(Boe)-Thr(But)-Phe-Gaba-OTmse /dannet av 1,30 g Z-Lys(Boe)-Thr(But)-Phe-Gaba-OTmse (trinn 12.5) ved hydrogenering analogt trinn 12.2/, 0,93 g Bpoc-Phe-/b-Trp(N02)/-OH (trinn 12.5A) og 0,22 g N-hydroksybenzotriazol i 8 ml metylenklorid tilsettes ved 0-5°C en oppløsning av 0,36 g DCCI i 2 ml metylenklorid. Etter 15 minutter ved 0-5°C holdes blandingen i 4 timer ved værelsetemperatur. For opparbeidelse frafiltreres det utfelte dicyklohexylurinstoff, filtratet inndampes i vakuum og residuet gjenutfelles fra en blanding av etylacetat (10 ml) og petroleter (70 ml) og utdrives deretter med metanol (10 ml).

DC: /toluen-aceton (7:3)/ Rf 0,20

/kloroform-metanol-vann (14:6:1)/ Rf 0,90

Trinn 12. 7

HC1.H-Phe-/D-Trp(N02 )/-Lys(Boe)-Thr(But)-Phe-Gaba-OTmse

En oppløsning av 1,27 g Bpoc-Asn-Phe-Phe-/b-Trp(N02)/- Lys(Boc)-Thr(But)-Phe-Gaba-OTmse (trinn 12.6) i en blanding av

27 ml trifluoretanol og 3 ml vann holdes tilsetning etter hvert av en blanding av trifluoretanol med konsentrert saltsyre (9:1)

ved synbart pH 1,5 (gasselektrode, automatisk titreringsapparat). Inntil reaksjonens avslutning forbrukes iløpet av I3j time ved værelsetemperatur ca. 0,76 ml av reagenser. Det etter inndampning i vakuum dannede råprodukt utrøres iløpet av én time med 30 ml eter og frafiltreres deretter.

DC: /kloroform-metanol (85:15)7 Rf 0,55

T rinn 12. 7A

2- trimetylsilyletyl- N- hydroksy- succinimidokarbonat

( SEOC- ONsu)

En oppløsning av 100 g klormaursyre-N-hydroksy-succinimidester og 73,2 g 2-trimetylsilyletanol i 160 ml metylenklorid dryppes ved 0-5°C 6 2,6 g N-metylmorfolin iløpet av 15 minutter. Blandingen omrøres i to timer ved 0-5°C, blandes for opparbeidelse med 1 liter eter og vaskes med hver gang 2 ganger 200 ml 1-N HC1, 200 ml vann, 20 0 ml 5%ig natriumhydrogenkarbonat-oppløsning og tre ganger med 200 ml vann. De vandige faser etter-ekstraheres med 0,5 liter eter og de forenede organiske faser tørkes over natriumsulfat og inndampes. Residuet gjenoppløses fra 36 0 ml diisopropyleter og de dannede krystaller frafiltreres og vaskes med 150 ml hexan, smp. 101-102°C.

Trinn 12. 7B

SEOC- Asn- OH

I en oppløsning av 2,64 g L-asparagin i 80 ml av en blanding av dimetylformamid-vann (6:2) innstilles pH på 7,5

ved tilsetning av 0,21 ml 1-N natronlut, og-deretter tildryppes stadig under opprettholdelse av pH 7,5 ved tilsetning av ytterligere mengder 1-N natronlut ved hjelp av et automatisk titreringsapparat, en oppløsning av 5,19 g SEOC-ONSu (trinn 12.7A) i 10 ml dimetylformamid iløpet av én time. Etter 2\ time frafiltreres en liten mengde uoppløst materiale og filtratet blandes med en mengde fortynnet saltsyre som er ekvivalent til mengden av forbrukt 1-N natronlut (ca. 20 ml). Oppløsningen inndampes i høyvakuum og residuet utdrives med 30 ml koldt vann og filtreres, smp.

144,5-146,5°C (under spaltning)

DC: /kloroform-metanol-vann (14:6:1)7 Rf 0,15

T rinn 12. 7C J

SEOC- Asn- ONSu

Til en oppløsning av 1,72 g SEOG-Asn-OH (trinn 12.7B)

i en blanding av 20 ml etylacetat og 10 ml dimetylformamid settes 0,79 g N-hydroksy-succinimid og den til 0-5°C avkjølte oppløsning blandes med 1,54 g DCCI. Etter 2 timer ved 0-5°C frafiltreres det utfelte dicyklohexylurinstoff, filtratet fortynnes med 150 ml etylacetat og vaskes tre ganger med hver gang 50 ml l%ig oksal-syreoppløsning og fire ganger med hver gang 5 0 ml vann. Den organiske fase tørkes over natriumsulfat og inndampes i vakuum. Det dannede skum anvendes uten ytterligere rensing for neste trinn.

DC:/kloroform-metanol-vann (14:6:1)7' Rf 0,75

T rinn 12. 7D

SEOC- Asn- Phe- OH

Til en suspensjon av 0,64 g fenylalanin og 1,44 g SEOC-Asn-ONSu (trinn 12.7C) i en blanding av 5 ml dimetylformamid og 5 ml vann dryppes iløpet av en halv time ved værelsetemperatur 1-N natronlut ved hjelp av et automatisk titreringsapparat med en slik hastighet at det overholdes pH på 7,5. Til opparbeidelse frafiltreres en liten mengde upppløst materiale og filtratet blandes ved 0-5°C med en mengde fortynnet saltsyre (ca. 4,2 ml av en 1-N oppløsning) som er ekvivalent mengden forbrukt natronlut.

Det utfelte råprodukt tørkes over fosforpentoksyd og omkrystalliseres fra 40 ml etylacetat, smp. 156-158°C (under spaltning).

DC: /kloroform-metanol-vann (14:6:1)7 Rf 0,33.

T rinn 12. 8

SEOC-Asn-Phe-Phe-/D-Trp(N02 )7-Lys(Boe)-Thr(But)-Phe-Gaba-OTmse

En'oppløsning av 500 mg HC1.H-Phe-/b-Trp(N02 )/-Lys(Boe)-Thr(But)-Phe-Gaba-OTmse (trinn 12.7), 202 mg SEOC-Asn-Phe-OH

(trinn 12.7D), 65 mg N-hydroksybenzotriazol og 44 mg N-metylmorfolin i 5 ml dimetylformamid avkjøles til 0°C og blandes med 116 mg DCCI, holdes 15 minutter ved 0-5°C og 6 timer ved værelsetemperatur. Det utfelte dicyklohexylurinstoff frafiltreres, filtratet inndampes i høyvakuum og residuet utdrives med 2 0 ml vann og suges fra. Rå-produktet utdrives enda to ganger med hver gang 4 ml metanol og frafiltreres.

DC: /kloroform-metanol (85:15)/ Rf 0,80

/kloroform-metanol-vann (14:6:1)/ Rf 0,90

Trinn 12. 9

H-Asn-Phe-Phe-/D-Trp (N02)_/-Lys (Boc)--Thr (But) -Phe-Gaba-OH

530 mg SEOC-Asn-Phe-Phe-/D-Trp(N02)/-Lys(Boe)-Thr(But)-Phe-Gaba-Tmse (trinn 12.8) oppløses i 46,7 ml av en nyfremstilt vannfri 0,15 molar trietylammoniumfluorid-oppløsning i dimetylformamid og holdes én time ved værelsetemperatur. Oppløsningen avkjøles til 0-5°C, blandes under god omrøring med 0,70 ml vandig 1-N saltsyre og konsentreres i høyvakuum til 3 ml. Produktet utfelles ved tilsetning av 30 ml vann.

DC: /kloroform-metanol-vann (14:6:1)/ R^ 0,4 5

Trinn 12. 10

Analogt Eksempel 1 fåes H-Asn-Phe-Phe-/b-Trp (N02)./- Lys(Boe)-Thr(But)-Phe-Gaba-OH (trinn 12.9) ved cyklisering med hjelp av DCCI og N-hydroksybenzotriazol. Råproduktet renses ved motstrømsfordeling (K=l,08).

DC: /kloroform-metanol (85:15)/ Rf 0,45

/kloroform-metanol-vann (14:6:1)/ Rf 0,60

E ksempel 13

(Symbolet /Trp(BR)/ betyr 5-brom-L-tryptofan). Fremstillingen av tittelforbindelsen foregår under samme betingelser

som fremstillingen i det foregående Eksempel 12, imidlertid under anvendelse av 5-brom-L-tryptofan i stedet for 6-nitro-D-tryptofan i tilsvarende utgangsstoffer og mellomprodukter.

Motstrømsfordeling: 320 trinn, K = 9,0

DC: System 101 : Rf 0,60

System 111B : Rf 0,40

System 112A : Rf 0,52

Utgangsstoffet med formel:

fremstilles som følger:

Trinn 13. 1

Bpoc-Phe-/Trp(Br\ J- OH

Analogt Eksempel 12.5A omsettes 0,57 g 5-brom-L-tryptofan med 1,00 g Bpoc-Phe-ONSu.

DC: /kloroform-metanol (85:1517 Rf 0,15

/kloroform-metanol-vann (14:6: 1\ J R^ 0,55

Trinn 13. 2

Bpoc-Phe/Trp(Br)/-Lys (Boe) -Thr (But) -Phe-Gaba-OTmse

En blanding av 0,57 g Bpoc-Phe-/frp (Br)J7-OH (trinn 13.1) 0,63 g H-Lys(Boe)-Thr(But)-Phe-Gaba-OTmse (Eksempel 12.5), 0,13 g N-hydroksybenzotriazol og 0,21 g DCCI omsettes analogt eks. 12.6. For rensing oppløses råproduktet i 10 ml varm metanol og utfelles ved avkjøling.

DC: /kloroform-metanol (85:15)/ Rf 0,80

/kloroform-metanol-vann (14:6:1)/ R^ 0,90

Trinn 13. 3

HC1. H-Phe-/Trp (Br)_/-Lys (Boe) -Thr (But) -Phe-Gaba-OTmse

Analogt Eksempel 12.7 behandles 0,84 g Bpoc-Phe-/Trp(Br17-Lys(Boe)-Thr(But)-Phe-Gaba-OTmse.

DC: /kloroform-metanol (85:15)/ r o,65

/kloroform-metanol-vann (14:6:1)/ Rf 0,90

Trinn 13. 4

SEOC-Asn-Phe-Phe-/Trp(Br )/-Lys(Boe)-Thr(But)-Phe-Gaba-OTmse

Analogt Eksempel 12.8 kobles 7 00 mg HCl.H-Phe-/Trp (Br)/-Lys(Boe)-Thr(But)-Phe-Gaba-OTmse (trinn 13.3) og 250 mg SEOC-Asn-Phe-OH (eksempel 12.7D) ved hjelp av 14 6 mg DCCI i nærvær av 88 mg N-hydroksybenzotriazol og 6 0 mg N-metylmorfolin.

DC: /kloroform-metanol (85:15)/ Rf o,77

/kloroform-metanol-vann (14:6:1)/ Rf 0,85

Trinn 13. 5

H-Asn-Phe-Phe-/Trp(Br)/-Lys(Boe)-Thr(But)-Phe-Gaba-OH

Analogt Eksempel 12.9 avspaltes i 5 00 mg SEOC-Asn-Phe-Phe-/Trp(Br)/-Lys(Boe)-Thr(But)-Phe-Gaba-OTmse (trinn 13.4) SEOC- og Tmse-gruppene samtidig.

DC: /kloroform-metanol-vann (14:6:1)/ Rf 0,50

Trinn 13. 6

Ved cyklisering av H-Asn-Phe-Phe-/Trp(Br)/-Lys(Boe)-Thr(But)-Phe-Gaba-OH ved hjelp av DCCI og N-hydroksybenzotriazol ifølge den i Eksempel 1.10 omtalte fremgangsmåte fåes et råprodukt som renses ved hjelp av motstrømsfordeling (K = 0,86).

DC: /kloroform-metanol (85:15)/ Rf 0,06

/kloroform-metanol-vann (14:6:1)/ Rf 0,85

E ksempel 14

behandles analogt Eksempel 1 med trifluoreddiksyre og overføres

ved ioneutveksler i acetat. Rensingen foregår ved hjelp av mot-strømsfordeling i samme system som angitt i Eksempel 1, K = 9.

DC: (kiselgel, Merck): System 157 C: Rf 0,25.

(Symbolet Ph(J) betyr p-jod-L-fenylalanin).

Utgangsmaterialet fåes som følger:

Trinn 14. 1

Z-( D- Trp) fLys( Boc)- Thr- OMe

En oppløsning av 2,78 g Z-(D-Trp)-Lys(Boe)-OH (eks. 1.3A), 0,85 g H-Thr-OMe-hydroklorid og 0,77 g N-hydroksybenzotriazol i 16 ml acetonitril blandes ved -5°C med 0,56 ml N-metylmorfolin og 1,03 g DCCI. Etter 15 timer ved -5°C opparbeides blandingen analogt trinn 14.3B. Produktet omkrystalliseres fra etylacetat-hexan, smp. 120-122°C.

DC: System 157A : Rf 0,47.

T rinn 14. IA

SEOC- Asn- Phe- Phe- OH

En oppløsning av 2,24 g Z-Asn-Phe-Phe-OH i 40 ml dimetylformamid hydrogeneres under tilsetning av 0,23 g Pd-kull (10%) i 4 timer ved værelsetemperatur. Etter frafiltreringen

av katalysatoren inndampes oppløsningen i høyvakuum til ca. 5 ml og videreforarbeides direkte i denne form1. En oppløsning av 1,71 g dannet H-Asn-Phe-Phe-OH i 15 ml dimetylformamid blandes med 10 ml vann og den dannede suspensjon etter tilsetning av 1,04 g SEOC-ONSu ved etterhvert tilsetning av 2-N natronlut ved hjelp av et automatisk titreringsapparat holdes i 2 timer (værelsetemperatur) ved pH 7,5. Etter en ytterligere tilsetning av 1,04 g SEOC-ONSu hensettes i 4 timer ved pH 7,5. For opparbeidelse frafiltrerer oppløsningen fra litt uoppløst materiale filtratet blandes ved 0-5°C med en til den forbrukte natriumhydroksyd ekvivalent mengde saltsyre (ca. 8,0 ml 2-N oppløsning), det utfelte produkt frafiltreres og tørkes. Råproduktet gjenutfelles hver gang en gang fra 10 ml metanol med 100 ml eter og fra 10 ml metanol med 80 ml vann, smp. 176-182°C (under spaltning). DC: /kloroform-metanol-vann (14:6:1)/ Rf 0,30.

Trinn 14. 2

SEOC- Asn- Phe- Phe-( D- Trp)- Lys( Boe)- Thr- OMe

En oppløsning av 340 mg Z-(D-Trp)-Lys(Boe)-Thr-OMe (trinn 14.1) i en blanding av 15 ml metanol og vann (9:1) hydrogeneres i nærvær av 50 mg palladium-kull (10%) og under tilsetning av 0,2N saltsyre i samme oppløseningsmiddel ved pH 4,5. Etter katalysatorens frafiltrering inndampes filtratet i vakuum og inndampes enda to ganger med dimetylformamid. Den gjenblivende oppløsning (totalt 1,5 g) blandes med 285 mg SEOC-Asn-Phe-Phe-OH (trinn 14.IA) og 90 mg N-hydroksybenzotriazol. Ved -5°C tilsettes 0,056 ml N-metylmorfolin og 123 mg DCCI og står 18 timer ved -5°C. Op<p>arbeidelsen foregår analogt Eks. 7.1, råproduktet omkrystalliseres fra vandig trifluoretanol.

DC: System 157A : Rf 0,45.

Trinn 14. 3

SEOC- Asn- Phe- Phe-( D- Trp)- Lys( Boe)- Thr- Hydrazid

En oppløsning av 355 mg SEOC-Asn-Phe-Phe-(D-Trp)-Lys(Boe)-Thr-OMe (trinn 14.2) i 1,1 ml dimetylformamid blandes ved værelsetemperatur med 0,16 ml hydrazinhydrat. Etter 2\ time utdrives den faste masse med 5 ml vann, utfellingen suges fra og vaskes med vann til fullstendig fjerning av hydrazin. Det etter utdrivning med metanol dannede produkt er enhetlig.

DC: System 157B : Rf 0,25.

Trinn 14. 3A

Boc-/Phe (J-)/-OH

En oppløsning av 2,9 g p-jod-L-fenylalanin i 10 ml 1-N natronlut og 25 ml tert.-butanol blandes med 2,4 ml di-tert.-butyl-dikarbonat, og omrøres videre ved værelsetemperatur i tre timer og hensettes enda i 20 timer. Reaksjonsoppløsningen fordeles mellom vann og hexan, den organiske fase kasseres og den vandige fase surgjøres under isavkjøling, produktet opptas i etylacetat og oppløsningsmidlet inndampes i vakuum. Produktet renses ved krystallisering fra karbontetraklorid, smp. 118-120°C. DC: System 157 B : Rf 0,35.

T rinn 14. 3B

Boc-/Phe(J)/-Gaba-OTmse

En oppløsning av 406 mg H-Gaba-OTmse (eks. 12.2),

782 mg Boc-/Phe(J)/-OH (trinn 14.3A) og 306 mg N-hydroksybenzotriazol i 5 ml acetonitril og 3 ml dimetylformamid blandes ved +5°C med en oppløsning av 412 mg DCCI i 1 ml dimetylformamid. Etter 20 timer ved 5°C frafiltreres det utfelte dicyklohexylurinstoff, filtratet fortynnes med etylacetat og utrystes med fortynnet saltsyre og natriumhydrogenkarbonatoppløsning. Etter tørking over natriumsulfat inndampes oppløsningsmidlet og produktet omkrystalliseres fra hexan, smp. 98-100°C.

DC: /éyklohexan-aceton (7:3)_7 Rf 0,35

System 157A Rf 0,68

T rinn 14. 3C

H-/Phe (J)_/-Gaba-OTmse . hydroklorid

En oppløsning av 345 mg Boc-/Phe (J),7-Gaba-OTmse

(trinn 14.3B) i 0,7 ml av en blanding av trifluoretanol-vann (9:1) blandes ved værelsetemperatur med 1,5 ml 1,2-N saltsyre i samme oppløsningsmiddel. Etter 30 minutter blandes blandingen med 10 ml tert.-butanol og inndampes i vakuum til omtrent halv-parten. Denne prosess gjentas enda tre ganger, deretter fjernes det resterende tert.-butanol ved lyofilisering. Residuet omkrystalliseres fra isopropanol-eter.

DC: System 157C : Rf 0,68.

Trinn 14. 4

SEOC-Asn-Phe-Phe-(D-Trp)-Lys(Boe)-Thr-/Phe(Jl7"Gaba-0Tmse

En oppløsning av 320 mg SEOC-Asn-Phe-Phe-(D-Trp)-Lys(Boe)-Thr-hydrazid (trinn 14.3) i 2 ml dimetylformamid blandes ved -15°C til -20°C med 0,14 ml 5,3-N saltsyre i dioksan og 0,04 ml tert.butylnitrit og omrøres 15 minutter ved denne temperatur. Deretter tilsettes ved -25°C en oppløsning av 193 mg H-/Phe(J)_7~ Gaba-OTmse . hydroklorid (trinn 14.3C) i 0,5 ml dimetylformamid og 0,18 ml N-metylmorfolin, oppvarmes langsomt til 0°C og holdes 16 timer ved denne temperatur. Produktet utfelles ved inndryp-

ning i vann og renses ved utdrivning med metanol og acetonitril.

DC: /kloroform-trifluoretanol-metanol (80:15:5)/ Rf 0,43.

Trinn 14. 5

H-Asn-Phe-Phe- (D-Trp) -Lys (Boe)-Thr-/i>he (J)_7-Gaba-OH

En oppløsning av 324 mg SEOC-Asn-Phe-Phe-(D-Trp)-Lys(Boc)-Thr-/Phe(JL7-Gaba-OTmse (trinn 14.4) i 2 ml dimetylformamid blandes med 12,3 ml 0,34 molar tetraetylammoniumfluorid

•i dimetylsulfoksyd og hensettes 1^ time ved 30°C. Produktet utfelles ved inndrypning i 40 ml iskoldt vann, som inneholder

0,41 ml 1-N saltsyre, og anvendes i neste trinn etter tørking.-

DC: System 157 : Rf 0,5.

T rinn 14. 6

En oppløsning av 258 mg H-Asn-Phe-Phe-(D-Trp)-Lys(Boe)-Thr-/Phe(JL7-Gaba-OH, 300 mg N-hydroksybenzotriazol og 410 mg DCCI i 200 ml dimetylformamid hensettes 20 timer ved 50°C. Opparbeidelse og rensing foregår analogt Eks. 8.2, K = 1,1.

DC: System 157A : Rf 0,22.

Eksempel 15

En oppløsning av 350 mg _

metylformamid blandes med 0,7 ml 2,1 molar tetrabutyl.ammonium-fluorid"i dimetylsulfoksyd og hensettes 20 timer ved 30°C. Etter blanding med 20 ml 1-N eddiksyre og 50 ml etylacetat adskilles den vandige fase, den organiske fase ekstraheres enda to ganger med litt vann og de forenede vandige oppløsninger inndampes i ' vakuum og lyofiliseres. Residuet, som består av en blanding av produkt og tetrabutylammoniumfluorid adskilles ved preparativ

tynnsjiktkromatografi på kiselgel i system 157C. Det fra kisel-gelen isolerte ennu ikke helt rene produkt renses ved motstrøms-fordeling i systemet kloroform-karbontetraklorid-metanol-0,05 molar ammoniumacetat (9:1:7:3) over 460 trinn. Det rene produkt (K=0,9) isoleres som vanlig. ,

DC: (kiselgel, Merck): System 157C: Rf 0,25

Utgangsmaterialet fåes som følger:

Trinn 15. 1

Z-( D- Trp)- Lys- OH . trifluoracetat

3,4 g Z-(D-trp)-Lys(Boe)-OH (eks. 1.3A) innføres

under isavkjøling i 34 ml av en blanding av trifluoreddiksyre-vann (9:1), inneholdende 0,5 ml 2-merkaptoetanol, og såsnart det er oppløst hensettes ennu 40 minutter ved 23°C. Ved inndrypning i 400 ml eter og 150 ml hexan utfelles råproduktet og oppløses i 30 ml vann. Etter henstand ved værelsetemperatur i 18 timer lyofiliseres oppløsningen og residuet anvendes direkte i neste trinn.

DC: System 157: Rf 0,35.

T rinn 15. 2

Z-( D- Trp)- Lys( SEOC)- OH

En oppløsning av 3,0 g Z-(D-Trp)-Lys-OH . trifluoracetat (trinn 15.1) og 1,47 g (2-trimetylsilyletyl)-(N-hydroksy)-succinimidokarbonat (eks. 12.7A) i 5,2 ml dimetylformamid blandes ved værelsetemperatur med 0,87 ml trietylamin og hensettes 15 timer. Etter fortynning med etylacetat surgjøres med saltsyre til pH 1-2,etylacetat-oppløsningen vaskes med vann, tørkes over natriumsulfat og inndampes. Råproduktet renses ved motstrømsfor-deling over 14 0 trinn i samme system, som angitt i eks. 1.10.,

K = 0,75.

DC: System 157 C : Rf 0,55.

Trinn 15. 3

Z-( D- Trp)- Lys( SEOC)- Thr- OMe

En oppløsning av 3,16 g Z-(D-Trp)-Lys(SEOC)-OH

(trinn 15.2), 1,32 g H-Thr-OMe.hydroklorid og 0,95 g N-hydroksy-benzotriazol i 25 ml acetonitril blandes ved -5°C med 0,86 ml N-metylmorfolin og 1,34 g DCCI og hensettes 16 timer ved denne temperatur. Det etter frafiltrering av dicyklohexylurinstoff dannede filtrat fortynnes med etylacetat, vaskes med fortynnet saltsyre og en natriumhydrogenkarbonatoppløsning og tørkes over natriumsulfat. Det etter inndampning av oppløsningsmidlet dannede residu kromatograferes med en blanding av etylacetat-hexan (7:3) til (9:1) over en kiselgelsøyle. De tynnsjiktkromatografisk rene fraksjoner inndampes til tørrhet.

DC: System 157A : Rf 0,38

Trinn 15. 4

Z- Asn- Phe- Phe-( D- Trp)- Lys( SEOC)- Thr- OMe

En oppløsning av 1,31 g Z-(D-Trp)-Lys(Boe)-Thr-OMe

i 30 ml metanol-vann (95:5) hydrogeneres over 13 0 mg palladium-kull (10%) i 2 timer. Etter katalysatorens frafiltrering inndampes filtratet og inndampes to ganger med dimetylformamid i høyvakuum. Den dannede oppløsning som inneholder 3,5 ml dimetylformamid blandes med 1,01 g Z-Asn-Phe-Phe-OH (Eks. 1.5A) og 330 mg N-hydroksybenzotriazol, avkjøles til -5°C, behandles med en opp-løsning av 44 0 mg DCCI i 0,5 ml dimetylformamid, hensettes 15 timer ved 0°C og opparbeides analogt Eks. 7.1.

DC: System 157A : Rf 0,45

Trinn 15. 5

Z- Asn- Phe- Phe-( D- Trp)- Lys( SEOC)- Thr- hydrazid

En oppløsning av 2,0 g Z-Asn-Phe-Phe-(D-Trp)-Lys(SEOC)-Thr-OMe i 6 ml dimetylformamid blandes ved værelsetemperatur med 0,85 ml hydrazinhydrat. Etter 2,15 timer opparbeides som i eksempel 14.3. Produktet kan på grunn av dets overordentlig tungt oppløselighet ikke kontrolleres ved DC.

Trinn 15. 5A

Trt- Tyr( But)- OH . dietylammoniumsalt

En oppløsning av 4,0 g H-Try(But)-OH i 50 ml kloroform blandes med 6,7 ml vann, 6,7 ml dietylamin og under isavkjø-ling iløpet av 30 minutter med 7,05 g trifenylklormetan. Etter ytterligere 1^ time adskilles den vandige fase, kloroformoppløs-ningen utrystes hver gang to ganger med en 4%ig vandig dietyl-aminoppløsning og mettet koksaltoppløsing, tørkes over natrium-sulf at og befris i vakuum for oppløsningsmiddel. Residuet krystalliseres fra eter-petroleter, smp. 141-145°C.

DC: /toluen-aceton (1:1)_7 Rf 0,48.

T rinn 15. 5B

T rt- Tyr( But)- ONSu

4,7 g Trt-Tyr(But)-OH-dietylammoniumsalt (trinn 15.5A) rystes under isavkjøling med 100 ml etylacetat og hver gang 10 ml 0,5 molar kaliumsulfat- og kaliumhydrogensulfatoppløsning. Etyl-acetatoppløsningen vaskes etter adskillelse av den nedre fase med vann og tørkes med natriumsulfat, og oppløsningsmidlet avdestilleres forsiktig i vakuum. Residuet oppløses i 50 ml dimetylformamid, blandes med 1,1 g N-hydroksysuccinimid og ved 0°C med 1,94 g DCCI og hensettes 15 timer ved 5°C. Etter frafiltrering av dicyklohexylurinstoffet utfelles fra filtratet med vann et råprodukt som kromatograferes på en kiselgelsøyle med kloroform. Fraksjonene som inneholder produktet ifølge DC forenes og omkrystalliseres fra metanol, smp. 163-164°C.

DC: (kloroform-etylacetat (1:1)) Rf 0,53

Trinn 15. 5C

Trt- Tyr( But)- Gaba- OBzl

Til en suspensjon av 580 mg Trt-Tyr(But)-ONSu (trinn 15.5B) og 730 mg H-Gaba-OBzl . p-toluensulfonat (Eks. 1.7A) i 1 ml ren kloroform has 0,77 ml N-metylmorfolin og hensettes 4 dager ved værelsetemperatur. Etter fortynning .med etylacetat utrystes oppløsningen under isavkjøling med 0,2 molar kaliumhydrogensulfat-oppløsning og vann, den organiske fase tørkes over natriumsulfat

og oppløsningsmidlet avdestilleres. Råproduktet kromatograferes

på kiselgel. Det rene produkt elueres med en blanding av etylacetat-hexan (1:1) og isoleres som vanlig.

DC: /toluen-aceton (8:2)/ Rf 0,5.

Trinn 15. 5D

H- Tyr( But)- Gaba- OBzl . hydroklorid

En oppløsning av 620 mg Trt-Tyr(But)-Gaba-OBzl (trinn 15.5C) i 20 ml av en blanding av trifluoretanol-vann (9:1)

blandes ved hjelp av et automatisk titreringsapparat ved pH 3,5

med 1,2-N saltsyre i samme oppløsningsmiddel, inntil det ikke

finner sted mere forbruk. Etter tilsetning av 20 ml tert.-butanol inndampes i vakuum. Dette gjentas enda to ganger og det resterende tert.-butanol fjernes ved lyofilisering. Til fjerning av trifenylkarbinol fordeles lyofilisatet mellom vann og eter, den vandige oppløsning lyofiliseres deretter.

DC: System 157B Rf0,5

T rinn 15. 6

Z- Asn- Phe- Phe-( D- Trp)- Lys( SEOC)- Thr- Tyr( But)- Gaba- OBzl

En oppløsning av 975 mg Z-Asn-Phe-Phe-(D-Trp)-Lys(SEOC)-Thr-hydrazid (trinn 15.5) i 7 ml dimetylformamid blandes ved -15° til -20°C med 0,47 ml 4,6 N saltsyre i dioksan og 0,11 ml tert.-butylnitrit. Etter 15 minutter settes til denne reaksjonsblan-

ding ved -25°C en oppløsning av 385 mg H-Tyr(But)-Gaba-OBzl . hydroklorid (trinn 15.5D) i 0,5 ml dimetylformamid og 0,4 4 ml N-metylmorfolin og blandingen hensettes 15 timer ved 0°C. Produktet utfelles med vann og renses ved utdrivning med acetonitril og metanol. På grunn av produktets uoppløselighet kan det ikke foregå DC-kontroll.

T rinn 15. 7

H- Asn- Phe- Phe-( D- Trp)- Lys( SEOC)- Thr- Tyr( But)- Gaba- OH

En oppløsning av 1,1 g Z-Asn-Phe-Phe-(D-Trp)-Lys(SEOC)-Thr-Tyr(But)-Gaba-OBzl i 30 ml dimetylformamid hydrogeneres i nær-55

vær av 100 mg palladium-kull (10%) i 3 timer. Katalysatoren frasuges, filtratet inndampes og produktet utfelles med vann. Det renses ved oppløsning i 5 ml dimetylformamid og utfelling med 15 ml metanol.

DC: System 157 : Rf 0,55.

Trinn 15. 8

En oppløsning av 700 mg H-Asn-Phe-Phe-(D-Trp)-Lys(SEOC)-Thr-Tyr(But)-Gaba-OH (trinn 15.7), N-hydroksybenzotriazol og 1,11 g DCCI i 540 ml dimetylformamid cykliseres i 21 timer ved 5 0°C. Opparbeidelsen foregår analogt Eks. 7.3. Det renses ved søylekromatografi over kiselgel, det rene stoff elueres med en blanding av kloroform-trifluoretanol-metanol (87:5:8) .

DC: System 157B : Rf 0,38.

Claims

1. Analogifremgangsmåte til fremstilling av terapeutisk aktive cyklopeptider med formel hvori R betyr Asn, Ala eller des-R, trp betyr D-Trp eller L-Trp, som i benzenringen kan være substituert med halogenatomer eller nitrogrupper, W betyr hydrogen eller en fri eller foretret hydroksylgruppe eller et halogenatom, spesielt jodatom, som er substituert på benzenrincen i L-fenylalaninresten, X betyr resten av en cu-aminolaverealkan-(mono- eller diDVkarboksylsyre eller des-X og Y betyr resten av en ui-aminolaverealkan- (mono-eller di)-karboksylsyre eller des-Y, med unntak av en forbindelse, hvori R betyr des-R, trp betyr D-Trp eller L-Trp, W betyr hydrogen, et av symbolene X og Y betyr des-X resp. des-Y og det andre betyr resten av 7-aminopheptansyre, samt syreaddisjonssalter og komplekser herav, karakterisert ved at fra en forbindelse med formel hvor R, W, X, Y og trp har ovennevnte betydninger, A betyr en e-aminobeskyttelsesgruppe eller hydrogen og B betyr en hydroksylbeskyttelsesgruppe eller hydrogen, idet bare et av symbolene A og B kan bety hydrogen, avspaltes beskyttelsesgruppen eller -gruppene, og hvis ønsket, frigjøres fra et dannet syreaddisjonssalt en tilsvarende base og/eller en dannet base omdannes i et syreaddisjonssalt herav, og/eller, hvis ønsket, omdannes et dannet sluttprodukt til et terapeutisk anvendbart kompleks herav.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at det fremstilles en forbindelse, hvori resten av en w-aminolaverealkanmonokarboksylsyre er karakterisert ved formel -NH-(CH2)n-C0- v hvori n betyr et helt tall fra 2-4.

3. Fremgangsmåte ifølge krav 1,karakterisert ved at det fremstilles en forbindelse, hvori R betyr Asn eller de's-R, tryptofan Q-resten har D-konfigurasjon og -X-Y-betyr sammen -[Gaba]^-, hvori p er lik 0, 1 eller 2.

4. Fremgangsmåte ifølge krav 1,karakterisert ved at det fremstilles forbindelsen med formel

5. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at det fremstilles forbindelsen med formel