DD157189A5 - Verfahren zur herstellung neuer angiotensin-ii-antagonisieren der oktapeptide - Google Patents

Abstract

Es werden neue Angiotensin-&&-antagonisierende Oktapeptide der allgemeinen Formel X-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Y-OA,worin X eine Acylgruppe von N-Methyl-aminosaeuren, besonders die Sarcosylgruppe, oder von in der Alpha - Stellung eine Aminooxygruppe oder eine Hydroxylgruppe enthaltenden aliphatischen Carbonsaeuren, Y den Rest einer aliphatischen Alpha-Hydroxy-carbonsaeure,besonders von Milchsaeure und A Wasserstoff oder ein C tief 1-5 Alkylgruppe bedeuten, durch Abspaltung der Schutzgruppen von entsprechenden, nach ueblichen peptidchemischen Methoden aufgebauten geschuetzten Oktapeptiden hergestellt.

Description

H 369 55

-Λ-

227213 7

Verfahren zur Herstellung neuer Angiotensin-II-antagonisierender Oktapeptide

.Anwendungsgebiet der Erfindung:

Die Erfindung betrifft die Herstellung von neuen, angiotensin-II-antagonisierend wirkenden Peptiden der allgemeinen Formel I

X - Arg - VaI - Tyr - lie - His - Pro - Y - OA (I)

X eine Aeylgruppe von N-Methyl-aminosäuren, besonders die Darcosylgruppe, oder von in derΛ-Stellung eine Aminooxy- oder Hydroxylgruppe enthaltenden aliphatischen Carbonsäure, . ·

Y den Rest einer aliphatischen(Χ-Hydroxy-carbonsäure, besonders von Milchsäure, A ein lasserstoffatom oder eine Alkylgruppe mit 1 bis 5

Kohlenstoffatomen bedeuten,

sowie von Säureadditionssalzen und Komplexen dieser Peptide. Die Erfindung erstreckt sich auch auf die Herstellung von den genannten Verbindungen als Wirkstoffe enthaltenden Arzneimittelpräparaten.

Charakteristik der bekannten technischen Lösungen:

Das erste Angiotensin-II-analogen, welches sowohl in vitro, als auch in vivo als spezifischer kompetitiver Inhibitor von Angiotensin-II wirkte, wurde im Jahre 1970 beschrieben (CR. Marshai u. Mitarb«: Prod. Hat. Acad. Sei. USA, 67,, .. 1624(1970); P.A. Khairallah u. Mitarb.: J. Med. Chem.. 12, 181 (197O)).

Diese Beobachtung hat den Anlaß zu ausgedehnten weiteren Forschungsarbeiten' gegeben, welche zur Herstellung von zahlreichen v/eiteren solchen antagonisierend wirkenden Angiotensin-.TI~analogen führten; solche Produkte boten Möglichkeiten zur Diagnostizierung und gegebenenfalls auch zur therapeutischen Behandlung von gewissen renin-abhängigen Hypertensionen. Von den auf diese Weise hergestellten zahlreichen antagonisierend wirkenden Verbindungen ist das (Sar ,

8 '

AIa )~angiotensin-II unter dem Hamen Saralasin schon in Verkehr gebracht worden (D. T. PaIs u. Mitarb. : Res. 2£, 673 (1971)); dieses Produkt hat sich im Laufe der klinischen Untersuchungen als geeignet zur Diagnostizierung (G. Bonner u. Mitarb.: Dtsch. Med. B_schr. KH. 432 (1979)) bzw. zur therapeutischen Behandlung (J.L. Marx: Science JJH, 821 (1976)) von Hypertensionen verschiedenen Usprungs erwiesen. Heuerdings wurde festgestellt, daß die Angiotensin-II-antagonisten auch zur Behandlung von als Folgeerscheinung der renovascularen Hypertension auftretenden Herzinsuffizienz geeignet sind (H. Gavras u. Mitarb,: JAJvLA 2Ji8, 880 (1977))-.

_ 3 —

227213 7

Die Untersuchung der Zusammenhänge zwischen der Struktur und der biologischen Wirkung der bisher hergestellten Angiotensin-II-analoga hat auch nützliche Informationen zur Klärung der agonistischen und antagonistischen Wirkungen geliefert.

Ziel der Erfindung:

Ziel der Erfindung ist die Herstellung vol solchen Antagonist en,'welche längere biologische Halbwertzeiten und keine derartigen Nebenwirkungen, wie z.B. anfängliche agonistische Wirkungen, zeigen.

Darlegung des Wesens der Erfindung:

Es würde gefunden, daß man wirksame kompetitive Inhibitoren von Angiotensin-II- erhält, wenn man das Phenylalanin in der 8-Stellung des Moleküls von Angiotensin-II durch eine aliphatische (jC-Hydroxycarbonsäure ersetzt und eine 3J-Methyl-aminosäure, zweckmäßig Sarkosin oder eine der von der Anmelderin vorher beschriebenen und als für ähnliche Zwecke wirksam gefundenen oc-Hydroxy- oder οι--Amino oxy car bonsäur en (vgl. DS-OS 2 831 271 bzw. 2 831 534) in die ,1-Stellung des Moleküls einbaut. Die auf diese Weise erhaltenen kornpetitiven Angiotensin-II-inhibitoren reduzieren in erheblichem Maß die durch Angiotensin-II verursachte Hypertension und können diese Wirkung auch bei subcutaner Verabreichung ausüben.

Die neuen Verbindungen der allgemeinen Formel I

X - Arg - VaI - Tyr - lie - His - Pro -Y-OA- (I)

worin X, Y und A die oben angegebenen Bedeutungen haben, werden erfindungsgemäß derart hergestellt, daß man

a) zur Herstellung von an der Stelle A ein Wasserstoffatom enthaltenden Verbindungen der allgemeinen Formel I die Schutzgruppen eines'geschützten Oktapeptidderivats der allgemeinen Formel II

B-X-Arg(C)-VaI-TyHD)-IIe-HiS(E)-PrO-Y-OF (II)

worin

B eine durch Acidolyse oder katalytisch^ Hydrierung entfernbare Gruppe, besonders eine Benzyloxycarbonyl- oder tert.-Butyloxycarbonylgruppe,

G eine zum temporären Schutz der Guanidinogruppe von Arg geeignete Schutzgruppe, besonders eine litro- oder Tosylgruppe,

D eine zum temporären Schutz der aromatischen Hydroxylgruppe von Tyr geeignete Schutzgruppe, besonders eine Benzyl- oder substituierte Benzylgruppe,

E eine zum temporären Schutz der Imidazolgruppe von His geeignete Schutzgruppe, besonders eine Dinitrophenylgruppe,

F eine zum Schutz der Carboxylgruppe der C-terminalen Aminosäure geeignete, gegen die Einwirkung von milden Säuren widerstandfähige, aber durch katalytisch^ Hydrogenolyse oder durch die Einwirkung von stärkeren Säuren entfernbare Schutzgruppe vertreten, oder

b) zur Herstellung von an der Stelle von A eine Alkylgruppe mit 1 bis 5Kohlenstoffatomen enthaltenden Verbindungen der allgemeinen Formel I die Schutzgruppen eines geschützten Oktapeptidderivats der allgemeinen Formel.III

B-X~Arg(C)-Val-Tyr(D)-Ile~His(E)-Pro-Y-OAV (III)

v/orin B, C, D und Ξ die oben angegebenen Bedeutungen haben und A' eine Alkylgruppe mit 1 bis 5 Kohlenstoffatomen bedeutet,

2272 13 7

selektiv schrittweise oder in einem Schritt entfernt und gewünschtenfalls die erhaltene Verbindung der allgemeinen Formel I in ein Säureadditionssalz oder in ein Komplexderivat überführt.

Die in den obigen Verfahren als Ausgangsstoffe verwendbaren Oktapeptidderivate der allgemeinen Formel II bzw. III können nach beliebigen, in der Peptidchemie üblichen Methoden, z.B. nach der in der ungarischen Patentschrift 168 431 beschriebenen Methode, durch Acylieren der entsprechenden Aminosäureester mit Pentafluorphenylestern von an der Isf-terminalen Aminogruppe geschützten Aminosäuren bzw. Peptiden hergestellt werden. Dabei sind zum Schutz der seitenfunktionellen Gruppen solche Schutzgruppen zu verwenden, welche unter den Bedingungen der nach dem Acylieren zum Entfernen der IT-Schutzgruppe durchzuführenden Acidolyse stabil sind.

Die geschützten Oktapeptide der allgemeinen Formeln II bzw. III können vorteilhaft schrittweise aus den einzelnen Aminosäuren aufgebaut werden, wobei man zum temporären Schutz der Aminogruppe der einzelnen Aminosäuren bzw. Aminosäurederivate eine durch Acidolyse leicht entfernbare Schutzgruppe, z.B. die tert.-Butyloxycarbonylgruppe, verwendet und dann, nach der Beendigung der Synthese, zuerst die Dinitrophenylgruppe durch Thiolyse abspaltet und anschließend sämtliche übrigen Schutzgruppen in einem Schritt durch katalytisch^ Hydrogenolyse entfernt.

Die Einführung derct-Hydroxycarbonsäure in die 8-Steilung wird zweckmäßig derart durchgeführt, daß man einen^-Hydroxycarbonsäureester der allgemeinen Formel IV

H-Y-O-Z . (IV)

worin Z eine Alkyl- oder Aralkylgruppe bedeutet und Y die oben angegebene Bedeutung hat, mit an der Aminogruppe

zweckmäßig mit einer tert.-Butyloxy-carbonylgruppe geschütztein Prolin umsetzt. Die auf diese Weise ausgebildete -CO-O-Gruppe zeigt in den weiteren Schritten der Synthese ein stabiles Verhalten.

Die erfindungsgemäß hergestellten Verbindungen der allge- . meinen Formel I können nach an sich bekannten Methoden, vorteilhaft durch lonenaustausch-chromatographie an Carboxymethylcellulose gereinigt v/erden. Auf diese Weise können die Produkte in der Form von lyophilisierten Pulvern erhalten werden, welche dann sehr gut zur Herstellung von verschiedenen Arzneimittelpräparaten geeignet sind.

Die antagonistische Wirkung der neuen Verbindungen der allgemeinen Formel I wurde an narkotisierten männlichen Katzen geprüft. Bei diesen Untersuchungen wurden den Tieren die Vagus-Herνen an beiden Seiten des Halses durchgeschnitten und nach Blockierung der Ganglionen wurde ihnen Hypertansin (CIBA) durch. Infusion (0,5 /Ug/kg/min) verabreicht. Nachdem sich der erhöhte Blutdruck stabilisiert hat. wurde dann die zu prüfende Verbindung in physiologischer Kochsalzlösung bzw. in trägerstoffhaitiger Lösung intravenös oder subcutan verabreicht. Die eingetretene Senkung des Blutdruckes wurde in ram Hg. in Prozenten des vor der Behandlung gemessenen Anfangswertes registriert. Die statistische Auswertung erfolgte aus den Blutdruckdifferenzen auf Grund des Student' sehen einmusterigen "t" Testes. Als Wirkungsdauer wurde die letzte noch signifikante Blutdrucksenkung (p = 5 %) betrachtet. Die auf diese Weise erhaltenen Ergebnisse wurden in der nachstehenden Tabelle zusammengefaßt.

Tabelle

V/irkung der in der 8-Stellung eine cL -Hydroxy-carbonsäure enthaltenden : Angiotensin-II-Analoga auf dem Blutdruck von Katzen

Wirkstoffe i.v. s.c.NaCl s.c.CMC s.c. Gel.

"ΊΟ "~n W ίίϊ S η ψο ϊή D ~~η ψο in D . "η $ϋΓ~ w~

(Sar¹,L-Lac⁸)-Ang-II 10 5 25 15 50 5 29 90 50 β 25 45 50 5 24 90

20 5 29 15 100 5 33 120 100 6 27 90 100 5 32 90

200 5 47 180 200 5 22 45 200 5 28 120

(Sar¹,L-Lac-0Bt⁸)- 10 5 27 12 100 β 15 45 100 5 41 90

Ang-II _{20 8 40} ,

(Sar¹,HMV⁸)-Ang-II 10 5 33 45 100 5 18 30 100 5 35 300

. 20 β 40 20

Saralasin 10 5 32 15 100 6 29 6θ 100 5 23 45

200 5 24 45 200 7 28 90

D: Dose, /Ug/kg; η: Zahl der Versuche; %i Blutdrucksenkung in %; m: Zeitdauer der Wirkung, Min.; ITaCl: in. physiologischer Kochsalzlösung; CMC: in Carboxyraethylcelluloselösung;' Gel.: in Gelatinelösung

Aus den Daten der Tabelle ist es ersichtlich, daß sämtliche 'in der 8-Stellung eineoC-Hydroxycarbonsäure und in der 1-Stellung Saralasin enthaltende Angiotensin-II-analoga erhebliche blutdrucksenkende Wirkungen zeigen.. Das Ausmaß dieser Wirkung ist auch bei subcutaner Verabreichung der Wirkstoffe bedeutsam; in Trägerstoffe enthaltenden Lösungen werden in zahlreichen Fällen Wirkungsdauern von mehreren Stunden erreicht.

Die erfindungsgemäß hergestellten neuen Peptide der allgemeinen Pormel I können gewünschtenfalls nach üblichen Methoden in therapeutisch anwendbare Säureadditionssalze bzw. Komplexe übergeführt v/erden. Unter therapeutisch anwendbaren Komplexen sind solche Verbindungen der Peptide zu verstehen, welche durch die Zugabe von gewissen organischen oder anorganischen Verbindungen zu den Peptiden entstehen und' eine protrahierte Wirkung den Wirkstoffen verleihen. Als Beispiele von zu diesem Zweck geeigneten organischen Verbindungen können Gelatine, Carboxymethylcellulose, Alginsäureester₅ Polyphloretinphosphate, Aminosäure-polymere und -Kopolymere u.a. erwähnt v/erden; als anorganische Verbindungen kommen Hydroxyde bzw. schwerlösliche Salze, z.B. Phosphate von gewissen Metallen, besonders von Zink in Betracht.

Die erfindungsgemäßen neuen Peptide, sowie deren Säureadditionssalze und Komplexe können in der Therapie in der Porm von üblichen Arzneimittelpräparaten verwendet werden. In solchen Arzneimittelpräparaten sind die erfindungsgemäßen neuen Verbindungen der allgemeinen Pormel I in Begleitung von zur enteralen bzw. parenteralen Verabreichung geeigneten anorganischen oder organischen Trägerstoffen enthalten. Diese Arzneimittelpräparate können in der Porm von festen Lyophilisaten, welche als Trägerstoffe pharmazeutisch anwendbare und mit den Peptiden nicht reagierende Peststoffe, z.B. Kohlehydrate enthalten, ferner von verdünnten oder konzentrierten, neben den Wirkstoffen gegebenenfalls auch kön-

227213 7

servierend oder stabilisierend v/irkende Hilfsstoffe enthaltenden Suspensionen oder Emulsionen hergestellt werden.

Die nach den üblichen pharmazeutischen Methoden herstellbaren Arzneimittelpräparate können zum differenzierenden Diagnostisieren von Hypertensionen verschiedenen Ursprungs, ferner in der Therapie zum Normalisieren von Hypertensionen renalen Ursprungs, in Hypertensionskrisen, in Fällen von sekundärer Herzinsuffiziens usw. eingesetzt werden.

Die Arzneimittelpräparate v/erden zweckmäßig in der Form von 1 bis 10 mg Wirkstoff enthaltenden Injektionen hergestellt. Die tägliche Dose der erfindungsgemäßen Wirkstoffe beträgt bei erwachsenen Patienten 1 bis 10 mg. Diese Menge wird vorzugsweise auf einmal intravenös, subcutan, intramuskulär oder in langsamer intravenöser Infusion verabreicht.

Die praktische Ausführung des erfindungsgemäßen Verfahrens wird durch die nachstehenden Beispiele näher veranschaulicht, wobei aber die Erfindung in keiner Weise auf/den Inhalt dieser Beispiele beschränkt ist.

Ausführungsbeispiele:

Die in den Beispielen verwendeten Abkürzungen von Aminosäuren, Schutzgruppen usw. entsprechen den in der Literatur allgemein üblichen Abkürzungen (vgl. J. Biol. Chem. 24,7, 977/1972). Ferner wurden noch die folgenden Abkürzungen verwendet: ·

Lac - L-MiIchsäure, HHIV= L-2-Hydroxy-3-methyl-valeriansäure, Pfρ = Pentalfluorphenyl.

Im Laufe der Herstellung der verschiedenen Verbindungen wurde das Eindampfen der Lösungen Jeweils in einem Büchi'sehen "Rotavapor" Apparat durchgeführt. Zur Bestimmung von Schmelz-

- 10 -

. - ίο - L

punkten wurde ein Apparat nach Dr. Tottoli (Büchi) verwendet. Die Dünnschichtchromatogramme wurden auf Silicagelplatten "Kieselgel G nach Stahl" (Merck) hergestellt. Zur Entwicklung der Chromatogramme wurden die folgenden Lösungsmittelgemische verwendet:

(1): n~Hexan: Äthylacetat = 4:1

(2): Äthylacetat:(Pyridin:Essigsäure:Wasser=20:6:11)=95:5

(3): Äthylacetat:(Pyridin:Essigsäure:Wasser=20:6:11)=90:10

(4) : Äthylacetat: (PyridinEssigsäure:Wasser=20:6:11 )=80:20

(5): Äthylacetat: (Pyridin.-Essigsäure:Wasser=20:6:11 )=7O:3O

(6): n-Butanol:Essigsäure:Wasser = 4:1:5 (obere Phase)

(7): l\F~Butanol:Essigsäure+Pyridin:Wasser = 30 Γ6:20': 24

(8): n-Butanol:Äthylacetat Essigsäure:Wasser = 1:1:1:1

Die Entwicklung der Flecke erfolgte mit Hinhydrin bzw. mit Chlortolidin/Kaliurrgodide .

Zur Reinigung der Endprodukte wurde die nachstehende allgemeine Methode verwendet:

0,5 g freies Peptid wurden in 4 ml 0,01 M Ammoniumacetatlösung gelöst, dann wurde diese Lösung auf eine 0,5 Liter Carboxymethylcellulose (CMC-52) enthaltende und vorher mit der obigen Ammoniumacetat-Pufferlösung in Gleichgewicht gebrachte Säule geschichtet«, Die Säule wurde dann, durch Gradienteluierung mit 1,5 Liter 0,01. M und 1,5 Liter 0,4 M Ammoniumacetatlösungen, die durch einen Gradientmischer zugeführt wurden, eluiert. Die Strömungsgeschwindigkeit war 25 ml pro Stunde ι es wurden Fraktionen von. je 10 ml aufgefangen. Das von der Säule herabfließende Eluat wurde mit Hilfe eines "LK6 Uvicord-II" Apparats (LKB-Produkter AB, Schweden) laufend registriert, dann wurde die auf Grund der erhaltenen Kurve ermittelte Hauptfraktion in einer Leybold-Heracus Lyophilisiereinrichtung lyophilisiert«. Nötigenfalls wurde das erhaltene Produkt ebenfalls unter Anwendung von Gradientelution re~ chromatographiert. '

~ 11 -

227213 7

Beispiel 1:

1 Q

(Sarkosin ,L-MiIchsäure )-Angiotensin-II

Schritt 1: Boc-Pro-Lac-OBzl

•2,15 g (10 mMol) Boc-Pro-OH v/erden in 10 ml wasserfreiem Tetrahydrofuran gelöst, die Lösung wird auf O⁰C abgekühlt und es werden unter Rühren bei dieser Temperatur portionsweise in 10,Minuten 2,4 g (15 mMol) Carbonyl-dimidazol zugegeben. Dann wird das Gemisch ebenfalls bei O⁰C tropfenweise in 15 Minuten mit der auf 0⁰C abgekühlten Lösung von 1,8 g (10 mMol) L-Milchsäure-benzylester in 10 ml wasserfreiem Tetrahydrofuran versetzt. Das Reaktionsgemisch wird dann· bei O⁰C 30 Minuten und anschließend bei 2O⁰C 2 Stunden lang gerührt und über Nach im Kühlschrank stehen gelassen. Am nächsten Tag wird das Lösungsmittel abdestilliert, der Rückstand in 30 ml Chloroform gelöst und die Lösung mit je 10 ml 1-n-Salzsäurelösung viermal, anschließend mit Wasser, dann mit Je 15 ml wäßriger ilatriumhydrogencarbonatlösung und zuletzt wieder mit Y/asser ausgeschüttelt. Die organische Phase wird mit wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und bis zu konstantem Gewicht eingedampft. Das als Rückstand erhaltene Öl wird im Exsikkator über Phosphorpentoxyd getrocknet. Es v/erden auf diese V/eise 3»0 g chromatographisch einheitliches Boc-Pro-Lac-OBzl (80 % d. Th.) erhalten; R_f^ = 0,32; R_f^ = 0,57.

Schritt 2:

Z-Sar-Arg(Ii0₂)-Val~Tyr(Bzl)-Ile-His(Dnp)-Pro-Lac-OBzl

2,85 g (7,5 mMol) Boc-Pro-Lac-OBzl werden in 15 ml 8-n Salzsäurelösung in Dioxan gelöst, die Lösung wird 15 Minuten stehen gelassen, dann mit 30 ml wasserfreiem Äther versetzt

- 12 -

und zur Trockne eingedampft. Das als Rückstand erhaltene freie Dipeptolid-hydrochlorid (Rf. = 0,37) wird in 20 ml Dimethylformamid gelöst, der pH-Wert der Lösung wird mit Triethylamin· auf 8 eingestellt und es werden 2,9 g (5 mMol) Boc-His(Dnp)-OPfp zugesetzt. Das Gemisch wird bei Raumtemperatur eine Stunde lang gerührt, wobei der pH-Wert des Gemisches ständig bei 8 gehalten wird. Das "Lösungsmittel wird dann abdestilliert, der Rückstand v/ird in Äthylacetat gelöst und die Lösung mit .10 foiger Citronensäurelösung, dann mit 1-n Salzsäurelösung, mit 5 %iger wäßriger !atriumhydrogencarbonatlösung und zuletzt mit Wasser ausgeschüttelt. Die organische Phase wird mit wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und das nach dem Abdestillieren des Lösungsmittels

(2)

als Rückstand erhaltene geschützte Tripeptid (Rf = 0,77) wird ohne Reinigung in 10 ml 8-n Salzsäurelösung in Dioxan gelöst und nach 20 Minuten wird das freie Tripeptid-hydrochlorid durch die Zugabe von wasserfreiem Äther gefüllt, abfiltriert und mit Äther gewaschen. Das auf diese Weise erhaltene freie Tripeptid-hydrochlorid (Rf - 0,10) wird in 20 ml Dimethylformamid gelöst, der pH-Wert der Lösung wird mit Triethylamin auf 8 eingestellt und es v/erden 2,78 g (7,5 mMol) Boc-Ile-OPfp zugesetzt. Das Reaktionsgemisch wird unter Aufrechterhaltung des pH-Wertes eine Stunde gerührt, dann wird das Lösungsmittel verdampft, der Rückstand in Äthylacetat gelöst und in der oben angegebenen Weise mit •10 %±ger Citronensäurelösung, mit 1~n Salzsäurelösung, mit 5 %iger liatriumhydrogencarbonatlösung und zuletzt mit Wasser ausgeschüttelt. Die organische Phase wird dann mit wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und eingedampft.'Der Rückstand wird mit η-Hexan verrieben und abfiltriert. Das auf

diese Weise erhaltene geschützte Tetrapeptid (Rf = 0,67) wird in 10 ml 8-n Salzsäurelösung in Dioxan gelöst, und nach 15 Minuten wird das freie Tetrapeptid-hydrochlorid (Rf - 0,52) durch die Zugabe von wasserfreiem Äther gefällt.. Dieses Produkt wird in 20 ml Dimethylformamid gelöst, der pH-Wert der Lösung wird mit Triethylamin auf 8

227213 7

eingestellt und es werden 3,24 g (6 mMol) Boc-Tyr(Bzl)-OPfp zugesetzt. Das Gemisch, wird unter Aufrechterhaltung des pH-Wertes 30 Minuten gerührt, dann wird das Lösungsmittel verdampft, der Rückstand in Äthylacetat gelöst und die Lösung mit 0,22 ml η,η-Dimethylamino-äthanol versetzt. Nach 15 Minuten wird die Lösung mit 10 %±g,er Citronensäurelösung, mit 1-n Salzsäurelösung, dann mit Wasser, mit 5 %iger Iatriumhydrogencarbonatlösung und zuletzt wieder mit Wasser ausgeschüttelt, mit wasserfreiem'natriumsulfat getrocknet und eingedampft. Der Rückstand wird mit einem 8:2 Gemisch von η-Hexan und Äther verrieben, und abfiltriert. Das auf

(3) diese Weise erhaltene geschützte Pentapeptid (R_f = 0,72) wird in 20 ml 8-n Salzsäurelösung in Dioxan gelöst und nach 15 Minuten wird durch die Zugabe von wasserfreiem Äther das freie Pentapeptid-hydrochlorid gefällt. Dieses wird in 20. ml Dimethylformamid gelöst, der pH-Wert der Lösung wird mit Triethylamin auf 8 eingestellt und die Lösung wird mit 2,6 g (6,8 mMol) Boc-Val-OPfp versetzt. Das Gemisch wird unter Aufrechterhaltung des pH-Wertes eine Stunde gerührt, dann wird das Lösungsmittel verdampft, der Rückstand in Äthylacetat gelöst und die Lösung auf die oben angegebene Weise ausgeschüttelt. Die organische Phase wird mit wasserfreiem natriumsulfat getrocknet, eingedampft, der Rückstand wird mit wasserfreiem Äther verrieben und abfiltriert. Das erhaltene geschützte Hexapeptid (R_f = 0,83) wird in 40 ml 8-n Salzsäurelösung in Dioxan gelöst und nach 15 Minuten wird durch die Zugabe von wasserfreiem Äther das freie Hexapeptid-hydrochlorid (R_f = 0,65) gefällt. Dieses Produkt wird in 20 ml Dimethylformamid gelöst, der pH-Wert der Lösung wird mit Triäthylamin auf 8 eingestellt und es werden 2,2 g (5 mMol) Boc-Arg(1O₂)-OPfρ zugesetzt. Das Gemisch wird unter Aufrechterhaltung des pH-Wertes 8 eine Stunde stehen gelassen, dann mit 60 ml Chloroform verdünnt und zuerst mit 10 %iger Zitronensäurelösung, dann Mt 1-n Salzsäurelösung und zuletzt mit Wasser ausgeschüttelt. Die abgetrennte organische Phase wird mit wasserfreiem Hatrium-

- 14 -

sixlfat getrocknet und eingedampft. Das als Rückstand erhaltene geschützte Heptapeptid wird mit einem 1:1 Gemisch von Äthanol und Äther verrieben und abfiltriert. Dieses ge-

(3)

schützte Heptapeptid (R., = 0,65) wird in 10 ml 8-n Salzsäurelösung in Dioxan gelöst und nach 15 Minuten wird das freie Heptapeptid-hydrochlorid (R_f = 0,40) durch die Zu-· gäbe von wasserfreiem Äther gefällt, abfiltriert, mit Äther gewaschen und getrocknet. Dieses Produkt wird dann in 15 ml Dimethylformamid gelöst, der pH-Wert der Lösung wird mit Triethylamin auf 8 eingestellt und es werden 1,8 g (5 mMol) Z-Sar-OPfp zugesetzt. Das Gemisch wird unter Aufrechterhaltung des pH-Wertes 30 Minuten gerührt, dann mit 45 ml Chloroform verdünnt und mit Wasser ausgeschüttelt. Die abgetrennte organische Phase wird mit wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und eingedampft, das als Rückstand erhaltene geschützte Oktapeptid mit wasserfreiem Äther verrieben und abfiltriertc Es werden auf diese Weise 2,12 g Z-Sar-Arg (JJO₂) -VaI -Tyr (BzI)- He -His (Dnp) -Pro -Lac -OBzI (29,6 % der auf His berechneten theoretischen Ausbeute; die durchschnittliche Ausbeute eines Reaktionsschrittes ist also 82 %) erhalten; IU^ = 0,465; P. 204-2-13⁰C.

Schritt 3:

Das Entfernen der Schutzgruppen

1,45 g (1 nilaol) Z-Sar-Arg(NO₂)-VaI-Tyr(BzI)-Ile-His(Dnp)-Pro-Lac-OBzl werden in 5 ml Dimethylformamid gelöst und mit 2,3 ml (30 mMol) 2-Mercaptoäthanol versetzt. Das Gemisch wird eine Stunde gerührt, dann mit wasserfreiem Äther versetzt und das auf diese Weise gefällte geschützte, aber keine Dnp-Gruppe mehr enthaltende Oktapeptid wird in Methanol gelöst und durch die Zugabe von Äther wieder gefällt. Ausbeute: 1,14 g (89 % d. Th.); R S^ = 0,60.

227213 7

Das obige Produkt wird in 40 ml eines 5:1:2 Gemisches von Methanol, Essigsäure und Wasser gelöst, mit 0,6 g 10 %iger Palladium-Aktivkohle versetz-t und unter lebhaftem Rühren wird 20 Stunden lang Wasserstoffgas durch das Gemisch geleitet. Der Katalysator wird dann durch Filtrieren entfernt, mit dem selben Lösungsmittelgemisch nachgewaschen und das Piltrat wird zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wird in wasserfreiem Äthanol verrieben und abfiltriert. Es

1 8

werden auf diese V/eise 0,7 g (Sar ,Lac )-Angiotensin-II

(84 % d. Th) erhalten. . ' Schritt 4:

Das auf obige Weise erhaltene rohe Peptid wird nach der oben beschriebenen allgemeinen Methode gereinigt. R ,,-Werte des erhaltenen gereinigten Oktapeptids: R^ ' =0,17; R_f = 0,40; R_f = 0,21. Aminosäure-Analyse: Pro 1,0 (1), YaI 1,0 (1), lie 1,08 (1), Tyr /,85 (D, His 0,85 (1), Arg 0,95 (1), Sar 1,0 (1).

Beispiel 2;

1 R

(Sarcosin ,L-Milchsäureäthylester )-Angiotensin-II

Schritt 1: . '

Boc-Pro-Lac-OEt

4,8 g (20 mMol) Boc-Pro-OH werden in 20 ml wasserfreiem Tetrahydrofuran gelöst, die Lösung auf O⁰C abgekühlt und in 10 Minuten, in kleinen Portionen mit 4,8 g (30 mMol) Carbonyl-diimidazol versetzt. Dann wird bei derselben Temperatur die ebenfalls abgekühlte Lösung von 2,1 g (20 mMol)' Liilchsäure-äthylester in Tetrahydrofuran tropfenweise zugesetzt. Das Reaktionsgemisch wird bei O⁰C 30 Minuten und anschließend bei 20⁰G 2 Stunden gerührt und über

Nacht stehen gelassen. Am nächsten Tag wird das Tetrahydrofuran abdestilliert, der Rückstand wird in 40 ml Äthylacetat gelöst und die Lösung wird mit je 15 ml 1-n Salzsäurelösung zweimal, mit Wasser einmal, mit je 20 ml 5 %iger Natriumhydrogencarbonatlösung zweimal und mit Wasser einmal in der angegebenen Reihenfolge ausgeschüttelt. Die abgetrennte organische Phase wird mit wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und eingedampft. Das als Rückstand erhaltene Öl wird im Exisikkator bis zu konstantem Gewicht getrocknet« Es v/erden auf diese Weise 2,22 g Boc-Pro-Lac-OEt (36 % d. Th.) erhalten; R^^ ~ 0,77; R.p = 0,36.

Schritt 2:

Z-Sar~Ärg(liO₂)~?al-Tyr (BzI) -Ile~His(Dnp)~Pro-Lac~OEt '

1,8 g (6 mMol) Boc-Pro-Lac-OEt werden in 3 ml 7,5-n Salzsäur el ö sung in Dioxan gelöst, die Lösung wird bei Raumtemperatur 15 Minuten stehen gelassen, dann werden 30 ml Äther zugegeben und das Gemisch wird zur Trockne eingedampft.. Das als Rückstand erhaltene freie Peptolid-hydrochlorid (R^, = 0,31) wird in 15 ml Dirnethylformamid gelöst, der pH-Wert der Lösung wird mit Triäthylamin auf 8 eingestellt und es werden 2,9 g (5 mMol) Boc-His(Dnp)-OPfp zu der Lösung gegeben. Das Gemisch wird eine Stunde bei Raumtemperatur stehen gelassen, dann wird das Lösungsmittel verdampft und der Rückstand wird in Äthylacetat gelöst, die Lösung wird mit 10 /Siger Zitronensäurelösung, mit 1-n Salzsäurelösung, mit 5 %iger ITatriumhydrogencarbonatlösung und mit Wasser in der angegebenen Reihenfolge ausgeschüttelt, die abgetrennte organische Phase wird mit wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und eingedampft. Das als Rückstand erhaltene geschützte IDripeptid (R_f^' = 0,69) wird sofort in 20 ml 7,5-m Salzsäurelösung in Dioxan gelöst, lach 20 Minuten wird wasserfreier Äther zugesetzt, das auf diese Weise gefällte freie Dipeptid-hydrochlorid (R_p ⁴^ - 0,9) wird in 15 ml Dimethyl-

227213 7

formamid gelöst, der pH-Wert der Lösung wird mit Triäthylamin auf 8 eingestellt und es werden 3,0 g (7,5 mMol) Boc- -Ile-OPfp zugegeben. Die Lösung wird unter Aufrechterhaltung des pH-Wertes 30 Minuten stehen gelassen, dann wird das Lösungsmittel verdampft, der Rückstand in Äthylacetat gelöst und die Lösung auf die oben angegebene Weise ausgeschüttelt. Die abgetrennte organische Phase wird mit wasserfreiem natriumsulfat getrocknet, eingedampft, der Rückstand wird mit einem 2:8 Gemisch von Äther und η-Hexan verrieben und abfiltriert. Das auf diese Weise erhaltene geschützte Tetrapeptid (R-^-^ = 0,36) wird in 10 ml 8-n Salzsäurelösung in Dioxan gelöst und nach 15 Minuten mit wasserfreiem Äther versetzt. Das gefällte freie Tetrapeptid-hydrochlorid (R- = 0,27 wird sofort in 20 ml Dimethylformamid gelöst, der pH-Wert der Lösung wird mit Triäthylamin auf 8 eingestellt und es werden 3,24 g (6 mMol) Boc-Tyr(Bzl)-OPfp zugesetzt. Das Gemisch wird unter Aufrechterhaltung des pH-Wertes 30 Minuten stehen gelassen, dann wird das Lösungsmittel verdampft und der Rückstand in Äthylacetat gelöst. Die Lösung wird mit 0,22 ml IIjU-Dimethylamino-äthylamin versetzt; nach 10 Minuten wird die Lösung auf die übliche Weise ausgeschüttelt, getrocknet und eingedampft. Der Rückstand wird mit n-Hexan verrieben und abfiltriert. Das auf diese Weise erhaltene

(2)

geschützte Pentapeptid (R- ^J = 0,64) wird in 10 ml 8-n Salzsäurelösung in Dioxan gelöst und nach 15 Minuten wird das Produkt durch die Zugabe von wasserfreiem Äther ge-_ fällt. Das erhaltene freie Pentapeptid-hydrochlorid (R 0,33) wird in 15 ml Dimethylformamid gelöst, der pH-Wert der Lösung wird mit Triäthylamin auf 8 eingestellt und es .werden 2> 1 S (5,5 mMol) Boc-Val-OPfp zugesetzt. Das Gemisch wird unter Aufrechterhaltung des pH-Wertes 30 Minuten stehen gelassen, dann v/ird es eingedampft, der Rückstand wird in Äthylacetat gelöst und die Lösung wird auf die übliche V/eise ausgeschüttelt, getrocknet und eingedampft. Der Rückstand wird mit n-Hexan verrieben und abfiltriert. Das auf diese Weise erhaltene geschützte Hexapeptid (R- = 0,76) wird

-18,

sofort in 10 ml 8-n Salzsäurelösung in Dimethylformamid gelöst und nach 15 Minuten wird das Produkt durch die Zugabe von wasserfreiem Äther gefällt. Das erhaltene freie Hexapeptid-hydrochlorid (R^ =0,34 wird in 20 ml Dimethylformamid gelöst, der pH-Wert der Lösung wird mit Triäthylamin auf 8 eingestellt, dann werden 3,96 g (6 mllol) Boc- -Arg(lI0p)-0Pf ρ zugesetzt. Das Gemisch wird unter Aufrechterhaltung des pH-Wertes eine Stunde stehen gelassen, dann mit 6ö ml Chloroform verdünnt, auf die übliche Weise ausgeschüttelt, getrocknet und eingedampft. Der Rückstand wird mit wasserfreiem Äthanol verrieben und abfiltriert. Das auf diese Weise erhaltene geschützte Heptapeptid (R~ =0,78) wird in 10 ml 8-n Salzsäurelösung in Dioxan gelöst und nach 15 Minuten wird das Produkt durch die Zugabe von wasserfreiem Äther gefällt. Das erhaltene freie Heptapeptid-hydrochlorid (R^ = 0,56) wird in 20 ml Dimethylformamid gelöst, der pH-Wert der Lösung wird mit Triethylamin auf 8 eingestellt und es werden 2,12 g (5,5 mlviol) Z-Sar-OPfp zugesetzt. Das Gemisch wird unter Aufrechterhaltung des pH-Wertes 30 Minuten stehen gelassen, dann mit 60 ml Chloroform ' verdünnt, auf die übliche Weise ausgeschüttelt, getrocknet und eingedampft, mit Äther verrieben, abfiltriert und aus Äthanol umkristallisiert. Es werden auf diese Weise 1,21 g Z-Sar-Arg(1O₂)~Val-Tyr(BzI)-Ile-His(Dnp)~Pro-Lac-OEt (17,5 % der auf His berechneten theoretischen Ausbeute, was einer auf die einzelnen Reaktionsschritte berechneten 75 zeigen durchschnittlichen Ausbeute entspricht) erhalten; P. 208 - 212⁰C; rJ^ = 0,5.

Schritt 3;

Das Entfernen der Schutzgruppen

1,21 g (0,88 miViol) Z-Sar-Arg(NO₂)-Val-Tyr(BzI)-IIe-HIs(Dnp)-Pro-Lac-OSt werden in 5 ml Dimethylformamid gelöst und mit 3 ml 2-Hercaptoäthanol versetzt» Das Gemisch, wird bei Raum-

. - 19 -

227213 7

temperatur eine Stunde lang gerührt, dann wird das Produkt durch die Zugabe von wasserfreiem Äther gefällt, abfiltriert, gewaschen, in Methanol gelöst und durch die Zugabe von wasserfreiem Äther wieder gefällt. Es werden auf diese Weise 0,94 g geschütztes, aber keine Dinitrophenyl-Schutzgruppe mehr enthaltendes Gktapeptid (89 % d. Th.) erhalt en;· R_f^)_e o,59. Dieses Oktapeptid wird in 20 ml 5:1:1 Gemisch von Methanol, Essigsäure und Wasser gelöst, die Lösung· wird mit 0,5 10 tigern Palladium-Aktivkohle-Katalysator versetzt und Wasserstoffgas wird 20 Stunden lang durch die Lösung geleitet, wobei das Reaktionsgemisch ständig lebhaft gerührt wird. Das Portschreiten der Reaktion wird durch Dünnschichtchromatographie überwacht. Hach der Beendigung der Reaktion wird das Reaktionsgemisch abfiltriert, der auf dem Filter gebliebene Katalysator mit demselben Lösungsmittelgemisch nachgewaschen und das mit der Waschflüssigkeit vereinigte Piltrat wird zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wird mit dem Gemisch von Äthanol und Äther verrieben und abfiltriert. Es werden 0,72 (96 % d. Th.) erhalten.

1 Pi triert. Es werden 0,72 g (Sar ,Lac-OEt )-Angiotensin-II

Schritt 4:

Das auf die obige Weise erhaltene rohe freie Peptid wird .nach der oben beschriebenen allgemeinen Methode gereinigt.

Das reine Peptid zeigt die folgenden charakteristischen Eigenschaften; R_f* ' = 0,24; ^Rf = 0,53; R_f = 0,36; Aminosäure-Analyse: Pro 1,02 (1), VaI 0,97 Ü), He 1,08 .(1), Tyr 0,91 (1), His 1,00 .(1), Arg 1,07 (1), Sar 1,0 (1)

- 20 Beispiel 3.».

7 / 1 1

(Sarcosin ,L-2-Hydroxy-3-methyl~valeriansäure )-Angiotensin-II

Schritt 1: H-HtIV-OBzI

7,12. g (40 mMol) H-HMY-OUa werden in 10 ml Äthylacetat suspendiert und mit 20 nil 4-n Salzsäurelösung in Äthylacetat versetzt. Das Gemisch wird 2 Stunden bei Raumtemperatur gerührt, dann wird der pH-Wert des Gemisches mit Triäthylamin auf 3 eingestellt, der gefällte Niederschlag wird abfiltriert und mit je 20 ml Äthylacetat zweimal gewaschen. Der pH-Wert des mit den Waschflüssigkeiten vereinigten Filtrats wird mit Triethylamin auf β eingestellt und dann v/erden 8 ml (60 mMol) Benzylbromid und 8,4 ml (6OmMoI) Tr iäthylamin zugesetzt* Das' Gemisch wird 8 Stunden unter Rückfluß gekocht, das gefällte anorganische Salz wird abfiltriert und das Pil trat mit Wasser,, mit 1~n Salzsäurelösung, mit 5 /Siger wäßriger Natriumhydrogencarbonatlösung und wieder mit Wasser in der angegebenen Reihenfolge ausgeschüttelt, mit wasserfreiem natriumsulfat getrocknet und eingedampft. Es werden auf diese Weise 5₅6 g H-HLIV-OBzI (63 % d. Th.) erhalten; dieses rohe Produkt wird durch Vakuumdestillation gereinigt. Das reine Produkt siedet unter .5 mm Hg Druck bei 134 - 136°C; CJ ψ - -13*9° (c = 1, in Aceton). .

Schritt 2: .

Boc-Pro-HMV-OBzI '

2,7 g (12,5 mMol) Boc-Pro-OH werden in 15 ml wasserfreiem Tetrahydrofuran gelöst,, die Lösung wird auf 0⁰G abgekühlt und es v/erden in kleinen Portionen, innerhalb von 10 Minuten 3)2 g (20 .mMol) Carbonyl-diimidazol zugesetzte Das Ge-

- 21 -

227213 7

misch wird bei derselben Temperatur mit der ebenfalls abgekühlten Lösung von 2,8 g (12,5 mMol) H-HMV-OBzI in 10 ml Tetrahydrofuran versetzt und dann 30 Minuten bei 0⁰C und anschließend 2 Stunden bei 2O⁰C gerührt und über ITacht in einem Kühlschrank stehen gelassen. Am nächsten Tag wird das Tetrahydrofuran abdestilliert, der Rückstand wird in 40 ml Äthylacetat gelöst, die Lösung wird mit je 15 ml 1-n Salzsäur elösung zweimal, mit Wasser einmal, dann mit einer 5 /Sigen ITatriumhydrogencarbonatlösung und zuletzt weder mit Wasser ausgeschüttelt, mit wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und eingedampft. Das als Rückstand verbliebene Öl wird bei 25⁰C bis zu konstantem Gewicht getrocknet. Es werden auf diese Weise 3,19 g Boc-Pro-HMV-OBzI (65 % d. Th.)

erhalten; R_f^ = 0,90; R^ ^u = 0,33.

Schritt 3: · Z-Sar-Arg(Ii0₂)-Val-Tyr(Bzl)-Ile-His(Dnp)-Pro-HIÄV-0Bzl

2,52 g (6 mMol) Boc-Pro-HMV-OBzl werden in 8 ml 8-n Salzsäur elö sung in Dioxan gelöst, die Lösung wird 15 Minuten bei Raumtemperatur stehen gelassen, dann mit 30 ml wasserfreiem Äther versetzt und zur Trockne eingedampft. Das als Rückstand erhaltene freie Dipeptolid-hydrochlorid (R^ ^ = 0,30) wird in 15 ml Dimethylformamid gelöst, -der pH-Wert der Lösung wird mit Triäthylamin auf 8 eingestellt und es v/erden 2,9 g (5 mMol) Boc~His(Dnp)-OPfp zugesetzt. Das Gemisch wird bei konstant gehaltenem pH-Wert eine Stunde stehen gelassen, dann eingedampft und der verbliebene Rückstand wird in Äthylacetat gelöst. Die Lösung wird mit 1-n Salzsäürelösung, mit Wasser und mit 5 %±ger wäßriger Uatriumhydrogencarbonatlösung in der angegebenen Reihenfolge ausgeschüttelt, mit wasserfreiem Uatriumsulfat getrocknet und eingedampft. Das als Rückstand erhaltene geschützte Tripeptid (R^ ^ = 0,67) wird in 10 ml 8-n Salzsäürelösung in Dioxan gelöst und nach 20 Minuten wird durch die Zugabe

- 22 -

von wasserfreiem Äther das freie Tripeptid-hydrochlorid (R_f ⁽⁴⁾ = 0,18) gefüllt.

Das auf die obige Weise erhaltene Tripeptidhydrochlorid Y/ird in 15 ml Dimethylformamid gelöst, der pH-Wert der Lösung wird mit Triäthylamin auf 8 eingestellt und es werden 2,4 g (6 mMol) Boc-Ile-OPfp zugesetzt. Das Gemisch wird bei konstant gehaltenem pH-Wert eine Stunde stehen gelassen und dann eingedampfte Der Rückstand wird in Chloroform gelöst und die Lösung wird auf die übliche Weise mit Wasser, mit 1-n Salzsäurelösung und mit 5 /Siger wäßriger Hatriumhydrogencarbonatlösung ausgeschüttelt, mit wasserfreiem Hatrium-.sulfat getrocknet und eingedampft« Der Rückstand wird mit η-Hexan und nach dem Dekantieren des Hexans mit wasserfreiem

Äther verrieben und abfiltriert« Das auf diese Weise erhaltene) ne geschützte Tetrapeptid (IL, =0,65) wird in 10 ml 8-n Salzsäurelösung in Dioxan gelöst und nach 15 Minuten Stehen wird durch die Zuga.be von wasserfreiem Äther das freie Tetrapept id -hydro chi or id (R^ ' = 0,27) gefällt. Dieses Produkt wird in 15 ml Dimethylformamid gelöst, der pH-Wert der Lösung wird mit Triäihylamin auf 8 eingestellt und es v/erden 2,96 g Boc-~C0yr(Bzl)~OPfp zugesetzt. Das Gemisch wird bei konstan gehaltenem pH-Wert 30 Minuten stehen gelassen und dann eingedampft. Der Rückstand wird in Äthylacetat gelöst, mit 0,22 ml !,M-Dimethylamino-äthylamin versetzt und die erhaltene Lösung v/ird 10 Minuten stehen gelassen. Dann v/ird die Lösung mit 10 /öiger wäßriger Zitronensäurelösung, mit 1-n Salzsäurelösung, mit 5 -%±ßex wäßriger latriumliydrogencarbonatlösung und zuletzt mit. Wasser ausgeschüttelt, mit wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und eingedampft. Der Rückstand wird mit η-Hexan verrieben und abfiltriert. Das auf diese Weise erhaltene geschützte Pentapeptid (Rr,^KJJ ~ 0,75) wird in 10 ml 8-n Salzsäurelösung in Dioxan gelöst und nach 15 Minuten v/ird durch die Zugabe von wasserfreiem Äther das freie Pentapeptid-hydrochlorid (R_f^ = 0,60) gefällt. Das Pentapeptid-hydrochlorid wird in 20 ml Dimethylformamid sofort

227213 7

gelöst, der pH-Wert der Lösung wird mit Triäthylamin auf eingestellt und es v/erden 2,6 g (6 mMol) Boc-VaI-OPfρ züge-, setzt. Die erhaltene Lösung wird bei konstant gehaltenem pH-Wert eine Stunde stehen gelassen, dann eingedampft. Der Rückstand wird in Chloroform gelöst, die Lösung wird mit 10 %lgex Zitronensäure, mit Λ-n Salzsäure, mit 5 /Siger wäßriger Natriumhydrogencarbonatlösung und zuletzt mit Wasser ausgeschüttelt, mit wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und eingedampft. Der Rückstand wird mit η-Hexan verrieben und abfiltriert. Das auf diese Weise geschützte Hexapeptid

( 3) (Ε« = 0,71) wird in 10 ml 8-n Salzsäurelösung in Dioxan gelöst, die Lösung wird bei Raumtemperatur 15 Minuten stehen gelassen und dann wird durch die Zugabe von wasserfreiem Äther das freie Hexapeptidhydrochlorid (R^ = 0,34) gefällt, Dieses Produkt wird in 20 ml Dimethylformamid sofort gelöst, der pH-Wert der Lösung mit Triäthylamin auf 8 eingestellt und es werden 2,64 g (6mMol) Boc-Arg(UOp)-OPfρ zugesetzt. Die Lösung wird unter Aufrechterhaltung des pH-Wertes 8 eine Stunde stehen gelassen, dann wird sie eingedampft, der Rückstand wird in Chloroform gelöst und diese Lösung wird einer 10 % Dimethylformamid enthaltenden 10 /oigen wäßrigen Zitronensäurelösung, mit 1-n Salzsäurelösung, mit 5 %iger wäßriger Natriumhydrogencarbonatlösung und mit Wasser in der angegebenen Reihenfolge ausgeschüttelt, mit wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und eingedampft. Der Rückstand wird mit einem 8:2 Gemisch von Äther und Äthanol verrieben und abfiltriert. Das auf diese Weise erhaltene geschützte Heptapeptid (R_f ^KJJ = 0,63) wird in 10 ml 8-n Salzsäurelösung in Dioxan gelöst, 15 Hinuten stehen gelassen und dann wird durch die Zugabe von wasserfreiem Äther das freie Heptatpeptid-hydrochlorid gefällt, abfiltriert, gewaschen und getrocknet. Das auf diese Weise erhaltene freie Heptatpeptid- -hydrochlorid R^ ⁵^ = 0,45) wird in 20 ml Dimethylformamid gelöst, der pH-Wert der Lösung wird mit Triäthylamin auf eingestellt und es werden 2,3 g (6 mT.iol) Z-Sar-OPfp züge-* setzt. Die Lösung wird bei konstant gehaltenem pH-Wert 30

- 24 -

Minuten stehen gelassen, dann wird sie mit 60 ml Chloroform verdünnt, mit 1~n Salzsäurelösung und anschließend mit Y/asser ausgeschüttelt, mit wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und eingedampft. Der Rückstand wird mit- einem 8:2 Gemisch von Mher und Äthanol verrieben, abfiltriert und gewaschen* Bs werden auf diese Weise 2,36 g Z--Sar~Arg (HOp) ~ VaI-Tyr ( BzI )~ne »Hi s(Dnp)-Pro-HMV-OBzI (30 % der auf His berechneten theoretischen Ausbeute, was einer durchschnittlichen schrittweisen Ausbeute von 82 % entspricht) erhalten; ϊ¹.: 193-202⁰C; R^ = 0,30; R._P ⁽⁴⁾ = 0,86.

Schritt 4:

Das Entfernen der Schutzgruppen

2,0 g (1,25 mMol) 2-Sar~Arg(iro₂)~Val-Tyr(Bzl)~Ile~His(Dnp)--Pro-HLIV-OBzl werden in 5 ml Dimethylformamid gelöst ,'die Lösung wird mit 2,8 ml 2~Hercapto-äthanol versetzt, eine Stunde -gerührt und dann wird das Produkt durch die Zugabe von wasserfreiem-Äther gefällt, mit Äther gewaschen, in Methanol gelöst und durch die Zugabe von wasserfreiem Äther noch einmal gefällt. Es werden auf diese Weise 1,44 g von der Dinitrophenylgruppe befreites geschütztes Oktapep-

(4) „ 0,41.

tid (80 % der theoretischen Ausbeute) erhalten; R.„

Das auf obige Weise erhaltene Produkt wird in einem 5:2:1 Gemisch von !,!ethanol, Essigsäure und Wasser gelöst, mit 0,7 g 10 /Sigem Palladium-Aktivkohle-Katalysator versetzt und Wasserstoffgas wird 20 Stunden lang durch das lebhaft, gerührte Gemisch geleitet. ITach der Beendigung der Reaktion wird der Katalysator abfiltriert, mit 20 ml des gleichen Lösungsrnittelgemisches gewaschen; das mit der Waschflüssigkeit vereinigte Piltrat wird zur Trockne eingedampft. Der .Rückstand wird mit einem Gemisch von gleichen

2 21113 7

Volumenteilen von Äthanol und Äther verrieben und abfiltriert. Es werden auf diese Weise 0,65 g (Sarcosin , L-Hydroxy-3-methyl-valeriansäure )-Angiotensin-II (67 % d. Th.) erhalten.

Schritt 5:

Das auf die obige Weise erhaltene Produkt wird nach der oben beschriebenen allgemeinen Methode gereinigt. Das reine L~Sarcosin , 2-Hydroxy-3-methyl-valeriansäure°)-Angiotensin-II zeigt die folgenden charakteristischen Eigenschaften: R_£ ^K ' = 0,26; R_f = 0,52; R_f = 0",30; Aminosäure-Analyse: Pro 1,06 (1), VaI 1,03 (1)", He 1,03 (D", Tyr 0,65 (1), His 0,99 (D, Arg (O,95)(D, Sar 1,0 (1).

Claims (1)

1. - 26 Erf indungsanspruch:

   • X - Arf - VaI - Tyr'- He - His - Pro - Y - OA (I)

   X eine Acylgruppe von II-Methyl-aminosäuren, "besonders die Sarcosylgruppe, oder von in deroc-Stellung eine Aoiinooxygruppe oder eine Hydroxylgruppe enthaltenden

   aliphatischen Garbonsäuren,
   Y der Rest einer aliphatischencL-Hydroxycarbonsäure, besonders von Milchsäure oder L~2-Hydroxy-3-methyl-

   valeriansäure
   A ein Y/asserstoffatom oder eine Alkylgruppe mit 1 bis

   Kohlenstoffatomen

   bedeuten, sowie von Säureadditionssalzen und therapeutisch anwendbaren Komplexen dieser Peptide, gekennzeichnet dadurch, daß man

   a) · zur Herstellung von an' der Stelle von A ein Wasserstoffatom enthaltenden Verbindungen der allgemeinen Formel I die Schutzgruppen eines geschützten Oktapeptids der allgemeinen Pormel II

   B-X-Arg(C)-VaI-Tyr(D)-1Ie-HiS(E)-PrO-Y-OP (II)

   worin
   B .eine durch Acidolyse oder katalytisch^ Hydrogenolyse entfernbare Schutzgruppe, besonders die Benzyloxycar-

   bonyl- oder tert.-Butyloxycarbonylgruppe, C eine zum temporären Schutz der Guanidingruppe von Arg geeignete Schutzgruppe, besonders die ITitro- oder

   Tösylgruppe,

   227213 7

   D eine zum temporären Schutz der aromatischen Hydroxylgruppe von Tyr geeignete Schutzgruppe, besonders die Benzylgruppe oder eine substituierte Benzylgruppe,

   E eine zum temporären Schutz der Imidazolgruppe von His geeignete Schutzgruppe, besonders die Dinitrophenylgruppe, . .

   F eine zum Schutz der Carboxylgruppe der G-terminalen Aminosäure geeignete, gegen die Einwirkung von milden Säuren widerstandsfähige, aber durch katalytisch^ Hydrogenolyse oder durch die Einwirkung von stärkeren Säuren entfernbare Schutzgruppe
   bedeuten und X und Y die obigen Bedeutungen haben, oder

   b) zur Herstellung von an der Stelle von A eine Alkylgruppe mit ΐ bis 5 Kohlenstoffatomen enthaltenden Verbindungen der allgemeinen Formel I die Schutzgruppen eines geschützten Oktapeptidesters der allgemeinen Formel III

   B-X-Arg(C)-Val-Tyr(D)-lie-His (E)-Pro-Y-OA' (III)

   worin X, Y₅ B, C, D und E die oben angegebenen Bedeutungen haben und A' eine Alkylgruppe mit 1 bis 5 Kohlenstoffatomen bedeutet,

   selektiv schrittweise oder in einem Schritt entfernt und gewünschtenfalls die erhaltene Verbindung der'allgemeinen Formel I in ein Säureadditionssalz oder in einen therapeutisch anwendbaren Komplex überführt.