DE69933046T2

DE69933046T2 - Reinigung von echinocandin cyclopeptiden

Info

Publication number: DE69933046T2
Application number: DE69933046T
Authority: DE
Inventors: Robert John Lebanon DOBBINS; Paul Eugene Carmel KROEFF; Thomas Jeffrey Brownsburg VICENZI
Original assignee: Eli Lilly and Co
Current assignee: Eli Lilly and Co
Priority date: 1998-12-09
Filing date: 1999-12-08
Publication date: 2007-09-13
Anticipated expiration: 2019-12-09
Also published as: DK1137663T3; CA2353930A1; BR9916101A; US6506726B1; EP1137663A2; JP2003511345A; WO2000034315A3; ZA200104621B; AU3113200A; KR20010101151A; PT1137663E; ATE338059T1; CN1337968A; IL143563A0; AU766091B2; WO2000034315A2; DE69933046D1; RU2001118849A; ES2272096T3; EP1137663B1

Description

TECHNISCHES GEBIET
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Reinigung von Echinocandin-Verbindungen, die zumindest eine protonierbare Aminogruppe enthalten, und insbesondere betrifft das Verfahren die Reinigung einer Verbindung vom Echinocandin-Typ durch Adsorption an ein hydrophobes Umkehrphasenchromatographie-Medium und Elution mit einem kontinuierlichen, nahezu linearen Gradienten von zunehmender Essigsäure. Außerdem wird ein Reinigungsverfahren zur selektiven Entfernung eines Tripeptidaldehyd-Nebenprodukts des Echinocandin-Fermentationsprozesses zum Erhalt einer Echinocandin-Verbindung von höherer Reinheit bereitgestellt.
HINTERGRUND
Echinocandin-Cyclopeptide sind Naturprodukte, deren antifungale Aktivitäten nachgewiesen worden sind. Zur Echinocandin-Cyclopeptid-Familie zählen Naturprodukte, wie Echinocandin B (ECB), Echinocandin C, Aculeacin Aγ, Mulundocandin, Sporiofungin A, Pneumocandin A₀, WF11899A und Pneumocandin B₀. Die Naturprodukte werden typischerweise durch Züchten verschiedener Mikroorganismen erhalten. Zum Beispiel wird Echinocandin B aus der Fermentation des Pilzes Aspergillus nidulans erhalten.
Im Zuge der Suche nach aktiveren Materialien sind die Naturprodukte in vielfältiger Weise modifiziert worden. Eine der häufigsten Modifikationen ist die Ersetzung der N-Acyl-Seitenkette des Naturprodukts zur Erzeugung eines halbsynthetischen Derivats gewesen. Zum Beispiel beschreiben US-Patent-Nrn. 4 293 489; 4 320 052; 5 166 135 und 5 541 160; und EP 359529 ; 448353; 447186; 462531 und 561639 eine Vielfalt von N-Acyl-derivatisierten Echinocandin-Verbindungen, die variierende Grade an antifungaler Aktivität bieten.
Die N-Acyl-Derivate werden durch Deacylieren des Naturprodukts, gefolgt von einer Reacylierung mit einer unterschiedlichen Acylgruppe, erzeugt. Die Deacylierung wird typischerweise mittels eines Enzyms erreicht (z.B. Deacylase-Enzym). Das Deacylase-Enzym kann von dem Mikroorganismus Actinoplanes utahensis oder Pseudomonas-Spezies erhalten werden. Siehe u.a. US-Patent-Nrn. 4 293 482 und 4 304 716; und EP 460 882 . Boek et al., Japanese Journal of Antibiotics, 1989; XLII (3): 382–388 beschreibt auch die Deacylierung von Echinocandin B durch Actinoplanes utahensis. Die deacylierte Verbindung wird typischerweise als der Nukleus des entsprechenden Naturprodukts bezeichnet (d.h. das deacylierte Produkt von Echinocandin B wird als der Echinocandin B-Nukleus (ECBN) bezeichnet). Ungünstigerweise produzieren sowohl der Fermentations- als auch der Deacylierungsprozess mehrere Nebenprodukte, die schwer entfernbar sind und die Reinheit des gewünschten deacylierten cyclischen Peptid-Nukleus herabsetzen.
US-Patent-Nr. 4 874 843 beschreibt einen chromatographischen Prozess unter Verwendung nichtfunktioneller Harze in einem Umkehrmodus, um Produkte vom Echinocandin-Typ zu reinigen. Obschon der Prozess die Reinheit der aus einem Fermentationsprozess stammenden Produkte verbesserte, sind noch weitere Verbesserungen erforderlich, um die Kontaminanten zu entfernen, die sowohl von dem intermediären deacylierten Nukleus und den fertig gestellten acylierten pharmazeutisch aktiven Verbindungen schwer abtrennbar sind. Da die Potenz des pharmazeutischen Endprodukts von der Reinheit der zur Herstellung des Endprodukts verwendeten Intermediate abhängt, sind Verbesserungen der Reinheit in irgend einem Stadium des Herstellungsprozesses in hohem Maße wünschenswert. Idealerweise werden die Kontaminanten im frühest möglichen Stadium im Herstellungsprozess entfernt.
Allgemeine Erörterungen der nicht-funktionellen Harze und ihrer Anwendungen in flüssigchromatographischen Trennungen können gefunden werden in J. Chromatography, 201, 287–292 (1980) und Grieser, M. D. et al, Analytical Chemistry, 45, 1348–1353 (1973). Die Anwendung jedes Schritts oder kontinuierlicher Gradienten wird erörtert; allerdings enthalten die Eluenten signifikante Mengen an organischen Lösungsmitteln. Bei einem Herstellungsprozess weckt die Verwendung von organischen Lösungsmitteln einige Bedenken, wie etwa hinsichtlich der Umweltschutzbe stimmungen (z.B. Emissionsgrenzwerte zur Luftreinhaltung), spezieller Handhabungsanforderungen (z.B. Entzündbarkeitsnormen) und Entsorgungsbeschränkungen (z.B. Giftmüllverordnungen). Daher besteht ein Bedarf nach einem Eluentsystem, das die Verwendung von organischen Lösungsmitteln minimiert und dennoch Gemische effizient in seine reinen Komponenten auftrennt.
OFFENLEGUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zum Trennen und Reinigen einer breiten Vielfalt von deacylierten Verbindungen vom Echinocandin-Typ bereit, die mindestens eine protonierbare Aminogruppe aus ihren Fermentations- oder Mischbrühen und teilweise gereinigten Prozessströmen enthalten, durch Adsorbieren des Gemischs an einem hydrophoben Umkehrphasenchromatographie-Medium und Eluieren mit einem kontinuierlichen, nahezu linearen Essigsäure-Gradienten im Bereich von 0,1% Essigsäure bis 10,0% Essigsäure nach Volumen in Wasser, vorzugsweise von 0,5% (pH = 5,5) bis 4,0% (pH = 2,5) Essigsäure.
Insbesondere stellt die Erfindung ein Verfahren zum Abtrennen und Ausreinigen deacylierter Echinocandin-Verbindungen bereit, umfassend die folgenden Schritte:

(i) Bereitstellen eines Gemischs, umfassend eine deacylierte Echinocandin-Verbindung, an die wenigstens eine protonierbare Aminogruppe angelagert ist;
(ii) Adsorbieren des Gemischs an ein hydrophobes Umkehrphasenchromatographie-Medium;
(iii) Eluieren der deacylierten Echinocandin-Verbindung mit einem kontinuierlichen, nahezu linearen Essigsäure-Gradienten im Bereich von 0,1% Essigsäure bis 10,0% Essigsäure nach Volumen in Wasser; und
(iv) Gewinnen der deacylierten Echinocandin-Verbindung.

Bei einer anderen Ausführungsform stellt die Erfindung ein Verfahren zum Ausreinigen deacylierter Echinocandin-Verbindungen aus einem Gemisch, enthaltend ein Tripeptidaldehyd-Nebenprodukt, bereit, welches die folgenden Schritte umfasst: (i) Bereitstellen eines Gemischs aus einer deacylierten Echinocandin-Verbindung und einem Tripeptidaldehyd-Nebenprodukt; (ii) Zugeben eines Derivatisierungsmittels zu dem Gemisch zur Erzeugung eines derivatisierten Tripeptidaldehyd-Produkts; und (iii) Trennen der deacylierten Echinocandin-Verbindung von dem derivatisierten Tripeptidaldehyd-Produkt unter Anwendung der hydrophoben Umkehrphasen-Chromatographie und Eluieren mit einem kontinuierlichen, nahezu linearen Essigsäure-Gradienten.
Wie hierin verwendet, bezieht sich der Begriff „Derivatisierungsmittel" auf ein Reagenz, das zum Reagieren mit der Aldehyd-Funktionalität des Tripeptid-Nebenprodukts fähig ist, um ein Intermediat zu erzeugen, das ausreichend unterschiedlich in der Hydrophobizität ist, um die Abtrennung des Tripeptid-Intermediats von der gewünschten Verbindung vom Echinocandin-Typ zu ermöglichen.
Die Bezeichnung „protonierbare Aminogruppe" bezieht sich auf eine Aminogruppe, die eine Protonierung vollzieht, wenn sie den Elutionsbedingungen der vorliegenden Erfindung unterzogen wird (d.h. 0,1% Essigsäure bis 10% Essigsäure nach Volumen in Wasser).
Die Bezeichnung „Verbindungen vom Echinocandin-Typ" bezieht sich auf Verbindungen mit der folgenden allgemeinen Struktur, einschließlich jeglicher einfachen Derivate davon:
worin R1 -H oder -OH ist; R2 -H oder CH₃ ist; R3 -H, -CH₃, -CH₂CONH₂ oder -CH₂CH₂NH₂ ist; R4 -H oder -OH ist; R5 -OH, -OPO₃H₂ oder -OSO₃H ist; R6 -H oder -OSO₃H ist, und R7 CH₃ ist. Echinocandin-Nukleus" bezieht sich auf die deacy lierte Echinocandin-Verbindung, worin R ein Wasserstoff ist. „ECBN" bezieht sich auf den Echinocandin-B-Nukleus, worin R1, R4 und R5 Hydroxylgruppen sind, R2, R3 und R7 Methylgruppen sind; und R1 und R6 Wasserstoffe sind.
Der Begriff „Alkyl" bezieht sich auf ein Kohlenstoff-Radikal der allgemeinen Formel C_nH_2n+1, enthaltend 1 bis 30 Kohlenstoffatome, sofern nicht anders angegeben. Das Alkan-Radikal kann gerade (z.B. Methyl, Ethyl, Propyl, Butyl etc.), verzweigt (z.B. Isopropyl, Isobutyl, tertiäres Butyl, Neopentyl etc.), cyclisch (z.B. Cyclopropyl, Cyclobutyl, Cyclopentyl, Methylcyclopentyl, Cyclohexyl etc.) oder multicyclisch (z.B. Bicyclo[2.2.1]heptan, Spiro[2.2]pentan etc.) sein. Das Alkan-Radikal kann substituiert oder unsubstituiert sein. Entsprechend weist der Alkyl-Abschnitt einer Alkoxygruppe oder eines Alkanoats dieselbe Definition wie oben auf.
Der Begriff „Alkenyl" bezieht sich auf einen acyclischen Kohlenwasserstoff, der mindestens eine Kohlenstoff-Kohlenstoff-Doppelbindung enthält. Das Alken-Radikal kann gerade, verzweigt, cyclisch oder multicyclisch sein. Das Alken-Radikal kann substituiert oder unsubstituiert sein.
Der Begriff „Alkinyl" bezieht sich auf einen acyclischen Kohlenwasserstoff, der mindestens eine Kohlenstoff-Kohlenstoff-Dreifachbindung enthält. Das Alkin-Radikal kann gerade oder verzweigt sein. Das Alkin-Radikal kann substituiert oder unsubstituiert sein.
Der Begriff „Aryl" bezieht sich auf aromatische Komponenten mit einzelnen (z.B. Phenyl) oder fusionierten Ringsystemen (z.B. Naphthalen, Anthracen, Phenanthren etc.). Die Arylgruppen können substituiert oder unsubstituiert sein.
Der Begriff „Heteroaryl" bezieht sich auf aromatische Komponenten, die mindestens ein Heteroatom innerhalb des aromatischen Ringsystems enthalten (z.B. Pyrrol, Pyridin, Indol, Thiophen, Furan, Benzofuran, Imidazol, Pyrimidin, Purin, Benzimidazol, Chinolin etc.). Die aromatische Komponente kann aus einem einzelnen oder fusionierten Ringsystem bestehen. Die Heteroarylgruppen können substituiert oder unsubstituiert sein.
Innerhalb des Gebiets der organischen Chemie, und insbesondere innerhalb des Gebiets der organischen Biochemie, ist es breit verstanden, dass eine signifikante Substitution von Verbindungen toleriert oder sogar nützlich ist. Bei der vorliegenden Erfindung beispielsweise erlaubt der Begriff Alkylgruppe Substituenten, die ein klassisches Alkyl sind, wie etwa Methyl, Ethyl, Propyl, Hexyl, Isooctyl, Dodecyl, Stearyl etc. Der Begriff „Gruppe" fasst besonders ins Auge und ermöglicht Substitutionen an Alkylen, die im Fachgebiet herkömmlich sind, wie etwa Hydroxy, Halogen, Alkoxy, Carbonyl, Keto, Ester, Carbamato etc., einschließlich der unsubstituierten Alkyl-Komponente. Allerdings ist für die Fachleute des Gebiets allgemein selbstverständlich, dass die Substituenten so ausgewählt werden sollten, dass sie die pharmakologischen Eigenschaften der Verbindung nicht nachteilig beeinflussen oder die Anwendung des Medikaments nicht beeinträchtigen. Zu geeigneten Substituenten für jegliche der oben definierten Gruppen zählen Alkyl, Alkenyl, Alkinyl, Aryl, Halo, Hydroxy, Alkoxy, Aryloxy, Mercapto, Alkylthio, Arylthio, Mono- und Dialkylamino, quaternäre Ammoniumsalze, Aminoalkoxy, Hydroxyalkylamino, Aminoalkylthio, Carbamyl, Carbonyl, Carboxy, Glycolyl, Glycyl, Hydrazinn, Guanyl und Kombinationen davon.
BESTE AUSFÜHRUNGSFORM DER ERFINDUNG
Fermentations- und Mischbrühen enthalten eine Anzahl von Nebenprodukten, die sehr schwer von dem gewünschten Cyclopeptid-Produkt trennbar sind. „Mischbrühe" bezieht sich auf ein Konversionsgemisch, wobei die Fermentationsbrühe mit einem deacylierenden Enzym ohne Reinigung direkt behandelt wird, um das deacylierte Produkt zu erzeugen (z.B. ECBN). Die Umkehrphasen-Flüssigchromatographie ist in der Vergangenheit mit angemessenem Erfolg angewendet worden; das Erfordernis nach Verbindungen von höherer Reinheit verlangt jedoch nach verbesserten Reinigungsmethoden. Die Anmelder haben entdeckt, dass die Trennung der Fermentations-Nebenprodukte vom gewünschten Fermentationsprodukt, das eine protonierbare Aminogruppe enthält, durch Verwendung von Umkehrphasenchromatographie-Medien in Kombination mit einem kontinuierlichen, nahezu linearen Essigsäure-Elutionsschema verbessert werden kann.
Zu geeigneten hydrophoben Chromatographiemedien zählen Umkehrphasen-Kieselgele und organische Polymere, wie etwa Copolymere von Styrol und Divinylbenzol, und Methacrylatpolymer. Eine Vielzahl von Umkehrphasen-Kieselgelen sind kommerziell erhältlich von Herstellern, wie BTR, E. Merck, Eka Nobel, Millipore, Phenomenex, Whatman oder YMC. Die Kieselgele werden mit geradkettigen Alkylkohlenwasserstoffen in einem Längenbereich von C₁ bis C₁₈ (wobei C₁, C₄, C₈ und C₁₈ die häufigsten sind) oder anderen hydrophoben Liganden (wie z.B. Phenyl oder Cyano) derivatisiert. Eine Vielzahl von Styrol/Divinylbenzolharzen, die für die Umkehrphasen-Flüssigchromatographie entworfen sind, sind ebenfalls kommerziell erhältlich, wie etwa Diaion^TM HP und SP-Harze (erhältlich von Mitsubishi Chemical Industries Limited, Tokio, Japan) und Amberlite XAD-2,4 und 16-Harze (erhältlich von Rohm and Haas Chemical Co., Philadelphia, PA) und die CG-161, 300 und 1000 Amberchrom-Harze von Toso Haas (Montgomeryville, PA). Nicht-funktionelle Harze sind allgemein durch ihr Porenvolumen (0,5–4,5 ml/g), spezifischen Oberflächenbereich (200–800 m²/g), Porendurchmesser (40–1300 Å), Porengrößenverteilung und/oder Beadgrößenverteilung gekennzeichnet. Zu bevorzugten nicht-funktionellen Harzen zählen Diaion HP-20 mit einem Oberflächenbereich von 500 m²/g, einer Porengröße von 200–300 Å und Partikelgröße von 200–800 μm; SP-825 mit einem Oberflächenbereich von 1.000 m²/g, Porengröße von 50–60 Å und Partikelgröße von 250–600 μm; SP-207 (bromierte Version von HP-20) mit einem Oberflächenbereich von 630 m²/g, Porengröße von 100–200 Å und Partikelgröße von 200–800 μm; und CG-161 CD mit einem Oberflächenbereich von 900 m²/g, Porengröße von 110–175 Å und Partikelgröße von 80–160 μm. Bevorzugter sind die HP-20- und SP-825-Harze.
Einleitend wird eine rohe oder teilgereinigte Lösung bereitgestellt, die die gewünschte cyclische Peptidverbindung mit mindestens einer protonierbaren Aminogruppe enthält. Allgemein kann die Aminogruppe während des Ablaufs des Essigsäure-Gradienten, der den pH-Bereich von 5,2 bis 2,5 umspannt, protoniert werden. Vorzugsweise ist die Aminogruppe ein primäres Amin; die Aminogruppe kann jedoch auch ein sekundäres Amin oder tertiäres Amin sein, solange die zusätzlichen Substituenten am Stickstoffatom nicht so hydrophob sind, dass sie die Polarität des positiv geladenen Amins verschieben. Die Lösung kann aus einem Fermentationsprozess oder einem synthetischen Prozess stammen. Z.B. können die cyclischen Peptidver bindungen mittels der synthetischen Verfahren hergestellt werden, wie beschrieben in US-Patent Nr. 5 696 084; J. Am. Chem. Soc., 108, 6041 (1986); Evans, D. A., et al., J. Am. Chem. Soc., 109, 5151 (1987); J. Med. Chem., 35, 2843 (1992); und Kurokawa, N., et al., Tetrahedron, 49, 6195 (1993). Die Rohlösung ist gewöhnlich eine Mischbrühe. Alternativ kann der Prozess zur weiteren Reinigung (oder Politur) des teilweise gereinigten Materials verwendet werden.
In Abhängigkeit von dem speziell angewendeten Fermentationsprozess mag es erwünscht sein, die Lösung vorab zu filtrieren, um partikuläres Material zu entfernen, das den chromatographischen Prozess beeinträchtigen könnte. Die Filtration kann auf vielfältige Weise erfolgen, wie den Fachleuten des Gebiets bekannt, einschließlich der Schwerkraftfiltration, Vakuumfiltration durch ein keramisches Filter, das eine Celite^TM-Filterhilfe enthalten kann oder auch nicht etc. Die Feststoffe in der Fermentationsbrühe können ebenfalls mittels Zentrifugation entfernt werden, gefolgt vom Abschöpfen der Flüssigkeit von den Feststoffen.
Die Fermentationslösung kann, sofern erwünscht, unter Anwendung vielfältiger Methoden konzentriert werden, die den Fachleuten des Gebiets ebenfalls wohlbekannt sind, wie etwa die Konzentrierung durch Verdampfung, Lyophilisierung etc. Das Konzentrat kann ein zweites Mal filtriert werden, um jegliches Präzipitat zu entfernen, das sich während des Konzentrationsprozesses gebildet haben kann.
Die rohe oder teilgereinigte Lösung wird auf eine Chromatographiesäule aufgebracht, die mit einem der oben beschriebenen hydrophoben chromatographischen Medien gepackt ist. Das gewünschte cyclische Peptidprodukt wird dann aus dem Chromatographiemedium unter Verwendung eines kontinuierlichen, nahezu linearen Gradienten im Bereich von etwa 0,1% Essigsäure bis etwa 10% Essigsäure, vorzugsweise von etwa 0,5% Essigsäure (pH = 5,5) bis etwa 4% Essigsäure (pH = 2,5) eluiert. Das obere Ende des Bereichs der ausgewählten Essigsäure-Konzentration basiert auf der Stabilität des verwendeten Chromatographiemediums und der Stabilität der bei jenem pH-Wert zu reinigenden Verbindung. Das untere Ende des Bereichs wird basierend auf dem pH-Wert, bei dem die Aminogruppe protoniert wird, und der erforderlichen Konzentration der Essigsäure, um das Produkt aus der hydrophoben Ober fläche zu eluieren, ausgewählt. Fachleute des Gebiets werden erkennen, dass der Gradient nicht perfekt linear zu sein braucht. Die Bedeutung von „nahezu linear" umfasst einen flachkonvexen oder konkaven Gradienten.
Am Ende des Gradientenelutions-Prozessschritts wird typischerweise ein zusätzliches Volumen der höher konzentrierten Essigsäurelösung zur Vervollständigung der Elution verwendet. Am Ende des Prozesses kann die Säule regeneriert werden, sodass die Säule für weitere Reinigungszyklen wieder verwendet werden kann. Der Regenerationsschritt umfasst typischerweise das Waschen der Säule mit Gemischen aus einem organischen Lösungsmittel und Wasser sowohl bei einem neutralen als auch alkalischen pH-Wert zur Entfernung jeglicher restlicher Materialien, die an der Säulenmatrix verblieben sind. Zu geeigneten Lösungsmitteln zählen Acetonitril, Methanol, Isopropanol und Aceton. Das lineare Essigsäure-Elutionsschema bietet nicht nur eine gute Selektivität (siehe u.a. unten stehendes Beispiel 1), sondern beschränkt auch die Verwendung von organischen Lösungsmitteln für den Regenerationsschritt des Säulenbetriebs. Somit wird sowohl die Absolutmenge an verwendetem organischen Lösungsmittel als auch das Volumen des Säulenablaufs, die jeweils vor der Entsorgung behandelt werden müssen, minimiert.
Das Fermentationsprodukt kann aus dem Eluat unter Anwendung einer Vielzahl von Methoden rückgewonnen werden. Zu geeigneten Rückgewinnungsmethoden zählen die Kristallisation, Konzentration durch Verdampfung und Lyophilisation.
Die Fermentationsbrühe für Echinocandin B enthält variierende Mengen eines Tripeptidaldehyd-(Asn-Gln-Leu-H)-Nebenprodukts mit der folgenden chemischen Struktur (Ia). Das Tripeptidaldehyd-Nebenprodukt vollzieht ebenso wie Echinocandin B während des enzymatischen Deacylierungsprozesses eine Deacylierung, wodurch das entsprechende deacylierte Tripeptidaldehyd (Ib) gebildet wird.
worin R C(O)CH₂CH(OH)C₉H₁₉ (Ia – Fermentations-Nebenprodukt) oder ein Wasserstoff (Ib – Deacylierungs-Nebenprodukt aus einer gemischten Brühe) ist.
Überraschenderweise ist die Rückhaltezeit des deacylierten Tripeptidaldehyds sehr ähnlich der von ECBN in der Umkehrphasen-Flüssigchromatographie, selbst unter optimalen Elutionsbedingungen, was die Trennung des deacylierten Tripeptidaldehyds (Ib) vom gewünschten ECBN sehr schwierig macht. Wird das Tripeptid nicht entfernt, so konkurriert die freie Aminogruppe des Tripeptids mit der freien Aminogruppe der ECBN-Verbindung während des Reacylierungsprozesses. Als Folge muss ein Überschuss an acylierender Verbindung zugegeben werden, um eine vollständige Acylierung der ECBN-Verbindung zu gewährleisten. Das Tripeptid-Kontaminat verbraucht nicht nur dafür erforderliche Ausgangsmaterialien, sondern erzeugt auch ein acyliertes Nebenprodukt, das bei der anschließenden Reinigung der acylierten ECB-Verbindung schwer entfernbar ist. Vorzugsweise wird das Tripeptid-Nebenprodukt vor der Reacylierung der ECBN-Verbindung entfernt.
Das Tripeptidaldehyd-Nebenprodukt kann entweder aus dem Fermentationsgemisch oder der Mischbrühe (d.h. dem Deacylierungsgemisch) durch Umsetzen des Aldehyds mit einem Derivatisierungsmittel vor der chromatographischen Reinigung entfernt werden. Das Derivatisierungsmittel kann der Aldehyd-Funktionalität zugesetzt werden, um die chromatographische Rückhaltezeit des Tripeptidaldehyds relativ zur gewünschten ECB-Verbindung zu verändern. Zu geeigneten Derivatisierungsmitteln zählen Natriumbisulfit, Hydroxylamin und Semicarbazidhydrochlorid. Einige Vorteile der Verwendung von Derivatisierungsmitteln gegenüber anderen Methoden zur Modifizierung der chromatographischen Rückhaltezeiten sind die Selektivität der Derivatisierungsmittel für die Aldehyd-Funktionalität und die milden Bedingungen, unter denen die Reaktion abläuft. Ist die Reaktion zwischen dem Derivatisierungsmittel und dem Tripeptidaldehyd reversibel, so kann das Aldehyd durch Entfernen des Derivatisierungsmittels leicht rückgewonnen werden. Das rückgewonnene Tripeptid kann dann für andere Zwecke verwendet werden.
BEISPIELE
Die folgenden Abkürzungen werden über die gesamten Beispiele hinweg zur Darstellung der jeweils aufgelisteten Materialien verwendet:

ACN: – Acetonitril
TFA: – Trifluoressigsäure
HP-20: – Styrol/Divinylbenzolharz mit einem Oberflächenbereich von 500 m²/g, einer Porengröße von 200–300 Å und einer Partikelgröße von 200–800 μm.
SP-825: – Styrol/Divinylbenzolharz mit einem Oberflächenbereich von 1.000 m²/g, einer Porengröße von 50–60 Å und einer Partikelgröße von 250–600 μm.
SP-207: – bromiertes Styrol/Divinylbenzolharz mit einem Oberflächenbereich von 630 m²/g, einer Porengröße von 100–200 Å und einer Partikelgröße von 200–800 μm.
CG-161CD: – Styrol/Divinylbenzolharz mit einem Oberflächenbereich von 900 m²/g, einer Porengröße von 110–175 Å und einer Partikelgröße von 80–160 μm.

Vorbereitung der Chromatographie und ECBN-Reinigungsverfahren:
Glassäulen im Größenbereich von 0,2 bis 5 Litern wurden verwendet. Zu den untersuchten chromatographischen Matrizes zählten HP-20, SP-825 und SP-207 (alle erhältlich von Mitsubishi) und CG-161cd (erhältlich von Toso Haas). Die Matrizes wurden chargenweise mit 50/50 Wasser/ACN, 0,1 M Natriumhydroxid und schließlich mit reinem Acetonitril (ACN) vor der Säulenpackung gewaschen. Die Matrix der Wahl wurde in die Säule der entsprechenden Größe unter Anwendung einfacher Aufschlämm-Absetztechniken gepackt. Säulengrößen von weniger als einem Liter wurden unter Verwendung einer herkömmlichen FPLC-Instrumentierung (erhältlich von Pharmacia) betrieben. Die Fünf-Liter-Säulenexperimente wurden unter Verwendung eines Waters Delta Prep 3000-Kontrollsystems durchgeführt.
Die ECBN-Gemische wurden mittels Filtration unter Verwendung von Cuno 30S Filtern vor dem Aufladen auf die jeweiligen Säulen geklärt. Die HP-20- und SP-825-Säulen wurden in 0,5% Essigsäure (HOAc) voräquilibriert, auf einen pH von 5,5 mit Natriumhydroxid (NaOH) eingestellt und mit der geklärten ECBN-Lösung beladen. Die HP-20-Säulen wurden mit etwa 5 bis 5,5 g ECBN/Liter des gepackten Harzes beladen, während die SP-825-Säulen mit etwa 11 bis 12 g/Liter beladen wurden. Nach dem Beladen wurden die Säulen mit 5 Säulenvolumen (CV) des Äquilibrationspuffers gewaschen. Das Produkt wurde unter Verwendung eines kontinuierlichen linearen 5 CV Gradienten im Bereich von 0,5% HOAc (pH = 5,5) bis 4% HOAc (pH = 2,5) eluiert. Am Ende des Gradienten wurden weitere 2 CV der 4% HOAc-Lösung zur Vervollständigung der Elution verwendet. Während der Elution des Produkts wurden 0,2 CV-Fraktionen abgesammelt. Die Fraktionen wurden mittels einer Vielfalt von Umkehrphasen-HPLC-(RP-HPLC)-Methoden charakterisiert, und die entsprechenden Fraktionen wurden zum Erhalt des Hauptstrom-Pools kombiniert. Die Säulen wurden durch Waschen mit einem 3 CV 60/40-Gemisch an ACN und Wasser regeneriert, gefolgt von einem 3 CV 60/40-Gemisch von ACN und 0,1 M NaOH. Die während des Betriebs angewendeten Fließgeschwindigkeiten waren 2 CV/Stunde (150 cm/Stunde) für Beladen, Waschen, Regenerieren und Reäquilibrieren, und 1 CV/Stunde (75 cm/Stunde) für die Elution. Die Hauptstrom-Pools wurden konzentriert.
Zu Vergleichszwecken wurden die folgenden mobilen Phasenbedingungen (organischer Modifikator und pH) und Gradientenelutions-Profile zusätzlich zum Matrixtyp untersucht.
ACN-Modifikator: In Beispielen 1–3 wurde ein 5 CV linearer ACN-Gradient verwendet (pH 5,5 mit einem Acetatpuffer).
Essigsäure-Elution: Über die zuvor beschriebenen Bedingungen hinaus wurde die Konzentration der Essigsäure auf 5% erhöht (Beispiel 10). Ein Stufengradient und ein konvexer Gradient wurden ebenfalls zum oben beschriebenen kontinuierlichen linearen Gradienten sowohl auf der HP-20- als auch der SP-825-Säule verglichen (Beispiele 13–19).
Analytische Charakterisierung der Proben:
Die Qualität und Quantität der ECBN-Chromatographieproben wurden unter Anwendung der folgenden analytischen Methoden ausgewertet.
Phosphatsystem: Eine Zorbox SB C-18, 3,5 μm-Partikel-Säule (0,46 cm ID × 15 cm), wurde mit einer 0,2% Phosphorsäure/ACN-mobilen Phase bei einer Fließgeschwindigkeit von 1,0 ml/min eluiert. Die Säule wurde bei 40°C betrieben, und der Ablauf wurde bei 210 nm überwacht. Die Säule wurde in 1% ACN äquilibriert, und nach der Probeninjektion wurde ein Gradient im Bereich von 1 bis 18,5% ACN über 9 Minuten zum Eluieren des ECBN verwendet. Nach der Elution wurde die Säule mit 50% ACN gewaschen, um jegliche hochgradig zurückgehaltenen Komponenten zu eluieren.
Phosphat/Octansulfonsäure-(OSA)-System: Dieses System ist ähnlich dem oben erörterten Phosphatsystem, mit der Ausnahme, dass die mobile Phase 30 mM OSA enthielt. Die Säule wurde mit 9% ACN äquilibriert. Nach Injektion der Probe wurde die Elution von ECBN mit einem Gradienten im Bereich von 9 bis 24% ACN über 9 Minuten erreicht. Die Säule wurde dann mit 50% ACN gewaschen, um hochgradig zurückgehaltene Komponenten zu eluieren. Die Säulen-Fließgeschwindigkeit und Detektor-Wellenlänge waren wie oben, wobei aber die Säulentemperatur 50°C betrug. Dieses System ist besonders nützlich für die Quantifizierung der Asn-Gln-Leu-H-Tripeptidaldehyd-Komponente.
TFA-System: Eine Vydac C-18, 3,5 μm-Säule (0,46 × 25 cm) wurde für den Assay verwendet. Die mobile Phase enthielt 0,1% TFA, und die Elution wurde unter Verwendung eines linearen ACN-Gradienten von 0 bis 10% über 20 Minuten hinweg erreicht, gefolgt von einer Säulenwäsche von 50%. Die Säulen-Fließgeschwindigkeit, Temperatur und Detektor-Wellenlänge waren dieselben wie für das oben beschriebene Phosphatsystem.
Die Aminosäure-Analyse (AAA) wurde ebenfalls an Proben als einer alternativen Methode zur Bestimmung des Tripeptidgehalts vorgenommen. Die Proben wurden säurehydrolysiert, und die Mole an Asn, Gln und Thr im Hydrolysat wurden durch Ionenaustausch-Chromatographie und Ninhydrin-Derivatisierung bestimmt. Die Thr-Rückgewinnung wurde zur Bestimmung der Mole ECBN in der Probe verwendet, wohingegen der Gln-Gehalt die Tripeptidmengen darstellte. Die Mol-% (M-%) des Asn-Gln-Leu-H-Tripeptids gegenüber ECBN wurden unter Anwendung der folgenden Gleichung berechnet: M-% Asn-Gln-Leu-H = 2 × [Gln]/[Thr]
Die optische Dichte (OD)-Messungen wurden an ausgewählten Proben bei der spezifizierten Wellenlänge zur Auswertung der relativen Probentrübung (OD bei 550 nm) oder des Gesamtproteingehalts (OD bei 280 nm) durchgeführt.
Die folgenden Beispiele sind zur Veranschaulichung, jedoch nicht zur Beschränkung der beanspruchten Erfindung angeführt.
Beispiel 1
Beispiel 1 vergleicht die RP-HPLC-chromatographischen Prozesse unter Anwendung eines Acetonitril-Elutionsschemas mit einem Essigsäure-Elutionsschema in Kombination mit einer Vielfalt von nichtfunktionellen Harzen. In Tabelle 1 sind die Ergebnisse zusammengefasst, die unter Anwendung der entworfenen Elutionsschemata und Säulenmedien beobachtet wurden.
Tabelle 1
In Tabelle 1 bedeuten: *Vergleichsbeispiele; ^aGemessen in Gramm ECBN pro Liter Harz; ^bDesmethyl-Unreinheit bezieht sich auf ein Gemisch aus zwei ECBN-Verbindungen, wobei die Methylgruppe an den Threonin- bzw. der Methylprolin-Peptideinheiten fehlt.
Das (ACN)-Modifikatorschema erzielte eine gute Ausbeute, Gesamtreinheit und Auflösung der Desmethyl-Komponenten; Acetonitril ist allerdings ein organisches Lösungsmittel. Tabelle 1 zeigt ganz klar, dass Essigsäure eine Alternative zum herkömmlichen organischen Lösungsmittel-Elutionsschema darstellt. Die Daten zeigen auch, dass ein kontinuierlicher Gradient von Essigsäure die Auflösung signifikant erhöht, verglichen entweder zu einem Stufengradienten oder konvexen Gradienten der Essigsäure. Obschon die Produktausbeute bei Beispiel 5 (linearer Gradient) etwas geringer ist und das Hauptstrom-Volumen im Vergleich zu Beispiel 4 (Stufengradient) größer ist, ist die ECBN-Gesamtreinheit höher (83% gg. 71%) und der Desmethylgehalt geringer (2% gg. 11%).
Es wird davon ausgegangen, dass die Elution des ECBN aus der hydrophoben Matrix unter Anwendung des Essigsäure-Elutionsprozesses auf zweierlei Weisen erreicht wird: (1) Essigsäure wirkt als ein organischer Modifikator, wodurch die Elutionsstärke der mobilen Phase erhöht wird; und (2) der niederere pH des B-Lösungsmittels (starkes Elutionslösungsmittel, pH = 2,5) dient zur Protonierung der Amin-Funktionalität von ECBN, wodurch es polarer und damit weniger durch die hydrophobe stationäre Phase zurückgehalten wird. Sowohl der organische Modifikator als auch der pH-Wert, die die 4% Essigsäurelösung beeinflussen, sind beim Vergleich der Beispiele 8 und 9 erkennbar. In Beispiel 9 wurde 100 mM Phosphorsäure (pH = 2,5) für die 4% HOAc (pH = 2,5) als dem B-Lösungsmittel substituiert. Hing die Elution des ECBN lediglich vom pH der mobilen Phase ab, so sollten die Elutionsposition und Rückgewinnung an ECBN ähnlich den in Beispiel 8 beobachteten sein. In der Tat ergab die Phosphatelution lediglich etwa 50% Rückgewinnung des ECBN und zeigte der Produkt-Peak einen signifikanten Grad an Tailing (Unsymmetrie). Somit kann die 4% HOAc eine Elution sowohl durch Herabsetzen des pH der mobilen Phase als auch durch Erhöhen der Elutionsstärke der mobilen Phase zustande bringen, indem er als ein organischer Modifikator dient.
Essigsäure bietet auch eine größere Selektivität als Acetonitril. Werden die RP-HPLC-Chromatogramme für die aus HP-20-Säulen gesammelten Hauptströme, die mit ACN gg. HOAc (Beispiele 1 bzw. 5) eluiert wurden, verglichen, so wurde die Abwesenheit von Untergrund-(backside)-Unreinheiten im unter Verwendung von HOAc eluierten Hauptstrom beobachtet. Im HOAc-Elutionsschema werden diese Komponenten nicht eluiert, bis die Säule regeneriert ist.
Beispiel 2
In Beispiel 2 werden die chromatographischen Prozesse unter Verwendung eines Einsäulen/linearen Essigsäure-Elutionsschemas (oben beschrieben) mit einem Zweisäulen/konvexen Acetonitril-Elutionsschema verglichen. Außerdem wird ein Vergleich zwischen unbehandelten Chargen von ECBN (Beispiele 2–8 und 2–10) mit ECBN-Chargen, die mit Natriummetabisulfit vor der Reinigung an der Säule behandelt wurden (Beispiele 2–7 und 2–9), beschrieben. Die Vorbehandlung mit Natriummetabisulfit wurde durch einfaches Zugeben von 10 mM Natriummetabisulfit zur Säulenladung und Rühren der Lösung für einen Zeitraum von 6–18 Stunden erreicht. Der Einsäulen-Prozess ist derselbe wie oben unter Verwendung eines Essigsäure-Elutionsschemas mit einem linearen Gradienten beschrieben.
Der zum Vergleich dienende Zweisäulen-Prozess verwendet zwei HP-20-Säulen, die in einer Vorsäulen-Hauptsäulen-(lead-trail)-Konfiguration betrieben werden. Eine Fermentationsbrühe wird auf zwei in Reihe geschaltete HP-20-Säulen aufgeladen. Jegliches ECBN, das nicht durch die erste Säule zurückgehalten wird, wird an der zweiten Säule konzentriert. Das ECBN wird vorausgesetztermaßen in etwa gleichen Anteilen zwischen den beiden Säulen verteilt. Nach der Beladung wird die Vorsäule (lead column) aus der Reihenschaltung abgekoppelt und mit 3,8 Säulenvolumen (CV) Wasser gewaschen. Die Elution der Vorsäule wird durch Waschen mit 3,3 CV an 5% HOAc erreicht. Der Hauptstrom aus der ersten Säule wird auf einen pH von 5,0 eingestellt und auf die teilweise beladene zweite Hauptsäule (trail column) gespeist. Die Säule wird mit 6,3 CV Wasser vor der Elution gewaschen. Ein konvexer Acetonitril-Gradient (0–9,4% gegenüber etwa 5 CV, enthaltend 0,5% HOAc) wird zum Eluieren der Säule verwendet. Der Säulenablauf wird fraktioniert, und die Fraktionen mit der gewünschten Reinheit (größer als 75% Umkehrphasen-HPLC-Hauptpeak-Reinheit und weniger als 10% Desmethyl-Komponente) werden als dem Hauptstrom gepoolt. Die gepoolte Lösung wird dann konzentriert.
Tabelle 2 vergleicht die Ergebnisse, die für den Einsäulen- gegenüber dem Zweisäulen-chromatographischen Prozess und den behandelten gegenüber den unbehandelten ECBN-Fermentationsbrühen beobachtet wurden.
Tabelle 2
In Tabelle 2 bedeuten: ^aDie berichteten Werte stehen für den Mittelwert aus zwei unabhängigen Kristallisationen und analytischen Bestimmungen; ^b%-Hauptpeak gegenüber gesamter RP-HPLC-Peakfläche; ^c% Desmethyl-Unreinheiten; ^dECBN/OD = Gramm ECBN (RP-HPLC)/Gesamt-OD in Gramm; wobei die OD in Gramm die OD bei 280 nm ist und ein E_0,1% von 1,0 zugrunde gelegt ist; ^eEine der beiden Chargen wies einen hohen Wassergehalt auf; daher war die mittlere Potenz reduziert.
Die oben berichteten analytischen Ergebnisse für die ECBN-Reinheit wurden erhalten, nachdem die Hauptströme konzentriert worden waren. Sowohl die Umkehrphasen-HPLC-Hauptpeak-Reinheit als auch die Desmethylmengen sind für die Einzel-HP-20- und SP-825-Säulen-Experimente ähnlich. Der Einzel-HP-20-Betrieb erbrachte jedoch durchwegs eine geringfügig größere Reduktion bei der Desmethyl-Komponente. Allgemein ist die ECBN-Umkehrphasen-HPLC-Reinheit des Einsäulen-Prozesses äquivalent zu oder besser als die ECBN-Reinheit aus den beiden Säulenprozessen, was eine wirtschaftlichere Methode der Reinigung bietet.
Keines der Säulenreinigungsschemata war zu einer signifikanten Verminderung der Menge an Tripeptid fähig; die Vorbehandlung mit Natriumbisulfit verminderte jedoch die Menge an Tripeptid-Unreinheiten signifikant. Die ECBN/OD-Reinheit des Produkts aus den Einsäulen-Studien war äquivalent zu oder größer als die, die in den Zweisäulen-Studien erhalten wurde. Obschon der ECBN/OD-Wert kein Absolutmaß der Reinheit darstellt, bietet er einen guten relativen Vergleich der ECBN-Reinheit, die aus den verschiedenen Säulenbetrieben resultiert. Alle Säulenbetriebe ergaben einen 10–15fachen Anstieg der ECBN/OD-Reinheit, wenn die Werte der Säuleneinspeiselösungen (Daten nicht gezeigt) zu denen der konzentrierten Hauptströme verglichen werden.

Claims

Verfahren zum Abtrennen und Ausreinigen deacylierter Echinocandin-Verbindungen, umfassend die folgenden Schritte: (i) Bereitstellen eines Gemischs, umfassend eine deacylierte Echinocandin-Verbindung, an die wenigstens eine protonierbare Aminogruppe angelagert ist; (ii) Adsorbieren des Gemischs an ein hydrophobes Umkehrphasenchromatographisches Medium; (iii) Eluieren der deacylierten Echinocandin-Verbindung mit einem kontinuierlichen, nahezu linearen Essigsäure-Gradienten im Bereich von 0,1% Essigsäure bis 10,0% Essigsäure nach Volumen in Wasser; und (iv) Gewinnen der deacylierten Echinocandin-Verbindung.
Verfahren nach Anspruch 1, worin der Essigsäure-Gradient im Bereich von 0,5% Essigsäure bis 4,0% Essigsäure nach Volumen in Wasser liegt.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, worin die deacylierte Echinocandin-Verbindung dargestellt ist durch die folgende Struktur:
worin R1 -H oder -OH ist; R2 -H oder CH₃ ist; R3 -H, -CH₃, -CH₂CONH₂ oder -CH₂CH₂NH₂ ist; R4 -H oder -OH ist; R5 -OH, -OPO₃H₂ oder -OSO₃H ist; R6 -H oder -OSO₃H ist, und R7 CH₃ ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1–3, worin das hydrophobe Umkehrphasen-Medium ein organisches Polymer ist.
Verfahren nach Anspruch 4, worin das organische Polymer ein Copolymer von Styrol und Divinylbenzol oder ein Methacrylat-Polymer ist.
Verfahren nach Anspruch 4 oder 5, worin das organische Polymer ein Styrol/-Divinylbenzolharz mit einem Oberflächenbereich von 500 m²/g, einer Porengröße von 200–300 Å und einer Partikelgröße von 200–800 μm; oder ein Styrol/Divinylbenzolharz mit einem Oberflächenbereich von 1.000 m²/g, einer Porengröße von 50–60 Å und einer Partikelgröße von 250–600 μm ist.
Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, worin das Gemisch ein Produkt aus einer gemischten Brühe ist.
Verfahren zum Ausreinigen deacylierter Echinocandin-Verbindungen aus einem Gemisch, enthaltend ein Tripeptidaldehyd-Nebenprodukt, weiches die folgenden Schritte umfasst: (i) Bereitstellen eines Gemischs aus einer deacylierten Echinocandin-Verbindung und einem Tripeptidaldehyd-Nebenprodukt; (ii) Zugeben eines Derivatisierungsmittels zu dem Gemisch zur Erzeugung eines derivatisierten Tripeptidaldehyd-Nebenprodukts; und (iii) Trennen der deacylierten Echinocandin-Verbindung von dem derivatisierten Tripeptidaldehyd-Nebenprodukt unter Anwendung der hydrophoben Umkehrphasen-Chromatographie und Eluieren mit einem kontinuierlichen, nahezu linearen Essigsäure-Gradienten.
Verfahren nach Anspruch 8, wobei der kontinuierliche, nahezu lineare Essigsäure-Gradient ein Gradient im Bereich von 0,1% Essigsäure bis 10,0% Essigsäure nach Volumen in Wasser ist.
Verfahren nach Anspruch 8 oder 9, wobei der Trennschritt (iii) umfasst: (a) Adsorbieren des Gemischs aus dem derivatisierten Tripeptidaldehyd-Nebenprodukt und der deacylierten Echinocandin-Verbindung an ein hydrophobes Umkehrphasen-chromatographisches Medium; (iii) Eluieren der deacylierten Echinocandin-Verbindung mit einem kontinuierlichen, nahezu linearen Essigsäure-Gradienten im Bereich von 0,1% Essigsäure bis 10,0% Essigsäure nach Volumen in Wasser.
Verfahren nach einem der Ansprüche 8–10, wobei die deacylierte Echinocandin-Verbindung dargestellt ist durch die folgende Struktur:
worin R1 -H oder -OH ist; R2 -H oder CH₃ ist; R3 -H, -CH₃, -CH₂CONH₂ oder -CH₂CH₂NH₂ ist; R4 -H oder -OH ist; R5 -OH, -OPO₃H₂ oder -OSO₃H ist; R6 -H oder -OSO₃H ist, und R7 CH₃ ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 8–11, wobei das Aldehyd-Nebenprodukt dargestellt ist durch die folgende Struktur:
worin R -C(O)CH₂CH(OH)C₉H₁₉ oder ein Wasserstoff ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 8–12, wobei das Gemisch ein Produkt aus einer Fermentationsbrühe ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 8–13, wobei das Gemisch ein Produkt aus einer gemischten Fermentationsbrühe ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 8–14, wobei das Derivatisierungsmittel ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Natriumbisulfit, Hydroxylamin und Semicarbazidhydrochlorid.
Verfahren nach Anspruch 15, wobei das Derivatisierungsmittel Natriumbisulfit ist.