DE2341798C2 - Das Octapeptid Xenopsin und Verfahren zu seiner Gewinnung - Google Patents

Description

Reinigungsschritt

Lösungsmittel

Gegenstand der Erfindung ist das Octapeptid Xenopsin der Formel

pyrGlu - GIy - Lys - Arg - Pro - Trp - He - Leu

und ein Verfahren zu seiner Gewinnung.

Aus Fröschen wurden bereits in früheren Zeiten wertvolle chinesische Arzneimittel, z. B. ein Krötengift »toad-cakc« hergestellt Aus Froschhäuten wurden bereits Steroidverbindungen, Histaminverbindungen, Adrenalinverbindungen und Serotoninverbindungen isoliert

Kürzlich wurde gefunden, daß in Froschhäuten neben diesen Verbindungen noch Peptide mit verschiedenen biologischen und pharmakologischen Aktivitäten enthalten sind. Von derartigen Peptiden sind nicht nur die Gruppe der Bradykinine und der Derivate davon, sondern auch Coerulein mit einer stark kontrahierenden Wirkung auf die Gallenblase (»Arch. Biochem. Biophys.«, 125, 57 [1981]), Phyllomedisin mit einer hypotensiven Wirkung (»Experientia«, 26, 866 [1970]), Ranatensin mit sowohl einer kontrahierenden Wirkung auf die glatte Muskulatur als auch einer hypertensiven Wirkung (»Fedr. Proc«, 29,282 [1970]) und Alytesin und Bombesin mit einer kontrahierenden Wirkung auf die glatte Muskulatur und einer hypertensiven Wirkung (»Experientia«, 27.166[197I]) bekannt

Es wurde nun gefunden, daß aus der Haut des afrikanischen Frosches Xenopus laevis pipidae ein ntups Peptid gewonnen werden kann, das eine kontrahierende Wirkung auf einen Rattenmagenstreifen und eine hypotensive Wirkung aufweist

Das den Gegenstand der Erfindung bildende neue Octapeptid Xenopsin wird erhalten durch Extrahieren der Haut des afrikanischen Frosches Xenopus laevis pipidae mit einem Ci- bis Ct-Alkanol. Entfernen des Lösungsmittsls aus dem Extrakt und Reinigen des Rückstands durch Chromatographie an saurem IoneniüstäUscherharz, Chromatographie art basischem Ionen-■ustauscherharz, Gelfiltration und Tröpfchen-Gegenjtromverteilungschromatographie, wobei die Reihenfolge der Chromatographieverfahren beliebig ist und eins oder ntelirere Chromatographieverfahren wiederholtwerden können.

Chromatographie an saurem

Ionenaustauscherharz Ameisensäure

Gelfiltration Ameisensäure
Chromatographie an basischem

ίο Ionenaustauscherharz wässriger Ammoniak

Tröpfchengegeinstrom- Mischung aus Butanol,

Verteilungschromatographie Essigsäure und Wasser

Bei der praktischen Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens wird die Haut des afrikanischen Frosches fein zerschnitten und dann mit einem Ci- bis CU-Alkanol extrahiert Bevorzugte Alkanole sind Methanol, Äthanol, IsopropanoL Vorzugsweise wird dem Alkanol eine sehr geringe Menge innerhalb des Bereiches von 0,01 bis 1 Gew.% bezogen auf das Gewicht des niederen Alkohols, einer wäßrigen Trichloressigsäurclösung zugegeben. Die Trichiorcssig säure inhibiert die Wirkungen von Enzymen und verhindert die Zersetzung des erfindungsgemäßen Peptidproduktes. Das Lösungsmittel wird dann aus dem Extrakt entfernt und der Rückstand wird in beliebiger Reihenfolge den folgenden Behandlungen unterzogen: (1) einer stark sauren Ionenaustauscherharzchromatographie, (2) einer stark basischen Ionenaustauscherharzchromatographie, (3) einer Gelfiltration und (4) einer Tröpfchengegenstromverteilungschromatographie. Auf diese Weise erhält man eine Fraktion mit einer kontrahierenden Wirkung auf einen Rattenmagenstreifen und einer hypotensiven Wirkung auf Ratten. Eine oder mehrere der vorstehend angegebenen Behandlungen (1) bis (4) können, je nach Erfordernis, mehrere Male wiederholt werden. Die Reihenfolge dieser vier Behandlungen ist nicht kritisch. Sie können in verschiedener Reihenfolge durchgeführt werden, wobei stets zufriedenstellende Ergebnisse erhalten werden.

Als stark saures Ionenaustauscherharz können verschiedene Handelsprodukte verwendet werden. Auch als stark basisches Ionenaustauscherharz und Gelfilter können verschiedene im Handel erhältliche Produkte verwendet werden.

Ein Beispiel für eine geeignete Tropfchengegenstromverteilungschromatographie wird im folgenden Arheitsbeispiel gegeben. Die dabei erhaltene Fraktion mit einer kontrahierenden Wirkung auf einen Rattenmagenstreifen wird in dem erforderlichen Maße getrocknet. Auf diese Weise erhält man das erfindungsgemäße Peptid.

Durch Airinosäureanalyse des dabei erhaltenen Peptids wurde bestätigt daß dieses jeweils I Moläquivalent von Prolin. Glycin. Glutaminsäure. Lysin. Arginin, Isoleucin und Leucin enthält Tryptophan wurde auch durch die optische Dichte bei 280 πιμ bestimmt Somit besteht das erfindungsgemäße Peptidprodukt aus 8 Aminosäuren. Die Struktur des erfindungsg;emäßen Peptidprodukts aus 8 Aminosäuren. Die Struktur des erfindungsgemäßen Peptids wurde wie folge analysiert:

(1) Chymotrypsin-Spallur.ig

Wenn das dimethyläminonaphthiiliri-sülföriyliefte (dansylierte) Peptid (D-P) einem Chymolrypsin-Abbau

unterworfen wird, entsteht ein dansylabgebautes Peptid (Ci). Wie die Aminosäureanalyse zeigt, ist das C-I aus

Lysin (1)^ Arginin (1), Glutaminsäure (1), Prolin (IX

Glycin (1) und Tryptophan (1) aufgebaut Daraus geht im Hinblick auf die Substratspezifität von Chymotrypsin hervor, daß die C-endständige Aminosäure von C-I aus Tryptophan besteht

(2) Trypsin-Spaltung

Wenn D-P der Einwirkung von Trypsin ausgesetzt wird, entsteht ein dansyl-abgebautes Peptid (T-I). Wie die Aminosäureanalyse zeigt, ist T-I aus Lysin (1), Arginin (1), Glycin (1) und Glutaminsäure (1) aufgebaut Im Hinblick auf die Substratspezifität von Trypsin ergibt sich somit, daß die C-endständige Aminosäure von T-I aus Arginin besteht

(3) Papain-Spaltung

Wenn D-P der Einwirkung von Papain ausgesetzt wird, entsteht ein dansyl-abgebautes Peptid (P-I). Wie die Aminosäureanalyse zeigt, ist P-I aus Lysin (1), Glutaminsäure (1) und Glycin (1) aufgebaut

(4) Abba;· von C-I durch Carboxypeptidase

C-! wird durch Carboxypeptidase A zersetzt und die dabei erhaltene Reaktionsflüssigkeit wird unter Verwendung eines Aminosäureanafysators direkt analysiert Die restliche Reaktionsflüssigkeit wird der Einwirkung von Carboxypeptidase B ausgesetzt und mit einem Aminosäureanalysator wird die Reaktionsflüssigkeit direkt analysiert Dabei zeigt sich, daß eine andere Aminosäure außer Tryptophan nicht freigesetzt worden ist Aus den obigen Ergebnisben ergibt sich unter Berücksichtigung der Aminosäurezusammensetzungen von T-I und Γ-t, daß es sich bei der vorletzten Aminosäure, die vor dem Tryptophan angeordnet ist um Prolin handelt.

(5)Birch-Redukt on

Das Peptid wird einer Birch-Reduktion unterworfen und die dabei erhaltene Reaktionsflüssigkeit wird einer Aminosäureanalyse unterzogen. Dabei zeigt es sich, daß das Arginin drastisch reduziert worden ist Daraus ergibt sich, daß es sich bei der vor Prolin angeordneten Aminosäure um Arginin handelt

Wenn die vorstehend beschriebenen Ergebnisse (1\ bis (5) gemeinsam betrachtet werden, so ist daraus zu ersehen, daß das Peptid eine Aminosäureanordnung

(Lysin - Glycin — Glutaminsäure) — Arginin — Prolin - Tryptophan - (Isoleucin - Leucin) aufweist Bezüglich der in Klammern angegebenen Teile sei bemerkt, daß aus den obigen Ergebnissen die Aminosäureanordnung nicht entnommen werden kann.

(6) Analyse des C endständigen Fragments

D-P wird mit Chymotrypsin digeriert und dansyliert zur Abtrennung von dansyliertem/Isoleucin-Leucin) (C-2). Dann wird das C-2 hydrolysiert Dabei zeigt sich, daß dansyliertes Isoleucin vorhanden ist Das Peptid wird außerdem der Einwirkung von Carboxypeplidase A ausgesetzt und die Reaktionsflüssigkeit wird mit einem Aminosäureanalysator direkt analysiert Dabei wird Leucin und nur eine sehr geringe Menge Isoleucin nachgewiesen. Aus diesem Ergebnis ist zu ersehen, daß die Reihenfolge von C-2 folgendeist: Isoleucin-Leucin (Freie Form).

(7) Analyse der N-endständSgen Aminosäure

D-P wird 16 Stunden lang mit 6n Chlorwasserstoffsäure bei 100° hydrolysiert und die dansylierende Aminosäure wird bestimmt und dabei zeigt es sich, daß es sich bei der dansyliertem Aminosäure um ε-dansyliertes Lysin handelt Daraus ist zu ersehen, daß die N-Sielle blockiert ist D-P wird in 1 η Natriumhydroxyd hydrolysiert und 75 Stunden lang bei 27° stehengelassen. Dann wird mit Essigsäure neutralisiert, dansyliert und mit Chlorwasserstoffsäure hydrolysiert Die Identifizierung der dansylierten Aminosäure ergibt, daß zusätzlich zu ε-dansyliertem Lysin noch dansylierte Glutaminsäure vorhanden ist Daraus ist zu ersehen, daß die N-endständige Aminosäure aus Pyroglutaminsäure besteht

(8) Analyse der C-endständige Aminosäure von P-I

P-I weist die folgende Aminosäureanordnung auf: π Pyroglutaminsäure-(Lysin-Glycin). Die C-endständix:e Aminosäure von P-I wird bestimmt nach dem Tritium-Markierungsverfahren (»Biochemical and Biophysical Research Communication«, 43, 1334 [1971]). Dadurch wird bestätigt, daß die C-ends<ändigen Aminosäure aus Lysin besteht Damit ergibt sich für P-1 die folgende Aminosäureanordnung: Pyroglutaminsäure — Glycin — Lysin.

Aus den vorstehenden Ergebnissen geht hervor, daß das erfindungsgemäße Peptid die folgende Struktur aufweist: Pyroglutaminsäure —Glycin —Lysin —Arginin — Prolin—Tryptophan — Isoleucin — Leucin.

Die folgende Figur zeigt die AngriPszentren jedes Enzyms an dem dar.sylierten Peptid bei dem obenerwähnten Verfahren zu- Strukturbestimmung.

PyrGlu · GIy ■ Lys · Arg Pro · Trp Heu Leu - OH

P-I

T-I —

C-I

— C-2

* Carboxypeptidase A

Das erfindungsgemäße Peptid weist im Tierversuch die folgenden pharmakologischen Aktivitäten auf:

(1) eine kontrahierende Wirkung auf einen Rattenmagenstreifen (gemessen nach der Methode von Magnus):

Schwellenwerts-Dosis = 0,1 ng/ml
Dosenansprechempfindlichkeit: positiv

jo (2) kontrahierende Wirkung auf ein Meerschweinchenileum (gemessen nach der Methode von Magnus): Schwellenwert-Dosis = 10 ng/ml
Dosenansprechempfindlichkeit: negativ (eines wurde relaxiert und dann kontrahiert)

(3) hypertensive Wirkung auf Ratten:
Schwellenwerts-Dosis = l,2μg/kg
Tachyphylaxie: positiv

Daraus ist zu ersehen, daß das erfindungsgemäße Peptid eine wertvolle Substanz darstellt, die hypotensive gastrointestinal-bewegungsfördernde Eigenschaften

aufweist. Außerdem hat das erfindungsgemäße Peptid

die folgenden physikalischen Eigenschaften:

Rf-Werte des dansylierten Peptids bei der Dünnschichtchromatographie auf Silikageli
Rfi 0,37 (Lösungsmittelsystem: Methylacetat/Isopropanol/ Ammoniak (9/7/4))

Rf: 0,27 (Lösungsmittelsystem: n-Butanol/Essigsäure/Wasser (4/1/5)).

Die Erfindung wird nachfolgend anhand eines Beispiels näher erläutert. In diesem Beispiel ist unter dem Ausdruck »aktive Fraktion« eine Fraktion mit einer kontrahierenden Wirkung auf einen Rattenmagenstreifen zu verstehen.

Beispiel

21 Methanol, das 5 VoI-% einer 6 gew.-°/oigen wäßrigen Trichloressigsäurelösung enthielt, wurden zu frischen Häuten von 30 afrikanischen Fröschen zugegeben und die Häute wurden eine Woche lang in einem Kühlschrank bei etwa -20° stehengelassen. Der dabei erhaltene Extrakt wurde von dem festen Rückstand abgetrennt und dann wurde der Extrakt untei vermindertem Druck eingeengt und getrocknet unter Bildung von Feststoffen 1,2 g).

Eine Säule mit einem Innendurchmesser von 3 cm und einer Länge von 60 cm wurde mit einem stark sauren Ionenaustauscherharz gefüllt, das mit 0.¹ M Arnmoniumformiat (pH 7,5) gut gepuffert war. Die Feststoffe wurden in 20 ml einer 0,001 η Ameisensäure gelöst und die Lösung wurde in die Säule gegossen. Die Gradientenelution wurde unter Verwendung von 2 1 Wasser und 2 1 0,5 M Ammoniumformiat (pH 6,5) mit einer Elutionsgeschwindigkeit von 60 ml/Std. und bei einem Einheitsfraktionsvolumen von 15 ml durchgeführt Die aktiven Fraktionen (die 75. bis 90 Fraktion) wurden gesammelt und lyophilisiert

Eine zweite Säule mit einem Innendurchmesser ·όπ 4,5 cm und einer Länge von 50 cm wurde mit einem stark saurem Ionenaustauscherharz, das mit 0,1 η Essigsäure gut gepuffert war, gefüllt Das lyophilisierte Produkt wurde in 5 ml 0,1 η Essigsäure gelöst und die Lösung wurde in die Säure gegossen. Die Entwicklungselution wurde unter Verwendung des gleichen Lösungsmittels mit einer Elutionsgeschwindigkeit von 20 ml/Std. und be> einem Einheitsfraktionsvolumen von 3 ml durchgeführt Die aktiven Fraktionen (die 45. bis 55. Fraktion) wurden gesammelt und lyophilisiert. Dieses lyophilisierte Produkt wurde in 1 ml 0,001 η wäßrigem Ammoniak gelöst und die Lösung wurde in eine dritte Säule mit einem Durchmesser von 0,9 cm und einer Länge von 50 cm eingeführt, die mit einem stark basischen lonenaustauscherharz, das mit 0,001 η wäßrigem Ammoniak ausreichend gepuffert war, gefüllt war. Die Entwicklungselution wurde unter Verwendung von 0,001 η wäßrigem Ammoniak mit einer ElutioviSgesch windigkeit von 12 ml/Std. und einem Einheitsfraktionsvolumen von 3 ml durchgeführt Die aktiven Fraktionen (die 8. bis 15. Fraktion) wurden gesammelt und lyophilisiert

Das lyophilisierte Produkt wurde anschließend durch

IQ Tröpfchengegenstromverteilungschromatographie gereinigt unter Verwendung einer Säule mit einer Innenkapaüität von 240 ml. Im einzelnen wurde ein flüssiges Gemisch aus n-Butanol, Essigsäure und Wasser im Volurnenverhältnis 4:1:5 in zwei Schichten getrennt. Die obere Schicht diente als stationäre Phase. Das lyophilisierte Produkt war in der unteren Schicht gelöst die abgetrennt wurde. Die erhaltene Lösung aus der unteren Schicht wurde tropfenweise auf die stationäre Phase gegeben. Die Tropfen der Lösung der unteren Schicht wanderten zum Boden der stationären Phase. Auf diese Art wurde die Elution bei einer Elutionsgeschwindigkeit von l,rnl/h und bei einem Einheitsfraktionsvolumen von 3 rm durchgeführt Es wurden die aktiven Fraktionen (die 48. bis 100. Fraktion) gesammelt und unter vermindertem Druck eingeengt und unter Bildung von Feststoffen getrocknet Die Feststoffe wurden in 0,5 ml einer 0,001 η Ameisensäure gelöst und die Lösung wurde in eine Säule mit einem Durchmesser von 0,9 cm und einer Länge von 30 cm

jo gegeben, die mit einem stark sauren Ionenaustauscherharz gefüllt war, das mit einer 0,1 M Ammoniumformiatflüssigkeit (pH 6,5) ausreichend gepuffert war. Die Entwicklungselution wurde bei einer Elutionsgeschwindigkeit von 15 ml/Std. und mit einem Einheitsfräktionsvolumen von 3 ml unter Verwendung von 0,05 M Ammoniumformiat (pH 6,5) durchgeführt Die aktiven Fraktionen (die 47. bis 63. Fraktion) wurden gesammelt und lyophilisiert, wobei man 750 μg eines weißen pulverförmigen Peptids erhielt

Dieses Peptid wurde dimethylaminonaphihalin-sulfonyliert (dansyliert) und unter Verwendung von zwei Arten von Entwicklungsmitteln, nämlich einer Flüssigkeit aus Butanol/Essigsäure/Wasser (4/1/5) und einer Flüssigkeit aus Methylacetat/Isopropanol/Ammoniak (9/7/4) einer Silikagel-Dünnschichtchronmtographie unterworfen. Diese bestätigte, daß es sich bei dem erhaltenen Peptid um eine einzige Substanz handelte.

Claims (1)

Patentansprüche:

1. Das Octapeptid Xenopsin der Formel
pyrGIu - GIy - Lys - Arg - Pro -Trp - Ue - Leu

Z Verfahren zur Gewinnung von Xenopsin gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Haut des afrikanischen Frosches Xenopus laevis pipidae mit einem Cr bis CrAlkanoI extrahiert, das Lösungsmittel aus dem Extrakt abtrennt und den Rückstand durch Chromatographie an einem stark sauren Ionenaustauscherharz, Chromatographie an einem stark basischen Ionenaustauscherbarz, Gelfiltration und Tröpfchengegenstromverteilungschromatographie, wobei die Reihenfolge der Chromatographieverfahren beliebig ist und eins oder mehrere Chromatographieverfahren wiederholt werden können, reinigt

Lösungsmittel hierfür sind beispielsweise folgende