DE2540544A1

DE2540544A1 - Polypeptide

Info

Publication number: DE2540544A1
Application number: DE19752540544
Authority: DE
Inventors: Harold Gregory; Beryl Margaret Preston
Original assignee: Imperial Chemical Industries Ltd
Current assignee: Imperial Chemical Industries Ltd
Priority date: 1974-09-11
Filing date: 1975-09-11
Publication date: 1976-03-25
Also published as: US4032633A; BE833276A; JPS5163102A; AU8400575A; IL47964A0; DE2540544C2; ZA755172B; JPS5950315B2; GB1461105A; NL7510477A; FR2284333B1; SE7510081L; FR2284333A1

Description

PATENTANWÄLTE DR.-ING. H. FlNCKE DIPL-ING. H. BOHR DIPL-ING. S. STAEGER

8 MÜNCHEN 5 i 1·

MÜLLERSTRASSE 31

Mappe 23821 - Dr. K/by Case PH 27254

IMPERIAL CHEMICAL INDUSTRIES LTD. London, Großbritannien

Polypeptide

Priorität: 11. September 1974 - Großbritannien

Die Erfindung bezieht sich auf Polypeptide, welche die Eigenschaft besitzen, die Sekretion von saurem Magensaft zu inhibieren.

Es ist seit vielen Jahren bekannt, daß Extrakte von menschlichem Urin eine Inhibierung der Sekretion von saurem Magensaft bei Warmblütlern verursachen können. Die Isolation zweier der aktiven Komponenten in reiner Form ist in der Dt-OS 2 359 564 boschrieben. Diese beiden reinen Komponenten sind als ß-Urogastron

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bzw. T-Urogastron bekannt. Die Grundlage der vorliegenden Erfindung ist die Feststellung, daß der enzymatisch^ Abbau von ß- oder y-Urogastron zu einen neuen Polypeptid führen kann und daß dieses neue Polypeptid und sein Reduktionsprodukt

kräftige Inhibitoren für die Sekretion von saurem Magensaft sind.

Gegenstand der Erfindung ist also ein Polypeptid, bei dem es sich um ein weißes, wasserlösliches, saures Polypeptid handelt, das aus einer einzigen Polypeptidkette mit drei inneren Disulfidbindungen besteht; am N-Ende nach Dansylierung Asparaginsäure und am C-Ende Leucin aufweist; ein Molekulargewicht von ungefähr 5 500 besitzt; die folgenden physikalischen Eigenschaften zeigt:

Papierchromatografie in n-Butanol:Essigsäure:Pyridin: Wasser (30:6:24:20) - einziger Fleck mit einer Mobilität von 0,90 relativ zu Phenylalanin;

Papierelektrophorese in Essigsäure/Ameisensäure mit pH-Wert 2,1 - ein "Komet" mit einer Frontmobilität von 1,58 relativ zu €-DNP-Lysin;

Acrylamidgelelektrophorese in 0,1 m Tris/Salzsäure-Puffer mit pH-Wert 8,9 - ein einziger Fleck, der sich mit einer Mobilität von 0,81 relativ zu Bromphenolblau zur Anode bewegt;

bei Analyse eines Hydrolysats ein Aminosäureverhältnis wie folgt ergibt:

Asparaginsäure 7, Serin 3, Glutaminsäure 4, Prolin 1, Glycin 4, Alanin 2, Valin 3, Cystein 6, Methionin 1, Isoleucin 2, Leucin 4,- Tyrosin 5, Histidin 2, Lysin 1 und Arginin 2;

und eine biologische Wirkung, wie weiter unten definiert, im Bereich von 0,2 bis 1 fug/kg aufweist;

oder das Reduktionsprodukt, bei dem die Cystinreste in Cysteinreste reduziert sind.

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Gegenstand der Erfindung ist weiterhin ein Verfahren zur Herstellung des erfindungsgemäßen Polypeptids, welches dadurch ausgeführt wird, daß man ß-Urogastron oder Γ-TJrogastron in einem wäßrigen Medium der Einwirkung einer lysinspezifischen Aminoendopeptidase unterwirft und hierauf das gewünschte PoIypeptid vom Reaktionsgemisch abtrennt und ggf., sofern ein Reduktionsprodukt gewünscht wird, das so erhaltene Polypeptid mit einem in der Peptidchemie zur Reduktion von Disulfidbindungen üblichen Reduktionsmittel, wie z.B. einem Thiol, beispielsweise Mercaptoathanol oder Dithiothreit, reduziert.

Ein Beispiel für eine geeignete lysinspezifische Aminoendopeptidase ist das Enzym AM-Protease, das aus den reifen Fruchtkörpern des Pilzes Armillaria mellea erhalten werden kann, wie es näher in der GB-PS 1 263 956 beschrieben ist. _v

Die Einwirkung der lysinspezifischen Aninoendopeptidase auf ß- oder JT-Urogastron kann so ausgeführt werden, daß das Enzym einfach in dem wäßrigen Medium aufgelöst wird. Es ist aber auch möglich, das Enzym an einen Träger zu binden, der in dem wäßrigen Medium löslich sein kann oder auch nicht.

Die Geschwindigkeit und das Ausmaß der Reaktion zwischen dem Urogastron, d.h. dem ß- oder Jf-Urogastron, welches als Ausgangsmaterial verwendet wird, und dem Enzym hängt vom Enzym/Substrat-Verhältnis, dem pH-Wert und der Temperatur des Inkubationsmediums, der Konzentration des Urogastrons und der Inkubationszeit ab. Im allgemeinen wird natürlich die zur Spaltung des Urogastrons erforderliche Zeit um so kürzer, je höher die Konzentration des Urogastrons oder je höher das Enzym/Substrat-Verhältnis ist. In ähnlicher Weise beeinflussen Veränderungen des pH-Werts oder der Temperatur des Inkubationsmediums die Spaltungszeit. Der Fortschritt der Reaktion kann dadurch verfolgt werden, daß man Proben des Reaktionsmediums unter Verwendung von^aiElektrophorese bei einem pH-Wert von 6,5 untersucht, oder dadurch, daß man die Proben der "Dansylierungstechnik" unterwirft, wobei 1-Dimethylaminonaphthalin-5-sulfonylchlorid (Hartley, Biochem. J. 1970, 119, 805) verwendet wird, und die Menge des gebildeten

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N^Ä,N^e-Dansyl-L-lysins bestimmt. Dadurch kann der Einfluß jeder Veränderung- der Reaktionsbedingungen bestimmt werden.

Im allgemeinen verläuft die Reaktion innerhalb einer großen Reihe von Enzym/Substrat-Verhältnissen, jedoch ist ein Mindestverhältnis von 1 Teil Enzym auf 1000 Teile Substrat erwünscht. Die Reaktion verläuft bei einem pH-Wert des Inkubationsmediums von 3 bis 10 und bei einer Temperatur von 10 bis 50⁰C. Bevorzugte Bedingungen zur Erzielung der gewünschten Spaltung des Urogastrons in einer verhältnismäßig kurzen Zeit, beispielsweise 12-24 st, sind eine Urogastronkonzentration von 1 mg/ml aufwärts, ein pH-Wert von 6 bis 9, eine Temperatur von 20 bis 40 C und ein Enzym/Substrat-Verhältnis von 1 Teil Enzym auf 8 Teile Substrat bis 1 Teil Enzym auf 100 Teile Substrat. Es ist auch zweckmäßig, Metallionen in das Inkubationsmedium einzubringen, wie z.B. Calcium- oder Magnesiumionen in Form ihrer Chloride

-2 -4 mit einer Konzentration von 10 bis 10 molar.

Die Wirkung der lysinspezifischen Aminoendopeptidase auf das ß- oder 7"-Ur ο gast r on besteht natürlich darin, das ß- oder ^P-Urogastron an der Aminoseite eines Lysinrestes zu spalten. Zwar enthält das Ausgangsurogastron zwei Lysinreste, aber es wurde gefunden, daß die Spaltung vorwiegend an einem der Lysinreste stattfindet. Aus ß-Urogastron wird ein Hexapeptid, das einen Glutaminsäure-, einen Leucin-, einen L^rsin-, zwei Tryptophan- und einen Argininrest enthält, wobei Lysin sich am N-Snde befindet, in Freiheit gesetzt, und aus ^-Urogastron wird ein " Pentapeptid, das einen Glutaminsäure-, einen Leucin-, einen Lysin- und zwei Tryptophanreste enthält, wobei Lysin sich am N-Ende befindet, in Freiheit gesetzt. Wenn jedoch etwas schärfere Reaktionsbedingungen angewendet werden, dann kann auch eine Spaltung am anderen Lysinrest stattfinden, was zu einem zweiten Polypeptid im Produkt führt.

Die nach der Abspaltung der Hexa- bzw. Pentapeptide aus ß- bzw. ^-Urogastron übrig bleibenden Polypeptide sind identisch und stellen das erfindungsgemäße Polypeptid dar. Dieses Polypeptid

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kann aus dem Reaktionsgemisch durch jede herkömmliche Technik für die Abtrennung von Polypeptiden isoliert werden, jedoch ist die Anwendung von Gelchromatografie besonders zweckmäßig. So ist es möglich, das nach der Abspaltung des Hexa- oder Pentapeptids vom ß- oder f-Urogastron erhaltene wäßrige Medium durch eine Kolonne eines vernetzten Dextrangels oder eines Polyacrylamidgels zu filtrieren und die Kolonne mit einem Puffer, der aus Komponenten besteht, die bei Gefriertrocknung unter Hochvakuum flüchtig sind, wie z.B. eine wäßrige Ammoniumacetatlösung mit einem pH-Wert von 7,2, zu eluieren, wobei das gewünschte Produkt erhalten wird, das durch Gefriertrocknen des Eluats isoliert wird.

Wenn das Reduktionsprodukt gewünscht wird, dann wird das erfindungsgemäße Polypeptid zweckmäßig in einem wäßrigen Puffer mit einem pH-Wert von 7 bis 10 unter Ausschluß von Sauerstoff und Licht reduziert. Das Produkt kann wiederum unter Verwendung von Gelchromatografie isoliert werden.

Wie oben angegeben, sind das erfindungsgemäße Polypeptid und sein Reduktionsprodukt kräftige Inhibitoren für die Sekretion von saurem Magensaft bei Warmblütlern. Diese Eigenschaft kann dadurch demonstriert werden, daß sie die Sekretion von saurem Magensaft bei Hunden inhibieren, die mit einer Heidenhain-Tasche versehen sind und deren Magensaftsekretion mit Histamin stimuliert worden ist. Dieser Test wird zur Bestimmung der biologischen Wirkung der Produkte verwendet. Die biologische Wirkung wird definiert als die Menge des Produkts, ausgedrückt in ug/kg, die bei Verabreichung durch intravenöse Injektion an einen Hund, der mit einer Heidenhain-Tasche versehen ist und dessen Magensäuresekretion durch Infusion von Histamin auf 60-80 % des maximalen Sekretionswerts stimuliert ist, eine 50-bis 7O5£ige Inhibierung dieser Säuresekretion verursacht. Eine gewisse Variation der biologischen Wirkung einer bestimmten Probe wird gefunden, wenn sie zu verschiedenen Gelegenheiten bei verschiedenen Hunden gemessen wird, weshalb das Ergebnis am besten als Dosierungsbereich ausgedrückt wird. Die physiologische

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Wirkung der Inhibierung der Sekretion des sauren Magensafts ist bei der Behandlung von Duodenal ge schwüren von Wert. Unter den Testbedingungen wurden keine ernst zu nehmenden toxischen Wirkungen festgestellt. Die Polypeptide zeigen außerdem bei einem Standardtest Geschwürheilungseigenschaften.

Bei Verwendung zur Erzielung einer Inhibierung der Sekretion von saurem Magensaft bei Warmblütlern kann eine große Reihe von Dosierungen verwendet werden, wie z.B. von 0,05 bis 10 pg/kg, je nach den Umständen und dem Ausmaß der gewünschten Inhibierung. Die Dosis kann durch Injektion, insbesondere intravenöse oder subkutane Injektion, oder durch intravenöse Infusion verabreicht werden. Die Wirkung einer einzigen intravenösen Injektion dauert ungefähr 1 1/2 st, und die Wirkung einer Infusion währt ungefähr 1 1/2 st nach Beendigung der Infusion,-so daß die Aufrechterhaltung eines niedrigen Aciditätswerts es erfordert, daß entweder die Dosis wiederholt wird oder daß ein Depotpräparat injiziert wird, aus welchem der aktive Bestandteil langsam während einer längeren Zeit in Freiheit gesetzt wird. Bei der Verwendung beim Menschen liegt eine typische Einzeldosis zwischen 5 und 500 μg/Mensch, verabreicht durch Injektion oder Infusion.

Das erfindungsgemäße Polypeptid oder Reduktionsprodukt kann in Form einer pharmazeutischen Zusammensetzung verabreicht werden, so daß gemäß der Erfindung weiterhin eine pharmazeutische Zusammensetzung vorgeschlagen wird, die das Polypeptid oder das R.eduktionsprodukt, wie sie oben definiert sind, und ein pharmazeutisch zulässiges Verdünnungsmittel oder Trägermittel enthält.

Bevorzugte Zusammensetzungen sind solche, die sich für parenterale Verabreichung eignen, wie z.B. sterile, injizierbare Lösungen oder Suspensionen und sterile, injizierbare Depotpräparate oder Präparate mit langsamer Abgabe. Eine injizierbare Lösung oder Suspension kann 0,5 bis 500 μg/ml enthalten, wobei die verdünnteren Lösungen durch Infusion verabreicht werden. Ein injizierbares Depotpräparat oder ein Präparat mit langsamer Abgabe kann dagegen bis zu 2 mg des aktiven Bestandteils je Dosis ent-

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halten. Besonders zweckmäßige sterile, injizierbare Lösungen werden in isotonischen Salz- oder isotonischen Dextroselösungen hergestellt, die nötigenfalls auf einen pH-¥ert von 5 bis 9 gepuffert sind und 1 "bis 100 pg/ml enthalten können.

Die oben erwähnten sterilen, injizierbaren Zusammensetzungen können als solche hergestellt und gelagert werden, oder sie können unmittelbar vor der Verwendung hergestellt werden, indem ein steriles Medium, wie z.B. Vfasser, zu einem bekannten Gewicht, wie z.B. 10 bis 200 μg, des sterilen Bestandteils zugegeben wird, der in einem Behälter, wie z.B. einer Phiole oder Ampulle, welche die Sterilität aufrechterhält, eingeschlossen ist. Das bekannte Gewicht an sterilem Bestandteil kann auch ausreichend sterile Dextrose oder ausreichend steriles Natriumchlorid enthalten, so daß nach Verdünnung mit dem sterilen Medium eine isotonische Lösung entsteht.

Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele näher erläutert. Die chromatografischen Materialien, die mit dem Warenzeichen oder der Bezeichnung des Herstellers benannt wurden, sind wie folgt erhältlich:

ein poröses Polyacrylamidgel, Biogel P6 von Bio-Rad Laboratories, Richmond, California, U.S.A.j

poröses vernetztes Dextrangel, Sephadex G-25 von Pharmacia Fine Chemicals AB, Uppsala, Schweden.

Bei den Verfahren, bei denen eine Chromatografiekolonne verwendet wurde, wurde das Eluat in Fraktionen aus einer bestimmten Anzahl von Tröpfchen gesammelt, wobei ein Ultrorac LKB 7«000-Fraktionssammler (LKB Instruments Ltd., Croydon, Surrey, Großbritannien) verwendet wurde und wobei diese Fraktionen durch Messung der UV-Absorption bei 280 mu auf Peptidmaterial untersucht wurden. Das Material wurde in Fraktionen gesammelt. Die biologische Aktivität wurde wie folgt bestimmt:

Hunde wurden mit gesonderten entnervten Funduschtaschen versehen, und es wurde eine subkutane Infusion von Histamin verwen-

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det, eine Magensaftsekreticn von annähernd 60-80 % der Maximalgeschwindigkeit zu stimulieren (üblicherweise war eine Infusion einer Lösung von 600 pg Histamin (ausgedrückt als Base) in 0,43 ml je Stunde ausreichend). Eine bekannte Menge Testmaterial wurde in isotonischer Salzlösung aufgelöst, und nachdem der Hund Magensaft mit stetiger Geschwindigkeit sekretierte, wurde eine einzige intravenöse Injektion dieses Materials verabreicht. Die Inhibierung der Magensaftsekretion wurde für die jeweils getestete Dosis notiert.

Die spezifische Aktivität kann aus den für die verschiedenen Dosen erhaltenen Resultaten bestimmt werden.

Aminosäureanalysen wurden unter Verwendung eines Locarte-Aminosäure-Analysators (Locarte Ltd., 24 Emperors Gate, London S.W. 7) ausgeführt.

Alle Kolonnenchromatografien wurden bei 4⁰C ausgeführt, und alle Pufferlösungen waren mit Toluol gesättigt.

Beispiel 1

Eine Lösung von 1,0 mg ß-Urogastron in einem Gemisch aus 200 pl eines 0,1 m Ammoniumbicarbonatpuffers mit einem pH-Wert von 8,2 und 50 ul einer 0,01 m Magnesiumchloridlösung wurde mit 60 pg AM-Protease in 200 pl Wasser 16 st bei 37⁰C inkubiert. Die erhaltene Lösung wurde auf eine Kolonne (35 x 1 cm) eines porösen vernetzten Dextrangels (Sephadex G-25) aufgebracht, und die Kolonne wurde mit 0,05 m Ammoniumacetat mit einer Fließgeschwindigkeit von 8 ml/st entwickelt. Fraktionen von 1 ml wurden gesammelt, und peptidisches Material wurde in den Fraktionen 12-20 und 38-52 festgestellt.

Das Material in den Fraktionen 38-52 war biologisch inaktiv, und Proben wurden mit Säure, Base oder Leucinaminopeptidase hydrolysiert. Analyse der resultierenden Lösungen zeigte, daß das ursprüngliche Peptid Aminosäuren in den folgenden Verhältnissen enthielt: GIu 1, Leu 1, Lys 1, Trp 2, Arg 1. Dansylie-

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rung ergab die Anwesenheit von Lysin am N-Ende.

Das Material aus den Fraktionen 12-20 war biologisch aktiv, und diese Fraktionen wurden vereinigt und lyophilisiert, wobei ein weißes, wasserlösliches, saures Polypeptid mit den folgenden Eigenschaften erhalten wurde:

1. biologische Aktivität bei einer Einzelbestinunung: 30 % Inhibierung bei einer Dosis entsprechend 0,7 pg/kg Ausgangsmaterial;

2. Aminosäureverhältnisse bei einer Analyse eines Hydrolysats:

Asp 7, Ser 3, GIu 4, Pro 1, GIy 4, AIa 2, VaI 3, Cys 6, Met 1, He 2, Leu 4, Tyr 5, His 2, Lys 1, Arg 2;

3. einziger Fleck mit einer Mobilität von 0,90 im Verhältnis zu Phenylalanin bei Papierchromatografie in n-Butanol;Essigsäure:Pyridin:Wasser (30:6:24:20);

4. ein "Komet" mit einer Frontmobilität von 1,58 relativ zu 6-DNP-Lysin bei Papierelektrophorese in Essigsäure/ Ameisensäure mit pH-Wert 2,1 (20 ml Ameisensäure, 80 ml Essigsäure, mit Wasser auf 1 1 gebracht);

5. einziger Fleck mit einer Mobilität von 0,81 relativ zu Bromphenolblau bei Acrylamidgelelektrophorese in 0,1 m Tris/Salzsäure-Puffer mit pH-Wert 8,9.

Dansylierung des Produkts zeigte die Anwesenheit von Asparaginsäure am N-Ende, und Digerierung mit Carboxypeptidase A zeigte die Anwesenheit von Leucin am C-Ende.

Dansylierung des Produkts zeigte jedoch die Anwesenheit einer kleinen Menge eines Peptids mit Lysin am N-Ende, woraus sich die Anwesenheit einer kleinen Menge eines Peptids erschließen läßt, das durch Spaltung am zweiten Lysinrest des Ausgangsmaterials gebildet wurde.

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Beispiel 2

Eine Lösung von 1,8 mg JMJrogastron in einem Gemisch aus 200 ul eines 0,1 m Ammoniumbicarbonatpuffers mit einem pH-Wert von 8,2 und 20 pl 0,1 m Calciumchloridlösung wurde mit 100 ug AM-Protease in 100 pl 0,1 m Ammoniumbicarbonatlösung 3 st bei 37°C inkubiert. Eine zweite Portion von 100 ug AM-Protease wurde zugegeben, und die Inkubierung wurde weitere 16 st fortgesetzt. Die erhaltene Lösung wurde auf eine Kolonne (35 x 1,1 cm) aus porösem vernetzten! Dextrangel (Sephadex G-25) aufgebracht, und die Kolonne wurde mit 0,05 m Ammoniumacetat bei einer Fließgeschwindigkeit von 17 ml/st entwickelt. Fraktionen von 30 Tropfen wurden gesammelt, und das Peptidmaterial wurde in den Fraktionen 15-24 und 49-65 entdeckt.

Das Material in den Fraktionen 49-65 war biologisch inaktiv, und Analyse von Hydrolysat zeigte, daß das Material Aminosäure in den folgenden Verhältnissen enthielt: GIu 1, Leu 1, Lys 1, Trp 2. Dansylierung ergab die Anwesenheit von Lysin am N-Ende.

Das Material aus den Fraktionen 15-24 war biologisch aktiv, und diese Fraktionen wurden vereinigt und lyophilisiert, wobei ein weißes, wasserlösliches, saures Polypeptid, nämlich das gleiche wie in Beispiel 1, erhalten wurde.

Beispiel 3

Eine Lösung von 1,75 mg ß-Urogastron in 1,0 ml 0,025 m Ammoniumbicarbonat wurde mit 30 ug AM-Protease in 100 μΐ Wasser während 3 st bei 37°C inkubiert. Eine zweite Portion von 20 pg AM-Protease wurde dann zugegeben, und die Inkubierung wurde weitere 16 st fortgesetzt. Die resultierende Lösung wurde auf eine Kolonne (100 χ 0,9 cm) eines porösen Polyacrylamidgels (Biogel P6: 200-400 Mesh) aufgegeben, welches mit 0,05 m Ammoniumacetat ins Gleichgewicht gebracht worden war. Die Kolonne wurde mit dieser Lösung bei einer Fließgeschwindigkeit von 5 ml/st entwickelt. Fraktionen von 1 ml wurden genommen, und das biologisch aktive Peptidmaterial wurde in den Fraktionen 24-30 ent-

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deckt. Diese wurden vereinigt und lyophilisiert, wobei ein weißes, wasserlösliches, saures Polypeptid mit den gleichen Eigenschaften wie das Produkt von Beispiel 1 erhalten wurde. Es zeigte bei einer Einfach be Stimmung eine biologische Aktivität entsprechend einer 67?4igen Inhibierung, wenn eine Dosis entsprechend 0,6 ug/kg des Ausgangsmaterials verwendet wurde.

Beispiel 4

Das gesamte in Beispiel 3 erhaltene Polypeptid wurde in ¥asser aufgelöst, worauf 100 mg Harnstoff, 1 mg Äthylendiamintetraessigsäure und 100 ul 1,5 m Tris/Salzsäure-Puffer mit einem pH-Wert von 8,6 zugegeben wurden. Die Lösung wurde mit Wasser auf 250 μΐ verdünnt, mit Stickstoff, der keinen Sauerstoff enthielt, gespült und hierauf mit 10 mg Dithiotreit zersetzt. Die erhaltene Lösung wurde 20 st im Dunkeln gehalten und dann auf eine Kolonne (100 χ 0,9 cm) eines porösen Polyacrylamidgels (Biogel P6; 200-400 Mesh) aufgebracht, welche mit 0,05 m Ammoniunacetat, das 0,0002 m Dithiothreit enthielt, ins Gleichgewicht gebracht worden war. Die Kolonne wurde mit dieser Lösung unter einer Fließgeschwindigkeit von 5 ml/st entwickelt. Fraktionen von 1 ml wurden gesammelt, und das Peptidmaterial wurde in den Fraktionen 24-33 entdeckt. Das Material aus diesen Fraktionen war biologisch aktiv. Diese Fraktionen wurden vereinigt und lyophilisiert, wobei ein Polypeptid erhalten wurde, in welchem die Cystinreste in Cysteinreste reduziert waren und welches die folgenden Eigenschaften besaß:

1. biologische Aktivität bei einer Einfachbestimmung:

59 % Inhibierung bei einer Dosis entsprechend 0,6 pg/kg Ausgangsmaterial;

2. Aminosäureverhältnisse bei Analyse eines Hydrolysats: Asp 7, Ser 3, GIu 4, Pro 1, GIy 4, AIa 2, VaI 3, Cys 6, Met 1, He 2, Leu 4, Tyr 5, His 2, Lys 1, Arg 2.

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Beispiel 5

Das in Beispiel 1 beschriebene Polypeptid oder ein Reduktionsprodukt davon, bei welchen die ursprünglichen Cystinreste in Cystein reduziert sind, wird in einer pyrogenfreien 5^igen (G/V) Dextroselösung aufgelöst, so daß eine Endkonzentration von 40 μβ/ml erhalten wird. Diese Lösung wird in Mengen von 2,5 ml in Phiolen eingebracht, und zwar jeweils durch ein sterilisierendes Kembranfiltrationssystem, wie z.B. ein 0,22 ταμ "Millipore"-Filter ("Millipore" ist ein Warenzeichen). Der Inhalt einer jeden Phiole wird dann lyophilisiert, und die Phiolen werden unter sterilen Bedingungen verschlossen und zugeschmolzen. Die Phiolen, die ein steriles Genisch aus Polypeptid und Dextrose enthalten, werden bei 4 C gelagert.

Beispiel 6

In eine Phiole, die gemäß Beispiel 5 hergestellt worden ist, werden unmittelbar vor der Verwendung 2,5 ml steriles Wasser eingebracht, wobei eine sterile, injizierbare Lösung von 40 pg/ml eines Polypeptids in einer 59^i gen (G/V) Dextroselösung erhalten wird.

Beispiel 7

10 mg des in Beispiel 1 beschriebenen Polypeptids oder eines Reduktionsprodukts davon, bei welchem die ursprünglichen Cystinreste in Cj^stein reduziert sind, werden in 50 ml pyrogenfreienr Wasser aufgelöst, und die Lösung wird durch ein sterilisierendes Membranfiltrationssystem filtriert, wie z.B. durch ein 0,22 inu "Millipore"-Filter ("Millipore" ist ein Warenzeichen), wobei das Filtrieren in Ampullen erfolgt, so daß jede Ampulle 0,5 ml aufnimmt. Der Inhalt einer jeden Ampulle wird dann lyophilisiert, und die Ampullen werden unter sterilen Bedingungen verschlossen. Die Ampullen, von denen jede 100 pg des sterilen Polypeptids enthält, v/erden bei -20°C gehalten.

Beispiel 8

Der Inhalt einer Ampulle, die wie in Beispiel 7 hergestellt wor-

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den ist, wird in steriler, pyrogenfreier, 5/oiger (G/V) Dextroselösung aufgelöst, so daß eine Lösung erhalten wird, die 1 bis 5 pg/ml Polypeptid in 5/jiger (G/V) Dextroselösung enthält. Diese Lösung eignet sich für die Verabreichung durch Infusion.

Wenn eine für Injektion geeignete Lösung gewünscht wird, dann wird der Inhalt einer xVmpulle mit steriler, pyrogenfreier 5/oiger (G/V) Dextroselösung verdünnt, so daß eine Lösung erhalten wird, die 5-50 ug/ml des Polypeptids enthält.

Alternativ kann die 5%ige "(G/V) Dextroselösung-durch isotonische Salzlösung ersetzt werden.

Das erfindungsgemäße Polypeptid wurde durch Verfahren untersucht, die zur Bestimmung der Struktur von Polypeptiden zur Verfügung stehen, wobei die folgende Struktur gefunden wurde:

H.Asn.Ser.Asp.Ser.Glu.Cys.Pro.Leu.Ser.His.Asp.Gly.Tyr

C Tyr. Met. Cys. VaI. GIy. Asp. His. Leu. Cys <— I He.GIu. AIa. Leu. Asp.Lys .Tyr. Ala.Cys —»

Tyr.GIy.VaI.VaI.Cys.Asn ^J

. GIy. GIu. Arg. Cy s. Gin. Ty r

HO.Leu.Asp.Arg

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Claims

PATENTANSPRÜCHE:

Polypeptid, welches ein weißes, wasserlösliches, saures Polypeptid ist, das im wesentlichen aus einer einzigen Polypeptidkette mit drei inneren Disulfidbindungen besteht; am N-Ende nach Dansylierung Asparaginsäure und am C-Ende Leucin aufweist; ein Molekulargewicht von ungefähr 500 besitzt; die folgenden physikalischen Eigenschaften zeigt:

Papierchromatografie in n-Butanol:Essigsäure:Pyridin: Wasser (30:6:24:20) - einziger Fleck mit einer Mobilität von 0,90 relativ zu Phenylalanin; Papierelektrophorese in Essigsäure/Ameisensäure mit pH-Wert 2,1 - ein "Komet" mit einer Frontrnobilität von 1,58 relativ zu 6-DNP-Lysin; Acrylamidgelelektrophorese in 0,1 m Tris/Salzsäure-Puffer mit pH-Wert 8,9 - ein einziger Fleck, der sich mit einer Mobilität von 0,81 relativ zu Bromphenolblau zur Anode bewegt;

bei Analyse eines Hydrolysats ein Aminosäureverhältnis wie folgt ergibt:

Asparaginsäure 7, Serin 3, Glutaminsäure 4, Prolin 1, Glycin 4, Alanin 2, Valin 3, Cystein 6, Methionin 1, Isoleucin 2, Leucin 4, Tyrosin 5, Histidin 2, Lysin und Arginin 2;

und eine biologische Wirkung, wie weiter oben definiert, im Bereich von 0,2 bis 1 pg/kg aufweist;

oder das Reduktionsprodukt, bei dem die Cystinreste in Cysteinreste reduziert sind.
2. Das Polypeptid der Formel:

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H.Asn.Ser.Asp.Ser.Glu.Cys.Pro.Leu.Ser.His.Asp.Gly.Tyr'

Γ Tyr.Met.Cys.VaI.GIy.Asp.His.Leu.Cys I

lie.GIu.Ala.Leu.Asp.Lys,Tyr.Ala.Cys

.Asp.bys ,Tyr.Kia.uys —» r Tyr. GIy. VaI. VaI. Cys. Asn ^J «Ulle.GIy.GIu.Arg.Cys.Gin.

Tyr HO.Leu.Asp.Arg

oder dessen Reduktionsprodukt, bei dem die Cystinreste in Cysteinreste reduziert sind.
3. Verfahren zur Herstellung eines Polypeptids nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß man ß-Urogastron oder y-Urogastron in einem wäßrigen Medium der Einwirkung einer lysinspezifischen Aminoendopeptidase unterwirft und hierauf das gewünschte Polypeptid vom Reaktionsgemisch abtrennt und ggf., sofern ein Reduktionsprodukt gewünscht wird, das so erhaltene Polypeptid mit einem in der Peptidchemie zur Reduktion von Disulfidbindungen üblichen Reduktionsmittel reduziert.
4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß als lysinspezifische Aminoendopeptidas3AM-Protease verwendet wird.
5. Verfahren nach Anspruch 3 oder 4, dadurch gekennzeichnet, daß das Urogastron der Einwirkung des Enzyms bei einer Konzentration von 1 mg/ml aufwärts, bei einem pH-Wert von 6 bis 9, bei einer Temperatur von 20 bis 40°C und bei einem Enzym/Substrat-Verhältnis von 1 Teil Enzym auf 8 Teile Substrat bis 1 Teil Enzym auf 100 Teile Substrat unterworfen wird.

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6. Verfahren nach Anspruch 3, 4 oder 5, dadurch gekennzeichnet, daß das gewünschte Polypeptid vom Reaktionsgemisch durch Gelchromatografie abgetrennt wird.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 3 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Reduktion mit einem Thiol bei einem pH-Wert von 7 bis 10 unter Ausschluß von Sauerstoff und Licht ausgeführt wird.
8. Pharmazeutische Zusammensetzung, dadurch gekennzeichnet, daß sie ein Polypeptid oder ein Reduktionsprodukt nach Anspruch 1 oder 2 sowie ein pharmazeutisch zulässiges Verdünnungsmittel oder Trägermittel enthält.
9. Zusammensetzung nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß sie eine für parenterale Verabreichung geeignete Form aufweist.
10. Zusammensetzung nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß sie die Form einer sterilen, injizierbaren Lösung oder Suspension aufweist.
11. Zusammensetzung nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß sie 0,5 bis 500 pg/ml des Polypeptids oder Reduktionsprodukts enthält.
12. Zusammensetzung nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß sie die Form eines sterilen, injizierbaren Depotpräparats oder eines Präparats mit langsamer Abgabe aufweist.
13- Zusammensetzung nach Anspruch 1-2, dadurch gekennzeichnet, daß sie bis zu 2 mg des aktiven Bestandteils enthält.
14. Pharmazeutische Zusammensetzung, dadurch gekennzeichnet, daß sie ein bekanntes Gewicht eines sterilen Polypeptids oder Reduktionsprodukts nach Anspruch 1 oder 2 aufweist, welches in einen Behälter eingeschlossen ist, der seine Sterilität bewahrt.

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