CN101525373A - TGF-β活化反应阻碍物质 - Google Patents

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CN101525373A CN200810100392A CN200810100392A CN101525373A CN 101525373 A CN101525373 A CN 101525373A CN 200810100392 A CN200810100392 A CN 200810100392A CN 200810100392 A CN200810100392 A CN 200810100392A CN 101525373 A CN101525373 A CN 101525373A
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Abstract

本发明的目的在于提供可阻碍TGF－β活化反应的物质，特别是提供可阻碍TGF－β活化反应的肽。通过本发明，提供包含11～50个氨基酸残基的肽，该肽含有Gln－Ile－Leu－Ser－X1－X2－X3－X4－Ala－Ser－Pro(式中X1至X4分别独立地表示任意的氨基酸残基，X1－X2－X3－X4表示Lys－Leu－Arg－Leu以外的、且不被蛋白酶切断的序列)表示的氨基酸序列。

Description

TGF-β活化反应阻碍物质
技术领域
本发明涉及阻碍TGF-β活化反应的物质。
背景技术
转化生长因子(Transforming Growth Factor(TGF)-β)通过强力促进间充质细胞的细胞外基质产生同时抑制上皮细胞的增殖，导致肝纤维化/肝硬化、动脉硬化、肺纤维症、硬皮症、肾机能不全(肾小球肾炎)、骨髓纤维化等硬化性疾病、类风湿性关节炎、增殖性玻璃体视网膜病变等病态；另外由于其抑制皮肤角化细胞的增殖、机能，诱导凋亡，因此与脱毛关系密切；此外其也抑制免疫细胞的机能等，是一种表现出多种生物活性的分子量为25kD的同型二聚体多功能细胞因子。由使用针对TGF-β的中和抗体的动物模型的研究可知，通过抑制TGF-β的功能能够预防、治疗硬化性疾病。例如文献报道可以通过使用TGF-β的中和抗体、TGF-β受体的抗体的抗体疗法或通过使用显性失活TGF-β受体基因或可溶性TGF-β受体基因的基因治疗在入口制止TGF-β的作用(日本特开2004-121001号公报；Schuppan等人，Digestion 59：385-390，1998；Qi等人，Proc Natl Acad Sci USA 96：2345-2349，1999；Ueno等人，Hum Gene Ther 11：33-42，2000)。但是，在抗体疗法或基因治疗中在必要量和给药方法方面存在问题，不能马上在临床应用。因此，进行了基于TGF-β的作用机理的低分子阻碍剂的开发。
本发明的研究者在动物模型上研究发现低分子化合物cytoxazone(サイトキサゾン)通过抑制TGF-β的信号传导通路抑制肝脏疾病的病态形成(国际公开WO2005/039570号)，但是尚未鉴定出Cytoxazone直接作用的靶蛋白。
另外，着眼于TGF-β作为潜活形式被产生出来、由于受到蛋白酶的作用而转换为活性型分子(TGF-β活化反应)，在动物模型上研究显示通过使用低分子合成蛋白酶抑制剂(Okuno等人，Gastroenterology 120：18784-1800，2001)或抗体(日本特开2003-252792号公报；Akita等人，Gastroenterology 123：352-364，2002)阻碍TGF-β的活化反应，有可能能够预防疾病。但是现在的蛋白酶抑制剂的抑制谱宽，用于人体有可能有副作用。另外现在的抗体由于有效浓度比较高，用于人时由于必须要大量纯化抗体，费用可能会比较大。
另外，本发明人在世界范围内首次测定了上述的TGF-β活化反应时被切断的部位，成功制备了识别所述切断面的抗体，并且使用该抗体证明了在人肝疾病中蛋白酶依存TGF-β活化反应在发挥作用(国际公开WO2005/023870号)。
过去，报告了一种由8-17个氨基酸组成的肽，其能在永生化毛乳头细胞株中抑制TGF-β的产生(日本特开2005-239695号公报)，但是没有揭示包括是否抑制基因表达、是否抑制活化反应的作用机制以及在体内的有效性。
另外，美国阿拉巴马大学的Murphy-Ullrich的研究小组通过对糖蛋白血小板反应蛋白1引起的附着型TGF-β活化反应的研究发现，血小板反应蛋白1的第412-415的序列KRFK与LAP的第54-57的序列LSKL结合引起活化，并且发现合成肽KRFK活化TGF-β，而合成肽LSKL抑制TGF-β活化反应(Schultz-Cherry等人，J.Biol.Chem.270：7304-7310，1995；Crawford等人，Cell 93：1159-1170，1998；Ribeiro等人，J.Biol.Chem.274：13586-13593，1999；Murphy-Ullrich and Poczatek Cytokine & Growth Factor Reviews 11：59-69，2000)。作为LAP的第54-57的序列的LSKL，与本发明人测定的纤溶酶切断部位K56-L57一致。血小板反应蛋白1通过与该部分结合或通过蛋白酶切断该部分阻碍该部分与活性型TGF-β1分子间的非共价结合，结果活性型TGF-β1分子从潜在型复合体中释放出来，即该部分为引起TGF-β1活化反应的部分。但是，通过本发明的研究者的重复试验，没有再现合成肽KRFK诱导TGF-β活化反应以及合成肽LSKL抑制TGF-β活化反应。Murphy-Ullrich等揭示了血小板反应蛋白1依存附着型TGF-β活化反应与肺或胰脏的病态形成的关系，但是没有研究与肝病的关系。
发明内容
本发明的课题在于解决上述现有技术的问题。即本发明要解决的技术问题是提供能够阻碍TGF-β活化反应的物质，特别是提供能够阻碍TGF-β活化反应的肽。
本发明人为解决上述技术问题进行了深入研究，在本发明人的TGF-β在肝脏通过称为纤溶酶、血浆激肽释放酶的蛋白酶被活化，从而发挥生物活性这一过去的发现基础上，成功地合成了能够在低浓度稳定地抑制纤溶酶/血浆激肽释放酶依存性TGF-β活化反应的肽，从而完成了本发明。
即，通过本发明提供：
(1)包含11～50个氨基酸残基的肽，该肽含有Gln-Ile-Leu-Ser-X1-X2-X3-X4-Ala-Ser-Pro(式中X1至X4分别独立地表示任意的氨基酸残基，X1-X2-X3-X4表示Lys-Leu-Arg-Leu以外的、且不被蛋白酶切断的序列)表示的氨基酸序列。
(2)如(1)所述的肽，其中X1和X3为碱性氨基酸以外的氨基酸残基。
(3)包含11～50个氨基酸残基的肽，其含有下记的(i)至(iv)中的任意的氨基酸序列。
Gln-Ile-Leu-Ser-Ala-Ala-Ala-Ala-Ala-Ser-Pro    (i)
Gln-Ile-Leu-Ser-Ala-Leu-Ala-Leu-Ala-Ser-Pro    (ii)
Gln-Ile-Leu-Ser-Gln-Gln-Gln-Gln-Ala-Ser-Pro    (iii)
Gln-Ile-Leu-Ser-Gln-Leu-Gln-Leu-Ala-Ser-Pro    (iv)
(4)如(1)～(3)中任一项所述的肽，其长度为11～20个氨基酸残基。
(5)肽，其包含Gln-Ile-Leu-Ser-X1-X2-X3-X4-Ala-Ser-Pro(式中X1至X4分别独立地表示任意的氨基酸残基，X1-X2-X3-X4表示Lys-Leu-Arg-Leu以外的、且不被蛋白酶切断的序列)表示的氨基酸序列。
(6)活性型TGF-β生成抑制剂，其含有(1)～(5)中任一项所述的肽。
(7)用于治疗和/或预防与TGF-β相关的病态的药物，其含有(1)～(5)中任一项所述的肽。
(8)肝再生促进剂或肝纤维化抑制剂，其含有(1)～(5)中任一项所述的肽。
在活体内，特别是在肝脏疾病的病态形成过程中，TGF-β的特定部位被蛋白酶切断，释放出活性型TGF-β。活性型TGF-β诱导肝纤维化/肝硬化，抑制肝细胞的增殖、即肝再生。本发明的肽作为作用于该切断部位的蛋白酶的诱饵，竞争性地抑制TGF-β活化反应，能够高效地抑制与TGF-β相关的病态的形成。
附图说明
图1表示QP肽、QPA肽和T200肽。
图2表示来自TGF-β活化蛋白酶切断序列的肽对肝星状细胞的活化抑制。
图3表示来自TGF-β活化蛋白酶切断序列的肽对肝再生不全的改善(照片)。
图4表示来自TGF-β活化蛋白酶切断序列的肽对肝再生不全的改善(数值化)。
图5表示QPQ肽的序列。
图6表示QP肽和QPQ肽对LAP切断反应的抑制。
图7表示QP肽、QPA肽、QPQ肽、T200肽对培养肝星状细胞的转化的影响的观察结果。
图8表示条件培养基中的活性型TGF-β生成量的测定结果。
图9表示QP肽、QPA肽和QPQ肽对肝再生不全的改善(照片)。
图10表示QP肽、QPA肽和QPQ肽对肝再生不全的改善(数值化)。
图11表示肝组织中的TGF-β1生成量的测定结果。
具体实施方式
以下，详细说明本发明的实施方式。
转化生长因子(Transforming Growth Factor(TGF)-β)与各种硬化性疾病、类风湿性关节炎、增殖性玻璃体视网膜病变的病态形成相关、与脱毛关系密切、抑制免疫细胞的机能；另外它也能通过抑制蛋白酶的过量产生而防止肺组织分解而导致肺气肿、抑制癌细胞的增殖等，是一种显示多种生物活性的分子量为25kD的同型二聚体多功能细胞因子。人类存在TGF-β1-β3的3种异构体(isoform)。TGF-β作为不能与受体结合的分子量约300kD的无活性潜在型产生，在靶细胞表面或其周围被活化，成为能与受体结合的活性型，进而发挥作用。
TGF-β对靶细胞的作用通过称为Smad的担当信号传导的一系列蛋白的磷酸化通路传达。首先，活性型TGF-β与靶细胞表面存在的II型TGF-β受体结合，形成包含2分子II型受体与2分子I型TGF-β受体的受体复合物，II型受体将I型受体磷酸化。接着，磷酸化的I型受体将Smad2或Smad3磷酸化，磷酸化的Smad2或Smad3与Smad4形成复合物，转移至核，与目标基因启动子区域存在的称为CAGA box的靶序列结合，与辅激活物一同诱导靶基因的转录表达。
本发明人发现潜在型TGF-β在肝脏由于蛋白酶的切断而活化，发挥出强的纤维形成诱导能力、肝细胞增殖抑制能力，因此导致肝纤维化/肝硬化、肝再生不全(肝再生不全)；并且报道了使用蛋白酶抑制剂抑制TGF-β的活性能够抑制病态形成(Okuno M等，Gastroenterology 2001；120：1784-1800；Akita K等，Gastroenterology 2002；123：352-364)。基于以上认识，报道了使用抗蛋白酶的抗体的治疗法(日本特开2003-252792号公报)。接着，将抑制TGF-β的信号传导的物质与抑制TGF-β活化的蛋白酶抑制剂并用，以期能够取得协同的病态形成抑制效果，筛选TGF-β信号传导抑制物质。结果，发现了具有噁唑烷酮环的cytoxazone，报告了使用cytoxazone的基于抑制TGF-β的信号转导通路的TGF-β相关疾病的治疗法、预防法(国际公开WO2005/039570号公报)。
另外，测定了在蛋白酶依存TGF-β活化反应的过程中纤溶酶、血浆激肽释放酶所切断的位点为潜在型TGF-β1分子的N末端侧LAP(Latency associatedprotein)序列的Lys56和Leu57之间以及Arg58和Leu59之间，成功制备了特异性识别切断面的抗体，即病态·组织·异构体特异性活化反应识别抗体(国际公开WO2005/023870号公报)。本发明确认含有潜在性TGF-β1分子中的纤溶酶、血浆激肽释放酶的切断位点Lys56与Leu57以及Arg58和Leu59的包含由Gln52至Pro62的11个氨基酸的序列的合成肽(称其为QP肽)、将Lys56与Leu57以及Arg58和Leu59全部替换为Ala使其不被蛋白酶切断的变异肽(称其为QPA肽)、将Lys56与Leu57以及Arg58和Leu59全部替换为Gln使其不被蛋白酶切断的变异肽(称其为QPQ肽)通过竞争性抑制纤溶酶/血浆激肽释放酶依存TGF-β活化反应，在低浓度稳定抑制活性型TGF-β的生成，抑制肝病的病态形成，奠定了基于TGF-β活化反应的特异性抑制的TGF-β相关疾病的治疗法、预防法开发的基础。
本发明的肽为含有Gln-Ile-Leu-Ser-X1-X2-X3-X4-Ala-Ser-Pro表示的氨基酸序列、包含11～50个氨基酸残基的肽。上式中X1至X4分别独立地表示任意的氨基酸残基，可列举天然型的20种氨基酸(甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、丝氨酸、苏氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、赖氨酸、精氨酸、胱氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、组氨酸、脯氨酸)。但是X1-X2-X3-X4表示Lys-Leu-Arg-Leu以外的、且不被蛋白酶切断的序列。
为了使其不易受到TGF-β活化蛋白酶的活性的影响，优选X1和X3为碱性氨基酸以外的氨基酸残基。此处，碱性氨基酸表示赖氨酸、精氨酸、组氨酸。
本发明的肽的长度为1150个氨基酸残基即没有特别的限制；优选1130个氨基酸残基；更优选11～20个氨基酸残基；进一步优选11～15个氨基酸残基；特别优选11个氨基酸残基。
本发明的肽比11个氨基酸长时，向Gln-Ile-Leu-Ser-X1-X2-X3-X4-Ala-Ser-Pro表示的氨基酸序列的N末端侧和/或C末端侧附加氨基酸序列。作为附加的氨基酸序列可以选择以下记载的TGF-β1、TGF-β2或TGF-β3的画了下划线的氨基酸序列的N末端侧和/或C末端侧的氨基酸序列或其一部分。例如，当为TGF-β1时，Gln-Ile-Leu-Ser-X1-X2-X3-X4-Ala-Ser-Pro表示的氨基酸序列的N末端侧可以附加G、RG、IRG、AIRG、EAIRG、IEAIRG、RIEAIRG、KRIEAIRG、RKRIEAIRG、KRKRIEAIRG、VKRKRIEAIRG、LVKRKRIEAIRG、ELVKRKRIEAIRG、MELVKRKRIEAIRG、DMELVKRKRIEAIRG、IDMELVKRKRIEAIRG、TIDMELVKRKRIEAIRG、KTIDMELVKRKRIEAIRG、CKTIDMELVKRKRIEAIRG或TCKTIDMELVKRKRIEAIRG表示的氨基酸序列。同样，当为TGF-β1时，Gln-Ile-Leu-Ser-X1-X2-X3-X4-Ala-Ser-Pro表示的氨基酸序列的C末端侧可以附加P、PS、PSQ、PSQG、PSQGE、PSQGEV、PSQGEVP、PSQGEVPP、PSQGEVPPG、PSQGEVPPGP、PSQGEVPPGPL、PSQGEVPPGPLP、PSQGEVPPGPLPE、PSQGEVPPGPLPEA、PSQGEVPPGPLPEAV、PSQGEVPPGPLPEAVL、PSQGEVPPGPLPEAVLA、PSQGEVPPGPLPEAVLAL、PSQGEVPPGPLPEAVLALY、PSQGEVPPGPLPEAVLALYN表示的氨基酸序列。当为TGF-β2或TGF-β3时，可以以下记氨基酸序列为基础，同样地附加氨基酸序列。
TGF-β1
(N末端)-TCKTIDMELVKRKRIEAIRG-QILSKLRLASP-PSQGEVPPGPLPEAVLALYN-(C末端)(SEQ ID NO.6)
TGF-β2
(N末端)-TCSTLDMDQFMRKRIEAIRG-QILSKLKLTSP-PEDYPEPEEVPPEVISIYNS-(C末端)(SEQ ID NO.7)
TGF-β3
(N末端)-TCTTLDFGHIKKKRVEAIRG-QILSKLRLTSP-PEPTVMTHVPYQVLALYNST-(C末端)(SEQ ID NO.8)
对本发明的肽中的氨基酸残基的种类没有特别限制，天然型氨基酸残基、非天然型氨基酸残基、或它们的衍生物均可。即氨基酸可以是L-氨基酸，也可以是D-氨基酸，还可以是它们的混合物。另外氨基酸的种类可以是α-氨基酸、β-氨基酸、γ-氨基酸、δ-氨基酸的任意一种，但优选作为天然型氨基酸的α-氨基酸。
本说明书所述非天然型氨基酸是指构成天然型蛋白质的20种天然型氨基酸(甘氨酸、L-丙氨酸、L-缬氨酸、L-亮氨酸、L-异亮氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-天冬氨酸、L-谷氨酸、L-天冬酰胺、L-谷氨酰胺、L-赖氨酸、L-精氨酸、L-胱氨酸、L-蛋氨酸、L-苯丙氨酸、L-酪氨酸、L-色氨酸、L-组氨酸、L-脯氨酸)以外的全部氨基酸。具体而言，例如可以举出：(1)天然型氨基酸中的原子被其它物质置换(置換)的非天然型氨基酸；(2)天然型氨基酸的侧链的旋光异构体(光学異性体)；(3)天然型氨基酸的侧链导入取代基的非天然型氨基酸以及(4)将天然型氨基酸的侧链进行取代，使疏水性、反应性、带电状态、分子的大小、氢结合能等发生变化得到的非天然型氨基酸等。
本说明书所述氨基酸的“衍生物”是指进行了化学修饰和生物学修饰等的氨基酸的衍生物。修饰的例子可以举出例如烷基化、酯化、卤素化、或氨基化等的官能团的导入、氧化、还原、加成或脱离等引起的官能团变换、糖化合物(单糖、二糖、寡聚糖或多糖)或脂质化合物等的导入、磷酸化或生物素化等，但不限于这些。
上述的本发明的肽的形态可以是游离形态，也可以以酸加成盐或碱加成盐形式提供。作为酸加成盐，可以举出例如盐酸盐、硫酸盐、硝酸盐、磷酸盐等无机酸盐；或者对甲苯磺酸盐、甲磺酸盐、柠檬酸盐、草酸盐、马来酸盐、酒石酸盐等有机酸盐。作为碱加成盐，可以举出例如钠盐、钾盐、钙盐、镁盐等金属盐；铵盐；甲基铵盐、三乙基铵盐等有机铵盐。有时也与甘氨酸等氨基酸形成盐。另外也有在分子内形成平衡离子的情况。
另外，肽或其盐有时作为水合物或溶剂化物存在。上述肽具有多个不对称碳。对各不对称碳的立体构型没有特殊限制，但优选氨基酸残基为L-氨基酸。基于这些不对称碳的旋光体(光学活性体)、非对映异构体等立体异构体、立体异构体的任意混合物、外消旋体等均包含在本发明的范围内。
本发明的肽可以通过本领域技术人员公知的常规方法合成。例如可以举出叠氮法、酰氯法、酸酐法、混合酸酐法、DCC法、活性酯法、羰基咪唑(カルボイミダゾ一ル)法、氧化还原法等。另外，其合成可以使用固相合成法和液相合成法中的任意一种。即可以通过使能构成本发明的肽的氨基酸与其余部分缩合，生成物有保护基时使保护基脱离来合成目的肽。缩合方法、保护基的脱离可以使用公知的任意方法(例如可以参照Bodanszky M and M.A.Ondetti，PeptideSynthesis，Interscience Publishers，New York(1966)、Schroeder and Luebke，The Peptide，Academic Press，New York(1965)、泉屋信夫等，肽的合成的基础和实验，丸善(1975)等)。
反应后可以组合使用通常的纯化法，例如溶剂提取、蒸馏、柱色谱、液相色谱、重结晶等来纯化本发明的肽。另外本发明的肽的C末端通常是羧基(-COOH)或羧酸根(-COO-)，但C末端也可以是酰胺(-CONH2)或酯(-COOR)。作为酯中的R，可列举碳原子数为1-12的烷基、碳原子数为3-10的环烷基、碳原子数为6-12的芳基、碳原子数为7-12的芳烷基等。本发明的肽也包含N末端的氨基被保护基保护的肽或结合着糖链的糖肽等的复合肽等。
本发明的肽的其它的制造方法可以是例如利用编码本发明的肽的氨基酸序列的基因，采用遗传工程的手法在微生物细胞、植物细胞、动物细胞等宿主生产重组蛋白质(肽)的方法。得到的重组肽可以采用凝胶过滤、反相HPLC、离子交换柱纯化等通常的用于纯化蛋白质或肽的方法来进行纯化。
本发明的肽由于显示TGF-β产生抑制作用，能够作为TGF-β产生抑制剂使用。另外，本发明的肽由于显示TGF-β产生抑制作用，能够用作治疗和/或预防与TGF-β相关的疾病的药物。例如，能够用作肝再生促进剂或肝纤维化抑制剂。作为与TGF-β相关的疾病，可以举出例如伴随着组织(肺、肝脏、肾脏、皮肤等)的纤维化的疾病，具体可以举出例如肺纤维化、肝硬化、肾疾病(肾炎、肾硬化病)、血管再狭窄、动脉硬化症、牛皮癣、硬皮病、先天性过敏症(アトピ一)、瘢痕瘤或关节炎等。
另外本发明的肽可以直接或以含有药物制造领域通常使用的各种固体载体、液体载体、乳化分散剂等的形式作为药物使用。具体而言，将本发明的肽以医药组合物的形态使用时，其制剂形态可以根据使用目的或使用对象适当选择，例如可以举出片剂、丸剂、散剂、溶液剂、混悬剂、乳剂、颗粒剂、胶囊剂、栓剂、注射剂(溶液剂、混悬剂等)等形态。
另外，作为形成片剂时使用的载体，可以使用例如乳糖、白糖、氯化钠、葡萄糖、尿素、淀粉、碳化钙、高岭土、结晶纤维素、硅酸等赋形剂；含有水或醇类的淀粉、明胶、羧甲基纤维素钠(CMC-Na)、甲基纤维素(MC)、羟基丙基纤维素(HPC)、羟丙基甲基纤维素(HPMC)、磷酸钙、聚乙烯吡咯烷酮等粘合剂；干燥淀粉、琼脂粉、昆布多糖粉、碳酸氢钠、碳酸钙、聚氧乙烯脱水山梨糖醇脂肪酸酯、十二烷基硫酸钠、硬脂酸单甘油酯、淀粉、乳糖等崩解剂；白糖、甘油三硬脂酸酯、可可粉、氢化油糖(水素添加油糖)的崩解控制剂；季胺碱、十二烷基硫酸钠、胶体状硅酸等吸附剂；纯化滑石、硬脂酸盐、硼酸粉、聚乙二醇等润滑剂等。进一步地根据需要可以将片剂制成包有通常的包衣的片剂，例如糖衣片、明胶包衣片、肠溶包衣片或双层片、多层片。
另外将本发明的肽制成注射剂时，优选将溶液剂、乳剂和混悬剂进行杀菌，且与血液等张等；形成这些形态时，可以使用水、乙醇、丙二醇、乙氧基化异硬脂醇、聚氧化异硬脂醇(ポリオキシ化イソステアリルアルコ一ル)、聚氧乙烯脱水山梨糖醇脂肪酸酯类等稀释剂；另外根据需要，可以配合使用亚硫酸氢钠、焦亚硫酸钠等稳定剂、羧甲基纤维素、藻酸钠、单硬脂酸铝等混悬剂、氯化钠、葡萄糖、甘油等等张剂、对羟基苯甲酸酯、苯甲醇、氯丁醇等保存剂，另外还可配合使用溶液辅助剂、缓冲剂、无痛化剂等。
上述各形态的医药组合物中，根据需要可以进一步地配合使用惯用的着色剂、香料、调味剂、甜味剂等，另外也可以含有其它药物有效成分。将本发明的肽用作药物时，使用时一般使其在药物中含有0.001-90重量％，优选0.001-80重量％。
本发明的肽，可以施与包括人类的哺乳动物。给药途径可以是经口施与也可以是非经口施与。本发明的肽的给药量应当根据患者的年龄、性别、体重、症状以及给药途径等条件的不同进行适宜的增减。一般而言，作为有效成分量，成人一日为1μg/kg～1,000mg/kg左右的范围，优选10μg/kg～100mg/kg左右的范围。上述的给药量可以一日一次施与也可以一日分成数次施与。另外给药时间以及给药间隔没有特别的限制，可以每天给药也可以间隔数日给药。
以下通过实施例进一步具体说明本发明，但本发明不受实施例的限定。
实施例
实施例1：QP肽和QPA肽对肝星状细胞的活化抑制
按照已知的方法(Okuno M等，Gastroenterology 2001；120：1784-1800)自雄性Wistar大鼠(体重350-400g；Japan Clea)的肝脏分离肝星状细胞，在每个3.5cm塑料培养皿中布放1×106个细胞，在1ml含有10％胎牛血清(FCS；GIBCO公司制造)的Dulbecco’s Modified Eagle培养基(DMEM；SIGMA公司制造)中培养。
自分离肝星状细胞第一日起，向培养液中添加QP肽(Gln-Ile-Leu-Ser-Lys-Leu-Arg-Leu-Ala-Ser-Pro)(SEQ ID NO.9)、QPA肽(Gln-Ile-Leu-Ser-Ala-Ala-Ala-Leu-Ala-Ser-Pro)(SEQ ID NO.10)以及作为对照的、偏离本发明人发现的TGF-β活化控制区域(Gly51～Arg110)(国际公开WO2005/023870号公报)的预想对TGF-β活化反应没有影响、并且报告具有TGF-β活化能力的不含有丝氨酸蛋白酶、基质蛋白酶(近藤等，日本血栓止血学会志，2003：14：210-219；Annes等J Cell Sci 2003；116：217-224)的一般切断序列的包含11个氨基酸的潜在型TGF-β1 LAP序列的合成肽(Thr-Gly-Val-Val-Arg-Gln-Trp-Leu-Ser-Arg-Gly；将其称为T200肽)(SEQ ID NO.11)(参见图1)，持续培养7天，在显微镜下观察各肽对通过在塑料培养皿上培养诱发的肝星状细胞的转化(也称为肝星状细胞的活化)的影响。
各肽配制成60mM储备水溶液，溶解于培养基使终浓度为1mM。至分离第3日，在含有10％FCS的DMEM培养基中处理，在第4日将培养基换成含有终浓度为1mM的各肽的加入0.1％牛血清白蛋白(BSA)的DMEM，将进一步培养2-4日的培养基作为条件培养基回收，用PROMEGA公司制造的ELISA试剂盒对条件培养基中存在的活性型TGF-β1的量进行定量，同时用显微镜(DMIRB；Leica公司制造)观察细胞的形态，并拍摄照片。
通过显微镜得到的观察结果示于图2。如图2所示，QPA肽显著抑制肝星状细胞的活化(伴有含有维生素A的油滴的消失的形态变化)。与此相对，QP肽显示弱的抑制效果，T200肽没有显示抑制效果。
进一步地，条件培养基中的活性型TGF-β生成量的测定结果示于表1。如表1所示，QPA肽显著地将条件培养基中的活性型TGF-β量降低至对照的1/55(2％)。与此相对，没有观察到显著的星状细胞活化抑制活性的T200肽将条件培养基中的活性型TGF-β量减少至对照的74％。
表1：来自TGF-β活化蛋白酶切断序列的肽对伴有肝星状细胞活化的活性型TGF-β1生成的抑制
由以上结果可知，QPA肽抑制纤溶酶/血浆激肽释放酶引起的TGF-β活化反应，抑制肝星状细胞的活化。
实施例2：QP肽和QPA肽对肝再生不全的改善
接着，使用已经证明血浆激肽释放酶依存TGF-β活化反应为其原因的肝再生不全的动物模型，即内毒素(LPS)前施与部分肝切除肝再生不全模型小鼠(Akita等.，Gastroenterology 2002；123：352-364)，进行评价QP肽和QPA肽在体内的效果的动物实验。
试验引入26只出生后五周龄的雄性C3H/HeN系小鼠。在检疫、环境驯化后按照分组当天的体重分组如下。即分成施与盐水(Saline)的盐水施与组(G1：n＝6)、施与LPS的盐水施与组(G2：n＝6)、施与LPS的QP肽施与组(G3：n＝4)、施与LPS的QPA肽施与组(G4：n＝4)和施与LPS的T200肽施与组(G5：n＝6)的5组(表2)。
试验开始后，腹腔内施与LPS 7μg(G1为盐水)，48小时后对全部小鼠进行肝脏部分切除。再过48小时后，将生存的供试动物全部剖检。剖检时，在采血后，将各组1-3只在用4％多聚甲醛(PFA)进行全身灌流后摘出肝脏，将全叶用包埋剂“Tissue Mount”冷冻包埋。另外对于剩余的1-3只，不进行全身灌流，一部分用福尔马林固定，其余采取后作为冷冻试样(mRNA用和蛋白定量用)。对于进行了福尔马林固定的脏器，制成块，与冷冻试样一起在-80℃的低温冰箱保存。
表2：试验组的构成
Figure A20081010039200141
试验材料和方法如下。
1.诱发物质
1.1诱发物质
名称：：脂多糖类(Lipopolysaccharides)(LPS；来自Escherichia coli 0111：B4)(SIGMA公司制)
保存方法：冷藏、遮光、密闭
1.2溶剂
名称：灭菌生理食盐水(大
Figure A20081010039200142
制药株式会社制)
2.受试物质
2.1QP肽
名称：TGF-β1 LAP肽
氨基酸序列：N-52QILSKLRLASP62-C
保存方法：冷藏
2.2QPA肽
名称：TGF-β1 LAP肽(N-52QILSKLRLASP62-C的突变肽)
氨基酸序列：N-52QILSAAAAASP62-C
保存方法：冷藏
2.3T200肽
名称：TGF-β1LAP肽(与活化反应无关的部分的肽)
氨基酸序列：N-200TGVVRQWLSRG210-C
保存方法：冷藏
3.供试动物
动物种：小鼠
系统：C3H/HeN Slc
供给源：日本エスエルシ一株式会社，静冈
微生物学品质：无特定病原(Specific Pathogen Free，SPF)
性别：雄
周龄：引入时5周龄(供试时6周龄)
4.动物的饲养管理
在将引入的动物在新的饲养环境驯化的同时，从笼子外面以能够确认的程度每天观察动物的状态，确认其一般状态(一般状態)良好。
饲养时间：引入后5天
试验时间：8天
5.供试动物的分组
5.1实施时间：动物引入7天后
5.2分组方法
考虑动物引入5天后的全部动物的体重，使用分组系统·Statlight#11分组(ユツクムス株式会社，东京)按照随机分组法进行分组。
5.3笼子的识别
粘贴写明组名、试验编号、系统名、施与样品名、有无灌流、个体编号、引入编号和笼子编号的标签。
6.动物的识别
分组后，进行单饲养(単飼育)。由于可以通过笼子进行识别，故此不再进行各个体的识别。
7.诱发物质的施与
7.1LPS施与样品的配制
配制频率：1次(用时配制)
配制方法：向1只装入5mg LPS的小瓶(バイアル瓶)中添加少量的盐水使其溶解。接着转移至其它容器，继续添加盐水至总量为5ml。此为1μg/μl的溶液。自该溶液准确量取350μl，将其加入装入了4.65ml灭菌生理食盐水(溶剂)的容器。随后用0.22μm的滤器灭菌过滤后，作为施与样品。
7.2LPS施与方法
施与量：7μg/头
施与路径：腹腔内施与
施与容量：0.1ml头
施与次数：1次(单次)
施与时间：肝部分切除48小时前
对象动物：G2～G5(G1施与盐水)
8.受试物质的施与
8.1肽施与样品的配制
配制频率：1次
配制方法：用盐水溶解，使达到2mg/ml，用作施与样品。
保存方法：使用前在冰箱(设定为4℃)保存。
8.2肽的施与方法
施与量：200μg/头
施与路径：静脉内施与
施与容量：0.1ml/头
施与时间：肝部分切除的50、38、24、14、2小时前以及10、24、34小时后
施与次数：2次/日，4天(原则上9:00和19:00)，计8次。
对象动物：G3～G5(G1、G2施与盐水)
9.肝部分切除(2/3partial hepatectomy；PH)
9.1处置方法
将小鼠进行乙醚吸入麻醉，自胸部至腹部剃毛，背位固定后用聚烯吡酮碘消毒手术部皮肤。切开腹部，自切开口取出肝外侧左叶、内侧右叶、内侧左叶至体外，用线系住这些肝叶的根部，切除取出至体外的肝脏。擦去血液，用キフア一ホツチキス封闭腹部，用聚烯吡酮碘消毒皮肤，处置完成。
9.2处置只数：全部26只
9.3处置时间：LPS施与48小时后
10.一般状态观察和体重测定
10.1一般状态观察
试验开始后，每日一次，观察全部个体的一般状态，发现异常时进行详细记录。
10.2体重测定
试验开始后，每日一次以上测定全部个体的体重，保存记录(打印纸)，进行统计。
11.剖检
11.1剖检时间：PH48小时后
11.2剖检方法
通过腹腔内施与戊巴比妥钠40mg/kg将小鼠麻醉后，用未处理注射器通过腹部大动脉尽可能采集血液，使其失血致死。
采血后，将各组1-3只在用4％PFA进行全身灌流后摘出肝脏，全叶用包埋剂“Tissue Mount”冷冻包埋。另外对于其余的1-3只，不进行全身灌流，一部分用10％中性缓冲福尔马林液浸渍固定，其余作为冷冻试样(mRNA用和蛋白定量用)在液氮中冷冻。
11.3血液的处理
将血液在采血后1小时内用3,000r.p.m，10分钟冷却(设定为4℃)离心分离。采集血清至其它容器，冷冻保存(设定为-80℃)至提出时。
12.病理组织标本的制作
制作脏器：肝脏
制作标本：石蜡块
制作方法：10％中性缓冲福尔马林液固定后，将肝脏切出，按照常规方法进行脱水、石蜡包埋。
13.组织切片的制作和染色
将包埋的肝组织用轮转式切片机(Leica社)制成厚度为5μm的肝组织切片。增殖细胞核抗原PCNA(Proliferating Cell Nuclear Antigen；增殖细胞的标记)的染色使用ヒストフアイン试剂盒(ニチレイバイオサイレンス社)按照已经报道(Greenwell A等，Cancer lett 1991；59：251-256)的方法进行。即按照试剂盒所附带的说明书，将除去石蜡的肝组织切片(厚度5μm)按照以下的操作进行染色。
·在95℃水浴中与柠檬酸缓冲液pH6温育10分钟。
·在室温与3％过氧化氢水温育20分钟。
(以下，在加湿室内、室温)
·与试剂盒附带的封闭缓冲液温育60分钟。
·与小鼠抗大鼠PCNA单克隆抗体(Dako社制)原液温育10分钟(一抗)。
·与试剂盒附带的封闭缓冲液温育10分钟。
·与试剂盒附带的单染色小鼠MAX-PO(M)温育10分钟(二抗)。
·与二氨基联苯胺四盐酸盐(DAB)混合液(ベクタ-社制)温育4分30秒使其显色。
*上述各操作步骤之间分别用PBS洗涤3次。
·与苏木精溶液(ムト一化学药品社製)温育20秒，与四硼酸钠溶液温育1分钟，进行核的对比染色后用Milli Q过滤水洗净。
用Leica社制DMIRB显微镜以200x倍率观察，拍摄照片，同时，以n＝8对各标本的PCNA阳性细胞百分率进行评价。
14.肝组织TGF-β1量的测定
按照Okuno M等的方法(Okuno M等，Gastroenterology 2001；120：1784-1800)由11.2中为蛋白质定量用制备的肝组织约100mg配制肝提取液，用PROMEGA社制的ELISA试剂盒对提取液中存在的TGF-β1的量进行定量。TGF-β的量以pg/mg蛋白质量表示。
(一般状态的观察结果)
对于施与LPS的组，施与12小时后的观察确认自发运动的减少以及立毛。其后随时间的推移这些症状有所恢复，至PH处置前完全恢复。PH处置后，观察到一部分个体出现蹲伏、自发运动减少、体温降低和驼背(円背位)的症状，也确认了死亡例。认为这些症状是PH处置的影响。
(染色结果)
染色结果如图3所示。通过向小鼠施与QP肽、QPA肽，明显改善了LPS前施与诱发的肝再生不全(已经证明血浆激肽释放酶依存性TGF-β活化反应是其原因)。与此相对，T200肽没有显示改善效果。
(定量结果)
将上述的染色结果用PCNA阳性肝细胞百分率进行定量，结果如图4所示。通过向小鼠施与QP肽，LPS前施与诱发的肝再生不全(PCNA阳性细胞的比率从40％减少至25％，已经证明血浆激肽释放酶依存性TGF-β活化反应是其原因，Akita等人，Gastroenterology 123：352-364，2002)得到完全改善。进一步地，施与QPA肽得到了PCNA阳性细胞的比率提高至47％的结果，显示具有肝再生不全改善效果和肝再生促进效果。与此相对，T200肽完全没有显示改善效果。
(肝组织TGF-β1量定量结果)
肝组织中的TGF-β1生成量的测定结果如表3所示。通过LPS前施与，肝组织TGF-β1量提高至对照组的值的约6.5倍；QPA肽将其减少至对照组的值的约1.4倍。与此相对，T200肽仅将TGF-β1量减少至对照组的值的约3倍。
表3：来源于TGF-β活化蛋白酶切断序列的肽对与肝再生不全相伴随的肝组织TGF-β1生成的抑制
Figure A20081010039200191
(总结·考察)
以上的结果显示，作为TGF-β活化蛋白酶引起的来自潜在型TGF-β1的LAP部分的切断序列的肽的QP肽和QPA肽，在低浓度抑制作为肝病原因的蛋白酶依存性TGF-β活化反应，抑制活性型TGF-β的生成，改善肝再生。就其效果而言，QPA肽比QP肽强。其原因是QPA肽不被蛋白酶所切断，可以在更低浓度安全且有效地发挥阻碍活性。期待QPA肽切断对照组的内源性基础TGF-β活化反应。通过使用本肽，使在现有技术中困难的稳定地抑制TGF-β活化反应成为可能，可期待本肽及其衍生物被开发为针对以各种硬化性疾病为代表的TGF-β相关疾病的预防药、治疗药。
实施例3
QP肽、和QPQ肽对LAP切断反应的阻碍
在将重组人LAP(R&D社)2μg(终浓度66μg/ml)与终浓度20μg/ml的血浆激肽释放酶(SIGMA社制)温育时，添加终浓度为2.5mg/ml的QP肽、QPA肽、T200肽、QPQ肽(SEQ ID NO.4)，在37℃温育40分钟后，通过采用13.5％聚丙烯酰胺凝胶的电泳(室温，27mA，50分钟)，分离LAP(分子量41kDa)和LAP分解产物(分子量38kDa)以及作为添加剂使用的BSA(终浓度0.3mg/ml，分子量80kDa)。将用半干转印装置分离的各蛋白质、分解产物转印至PVDF膜，按照秋田等人的方法(Gastroenterology 123；352-364，2002)，与终浓度为5μg/ml的抗LAP小鼠单克隆抗体(R&D社)或终浓度为20μg/ml的抗L59切断面识别小鼠单克隆抗体(自制，国际公开WO2005/023870号公报)在室温温育60分钟后，与终浓度为1μg/ml的辣根过氧化物酶结合山羊抗小鼠二次抗体(JacksonImmunoResearch Laboratories社)在室温反应60分钟，用ECL plus试剂(GEHealthcare社)使其显色，对各肽对LAP带的减弱以及LAP分解产物生成的影响进行半定量(图6)。
结果显示，QP肽明显抑制LAP的切断反应(板A出现的LAP带的减弱以及板B出现的LAP分解产物生成)(第3泳道)；与QP肽相比，QPQ肽更强地阻碍LAP的切断反应(第6泳道)；与此相对，QPA肽和T200肽显示弱的阻碍效果(第4泳道；第5泳道)。
实施例4
按照实施例1记载的方法，观察QP肽、QPA肽、QPQ肽和T200肽对通过在塑料培养皿上培养诱发的培养肝星状细胞的转化的影响。
将各肽溶解于培养基，使终浓度为0.5mM(约500μg/ml)。至分离第1日，在含有10％FCS的DMEM培养基中处理，在第2日，将培养基换成含有终浓度为0.5mM的各肽的加入0.1％BSA的DMEM，将进一步培养2-7日的培养基作为条件培养基回收，用PROMEGA公司制造的ELISA试剂盒对条件培养基中存在的活性型TGF-β1的量进行定量，同时用显微镜(DMIRB；Leica公司)观察细胞的形态并拍摄照片。
通过显微镜得到的观察结果示于图7。如图7所示，QP肽、QPA肽、QPQ肽显著抑制肝星状细胞的活化(伴有含有维生素A的油滴的消失的形态变化)。特别是QPQ肽显示出最强的抑制效果。与此相对，T200肽没有显示抑制效果。
此时的条件培养基中的活性型TGF-β生成量的测定结果示于图8。如图8所示，QP肽、QPA肽、QPQ肽分别抑制对照组细胞条件培养基中的活性型TGF-β生成的55％、25％和90％。
由以上结果可知，QPQ肽比QPA肽更强地抑制纤溶酶/血浆激肽释放酶引起的TGF-β活化反应，抑制肝星状细胞的活化。
实施例5：
QP肽、以及QPA肽、QPQ肽对肝再生不全的改善
以下，按照实施例2记载的方法，使用LPS前施与部分肝切除肝再生不全模型小鼠，进行评价QP肽、以及QPA肽、QPQ肽、T200肽在体内对肝再生不全模型的效果的动物实验。
试验引入26只出生后五周龄的雄性C3H/HeN系小鼠。在检疫、环境驯化后按照分组当天的体重如表4分组。即分成施与盐水的盐水施与组(G1：n＝8)、施与LPS的盐水施与组(G2：n＝8)、施与LPS的QP肽施与组(G3：n＝8)、施与LPS的QPA肽施与组(G4：n＝8)、施与LPS的QPQ肽施与组(G5：n＝8)和施与LPS的T200肽施与组(G6：n＝8)的6组。
表4：
Figure A20081010039200221
试验开始后，腹腔内施与LPS 7μg(G1为盐水)，48小时后对全部小鼠进行肝脏部分切除。再过48小时后，将生存的供试动物全部剖检。剖检时，在采血后，将各组4只在用4％PFA进行全身灌流后摘出肝脏，全叶用包埋剂“TissueMount”冷冻包埋。另外对于剩余的4只，不进行全身灌流，一部分用福尔马林固定，其余采取后作为冷冻试样(mRNA用和蛋白定量用)。对于进行了福尔马林固定的脏器，制成块，与冷冻试样一起在-80℃的低温冰箱保存。
受试物质
QPQ肽
名称：TGF-β1肽
氨基酸序列：N-52QILSQQQQASP62-C
保存方法：冷藏
LPS施与方法
施与量：7μg/头
施与路径：腹腔内施与
施与容量：0.1ml/头
施与次数：1次(单次)
施与时间：肝部分切除的48小时前
对象动物：G2～G6(G1施与盐水)
受试物质的施与
肽施与样品的配制
配制频率：1次
配制方法：用盐水溶解，使其为2mg/ml，用作施与样品。
保存方法：使用前在冰箱(保存于4℃)。
肽的施与方法
施与量：200μg/头
施与路径：静脉内施与
施与容量：0.1ml/头
施与时期：肝部分切除的50、38、24、14、2小时前以及10、24、34小时后
施与次数：2次/日，4天(原则上9:00和19:00)，计8次。
对象动物：G2～G6(G1、G2施与盐水)
肝部分切除(2/3 partial hepatectomy；PH)
处置方法
将小鼠进行乙醚吸入麻醉，自胸部至腹部剃毛，背位固定后将用聚烯吡酮碘消毒手术部皮肤。切开腹部，自切开口取出肝外侧左叶、内侧右叶、内侧左叶至体外，用线系住这些肝叶的根部，切除放置至体外的肝脏。擦去血液，用キフア一ホツチキス封闭腹部，用聚烯吡酮碘消毒皮肤，手术完成。
处置只数：全部48只
处置时间：LPS施与48小时后
剖检
剖检时间：PH48小时后
剖检方法
通过腹腔内施与戊巴比妥钠40mg/kg将小鼠麻醉后，用未处理注射器通过腹部大动脉尽可能采集血液，使其失血致死。
采血后，将各组4例在用4％PFA进行全身灌流后摘出肝脏，全叶用包埋剂“Tissue Mount”冷冻包埋。对于其余的4例，不进行全身灌流，一部分用10％福尔马林液浸渍固定，其余作为冻结试样(mRNA用和蛋白定量用)在液氮中冷冻。
肝组织TGF-β1量的测定
按照Okuno等人的方法(Okuno M等，Gastroenterology 2001；120：1784-1800)将11.2中为蛋白质定量用制备的肝组织约30mg配制成肝提取液，用PROMEGA社制的ELISA试剂盒对提取液中存在的TGF-β1的量进行定量。TGF-β量以pg/mg蛋白质量表示。其它同实施例2。
(一般状态的观察结果)
对于施与LPS的组，施与12小时后的观察确认自发运动的减少和立毛。
(染色结果)
染色结果如图9所示。通过向小鼠施与QP肽、QPA肽、QPQ肽，明显改善LPS前施与诱发的(已经证明血浆激肽释放酶依存性TGF-β活化反应是其原因；Akita等.，Gastroenterology；123：352-364，2002)肝再生不全。QPQ肽、QPA肽、QP肽的改善效果大体相同。与此相对，T200肽没有改善效果。
(定量结果)
将上述染色结果用PCNA阳性肝细胞百分率进行定量，结果如图10所示。通过向小鼠施与QP肽、QPA肽、QPQ肽，改善了LPS前施与诱发的肝再生不全(PCNA的比率从55％减少至47％；已经证明血浆激肽释放酶依存性TGF-β活化反应是其原因；Akita等人，Gastroenterology 123：352-364，2002)。进一步地，通过施与QP肽、QPA肽、QPQ肽，PCNA阳性的比率分别提高至66％、70％、64％，显示具有肝再生不全效果和肝再生促进效果。与此相对，T200肽完全没有改善效果(45％)。
(肝组织TGF-β1量定量结果)
肝组织中的TGF-β1生成量的测定结果如图11所示。LPS前施与导致的肝组织TGF-β1量提高至约2.3倍；QP肽、QPA肽、QPQ肽分别将这种上升抑制至1.6倍、0.7倍、1.6倍。与此相对，T200肽没有抑制效果，甚至使其上升(3.1倍)。
(总结·考察)
以上的结果显示，作为TGF-β活化蛋白酶引起的潜在型TGF-β1的LAP部分的切断序列来源的QP肽、QPA肽和QPQ肽，在低浓度抑制作为肝病原因的蛋白酶依存性TGF-β活化反应，抑制活化TGF-β的生成，改善肝再生。
在体外，QP肽形成酶基质复合物的能力强，分解后消失，因此在细胞培养系、动物模型显示轻微的阻碍活性。与此相对，由于QPA肽形成酶基质复合物的能力比QP肽弱，且生成的酶基质复合物不会被切断，稳定存在，因此在细胞培养系、动物模型中与QP肽相比，显示显著的阻碍作用。
在体外，蛋白酶序列非特异性地被T200肽捕获，因此显示弱结合活性。另外由于在细胞培养系、动物模型中与T200肽相比，QPA肽形成酶基质复合物的能力高，所以与T200肽相比，QPA肽更加具有阻碍效果。
QPQ肽由于维持高的酶基质复合物形成能力，同时不会被切断，在体外、细胞培养系、动物模型等任意的评价体系中显示最强的阻碍活性。即QPQ肽比QP肽、QPA肽更能稳定地抑制与病态形成相伴的TGF-β活化反应，可期待本肽及其衍生物被开发为针对以各种硬化性疾病为代表的TGF-β相关疾病的预防药、治疗法。
序列表
<110>Riken
<120>TGF-β活化反应阻碍物质
<130>FA8105A
<160>11
<210>1
<211>11
<212>PRT
<213>人工的(Artificial)
<220>
<223>合成肽(Synthetic peptide)
<220>
<221>misc_feature
<222>(5)..(8)
<223>Xaa可以是任意氨基酸
<400>1
Gln Ile Leu Ser Xaa Xaa Xaa Xaa Ala Ser Pro
  1               5                  10
<210>2
<211>11
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成肽
<400>2
Gln Ile Leu Ser Ala Ala Ala Ala Ala Ser Pro
  1               5                  10
<210>3
<211>11
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成肽
<400>3
Gln Ile Leu Ser Ala Leu Ala Leu Ala Ser Pro
  1               5                  10
<210>4
<211>11
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成肽
<400>4
Gln Ile Leu Ser Gln Gln Gln Gln Ala Ser Pro
  1               5                  10
<210>5
<211>11
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成肽
<400>5
Gln Ile Leu Ser Gln Leu Gln Leu Ala Ser Pro
  1               5                  10
<210>6
<211>51
<212>PRT
<213>人(Human)
<400>6
Thr Cys Lys Thr Ile Asp Met Glu Leu Val Lys Arg Lys Arg Ile Glu
1               5                   10                  15
Ala Ile Arg Gly Gln Ile Leu Ser Lys Leu Arg Leu Ala Ser Pro Pro
            20                  25                  30
Ser Gln Gly Glu Val Pro Pro Gly Pro Leu Pro Glu Ala Val Leu Ala
        35                  40                  45
Leu Tyr Asn
    50
<210>7
<211>51
<212>PRT
<213>人
<400>7
Thr Cys Ser Thr Leu Asp Met Asp Gln Phe Met Arg Lys Arg Ile Glu
  1              5                   10                   15
Ala Ile Arg Gly Gln Ile Leu Ser Lys Leu Lys Leu Thr Ser Pro Pro
             20                  25                  30
Glu Asp Tyr Pro Glu Pro Glu Glu Val Pro Pro Glu Val Ile Ser Ile
         35                  40                  45
Tyr Asn Ser
    50
<210>8
<211>51
<212>PRT
<213>人
<400>8
Thr Cys Thr Thr Leu Asp Phe Gly His Ile Lys Lys Lys Arg Val Glu
  1               5                  10                  15
Ala Ile Arg Gly Gln Ile Leu Ser Lys Leu Arg Leu Thr Ser Pro Pro
             20                  25                  30
Glu Pro Thr Val Met Thr His Val Pro Tyr Gln Val Leu Ala Leu Tyr
         35                  40                  45
Ash Ser Thr
     50
<210>9
<211>11
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成肽
<400>9
Gln Ile Leu Ser Lys Leu Arg Leu Ala Ser Pro
1                 5                  10
<210>10
<211>11
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成肽
<400>10
Gln Ile Leu Ser Ala Ala Ala Leu Ala Ser Pro
  1               5                  10
<210>11
<211>11
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成肽
<400>11
Thr Gly Val Val Arg Gln Trp Leu Ser Arg Gly
  1               5                  10

Claims (8)

1.包含11～50个氨基酸残基的肽，该肽含有Gln-Ile-Leu-Ser-X1-X2-X3-X4-Ala-Ser-Pro(式中X1至X4分别独立地表示任意的氨基酸残基，X1-X2-X3-X4表示Lys-Leu-Arg-Leu以外的、且不被蛋白酶切断的序列)表示的氨基酸序列。
2.权利要求1所述的肽，其中X1和X3为碱性氨基酸以外的氨基酸残基。
3.包含11～50个氨基酸残基的肽，其含有下记(1)～(4)中的任意的氨基酸序列，
Gln-Ile-Leu-Ser-Ala-Ala-Ala-Ala-Ala-Ser-Pro    (1)
Gln-Ile-Leu-Ser-Ala-Leu-Ala-Leu-Ala-Ser-Pro    (2)
Gln-Ile-Leu-Ser-Gln-Gln-Gln-Gln-Ala-Ser-Pro    (3)
Gln-Ile-Leu-Ser-Gln-Leu-Gln-Leu-Ala-Ser-Pro    (4)
                                                  。
4.权利要求1～3中任一项所述的肽，其长度为11～20个氨基酸残基。
5.肽，其包含Gln-Ile-Leu-Ser-X1-X2-X3-X4-Ala-Ser-Pro(式中X1至X4分别独立地表示任意的氨基酸残基，X1-X2-X3-X4表示Lys-Leu-Arg-Leu以外的、且不被蛋白酶切断的序列)表示的氨基酸序列。
6.活性型TGF-β生成抑制剂，其含有权利要求1～5中任一项所述的肽。
7.用于治疗和/或预防与TGF-β相关的病态的药物，其含有权利要求1～5中任一项所述的肽。
8.肝再生促进剂或肝纤维化抑制剂，其含有权利要求1～5中任一项所述的肽。
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