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Die
vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein neues Verfahren zur Bildung
einer intramolekularen Disulfidbindung in Peptid- oder Peptid-nachahmenden Molekülen.
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Stand der Technik
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Viele
biologisch wirksame Peptide, welche bei der Behandlung verschiedener
Krankheiten nützlich sind,
sind bekannt dafür,
dass sie Disulfidbindungen (1,2) enthalten. Viele von diesen sind
bereits als Pharmazeutika registriert, während andere noch immer im
Entwicklungsstadium sind; einige bedeutende Beispiele von Peptiden
mit Disulfidbindungen sind unten aufgeführt: Octreotid:
Vapreotid:
Eptifibatid:
Somatostatin:
Oxytocin:
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Verfahren,
welche herkömmlicherweise
für die
Bildung von Disulfidbindungen verwendet werden, machen Gebrauch
von linearen Precursoren, welche Cystein oder andere, SH-Gruppen
in freier Form enthaltende Derivate enthalten, welche mittels verschiedener
Oxidationsmittel einem oxidativen Verfahren unterworfen werden.
Diese oxidativen Verfahren wurden in der Literatur (3, 4) eingehend
beschrieben.
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Der
Hauptnachteil der oxidativen Verfahren ist das Inkontaktbringen
des Peptidmoleküls
mit Oxidationsmitteln, was die Bildung von Verunreinigungen zur
Folge haben kann, mit daraus folgenden geringen Verfahrensausbeuten
und Schwierigkeiten bei der Reinigung. Diese Behandlungen können ferner
zur teilweisen Desaktivierung des Peptids vom Standpunkt der biologischen
Wirksamkeit her führen.
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Andere
Nachteile, besonders für
die Zwecke der industriellen Herstellung, entstehen aus dem Umstand,
dass einige dieser Verfahren, ob in der Schätzungsphase oder in der Oxidationsphase
der -SH Gruppe, Reaktanden wie z.B. Schwermetalle, Jod, Kaliumferricyanid,
etc. verwenden, welche entsprechende Beseitigungsverfahren zur Folge
haben.
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Ein
nichtoxidatives Verfahren zur Cyclisierung von Peptiden wurde in
(5) beschrieben. Der grundsätzliche
Nachteil dieses Verfahrens, welches von der Anwesenheit einer vorgebildeten
-S-S-Alkylgruppe Gebrauch macht, liegt in der Notwendigkeit der
entsprechenden Beseitigung der toxischen Gase (Alkylmercaptane),
welche durch die Reaktion freigesetzt werden.
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Es
ist auch bekannt (6), dass die -S-Sulfonatgruppe (Bunte-Salz) mit
den -SH-Gruppen reagiert, um Disulfidbindungen zu bilden; ferner
wurde in diesen in der Literatur bekannten Fällen die -S-Sulfonatgruppe durch
oxidative Sulfitolyse von Cysteinresten in die Peptidmoleküle eingeführt, und
diese Strategie kann nicht auf die Herstellung von cyclischen Peptiden
angewendet werden, welche die gleichzeitige Anwesenheit einer -S-Sulfonatgruppe
und einer freien -SH-Gruppe in demselben Molekül voraussetzt.
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Die
Möglichkeit
des Einführens
von vorgebildeten -S-Sulfonatgruppen während der Synthese von Peptidmolekülen wurde
beschrieben (8). Wir haben nun herausgefunden, und dies ist der
Gegenstand der vorliegenden Erfindung, dass die zweite -SH-Gruppe
in freier Form, welche zur Bildung der intramolekularen Disulfidbindung
notwendig ist, in Gegenwart der -S-Sulfonatgruppe durch selektives
Entfernen einer Schutzgruppe vom Trityl-Typ oder zumindest vom säureempfindlichen
Typ unter geeigneten sauren Bedingungen erhalten werden kann.
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Beschreibung der Erfindung
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Die
vorliegende Erfindung stellt ein neues Syntheseverfahren zur Cyclisierung
von Peptid- oder Peptid-nachahmenden Molekülen mittels der Bildung von
intramolekularen Disulfidbindungen bereit, welches einfach und nicht
oxidativ ist; wobei das Verfahren umfasst:
- (a)
Herstellung eines linearen Precursors, der eine -S-Sulfonatgruppe
und eine geschützte
-SH-Gruppe mit säureempfindlichem
Schutz enthält;
- (b) selektive Freisetzung der -SH-Gruppe in einem wasserfreien,
sauren Medium und in der Gegenwart von geeigneten Carbokationenfängern;
- (c) Cyclisierung, um den teilweise entschützten linearen Precursor bei
einem pH von zwischen 5 und 9 zu lösen.
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Das
Verfahren der vorliegenden Erfindung kann auch auf irgendeine lineare
Peptid- oder Peptid-nachahmende Verbindung angewendet werden, welche
mindestens zwei Cysteine oder andere Reste mit -SH-Gruppen in der
Seitenkette enthält.
Das eine erste -SH-Gruppe (normal ein Cystein) enthaltende Aminosäurederivat
wird zuerst mit einer Schutzgruppe geschützt, welche im Hinblick auf
die S-Sulfonatgruppe selektiv entfernt werden kann; die Schutzgruppen
und die zugehörigen
Verwendungsbedingungen sind im Fachgebiet gut bekannt und sind beschrieben,
zum Beispiel in (7), welches hier durch Bezugnahme eingeschlossen ist;
bevorzugt werden sie aus der Gruppe aus 4-Methoxytrityl (Mmt), 2,4,6-Trimethoxybenzyl
(Tmob), 4,4',4''-Trimethoxytrityl (TmTr), Trityl (Trt),
wobei Trityl (Trt) die besonders bevorzugte Schutzgruppe ist. Die eine
Verbleibende der beiden SH-Gruppen, welche dann verwendet wird,
um die Disulfidbindung zu bilden, wird dann mit der S-Sulfonatgruppe
geschützt;
derartige S-Sulfonatgruppen und die zugehörigen Anwendungsverfahren sind
im Fachgebiet ebenfalls bekannt und werden zum Beispiel in (8) beschrieben,
welches hier durch Bezugnahme eingeschlossen ist.
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In
der Praxis wird das zu cyclisierende Peptid unter Verwendung von
Aminosäurederivaten,
die bereits geschützte
-SH-Gruppen (im Fall von sowohl der säureempfindlichen Schätzung als
auch der Sulfonatgruppe) enthalten, chemisch synthetisiert, um mögliche Selektivitätsprobleme
zu vermeiden.
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Der
nachfolgende Schritt schließt
dann die selektive Enternung der ersten säureempfindlichen Schutzgruppe
ein; auf diese Weise wird ein Peptid erhalten, welches eine freie
-SH-Gruppe und eine durch eine S-Sulfonatgruppe geschützte -SH-Gruppe
umfasst. Allerdings weisen aus dem Stand der Technik bekannte Bedingungen
zur Entfernung der obengenannten Schutzgruppe eine Reihe von Nachteilen
auf; zum Beispiel kann das fehlerhafte Entblocken der Schutzgruppe
die Polypeptidkette schädigen
und besonders auch den durch die Sulfonatgruppe geschützten zweiten
-SH-Rest entblocken.
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Einer
der kennzeichnenden Gegenstände
der vorliegenden Erfindung ist daher der, dass spezifische Reaktionsbedingungen
gefunden wurden, welche im Hinblick auf die durch die Sulfonatgruppe
geschützte SH-Gruppe
ein selektives Entblocken der ersten SH-Gruppe erlauben.
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Nach
einem bevorzugten Gegenstand der vorliegenden Erfindung wird die
selektive Freisetzung der -SH-Gruppe in einem wasserfreien, aprotischen,
unpolaren organischen Lösungsmittel
in Gegenwart von wasserfreier Trifluoressigsäure und einem geeigneten Carbokationenfänger, wie
etwa Triisopropylsilan durchgeführt.
Vorzugsweise ist die Schutzgruppe Trityl und die Entblockungsreaktion
wird in der Gegenwart einer Mischung aus Trifluoressigsäure und
Triisopropylsilan in Volumenverhältnissen
von zwischen 90:10 und 99:1, noch weiter bevorzugt in einem Verhältnis von
etwa 95:5 durchgeführt.
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Die
Reaktionsbedingungen sind mit der Anwesenheit weiterer Fänger, die
in der Lage sind, Carbokationen zu fangen, wie z.B. Anisol, Tryptophan-Derivate
wie z.B. Tryptophanmethyl ester (H-Trp-OMe), und/oder Phenol vereinbar;
die Fänger
werden in Mengen von zwischen 1 und 3, bevorzugt etwa 2 Äquivalenten
bezogen auf das zu cyclisierende Peptid verwendet; Phenol erwies
sich als der Beste von diesen.
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Das
wasserfreie, aprotische, unpolare Lösungsmittel wird schließlich unter
Dichlormethan, Chloroform, Dichlorethan, Trichlorethylen und/oder
Tetrachlorethylen ausgewählt,
wobei Dichlormethan besonders bevorzugt ist. Dieses Lösungsmittel
wird bevorzugt in einer Menge von zwischen 25 und 10 Litern, weiter
bevorzugt zwischen 20 und 15 Litern pro Mol zu cyclisierendem Peptid
verwendet. Das bevorzugte Verhältnis zwischen
Solvens und Trifluoressigsäure
beträgt
ungefähr
2,2:1 pro Volumen.
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Einfaches
Lösen des
eine freie -SH-Gruppe und eine durch eine S-Sulfonatgruppe geschützte -SH-Gruppe
umfassenden Peptids bei einem pH zwischen 5 und 9 führt durch
Verdrängung
der S-Sulfonatgruppe spontan zur Bildung der Disulfidbindung, ohne
dass es andere Recktanten bedarf.
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Wie
in den Tabellen 1 und 2 gezeigt wurden die zeitbezogenen prozentualen
Umsätze,
Reaktionszeiten und Reinheit bei verschiedenen pH-Werten untersucht,
um den pH-Bereich zu bestimmen, innerhalb welchem die Cyclisierung
durchzuführen
ist. Der optimale pH erwies sich zwischen 5 und 9, und insbesondere
ist der verwendete pH pH=8,3.
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In
der Tabelle bezeichnet 8SH die lineare Zwischenstufe, während Octriotid
ein Beispiel für
ein cyclisiertes Peptid mit einer Disulfidbrücke ist. Tabelle 1
| 30' | 90' | 150' |
pH | 8SH
(HPLC A%) | Octreotid (HPLC
A%) | 8SH
(HPLC A%) | Octreotid (HPLC
A%) | 8SH
(HPLC A%) | Octreotid (HPLC
A%) |
pH=3 | 75,9 | 7,4 | 73,8 | 10,3 | 69,9 | 14,5 |
pH=5,6 | 15,3 | 71,4 | 4,4 | 78,2 | 4,0 | 77,4 |
pH=6,9 | 3,0 | 79,3 | 2,7 | 79,0 | 2,5 | 79,0 |
pH=8,3 | 1,7 | 81,5 | 1,5 | 81,3 | 1,4 | 82,1 |
pH=9,2 | 1,5 | 84,1 | 0,7 | 84,2 | 0,7 | 84,2 |
Tabelle 2
pH | Reaktionsende | 8SH
(HPLC A%) | Octreotid
(HPLC A% ) | andere
Verunreinigungen >0,5% (A%) |
pH=3,0 | 72h | 3,6 | 76,4 | 13 |
pH=5,6 | 24h | 3,5 | 78,6 | 12,7 |
pH=6,9 | 24h | 2 | 80,8 | 11 |
pH=8,3 | 24h | 1,2 | 81,9 | 10,9 |
pH=9,2 | 24h | 0,4 | 88,8 | 7,6 |
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Die
Verwendung eines pHs von weniger als 5 führt zu langsamen Reaktionszeiten,
einer unvollständigen
Reaktion und geringer Reinheit. Die Verwendung eines pHs von größer als
9 sollte aufgrund von möglichen
Racemisierungsreaktionen mit der Bildung von schwierig zu identifizierenden
Diastereomeren vermieden werden, welche typisch für Peptide
mit basischem pH (9, 10) sind. Die Verwendung eines pHs von größer als 9
sollte ebenfalls aufgrund möglicher
Disproportionierungsreaktionen vermieden werden, welche die Disulfidbrücken dazu
bringen würden,
zu brechen, was zur möglichen
Bildung von Dimeren oder Oligomeren (11) führen würde.
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Folglich
wird die Bildung der Disulfidbrücken
bevorzugt bei einem pH von zwischen 7 und 9, noch weiter bevorzugt
zwischen 8 und 8,5 durchgeführt.
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Das
Reaktionsmittel ist bevorzugt eine Mischung aus Pufferlösung/aprotischem
organischem Lösungsmittel
bei einem geeigneten pH: der Puffer wird unter Verwendung von Salzen,
wie Natrium- oder Kaliumphosphaten oder Ammoniumacetaten, bevorzugt
Natriumphosphat hergestellt; das aprotische, polare organische Lösungsmittel
wird aus der Gruppe aus Acetonitril, Tetrahydrofuran, Dimethylformamid,
weiter bevorzugt Acetonitril ausgewählt. Das aprotische, polare
organische Lösungsmittel
liegt bevorzugt in einer Menge von 0,5-1,5 Volumina pro Volumen
des wässrigen
Puffers, noch weiter bevorzugt in einer Menge von 0,8-1,2 Volumina
pro Volumen des wässrigen
Puffers vor.
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Die
Reaktion wird außerdem
bevorzugt bei einer Temperatur von zwischen 0 und 50°C, noch weiter bevorzugt
bei einer Temperatur von zwischen 15 und 30°C durchgeführt; die Zeit, die benötigt wird,
um die Cyclisierung durchzuführen
beträgt
normalerweise zwischen 5 Minuten und 24 Stunden, bevorzugt zwischen
5 und 60 Minuten.
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Das
resultierende Peptid kann dann isoliert werden und/oder weiterer
Reinigung mit den Methoden, die normalerweise für die Reinigung von Peptiden
(Phasenumkehr, Innenaustausch, etc.) verwendet werden, unterworfen
werden; insbesondere kann es durch Präzipitieren, zum Beispiel durch
Zugabe von Methyl-tert-butylether (MTBE), Ethylether, n-Hexan oder
n-Heptan zu dem wässrigen
Puffer isoliert werden, wobei Methyl-tert-Butylether besonders bevorzugt
ist. Der lineare Precursor kann in Lösung oder in Festphase, durch sequentielles
Anbringen von Aminosäurederivaten
oder durch Fragmente unter Verwendung von Verfahren, welche in der
Peptidsynthese gut bekannt sind, welche Schutz für die Seitenketten bereitstellen,
und anschließendes
Schützen
und Entschützen
der terminalen Aminogruppe hergestellt werden. Die Carboxyl-Aktivierung ermöglicht es,
aktive Ester, EDC, DCC oder andere typische Peptidsynthese-Verfahren
(10) zu verwenden.
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Das
neue Cyclisierungsverfahren wurde bei der Synthese verschiedener
cyclischer Peptide mit einer Disulfidbindung, wie Vapreotid, Eptifibatid
und Octreotid verwendet. Schema 1 zeigt die Anwendung des Verfahrens
zur Darstellung des Peptids Octreotid rein beispielhaft: Das Peptid
wird durch Cyclisierung des linearen Precursors H-DPhe-Cys(SO3Na)-Phe-DTrp-Lys-Thr-Cys-Thr-ol (8SH) erhalten.
Die folgenden Beispiele sind rein beispielhaft gegeben und schränken die
Erfindung nicht ein.
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Beispiel 1
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Die
Stabilität
der Sulfonat-Schutzgruppe wurde unter Trityl-Entfernungsbedingungen unter Verwendung
von Fmoc-Cys(SO
3Na)-ONa und Fmoc-Cys(Trt)-OH
als Modellprodukte ausgewertet. Die zwei Produkte (100 mg von jedem)
wurden separat in Dichlormethan (1 ml) suspendiert und Trifluoressigsäure (0,5
ml) und Triisopropylsilan (0,05 ml) wurden zugegeben. Die Bildung
von Fmoc-Cys-OH (das Produkt wurde durch Entfernen der Schutzgruppen
erhalten) wurde durch HPLC untersucht. Die Bildung von Fmoc-Cys-OH
wurde unter Verwendung einer Vydac C18 (5 μm) (4,6 × 250)mm Säule ausgewertet.
Eluent
A: H
2O/CH
3CN 90/10
mit 0,1% Trifluoressigsäure
Eluent
B: CH
3CN mit 0,1% Trifluoressigsäure
Gradient:
%B: 10-40 (20 Minuten), 80 (10 Minuten).
Retensionszeit von
Fmoc-Cys(SO
3Na)-ONa = 16,9
Retensionszeit
von Fmoc-Cys(Trt)-OH = 35,0
Retensionszeit von Fmoc-Cys-OH
= 25,3
Fmoc-Cys-OH wurde mittels LC-MS nachgewiesen; [M+H]
+ = 344
Reaktionszeit
[min] | Bildung
von Fmoc-Cys-OH aus Fmoc-Cys(Trt)-OH (A%] | Bildung
von Fmoc-Cys-OH aus Fmoc-Cys(SO3Na)-ONa
(A%) |
0 | 0,00 | 0,00 |
15 | 93,13 | 0,00 |
30 | 93,04 | 0,33 |
60 | 92,65 | 0,62 |
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Nach
15 Minuten war die Entfernung des Trityls von Fmoc-Cys(Trt)-OH praktisch
vollständig,
während keine
Entfernung der Schutzgruppe von Fmoc-Cys(SO3Na)-ONa
beobachtet wurde, abgesehen von einem kleinen Prozentsatz, und das
nur ab 30 Minuten.
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Beispiel 2
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Das
geschützte
Oktapeptid [Boc-DPhe-Cys(SO3Na)-Phe-DTrp-Lys(Boc)-Thr-Cys(Trt)-Thr-ol]
(0,27 mol; 420 g) und Methylenchlorid (4,9 l) wurden in einen 50
Liter-Reaktor eingebracht. Phenol (0,54 mol; 50 g) und Trifluoressigsäure [TFA]
(2,19 l) wurden zugegeben, und die Mischung wurde für 10 Minuten
bei 23°C
gerührt.
Triisopropylsilan [TIS] (1,2 mol; 247 ml) wurden zu der Lösung zugegeben,
und die Mischung wurde für 5
Minuten gerührt.
Zum Schluss wurde Methyl-tert-Butylether (MTBE) (19,7 l) zugegeben,
und die Mischung wurde mindestens 60 Minuten gerührt. Der Feststoff wurde herausgefiltert,
mit MTBE (10,4 l) gewaschen und unter Vakuum bei 30°C mindestens
15 Stunden getrocknet.
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Der
erhaltene Feststoff [2TFA.H-DPhe-Cys(SO3Na)-Phe-DTrp-Lys-Thr-Cys-Thr-ol] wurde
zusammen mit Acetonitril (39,1 l) in einen 100 Liter-Reaktor eingebracht,
und das Gemisch wurde mindestens 5 Minuten bei 23°C gerührt.
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Eine
Phosphat-Pufferlösung,
welche zuvor mit Stickstoff gespült
wurde (39,1 l 0,2 molarer Puffer, hergestellt mit 1394 g Na2HPO4·2H2O, 39,1 l H2O, und
durch Zugabe von H3PO4 auf
pH=8,3 eingestellt), wurde zu dem Reaktionsgemisch zugegeben, und
das Gemisch wurde bei 23°C
unter Stickstoff gerührt,
bis sich die Disulfidbindung bildete. Das Reaktionsgemisch wurde
mit Trifluoressigsäure
(0,731 l) auf pH=3 angesäuert.
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Die
flüchtige
Fraktion wurde unter Vakuum entfernt, dann wurde das NaCl (5,7 kg)
und Tetrahydrofuran (12,6 l) eingebracht. Das Gemisch wurde gerührt, trennen
gelassen, und die Phasen wurden getrennt. Die wässrige Phase wurde mit Tetrahydrofuran
(12,6 l) wieder in den Reaktor eingebracht. Das Gemisch wurde gerührt, trennen
gelassen und die Phasen wurden getrennt. Die vereinigten organischen
Phasen wurden unter einem Vakuum eingeengt, bis ein rührbarer
Rest erhalten wurde. Der Rest wurde dreimal mit Isopropanol (29,7 l)
resuspendiert, dann wurde Isopropanol (3,5 l) zugegeben. Nachdem
die vollständige Entfernung
des Wassers durch Karl Fischer Analyse nachgeprüft wurde, wurde das Salz herausgefiltert
und mit Isopropanol (1,5 l) gewaschen. Die alkoholische Lösung (8,1
l) wurde bei 0°C
tropfenweise zu einem Gemisch aus n-Hexan (60 l) und MTBE (19,9
l) zugegeben. Der Niederschlag wurde mindestens 15 Minuten gerührt. Das
Produkt wurde herausgefiltert, mit n-Hexan (7,5 l) gewaschen, und
unter einem Vakuum bei 30°C
für mindestens
15 Stunden getrocknet.
418 g (0,30 mol) wurden erhalten. LOD:
10%
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Das
Produkt wurde mittels LC-MS nachgewiesen: [M+H]+ =
1019 und HPLC (Nachweis bezogen auf Standard).
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Verwendete HPLC-Methode:
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- Säule:
JUPITER 5 μm
C18300A (4,6 × 250
mm)
- Eluent: A = 10% ACN + 0,1% TFA; B = ACN + 0,1% TFA
- Temperatur: 30°C
- Flussgeschwindigkeit: 1 ml/min
- Gradient: %B = 10-30 (30')-80(10')
- Wellenlänge:
220 nm
- Probe: 1 g/l (eingespritztes Volumen: 20 μl)
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Bibliographische Quellenangaben
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- (1) Handbook of Biochemistry, Seiten C-164 bis C-188
- (2) Brazeau, P., et al., Science, 179, 77, 1973
- (3) Katsoyannis, P. G., The Chemistry of Polypeptides, Plenum
Press, 1974, Seiten 60-85
- (4) Kudryavtseva, E.V., Sidorova, M.V., Ovchinnikov, M.V., Bestpalova,
Z.D. und Bushuev, V.N., Peptide Res., 49, 1997, 52-58
- (5) US-3,929,758 ,
Lawrence et al., 30. Dezember 1975
- (6) Schwartz, G. et al., Biochemistry, 15, 1976, 4071-4076
- (7) Greene et al., Protective Groups in Organic Synthesis, dritte
Auflage, 6tes Kapitel, Wiley Intersience.
- (8) Maugras, I., Gosteli, J., Rapp, E., Nyfeler, R., Int. J.
Peptide Protein Res., 45, 1995, 152-156
- (9) Williams, M.W., Young, G.T., J. Chem. Soc., 27, 1962, 3409
- (10) The Peptides, Editors: E. Gross und J. Meienhofer; Academic
Press, Band 1, 1979
- (11) Andreu D., Albericio F., Solé N., Munson M., Ferrer M.,
Barany G., Methods in Molecular Biology: Peptide Synthesis Protocols;
Band 35, Seite 117: herausgegeben von: M.W. Pennington und B.M.
Dunn, 1994 Humana Press Inc., Totowa, NJ
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