Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Reinigung eines Rohpeptids mittels präparativer Mitteldruck-Flüssigkeitschromatographie.
Das Prinzip der Festphasensynthese von Peptiden ist von R.B. Merrifield zum Beispiel in "Angewandte Chemie", Band 97, (1985), Seiten 801 bis 812, beschrieben. Im "International Journal of Peptide and Protein Research", Band 25, (1985), Seiten 449 bis 474 beschreibt M. Bodanszky das Prinzip der Peptidsynthese in Flüssigphase.
Im Europäischen Patent Nr. 0 037 516 wird eine Festphasensynthese eines Vasopressinderivates nach Merrifield beschrieben, und im ersten Abschnitt auf Seite 8 wird eine Reinigung auf Molekularsieben (Trennung nach Molekulargewicht) beschrieben. Eine ähnliche Reinigung wird auch in der US-PS 4 148 787 und in "Collection Czechoslov. Chem. Comm.", Vol. 31, (1966), Seiten 4581 bis 4591, beschrieben.
In der US-PS 4 093 610 wird im Zusammenhang mit einer Flüssigphasensynthese eine Reinigung auf Ionenaus tauscher oder auf Molekularsieben beschrieben.
Weitere Reinigungsmethoden werden in der DE-OS 2 723 453 (siehe Beispiel 19) und der DE-PS 1 643 273 beschrieben, wobei die letztere Methode nur für Mengen im mg-Bereich durchführbar ist.
Auf die Problematik der Peptid-Reinigung ist auch von G. Flouret et al. in "Int. J. Peptide Protein Res.", 13, (1979), Seiten 137 bis 141 , hingewiesen worden.
Im übrigen sei auch auf folgende, zum Stand der Technik gehörende Literaturstellen verwiesen:
- K. Noda in "Int. J. Peptide Protein Res.", 19, (1982), Seiten 413-419;
- "Collection of Czechoslov. Chem. Comm.", Vol. 32, (1967), Seiten 1250 bis 1257;
- Europäische Patentanmeldung Nr. 83 850 335.7 (Publikations-Nr. 0 112 809), insbesondere Beispiel 1, worin die nicht ökonomische HPLC zur Anwendung kommt;
- US-PS 4 495 097; und
- V. du Vigneaud et al., (1960), J. Biol. Chem. Vol. 235, Nr. 12, Seiten 64 bis 66.
Ausführlicher werden bestimmte Reinigungsmethoden beschrieben in
- J. Chromatog., 38, (1968), Seiten 396 bis 398, und
- M. Zaoral et al., Collection Czechoslov. Chem. Comm., Vol. 43, (1978), Seiten 511 bis 522.
Mit allen diesen bekannten Reinigungsverfahren können im allgemeinen ökonomisch vertretbare Reinheitsgrade von 92 bis 94% erreicht werden. Das hat zur Folge, dass bei einer medizinischen Verwendung einer Peptidverbindung stets nachgewiesen werden musste, dass die sie begleitenden Nebenprodukte keine nachteiligen Folgen, Auswirkungen, Nachteile haben, was nicht leicht war, da man oft nicht wusste, aus was für Verbindungen die Nebenprodukte bestanden. Dieser Zustand ist unbefriedigend, zumal in der Medizin immer mehr Peptidverbindungen eingesetzt werden.
Es bestand daher seit langer Zeit das Bedürfnis, ein ökonomisches Reinigungsverfahren für Peptidverbindungen zur Verfügung zu haben, mit welchem Reinheiten von über 99% erreicht werden können. Anhand der bekannten Literatur musste man annehmen, dass es überhaupt nicht möglich ist, eine solche Reinheit auf ökonomische Art zu erreichen. Ebenso nahm man an, dass es absolut unmöglich ist, ein solches Peptid-Reinigungsverfahren mit hohen Ausbeuten und Reinheitsgraden im industriellen Massstab durchzuführen.
Völlig überraschend wurde nun doch ein solches Verfahren gefunden.
Das erfindungsgemässe Verfahren zur Reinigung eines Rohpeptids, vorzugsweise einer wässrigen Rohpeptidlösung, mittels präparativer Mitteldruck-Flüssigkeitschromatographie ist dadurch gekennzeichnet, dass man das zu reinigende Peptid in möglichst konzentrierter Form auf eine Chromatographie-Säule aufträgt, die "reversed-phase-silica"-Material, d.h. alkylierte hochkondensierte Polykieselsäure, mit einer Korngrösse von 20 bis 90 Mikrometer und mit einer Porengrösse von 6 bis 30 Nanometer (60 bis 300 Angström) als feste Matrix enthält, dann bei einem Druck von 0 bis 40 bar mit einem Fliessmittel, bestehend aus einem Gemisch aus wenigstens einem organischen Lösungsmittel und Wasser oder einer Pufferlösung mit einem pH-Bereich von 2 bis 10, entweder isokratisch oder mit einem Gradienten eluiert und so das Gemisch auftrennt, und das auf diese Weise erhaltene Eluat fraktionlert.
Bevorzugte Ausführungsformen des erflndungsgemässen Verfahrens sind in den abhängigen Verfahrensansprüchen definiert.
Das erfindungsgemässe Verfahren hat den Vorteil, dass es äusserst ökonomisch ist. Es ist weiter sehr vorteilhaft, dass das erfindungsgemässe Verfahren in einem niedrigen Druckbereich durchgeführt werden kann. Ebenso ist das Säulenfüllmaterial relativ billig; im Vergleich zu entsprechendem HPLC-Material ist es gegenwärtig etwa 20 mal billiger. Während der Reinigung werden die Peptidverbindung weder denaturiert noch weisen sie einen Aktivitätsverlust auf; das erfindungsgemässe Verfahren ist also für die Peptidverbindungen äusserst schonend. Durch geeignete Wahl des Fliessmittels können die Peptidverbindungen rasch und selektiv getrennt werden. Die erfindungsgemäss aufgetrennten, gereinigten Peptidverbindungen weisen erstaunlicherweise eine Reinheit von über 99% auf.
Es sei auch festgehalten, dass mit dem erfindungsgemässen Verfahren grosse Mengen an Lösungsmitteln eingespart werden können.
Der Nachweis der Peptidverbindungen in den Fraktionen erfolgt z.B. im UV-Licht bei einer Wellenlänge von 232 nm oder 275 nm.
Zur Kontrolle der Reinheit und der Struktur des Peptides in den Fraktionen können die bekannten Methoden angewendet werden: beispielsweise HPLC, DC, Aminosäurenanalyse, Sequenzanalyse.
Falls ein Puffer im Fliessmittel verwendet wird, so werden die entsprechenden Fraktionen vorteilhaft noch vor der Lyophilisation entsalzt, z.B. an Ionenaustauschern oder mittels Molekularsieben.
Um das fraktionierte, erfindungsgemäss gereinigte Peptid als Festkörper zu erhalten, wird die entsprechende Fraktion beispielsweise lyophilisiert.
Mit dem erfindungsgemässen Reinigungsverfahren ist es möglich, beispielsweise 20-50 g Rohpeptid innerhalb von 3 Stunden zu reinigen.
Für das erfindungsgemässe Reinigungsverfahren können Peptidverbindungen verwendet werden, die sowohl mittels Festphasensynthese nach Merrifield ("Angewandte Chemie", Band 97, (1985), Seiten 810 bis 812) als auch in der Flüssigphasensynthese ("Int. J. Peptide Protein Res.", 25, (1985), Seiten 449 bis 474) synthetisiert werden.
Mit dem erfindungsgemässen Verfahren können insbesondere folgende Peptide gereinigt werden: die Disulfid-Verbindungen, welche gemäss einem neuen Verfahren hergestellt worden sind, wie es im Schweizer Patent Nr. 674 848 beschrieben ist, oder auch Terlipressin, CIS-Pressin der Formel
EMI7.1
Hamburger-Peptid der Formel Asp-Ser-Asp-Pro-Arg, Vasopressin Calcitonin, Somatostatin und Insulin.
Entsprechende Strukturformeln sind beschrieben in:
- "Handbook of Biochemistry" C-164 bis C-188
- Amino Acid Sequences of Proteins, C-265 (Handbcok of Biochemistry selected date for Molecular Biology, 2nd edition (1970), Editor: Herbert A. SOBER, PhD, Published by: The Chemical Rubber Co., Cleveland, Ohio, 44 128), und
- "Int. J. Peptide Protein Res.", 15, (1980), Seiten 342 bis 354.
Die nachfolgenden Beispiele sollen die vorliegende Erfindung erläutern.
Beispiel 1: Terlipressin
10 g Terlipressin (Rohpeptid), gelöst in 750 ml destilliertem Wasser, wurde mittels einer MPLC-Anlage der Firma Labomatic AG auf eine 45 x 880 mm Säule unter einem Druck von 15 bar aufgetragen. Das Peptid wurde dann mit einem Fliessmittelgemisch von 26% Methanol und 74% 0,1 M Triethylammoniumphosphat (TEAP) pH 2,45 mit einem Durchfluss von 60 ml/Min. eluiert und fraktioniert. Die Detektion des Peptides erfolgte bei 210 nm im Durchfluss. Das Peptid wurde dann mittels HPLC-Analyse in den Fraktionen nachgewiesen und die entsprechenden Fraktionen nach Zusammenschütten nach bekannten Methoden auf einem Ionenaustauscher entsalzt und lyophilisiert.
Die Reinheit des somit erhaltenen Peptides wurde mittels HPLC-, Aminosäuren- und Sequenzanalyse bestimmt. Ausbeute: 83%, Reinheit: 99,8%.
Beispiel 2: CIS-Pressin
Säule: 52 x 480 mm
Packung: Reversephasematerial C18-20-100
Fliessmittel: 18% Acetonitril/82% 0,12 M TEAP pH 2,9
Durchfluss: 18 ml /min.
Druck: 20 bar
Detektion: 232 nm
Probenmenge: 5 g gelöst in 200 ml dest. Wasser
Ausführung siehe Beispiel 1
Ausbeute: 78%, Reinheit: 99,5%
Beispiel 3: Asp-Ser-Asp-Pro-Arg Hamburger Peptid
Säule: 37 x 1083 mm
Packung: Reversephase-Material C18-30-60
Fliessmittel: 10% Methanol/0,1% Trifluoressigsäure TFA in dest. Wasser
Druck: 17 bar
Durchfluss: 25 ml/Min.
Detektion: 210 nm
Probenmenge 3g gelöst in 70 ml dest. Wasser
Ausbeute: 85%, Reinheit: 99,7%
Ausführung wie Beispiel 1, jedoch keine Entsalzung nötig, sondern direkte Lyophilisation der gesammelten Fraktionen.
The present invention relates to a method for purifying a crude peptide by means of preparative medium pressure liquid chromatography.
The principle of solid phase synthesis of peptides has been developed by R.B. Merrifield, for example, in "Angewandte Chemie", Volume 97, (1985), pages 801 to 812. In the "International Journal of Peptide and Protein Research", volume 25, (1985), pages 449 to 474, M. Bodanszky describes the principle of peptide synthesis in the liquid phase.
European Patent No. 0 037 516 describes a solid phase synthesis of a vasopressin derivative according to Merrifield and in the first section on page 8 a purification on molecular sieves (separation according to molecular weight) is described. A similar purification is also described in U.S. Patent No. 4,148,787 and in "Collection Czechoslov. Chem. Comm.", Vol. 31, (1966), pages 4581 to 4591.
In US Pat. No. 4,093,610, cleaning on ion exchangers or on molecular sieves is described in connection with a liquid phase synthesis.
Further cleaning methods are described in DE-OS 2 723 453 (see example 19) and DE-PS 1 643 273, the latter method being feasible only for amounts in the mg range.
The problem of peptide purification is also discussed by G. Flouret et al. in "Int. J. Peptide Protein Res.", 13, (1979), pages 137 to 141.
For the rest, reference is also made to the following literature references belonging to the prior art:
- K. Noda in "Int. J. Peptide Protein Res.", 19, (1982), pages 413-419;
- "Collection of Czechoslov. Chem. Comm.", Vol. 32, (1967), pages 1250 to 1257;
European patent application No. 83 850 335.7 (publication no. 0 112 809), in particular example 1, in which the non-economical HPLC is used;
U.S. Patent 4,495,097; and
- V. du Vigneaud et al., (1960), J. Biol. Chem. Vol. 235, No. 12, pages 64 to 66.
Certain cleaning methods are described in more detail in
- J. Chromatog., 38, (1968), pages 396 to 398, and
- M. Zaoral et al., Collection Czechoslov. Chem. Comm., Vol. 43, (1978), pages 511 to 522.
With all of these known cleaning methods, economically acceptable degrees of purity of 92 to 94% can generally be achieved. As a result, the medical use of a peptide compound always had to demonstrate that the by-products accompanying it had no adverse consequences, effects, disadvantages, which was not easy, since it was often not known what compounds the by-products consisted of. This condition is unsatisfactory, especially as more and more peptide compounds are used in medicine.
There has therefore been a need for a long time to have an economical purification process for peptide compounds available with which purities of over 99% can be achieved. On the basis of the known literature, one had to assume that it is not at all possible to achieve such purity in an economical way. It was also assumed that it is absolutely impossible to carry out such a peptide purification process with high yields and purity levels on an industrial scale.
Such a method has now been found completely surprisingly.
The process according to the invention for purifying a crude peptide, preferably an aqueous crude peptide solution, by means of preparative medium-pressure liquid chromatography is characterized in that the peptide to be purified is applied in the most concentrated form possible to a chromatography column, the “reversed-phase silica” material, ie contains alkylated, highly condensed polysilicic acid, with a grain size of 20 to 90 micrometers and with a pore size of 6 to 30 nanometers (60 to 300 angstroms) as a solid matrix, then at a pressure of 0 to 40 bar with an eluent consisting of a mixture of at least one organic solvent and water or a buffer solution with a pH range of 2 to 10, either isocratic or eluted with a gradient, so that the mixture is separated and the eluate obtained in this way is fractionated.
Preferred embodiments of the method according to the invention are defined in the dependent method claims.
The method according to the invention has the advantage that it is extremely economical. It is furthermore very advantageous that the method according to the invention can be carried out in a low pressure range. The column filling material is also relatively cheap; compared to the corresponding HPLC material, it is currently about 20 times cheaper. During the purification, the peptide compound is neither denatured nor does it show a loss of activity; the method according to the invention is therefore extremely gentle on the peptide compounds. The peptide compounds can be separated quickly and selectively by a suitable choice of the flow agent. The purified peptide compounds separated according to the invention surprisingly have a purity of over 99%.
It should also be noted that large amounts of solvents can be saved with the method according to the invention.
The detection of the peptide compounds in the fractions takes place e.g. in UV light at a wavelength of 232 nm or 275 nm.
Known methods can be used to control the purity and structure of the peptide in the fractions: for example HPLC, DC, amino acid analysis, sequence analysis.
If a buffer is used in the flow agent, the corresponding fractions are advantageously desalted before the lyophilization, e.g. on ion exchangers or using molecular sieves.
In order to obtain the fractionated peptide purified according to the invention as a solid, the corresponding fraction is lyophilized, for example.
With the purification method according to the invention, it is possible, for example, to purify 20-50 g of crude peptide within 3 hours.
For the purification process according to the invention, peptide compounds can be used which are used both by means of solid phase synthesis according to Merrifield ("Angewandte Chemie", Volume 97, (1985), pages 810 to 812) and in liquid phase synthesis ("Int. J. Peptide Protein Res.", 25, (1985), pages 449 to 474).
With the method according to the invention, the following peptides in particular can be purified: the disulfide compounds which have been prepared by a new method as described in Swiss Patent No. 674 848, or also terlipressin, CIS-Pressin of the formula
EMI7.1
Hamburger peptide of the formula Asp-Ser-Asp-Pro-Arg, vasopressin calcitonin, somatostatin and insulin.
Corresponding structural formulas are described in:
- "Handbook of Biochemistry" C-164 to C-188
- Amino Acid Sequences of Proteins, C-265 (Handbcok of Biochemistry selected date for Molecular Biology, 2nd edition (1970), Editor: Herbert A. SOBER, PhD, Published by: The Chemical Rubber Co., Cleveland, Ohio, 44 128 ), and
- "Int. J. Peptide Protein Res.", 15, (1980), pages 342 to 354.
The following examples are intended to illustrate the present invention.
Example 1: Terlipressin
10 g of terlipressin (crude peptide), dissolved in 750 ml of distilled water, was applied to a 45 x 880 mm column under a pressure of 15 bar using an MPLC system from Labomatic AG. The peptide was then mixed with a mobile phase mixture of 26% methanol and 74% 0.1 M triethylammonium phosphate (TEAP) pH 2.45 at a flow rate of 60 ml / min. eluted and fractionated. The peptide was detected at 210 nm in flow. The peptide was then detected in the fractions by means of HPLC analysis and the corresponding fractions after being poured together were desalted and lyophilized on an ion exchanger by known methods.
The purity of the peptide thus obtained was determined by means of HPLC, amino acid and sequence analysis. Yield: 83%, purity: 99.8%.
Example 2: CIS-Pressin
Column: 52 x 480 mm
Package: reverse phase material C18-20-100
Superplasticizer: 18% acetonitrile / 82% 0.12 M TEAP pH 2.9
Flow: 18 ml / min.
Pressure: 20 bar
Detection: 232 nm
Sample amount: 5 g dissolved in 200 ml dist. water
For execution see example 1
Yield: 78%, purity: 99.5%
Example 3: Asp-Ser-Asp-Pro-Arg Hamburger Peptide
Column: 37 x 1083 mm
Package: reverse phase material C18-30-60
Superplasticizer: 10% methanol / 0.1% trifluoroacetic acid TFA in dist. water
Pressure: 17 bar
Flow: 25 ml / min.
Detection: 210 nm
Sample amount 3g dissolved in 70 ml dist. water
Yield: 85%, purity: 99.7%
Execution as example 1, but no desalination necessary, but direct lyophilization of the collected fractions.