CH676987A5 - Crude peptide purificn. by medium-pressure liq. chromatography - Google Patents

Description

  
 



  Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Reinigung eines Rohpeptids mittels präparativer Mitteldruck-Flüssigkeitschromatographie. 



  Das Prinzip der Festphasensynthese von Peptiden ist von R.B. Merrifield zum Beispiel in "Angewandte Chemie", Band 97, (1985), Seiten 801 bis 812, beschrieben. Im "International Journal of Peptide and Protein Research", Band 25, (1985), Seiten 449 bis 474 beschreibt M. Bodanszky das Prinzip der Peptidsynthese in Flüssigphase. 



  Im Europäischen Patent Nr. 0 037 516 wird eine Festphasensynthese eines Vasopressinderivates nach Merrifield beschrieben, und im ersten Abschnitt auf Seite 8 wird eine Reinigung auf Molekularsieben (Trennung nach Molekulargewicht) beschrieben. Eine ähnliche Reinigung wird auch in der US-PS 4 148 787 und in "Collection Czechoslov. Chem. Comm.", Vol. 31, (1966), Seiten 4581 bis 4591, beschrieben. 



  In der US-PS 4 093 610 wird im Zusammenhang mit einer Flüssigphasensynthese eine Reinigung auf Ionenaus tauscher oder auf Molekularsieben beschrieben. 



  Weitere Reinigungsmethoden werden in der DE-OS 2 723 453 (siehe Beispiel 19) und der DE-PS 1 643 273 beschrieben, wobei die letztere Methode nur für Mengen im mg-Bereich durchführbar ist. 



  Auf die Problematik der Peptid-Reinigung ist auch von G. Flouret et al. in "Int. J. Peptide Protein Res.", 13, (1979), Seiten 137 bis 141 , hingewiesen worden. 



  Im übrigen sei auch auf folgende, zum Stand der Technik gehörende Literaturstellen verwiesen:
 - K. Noda in "Int. J. Peptide Protein Res.", 19, (1982), Seiten 413-419;
 - "Collection of Czechoslov. Chem. Comm.", Vol. 32, (1967), Seiten 1250 bis 1257;
 - Europäische Patentanmeldung Nr. 83 850 335.7 (Publikations-Nr. 0 112 809), insbesondere Beispiel 1, worin die nicht ökonomische HPLC zur Anwendung kommt;
 - US-PS 4 495 097; und
 - V. du Vigneaud et al., (1960), J. Biol. Chem. Vol. 235, Nr. 12, Seiten 64 bis 66. 



  Ausführlicher werden bestimmte Reinigungsmethoden beschrieben in 
 - J. Chromatog., 38, (1968), Seiten 396 bis 398, und
 - M. Zaoral et al., Collection Czechoslov. Chem. Comm., Vol. 43, (1978), Seiten 511 bis 522. 



  Mit allen diesen bekannten Reinigungsverfahren können im allgemeinen ökonomisch vertretbare Reinheitsgrade von 92 bis 94% erreicht werden. Das hat zur Folge, dass bei einer medizinischen Verwendung einer Peptidverbindung stets nachgewiesen werden musste, dass die sie begleitenden Nebenprodukte keine nachteiligen Folgen, Auswirkungen, Nachteile haben, was nicht leicht war, da man oft nicht wusste, aus was für Verbindungen die Nebenprodukte bestanden. Dieser Zustand ist unbefriedigend, zumal in der Medizin immer mehr Peptidverbindungen eingesetzt werden. 



  Es bestand daher seit langer Zeit das Bedürfnis, ein ökonomisches Reinigungsverfahren für Peptidverbindungen zur Verfügung zu haben, mit welchem Reinheiten von über 99% erreicht werden können. Anhand der bekannten Literatur musste man annehmen, dass es überhaupt nicht möglich ist, eine solche Reinheit auf ökonomische Art zu erreichen. Ebenso nahm man an, dass es absolut unmöglich ist, ein solches Peptid-Reinigungsverfahren mit hohen Ausbeuten und Reinheitsgraden im industriellen Massstab durchzuführen. 



  Völlig überraschend wurde nun doch ein solches  Verfahren gefunden. 



  Das erfindungsgemässe Verfahren zur Reinigung eines Rohpeptids, vorzugsweise einer wässrigen Rohpeptidlösung, mittels präparativer Mitteldruck-Flüssigkeitschromatographie ist dadurch gekennzeichnet, dass man das zu reinigende Peptid in möglichst konzentrierter Form auf eine Chromatographie-Säule aufträgt, die "reversed-phase-silica"-Material, d.h. alkylierte hochkondensierte Polykieselsäure, mit einer Korngrösse von 20 bis 90 Mikrometer und mit einer Porengrösse von 6 bis 30 Nanometer (60 bis 300 Angström) als feste Matrix enthält, dann bei einem Druck von 0 bis 40 bar mit einem Fliessmittel, bestehend aus einem Gemisch aus wenigstens einem organischen Lösungsmittel und Wasser oder einer Pufferlösung mit einem pH-Bereich von 2 bis 10, entweder isokratisch oder mit einem Gradienten eluiert und so das Gemisch auftrennt, und das auf diese Weise erhaltene Eluat fraktionlert. 



  Bevorzugte Ausführungsformen des erflndungsgemässen Verfahrens sind in den abhängigen Verfahrensansprüchen definiert. 



  Das erfindungsgemässe Verfahren hat den Vorteil, dass es äusserst ökonomisch ist. Es ist weiter sehr vorteilhaft, dass das erfindungsgemässe Verfahren in einem niedrigen Druckbereich durchgeführt werden kann. Ebenso ist das Säulenfüllmaterial relativ billig; im Vergleich zu  entsprechendem HPLC-Material ist es gegenwärtig etwa 20 mal billiger. Während der Reinigung werden die Peptidverbindung weder denaturiert noch weisen sie einen Aktivitätsverlust auf; das erfindungsgemässe Verfahren ist also für die Peptidverbindungen äusserst schonend. Durch geeignete Wahl des Fliessmittels können die Peptidverbindungen rasch und selektiv getrennt werden. Die erfindungsgemäss aufgetrennten, gereinigten Peptidverbindungen weisen erstaunlicherweise eine Reinheit von über 99% auf.

  Es sei auch festgehalten, dass mit dem erfindungsgemässen Verfahren grosse Mengen an Lösungsmitteln eingespart werden können. 



  Der Nachweis der Peptidverbindungen in den Fraktionen erfolgt z.B. im UV-Licht bei einer Wellenlänge von 232 nm oder 275 nm. 



  Zur Kontrolle der Reinheit und der Struktur des Peptides in den Fraktionen können die bekannten Methoden angewendet werden: beispielsweise HPLC, DC, Aminosäurenanalyse, Sequenzanalyse. 



  Falls ein Puffer im Fliessmittel verwendet wird, so werden die entsprechenden Fraktionen vorteilhaft noch  vor der Lyophilisation entsalzt, z.B. an Ionenaustauschern oder mittels Molekularsieben. 



  Um das fraktionierte, erfindungsgemäss gereinigte Peptid als Festkörper zu erhalten, wird die entsprechende Fraktion beispielsweise lyophilisiert. 



  Mit dem erfindungsgemässen Reinigungsverfahren ist es möglich, beispielsweise 20-50 g Rohpeptid innerhalb von 3 Stunden zu reinigen. 



  Für das erfindungsgemässe Reinigungsverfahren können Peptidverbindungen verwendet werden, die sowohl mittels Festphasensynthese nach Merrifield ("Angewandte Chemie", Band 97, (1985), Seiten 810 bis 812) als auch in der Flüssigphasensynthese ("Int. J. Peptide Protein Res.", 25, (1985), Seiten 449 bis 474) synthetisiert werden. 



   Mit dem erfindungsgemässen Verfahren können insbesondere folgende Peptide gereinigt werden: die Disulfid-Verbindungen, welche gemäss einem neuen Verfahren hergestellt worden sind, wie es im Schweizer Patent Nr. 674 848 beschrieben ist, oder auch Terlipressin, CIS-Pressin der  Formel 
EMI7.1
 



  Hamburger-Peptid der Formel Asp-Ser-Asp-Pro-Arg, Vasopressin Calcitonin, Somatostatin und Insulin. 



  Entsprechende Strukturformeln sind beschrieben in:
 - "Handbook of Biochemistry" C-164 bis C-188
 - Amino Acid Sequences of Proteins, C-265 (Handbcok of Biochemistry selected date for Molecular Biology, 2nd edition (1970), Editor: Herbert A. SOBER, PhD, Published by: The Chemical Rubber Co., Cleveland, Ohio, 44 128), und
 - "Int. J. Peptide Protein Res.", 15, (1980), Seiten 342 bis 354. 



  Die nachfolgenden Beispiele sollen die vorliegende Erfindung erläutern. 


 Beispiel 1: Terlipressin 
 



  10 g Terlipressin (Rohpeptid), gelöst in 750 ml destilliertem Wasser, wurde mittels einer MPLC-Anlage der Firma Labomatic AG auf eine 45 x 880 mm Säule unter einem Druck von 15 bar aufgetragen. Das Peptid wurde dann mit einem Fliessmittelgemisch von 26% Methanol und 74% 0,1 M Triethylammoniumphosphat (TEAP) pH 2,45 mit einem Durchfluss von 60 ml/Min. eluiert und fraktioniert. Die Detektion des Peptides erfolgte bei 210 nm im Durchfluss. Das Peptid wurde dann mittels HPLC-Analyse in den Fraktionen  nachgewiesen und die entsprechenden Fraktionen nach Zusammenschütten nach bekannten Methoden auf einem Ionenaustauscher entsalzt und lyophilisiert. 



  Die Reinheit des somit erhaltenen Peptides wurde mittels HPLC-, Aminosäuren- und Sequenzanalyse bestimmt. Ausbeute: 83%, Reinheit: 99,8%. 


 Beispiel 2: CIS-Pressin 
 
 



   Säule: 52 x 480 mm
 Packung: Reversephasematerial C18-20-100
 Fliessmittel: 18% Acetonitril/82% 0,12 M TEAP pH 2,9
 Durchfluss: 18 ml /min.
 Druck: 20 bar
 Detektion: 232 nm
 Probenmenge: 5 g gelöst in 200 ml dest. Wasser
 Ausführung siehe Beispiel 1
 Ausbeute: 78%, Reinheit: 99,5% 


 Beispiel 3: Asp-Ser-Asp-Pro-Arg Hamburger Peptid 
 
 



  Säule: 37 x 1083 mm
 Packung: Reversephase-Material C18-30-60
 Fliessmittel: 10% Methanol/0,1% Trifluoressigsäure TFA in dest. Wasser
 Druck: 17 bar 
 Durchfluss: 25 ml/Min.
 Detektion: 210 nm
 Probenmenge 3g gelöst in 70 ml dest. Wasser
 Ausbeute: 85%, Reinheit: 99,7%
 Ausführung wie Beispiel 1, jedoch keine Entsalzung nötig, sondern direkte Lyophilisation der gesammelten Fraktionen. 

Claims (11)

1. Verfahren zur Reinigung eines Rohpeptids mittels präparativer Mitteldruck-Flüssigkeitschromatographie, dadurch gekennzeichnet, dass man das zu reinigende Peptid in möglichst konzentrierter Form auf eine Chromatographie-Säule aufträgt, die "reversed-phase-silica"-Material, d.h. alkylierte hochkondensierte Polykieselsäure, mit einer Korngrösse von 20 bis 90 Mikrometer und mit einer Porengrösse von 6 bis 30 Nanometer (60 bis 300 Angström) als feste Matrix enthält, dann bei einem Druck von 0 bis 40 bar mit einem Fliessmittel, bestehend aus einem Gemisch aus wenigstens einem organischen Lösungsmittel und Wasser oder einer Pufferlösung mit einem pH-Bereich von 2 bis 10, entweder isokratisch oder mit einem Gradienten eluiert und so das Gemisch auftrennt, und das auf diese Weise erhaltene Eluat fraktioniert.

2.

Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die feste Matrix eine Korngrösse von 20 bis 60 Mikrometer hat.

3. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die feste Matrix eine Porengrösse von 10 Nanometer (100 Angström) hat.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass das "reversed-phase-silica"- Material Silicium-Verbindungen mit einer Kettenlänge von 3 bis 18 C-Atomen insbesondere 8 oder 18 C-Atome, enthält.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass das zu reinigende Peptid eine Konzentration von 1 bis 100 mg, insbesondere von 1 bis 10 mg, Peptid pro ml Lösung aufweist.

6.

Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass das organische Lösungsmittel ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Acetonitril, Ethanol, Methanol, Trifluoressigsäure und Methylenchlorid.

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass man das zu reinigende Rohpeptid, welches vorzugsweise als wässrige Lösung oder als wässrig/alkoholische Lösung vorliegt, mit einer Pumpe auf die Chromatographie-Säule aufträgt.

8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass man bei einem Druck von 12 bis 15 bar eluiert.

9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass man bei einer Temperatur von 4 bis 80 DEG C, insbesondere bei Raumtemperatur, vorzugsweise von 20 bis 25 DEG C, arbeitet.

10.

Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass man ein Peptid, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Terlipressin, CIS-Pressin der Formel EMI12.1 Hamburger-Peptid der Formel Asp-Ser-Asp-Pro-Arg, Vasopressin, Calcitonin, Somatostatin, und Insulin reinigt.

11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass der Gradient konkav, konvex oder linear ist, und eine Veränderung der Fliessmittelzusammensetzung und/oder eine Veränderung der Ionenstärke und/oder eine Veränderung des pH-Wertes umfasst. 1. Verfahren zur Reinigung eines Rohpeptids mittels präparativer Mitteldruck-Flüssigkeitschromatographie, dadurch gekennzeichnet, dass man das zu reinigende Peptid in möglichst konzentrierter Form auf eine Chromatographie-Säule aufträgt, die "reversed-phase-silica"-Material, d.h. alkylierte hochkondensierte Polykieselsäure, mit einer Korngrösse von 20 bis 90 Mikrometer und mit einer Porengrösse von 6 bis 30 Nanometer (60 bis 300 Angström) als feste Matrix enthält, dann bei einem Druck von 0 bis 40 bar mit einem Fliessmittel, bestehend aus einem Gemisch aus wenigstens einem organischen Lösungsmittel und Wasser oder einer Pufferlösung mit einem pH-Bereich von 2 bis 10, entweder isokratisch oder mit einem Gradienten eluiert und so das Gemisch auftrennt, und das auf diese Weise erhaltene Eluat fraktioniert. 2.

Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die feste Matrix eine Korngrösse von 20 bis 60 Mikrometer hat. 3. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die feste Matrix eine Porengrösse von 10 Nanometer (100 Angström) hat. 4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass das "reversed-phase-silica"- Material Silicium-Verbindungen mit einer Kettenlänge von 3 bis 18 C-Atomen insbesondere 8 oder 18 C-Atome, enthält. 5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass das zu reinigende Peptid eine Konzentration von 1 bis 100 mg, insbesondere von 1 bis 10 mg, Peptid pro ml Lösung aufweist. 6.

Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass das organische Lösungsmittel ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Acetonitril, Ethanol, Methanol, Trifluoressigsäure und Methylenchlorid. 7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass man das zu reinigende Rohpeptid, welches vorzugsweise als wässrige Lösung oder als wässrig/alkoholische Lösung vorliegt, mit einer Pumpe auf die Chromatographie-Säule aufträgt. 8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass man bei einem Druck von 12 bis 15 bar eluiert. 9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass man bei einer Temperatur von 4 bis 80 DEG C, insbesondere bei Raumtemperatur, vorzugsweise von 20 bis 25 DEG C, arbeitet. 10.

Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass man ein Peptid, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Terlipressin, CIS-Pressin der Formel EMI12.1 Hamburger-Peptid der Formel Asp-Ser-Asp-Pro-Arg, Vasopressin, Calcitonin, Somatostatin, und Insulin reinigt. 11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass der Gradient konkav, konvex oder linear ist, und eine Veränderung der Fliessmittelzusammensetzung und/oder eine Veränderung der Ionenstärke und/oder eine Veränderung des pH-Wertes umfasst.