JP2003511345A - Ｅｃｈｉｎｏｃａｎｄｉｎシクロペプチド化合物の精製 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、少なくとも１個のプロトン化可能なアミノ基を含む、広範な種々の発酵シクロペプチド産物（脱アシル化Ｅｃｈｉｎｏｃａｎｄｉｎ型化合物を含む）を、これらの発酵または混合ブロスから分離および精製する方法、ならびに混合物を疎水性の逆相クロマトグラフィー媒体上に吸着させる工程、および水中、０．１体積％の酢酸〜１０．０体積％の酢酸（好ましくは、０．５％（ｐＨ＝５．５）〜４．０％（ｐＨ＝２．５）の酢酸）の範囲の連続したほぼ直線的な勾配で溶出する工程によって、部分的に精製されるプロセスストリームを提供する。トリペプチドアルデヒド副産物を、誘導体化剤の手段により発酵産物から取り除くプロセスがまた、記載される。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 （技術分野） 本発明は、少なくとも１個のプロトン化可能なアミノ基を含むシクロペプチド
化合物を精製するためのプロセスに関し、特に、疎水性の逆相クロマトグラフィ
ー媒体に吸着させ、そして連続したほぼ直線的な勾配で増加する酢酸で溶出する
ことによる、Ｅｃｈｉｎｏｃａｎｄｉｎ型化合物の精製に関する。精製プロセス
はまた、Ｅｃｈｉｎｏｃａｎｄｉｎ発酵プロセスのトリペプチド−アルデヒド副
産物を選択的に除去する工程を提供し、より高純度のＥｃｈｉｎｏｃａｎｄｉｎ
化合物を得る。

【０００２】 （背景技術） Ｅｃｈｉｎｏｃａｎｄｉｎシクロペプチドは、抗真菌活性を有することが示さ
れている天然産物である。Ｅｃｈｉｎｏｃａｎｄｉｎシクロペプチドファミリー
に含まれるのは、例えば、Ｅｃｈｉｎｏｃａｎｄｉｎ Ｂ（ＥＣＢ）、Ｅｃｈｉ
ｎｏｃａｎｄｉｎ Ｃ、Ａｃｕｌｅａｃｉｎ Ａγ、Ｍｕｌｕｎｄｏｃａｎｄｉ
ｎ、Ｓｐｏｒｉｏｆｕｎｇｉｎ Ａ、Ｐｎｅｕｍｏｃａｎｄｉｎ Ａ₀、ＷＦ１
１８９９Ａ、およびＰｎｅｕｍｏｃａｎｄｉｎ Ｂ₀のような天然産物である。
この天然産物は、代表的に、種々の微生物を培養することによって産生される。
例えば、Ｅｃｈｉｎｏｃａｎｄｉｎ Ｂは、真菌（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎ
ｉｄｕｌａｎｓ）の発酵から産生される。

【０００３】 より活性な物質を調査する際に、この天然産物は、種々の方法で修飾されきた
。最も通常の修飾の１つは、天然産物上のＮ−アシル側鎖の置換であり、半合成
誘導体を産生する。例えば、米国特許第４，２９３，４８９号；同第４，３２０
，０５２号；同第５，１６６，１３５号；および同第５，５４１，１６０号；な
らびにＥＰ３５９５２９；４４８３５３；４４７１８６；４６２５３１；および
５６１６３９は、種々の程度の抗真菌活性を提供する、種々のＮ−アシル誘導体
化Ｅｃｈｉｎｏｃａｎｄｉｎ化合物を記載する。

【０００４】 Ｎ−アシル誘導体は、天然産物を脱アシル化し、次いで異なるアシル基で再び
アシル化することにより産生される。この脱アシル化は、代表的に、酵素（例え
ば、デアシラーゼ酵素）によって達成される。このデアシラーゼ酵素は、微生物
（Ａｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｓ ｕｔａｈｅｎｓｉｓまたはＰｓｅｕｄｏｍｏｎａ
ｓ種）から得られ得る。すなわち米国特許第４，２９３，４８２号；および同第
４，３０４，７１６号；ならびにＥＰ４６０，８８２を参照のこと。脱アシル化
化合物は、代表的に、対応する天然産物の核として言及される（すなわち、Ｅｃ
ｈｉｎｏｃａｎｄｉｎ Ｂの脱アシル化産物は、Ｅｃｈｉｎｏｃａｎｄｉｎ Ｂ
核（ＥＣＢＮ）として言及される）。あいにく、発酵および脱アシル化プロセス
の両方は、除去することが困難な数種の副産物を産生し、そして所望の脱アシル
化環状ペプチド核の純度を低下させる。

【０００５】 米国特許第４，８７４，８４３は、Ｅｃｈｉｎｏｃａｎｄｉｎ型産物を精製す
るために、逆モード（ｒｅｖｅｒｓｅｄ ｍｏｄｅ）で非機能性樹脂を使用する
クロマトグラフィープロセスを記載する。このプロセスは、発酵プロセスから誘
導される産物の純度を改善するにもかかわらず、さらなる改善物は、中間体の脱
アシル化核と最終のアシル化された薬学的に活性な化合物の両方からの分離が困
難な不純物を除去することをさらに必要とする。最終の薬学的な産物の効力は、
最終産物を作製するために使用される中間体の純度に依存するので、製造プロセ
スの任意の段階での純度の改善が、非常に所望される。理想的に、この不純物は
、製造プロセス中で可能な最も初期の段階で除去される。

【０００６】 非機能性樹脂およびそれらの液体クロマトグラフィー分離での適用の一般的な
議論は、Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ，２０１，２８７−２９２（１９８
０）およびＧｒｉｅｓｅｒ，Ｍ．Ｄ．ら、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓ
ｔｒｙ，４５，１３４８−１３５３（１９７３）に見出され得る。工程または連
続勾配のいずれかの使用が記載されているが、この溶出液は、有意な量の有機溶
媒を含む。製造プロセスにおいて、有機溶媒の使用により、環境規制（例えば、
空気の質の排出基準）、特別な取り扱い条件（例えば、引火性基準）および処理
限度（たとえば、毒物廃棄規制）のようないくつかの関心事が、生じる。従って
、有機溶媒の使用を最小にし、混合物を純粋な成分にさらに効果的に分離する溶
出システムの必要性が、存在する。

【０００７】 （発明の開示） 本発明は、少なくとも１個のプロトン化可能なアミノ基を含む、広範な種々の
発酵シクロペプチド産物（脱アシル化Ｅｃｈｉｎｏｃａｎｄｉｎ型化合物を含む
）を、これらの発酵または混合ブロスから分離および精製する方法、ならびに混
合物を疎水性の逆相クロマトグラフィー媒体上に吸着させる工程、および水中、
０．１体積％の酢酸〜１０．０体積％の酢酸（好ましくは、０．５％（ｐＨ＝５
．５）〜４．０％（ｐＨ＝２．５）の酢酸）の範囲の連続したほぼ直線的な勾配
で溶出する工程によって、部分的に精製されるプロセスストリームを提供する。

【０００８】 本発明の別の実施形態において、Ｅｃｈｉｎｏｃａｎｄｉｎ型化合物（そらら
の単純な誘導体を含む）を精製するためのプロセスが提供され、ここで、発酵混
合物または部分的に精製された混合物中のアルデヒド副産物（特に、トリペプチ
ド−アルデヒド副産物）は、誘導体化剤と反応する。好ましくは、発酵ブロスま
たは混合ブロスを、上記の方法を使用して、対応するＥｃｈｉｎｏｃａｎｄｉｎ
核を精製する前に、誘導体化剤と反応させる。

【０００９】 本明細書中で使用されるように、用語「誘導体化剤」とは、トリペプチド副産
物のアルデヒド官能基と反応して、所望のＥｃｈｉｎｏｃａｎｄｉｎ型化合物か
らトリペプチド中間体の分離を可能にするのに、十分異なる疎水性である中間体
を産生し得る試薬のことを言う。

【００１０】 用語「プロトン化可能なアミノ基」とは、本発明の溶出条件（すなわち、水中
、０．１体積％の酢酸〜１０体積％の酢酸）に供された場合にプロトン化を受け
るアミノ基のことを言う。

【００１１】 用語「Ｅｃｈｉｎｏｃａｎｄｉｎ型化合物」とは、以下の一般構造（その任意
の単純な誘導体を含む）：

【００１２】

【化４】 を有する化合物を言い、ここで、Ｒは、水素または−Ｃ（Ｏ）Ｒ’であり、ここ
で、Ｒ’は、連結した少なくとも１個のプロトン化可能なアミノ基に付加したア
ルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アリール基、またはヘテロアリール基
であり；Ｒ１は、−Ｈまたは−ＯＨであり；Ｒ２は、−Ｈまたは−ＣＨ₃であり
；Ｒ３は、−Ｈ、−ＣＨ₃、−ＣＨ₂ＣＯＮＨ₂または−ＣＨ₂ＣＨ₂ＮＨ₂であり；
Ｒ４は、−Ｈまたは−ＯＨであり；Ｒ５は、−ＯＨ、−ＯＰＯ₃Ｈ₂、または−Ｏ
ＳＯ₃Ｈであり；そしてＲ６は、−Ｈまたは−ＯＳＯ₃Ｈである。「Ｅｃｈｉｎｏ
ｃａｎｄｉｎ核」とは、Ｒが水素である脱アシル化Ｅｃｈｉｎｏｃａｎｄｉｎ化
合物を言う。「ＥＣＢＮ」とは、Ｅｃｈｉｎｏｃａｎｄｉｎ Ｂ核を言い、ここ
で、Ｒ１、Ｒ４およびＲ５は、ヒドロキシル基であり、Ｒ２、Ｒ３、およびＲ７
は、メチル基であり；そしてＲ１およびＲ６は、水素である。

【００１３】 用語「アルキル」とは、他に述べない限り、１〜３０個の炭素原子を含む一般
式Ｃ_nＨ_2n+1の炭化水素基をいう。アルカン基は、直鎖（例えば、メチル、エチ
ル、プロピル、ブチルなど）、分枝鎖（例えば、イソプロピル、イソブチル、ｔ
ｅｒｔ−ブチル、ネオペンチルなど）、環式（例えば、シクロプロピル、シクロ
ブチル、シクロペンチル、メチルシクロペンチル、シクロヘキシルなど）、また
は多環式（例えば、ビシクロ［２．２．１］ヘプタン、スピロ［２．２］ペンタ
ンなど）であり得る。アルカン基は、置換されていても、または置換されていな
くともよい。同様に、アルコキシ基またはアルカノエートのアルキル部分は、上
記と同様の定義を有する。

【００１４】 用語「アルケニル」とは、少なくとも１つの炭素−炭素二重結合を含む非環式
炭化水素をいう。アルケン基は、直鎖、分枝鎖、環式、または多環式であり得る
。アルケン基は、置換されていても、または置換されていなくてもよい。

【００１５】 用語「アルキニル」とは、少なくとも１つの炭素−炭素三重結合を含む非環式
炭化水素をいう。アルキン基は、直鎖または分枝鎖であり得る。アルキン基は、
置換されていても、または置換されていなくともよい。

【００１６】 用語「アリール」とは、単環系（例えば、フェニル）または縮合環系（例えば
、ナフタレン、アントラセン、フェナントレンなど）を有する芳香族部分をいう
。アリール基は、置換されていても、または置換されていなくともよい。

【００１７】 用語「ヘテロアリール」とは、芳香族環系内に少なくとも１つのヘテロ原子を
含む芳香族部分をいう（例えば、ピロール、ピリジン、インドール、チオフェン
、フラン、ベンゾフラン、イミダゾール、ピリミジン、プリン、ベンズイミダゾ
ール、キノリンなど）。芳香族部分は、単環系または縮合環系からなり得る。ヘ
テロアリール基は、置換されていても、または置換されていなくともよい。

【００１８】 有機化学の分野において、および特に有機生物化学の分野において、化合物の
有意な置換は許容されるかまたはさらに有用であると広く理解される。本発明に
おいて、例えば、用語アルキル基は、典型的なアルキル（例えば、メチル、エチ
ル、プロピル、ヘキシル、イソオクチル、ドデシル、ステアリルなど）である置
換基を許容する。用語「基」は、当該分野で一般的であるアルキルにおける置換
基（例えば、ヒドロキシ、ハロゲン、アルコキシ、カルボニル、ケト、エステル
、カルバメート（ｃａｒｂａｍａｔｏ）など）（ならびに非置換アルキル部分を
含む）を、特に想定し、そしてこれを許容する。しかし、この化合物の薬理学的
な特性に悪影響を与えず、またはこの医薬の用途に不利に干渉しないように、置
換基は選択されるべきであることが、当業者によって、一般的に理解される。上
記で定義される任意の基について適切な置換基としては、アルキル、アルケニル
、アルキニル、アリール、ハロ、ヒドロキシ、アルコキシ、アリールオキシ、メ
ルカプト、アルキルチオ、アリールチオ、モノ−およびジ−アルキルアミノ、４
級アンモニウム塩、アミノアルコキシ、ヒドロキシアルキルアミノ、アミノアル
キルチオ、カルバミル、カルボニル、カルボキシ、グリコリル、グリシル、ヒド
ラジノ、グアニル、ならびにそれらの組み合わせが挙げられる。

【００１９】 （発明を実施するための最善の様式） 醗酵ブロスおよび混合ブロスは、所望の環状ペプチド産物から分離するのが非
常に困難である多数の副産物を含む。「混合ブロス（ｍｉｘｅｄ ｂｒｏｔｈ）
」とは、変換混合物（ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ ｍｉｘｔｕｒｅ）をいい、ここで
、醗酵ブロスは、精製なしに脱アシル化酵素によって直接処理され、脱アシル化
産物（例えば、ＥＣＢＮ）を生成する。逆相液体クロマトグラフィーは、合理的
な成功で過去においてし使用されてきた；しかし、より高い純度の化合物につい
ての必要性が、精製のより改善された方法を必要とする。プロトン化可能な（ｐ
ｒｏｔｏｎａｂｌｅ）アミノ基を含む所望の醗酵産物からの醗酵副産物の分離が
、連続のほぼ直線的な酢酸溶出スキームと組み合わせて逆相クロマトグラフィー
媒体を使用することによって改善され得る、適用が、発見された。

【００２０】 適切な疎水性クロマトグラフィー媒体としては、逆相シリカ、および有機ポリ
マー（例えば、スチレンおよびジビニルベンゼンのコポリマー、メタクリレート
ポリマー）が挙げられる。種々の逆相シリカは、種々の専門業者から市販される
（例えば、ＢＴＲ、Ｅ．Ｍｅｒｃｋ、Ｅｋａ Ｎｏｂｅｌ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ
、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ、Ｗｈａｔｍａｎ、またはＹＭＣ）。シリカは、Ｃ₁〜
Ｃ₁₈（Ｃ₁、Ｃ₄、Ｃ₈およびＣ₁₈が最も一般的である）の長さにわたる直鎖アル
キル炭化水素あるいは他の疎水性リガンド（例えば、フェニルまたはシアノ）で
誘導される。例えば以下の、逆相液体クロマトグラフィーのために設計される種
々のスチレン／ジビニルベンゼン樹脂がまた、市販される：Ｄｉａｉｏｎ^TMＨＰ
およびＳＰ樹脂（Ｍｉｔｓｕｂｉｓｈｉ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉ
ｅｓ Ｌｉｍｉｔｅｄ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）、およびＡｍｂｅｒｌｉｔｅ
ＸＡＳ−２、４、および１６樹脂（Ｒｏｈｍ ａｎｄ Ｈａｓｓ Ｃｈｅｍｉ
ｃａｌ Ｃｏ．，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ）、ならびにＣＧ−１６１、
３００、および１０００Ａｍｂｅｒｃｈｒｏｍ樹脂（Ｔｏｓｏ Ｈａｓｓ（Ｍｏ
ｎｔｇｏｍｅｒｙｖｉｌｌｅ，ＰＡ））。非機能性樹脂は、一般的に、それらの
ポアー容積（ｐｏｒｅ ｖｏｌｕｍｅ）（０．５〜４．５ｍｌ／ｇ）、特異的表
面積（２００〜８００ｍ²／ｇ）、ポアー直径（４０〜１３００Å）、ポアーサ
イズ分布および／またはビーズサイズ分布によって特徴付けられる。好ましい非
機能性樹脂としては、５００ｍ²／ｇの表面積、２００〜３００Åのポアーサイ
ズおよび２００〜８００μｍの粒子サイズを有するＤｉａｉｏｎ ＨＰ−２０；
１，０００ｍ²／ｇの表面積、５０〜６０Åのポアーサイズおよび２５０〜６０
０μｍの粒子サイズを有するＳＰ−８２５；６３０ｍ²／ｇの表面積、１００〜
２００Åのポアーサイズおよび２００〜８００μｍの粒子サイズを有するＳＰ−
２０７（ＨＰ−２０のブロム化型）；ならびに９００ｍ²／ｇ表面積、１１０〜
１７５Åのポアーサイズおよび８０〜１６０μｍの粒子サイズを有するＣＧ−１
６１ＣＤ。ＨＰ−２０およびＳＰ−８２５樹脂が、より好ましい。

【００２１】 最初に、少なくとも１つのプロトン化可能なアミノ基を有する所望の環状ペプ
チド化合物を含む、粗溶液または部分的に精製された溶液が、提供される。一般
的に、このアミノ基は、５．５〜２．５のｐＨ範囲にわたる一連の酢酸勾配の間
でプロトン化され得る。好ましくは、このアミノ基は、１級アミンであり；しか
し、このアミノ基は、窒素原子におけるさらなる置換基が、それらが正に荷電し
たアミンの極性に打ち勝つに十分に疎水性でない限り、２級アミンまたは３級ア
ミンであってもよい。溶液は、醗酵プロセスまたは合成プロセスから誘導され得
る。例えば、環状ペプチド化合物は、米国特許第５，６９６，０８４号；Ｊ．Ａ
ｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１０８，６０４１（１９８６）；Ｅｖａｎｓ，Ｄ．Ａ
．ら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１０９，５１５１（１９８７）；Ｊ．Ｍ
ｅｄ．Ｃｈｅｍ．，３５，２８４３（１９９２）；およびＫｕｒｏｋａｗａ，Ｎ
．ら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，４９，６１９５（１９９３）に記載される合成
方法によって調製され得る。粗溶液は、通常、混合ブロスである。あるいは、こ
のプロセスは、部分的に精製された物質をさらに精製（または磨く（ｐｏｌｉｓ
ｈ））ために使用され得る。

【００２２】 使用される特定の醗酵プロセスに依存して、クロマトグラフィープロセスと相
互作用し得る粒子を除去するために、この溶液を予め濾過することが所望され得
る。濾過は、当業者に公知の任意の種々の手段によって達成され得る、これは、
Ｃｅｌｉｔｅ^TMフィルター補助などを含むかまたは含まないセラミックフィルタ
ーを通しての重力濾過、真空濾過を含む。醗酵ブロス中の固体はまた、遠心分離
に続いてこの固体から液体をデカンテーションすることによって除去され得る。

【００２３】 醗酵溶液は、所望である場合、当業者に周知である種々の手段（例えば、蒸発
濃縮（ｅｖａｐｏｒａｔｉｖｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ）、凍結乾燥など
）をまた使用して濃縮され得る。この濃縮物は２回濾過されて、濃縮プロセスの
間に形成されてい得る任意の沈殿物が除去され得る。

【００２４】 粗溶液または部分的に精製された溶液が、上述の疎水性クロマトグラフィー媒
体の１つが詰められたクロマトグラフィーカラムに充填される。次いで、所望の
環状ペプチド産物が、約０．１％酢酸〜約１０％酢酸、好ましくは約０．５％酢
酸（ｐＨ＝５．５）〜約４％酢酸（ｐＨ＝２．５）の範囲の連続するほぼ直線的
な勾配を使用して、クロマトグラフィー媒体から溶出される。選択される酢酸濃
度の範囲の上限は、使用されるクロマトグラフィー培地の安定性、およびそのｐ
Ｈで精製される化合物の安定性に基づく。この範囲の下限は、アミノ基がプロト
ン化されるｐＨ、およびこの疎水性表面から産物が溶出されるために必要とされ
る酢酸の濃度に基づく。当業者は、勾配が完全に直線である必要はないことを理
解する。「ほぼ直線」の意味内に、平坦な凸または凹勾配を含む。

【００２５】 勾配溶出プロセス工程の終わりで、さらなる容積のより高い濃度の酢酸溶液が
、溶出を完全にするために、典型的に使用される。このプロセスの終わりで、カ
ラムが、再生され得、その結果、このカラムは、さらなる精製サイクルのために
再使用され得る。再生工程は、典型的に、中性およびアルカリｐＨの両方で有機
溶媒および水の混合物でこのカラムを洗浄して、カラムマトリック上に残存する
任意の残りの物質を除去する工程を包含する。適切な溶媒としては、アセトニト
リル、メタノール、イソプロパノール、およびアセトンが挙げられる。直線的な
酢酸溶出スキームは、良好な選択性（例えば、以下の実施例１を参照のこと）を
提供するだけでなく、カラム操作の再生工程に対する有機溶媒の使用を制限する
。従って、使用される有機溶媒の絶対量および処分される前に処理されなければ
ならないカラム溶出液の容積の両方が、最小化される。

【００２６】 醗酵産物は、種々の方法を使用して溶出液から回収され得る。適切な回収方法
としては、結晶化、蒸発濃縮、および凍結乾燥が挙げられる。

【００２７】 Ｅｃｈｉｎｏｃａｎｄｉｎ Ｂについての両方の醗酵は、以下の化学構造（Ｉ
ａ）を有する種々のレベルのトリペプチド−アルデヒド（Ａｓｎ−Ｇｌｎ−Ｌｅ
ｕ−Ｈ）副産物を含む。トリペプチド−アルデヒド副産物は、脱アシル化を受け
、ならびにＥｃｈｉｎｏｃａｎｄｉｎ Ｂは、酵素による脱アシル化プロセスの
間に、対応する脱アシル化トリペプチド−アルデヒド（Ｉｂ）を形成する：

【００２８】

【化５】 ここで、Ｒは、Ｃ（Ｏ）ＣＨ₂ＣＨ（ＯＨ）Ｃ₉Ｈ₁₉（Ｉａ−醗酵副産物）または
水素（Ｉｂ−混合ブロスからの脱アシル化副産物）である。

【００２９】 驚くべきことに、脱アシル化トリペプチド−アルデヒドの保持時間は、逆相液
体クロマトグラフィーにおいてＥＣＢＮと非常に類似しており（最適化溶出下で
さえ）、従って、脱アシル化トリペチド−アルデヒド（Ｉｂ）を所望のＥＣＢＮ
から分離することは非常に困難である。このトリペプチドが除去されない場合、
このトリペプチドの遊離のアミノ基は、再アシル化プロセスの間、ＥＣＢＮ化合
物の遊離のアミノ基と競合する。結果として、過剰のアシル化化合物が、ＥＣＢ
Ｎ化合物の完全なアシル化を確実にするために、添加されなければならない。ト
リペプチド不純物は、必要とされる出発物質を消費するだけでなく、アシル化Ｅ
ＣＢ化合物の引き続いての精製において除去することが困難であるアシル化副産
物をまた生成する。好ましくは、トリペプチド副産物は、ＥＣＢＮ化合物の再ア
シル化の前に除去される。

【００３０】 トリペプチド−アルデヒド副産物は、クロマトグラフィー精製の前に誘導体化
剤（ｄｅｒｉｖａｔｉｚｉｎｇ ａｇｅｎｔ）とアルデヒドを反応させることに
よって、醗酵混合物または混合ブロス（すなわち、脱アシル化混合物）のいずれ
かから除去され得る。誘導体化剤は、所望のＥＣＢ化合物に対して、トリペプチ
ド−アルデヒドのクロマトグラフィー保持時間を変化させるために、アルデヒド
官能基に添加され得る。適切な誘導体化剤としては、二硫化ナトリウム、ヒドロ
キシルアミンおよびセミカルバジドヒドロクロリドが挙げられる。クロマトグラ
フィー保持時間を調節する他の手段と対比して、誘導体化剤を使用することのい
くつかの利点は、アルデヒド官能基についての誘導体化剤の選択性およびこの反
応が生じる穏やかな条件である。誘導体化剤とトリペプチド−アルデヒドとの間
の反応が可逆性である場合、アルデヒドは、誘導体化剤を除去することによって
容易に回収され得る。回収されたトリペプチドは、次いで、他の目的のために使
用され得る。

【００３１】 （実施例） 以下の略語は、それぞれの列挙される物質を表すために、実施例を通じて使用
される ＡＣＮ：アセトニトリル ＴＦＡ：トリフルオロ酢酸 ＨＰ−２０：５００ｍ²／ｇの表面領域、２００Å〜３００Åのポアー径、お
よび２００μｍ〜８００μｍの粒子サイズを有するスチレン／ジビニルベンゼン
樹脂 ＳＰ−８２５：１，０００ｍ²／ｇの表面領域、５０Å〜６０Åのポアー径、
および２５０μｍ〜６００μｍの粒子サイズを有するスチレン／ジビニルベンゼ
ン樹脂 ＳＰ−２０７：６３０ｍ²／ｇの表面領域、１００Å〜２００Åのポアー径、
および２００μｍ〜８００μｍの粒子サイズを有する臭素化されたスチレン／ジ
ビニルベンゼン樹脂 ＣＧ−１６１ＣＤ：９００ｍ²／ｇの表面領域、１１０Å〜１７５Åのポアー
径、および８０μｍ〜１６０μｍの粒子サイズを有するスチレン／ジビニルベン
ゼン樹脂 （クロマトグラフ調製およびＥＣＢＮ精製手順：） ０．２リットル〜５リットルのサイズの範囲で、ガラスカラムを使用した。Ｈ
Ｐ−２０、ＳＰ−８２５およびＳＰ−２０７（全て、Ｍｉｔｓｕｂｉｓｈｉから
入手可能）ならびにＣＧ−１６１ｃｄ（Ｔｏｓｏ Ｈａｓｓから入手可能）を含
むこのクロマトグラフマトリックスを研究した。このマトリックスを、カラム充
填の前に、５０／５０の水／ＡＣＮ、０．１Ｍの水酸化ナトリウム、および最終
的に純粋なアセトニトリル（ＡＣＮにより）バッチ洗浄した。単純スラリー沈降
技術を使用して、この選り抜きのマトリックスを適切なサイズのカラム中に充填
した。従来のＦＰＬＣ機器（Ｐｈａｒｍａｃｉａから入手可能）を使用して、１
リットル未満のカラムサイズを操作した。Ｗａｔｅｒｓ Ｄｅｌｔａ Ｐｒｅｐ
３０００コントローラーシステムを使用して、５リットルカラムの実験を行っ
た。

【００３２】 それぞれのカラム上に装填する前にＣｕｎｏ ３０Ｓフィルターを使用した濾
過により、ＥＣＢＮ混合物を清澄化した。ＨＰ−２０およびＳＰ−８２５カラム
を、０．５％酢酸（ＨＯＡｃ）中で前平衡化し、水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）
を用いて５．５のｐＨに調整し、清澄化ＥＣＢＮ溶液で充填した。このＨＰ−２
０カラムを約５〜５．５ｇのＥＣＢＮ／リットルの充填樹脂に装填し、一方、Ｓ
Ｐ−８２５カラムを約１１〜１２ｇ／リットルで装填した。装填後、これらのカ
ラムを５カラム容量（ＣＶ）の平衡化緩衝液を用いて洗浄した。この生成物を５
ＣＶの連続的な０．５％ＨＯＡｃ（ｐＨ＝５．５）〜４％ＨＯＡｃ（ｐＨ＝２．
５）の範囲の直線勾配を使用して溶出した。この勾配の最後に、さらなる２ＣＶ
の４％ＨＯＡｃ溶液を使用し、この溶出を完了した。この生成物の溶出の間に、
０．２ＣＶの画分を収集した。この画分を、種々の逆相ＨＰＬＣ（ＲＰ−ＨＰＬ
Ｃ）方法を使用して特徴づけ、適切な画分を一緒にして、主流プールを得た。こ
のカラムを、３ＣＶのＡＣＮおよび水の６０／４０混合液、続いて３ＣＶのＡＣ
Ｎおよび０．１ＭのＮａＯＨの６０／４０混合液を用いて洗浄することにより再
生した。この操作の間に使用した流速は、装填、洗浄、再生および再平衡化には
２ＣＶ／時間（１５０ｃｍ／時間）、そして溶出には１ＣＶ／時間（７５ｃｍ／
時間）を使用した。この主流プールを濃縮した。

【００３３】 比較のために、マトリックスの型に加え、後続の移動相の条件（有機改変剤（
ｍｏｄｉｆｉｅｒ）およびｐＨ）および勾配溶出プロフィールを研究した。

【００３４】 ＡＣＮ改変剤：実施例１〜３は５ＣＶの直線ＡＣＮ勾配（アセテート緩衝液を
有し、ｐＨ５．５）を使用した。

【００３５】 酢酸溶出：前述の条件に加え、酢酸の濃度を５％まで増加した（実施例１０）
。階段勾配および凸型勾配もまた、ＨＰ−２０およびＳＰ−８２５カラムについ
て上記の連続直線勾配と比較した（実施例１３〜１９）。

【００３６】 （サンプルの分析的特徴づけ） ＥＣＢＮクロマトグラフサンプルの質および量を、以下の分析方法を使用して
評価した。

【００３７】 フォスフェート系：ＺｏｒｂｏｘＳＢ Ｃ−１８（３．５ミクロン粒子カラム
（０．４６ｃｍＩＤ×１５ｃｍ））を、１．０ｍｌ／分の流速で、０．２％リン
酸／ＡＣＮの移動相を使用して溶出した。このカラムを４０℃にて操作し、そし
て溶出物を２１０ｎｍでモニターした。このカラムを１％ＡＣＮ中で平衡化し、
そしてサンプル注入後、９分間にわたり、１〜１８．５％ＡＣＮの範囲の勾配を
使用して、ＥＣＢＮを溶出した。溶出後、このカラムを５０％ＡＣＮを用いて洗
浄し、任意の高く保持された成分を溶出した。

【００３８】 Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ／Ｏｃｔａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ Ａｃｉｄ（ＯＳＡ）系
：この系は、移動相が３０ｍＭのＯＳＡを含むことを除いて、上記のフォスフェ
ート系と同様である。このカラムを９％ＡＣＮを用いて平衡化する。サンプル注
入後、９分間にわたり、９〜２４％のＡＣＮの範囲の勾配を用いて、ＥＣＢＮの
溶出を達成する。次いで、このカラムを、５０％ＡＣＮを用いて洗浄し、高く保
持された成分を溶出した。カラム流速および検出器波長は、上記の通りであり、
一方、カラム温度は、５０℃であった。この系は、Ａｓｎ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｈ
トリペプチド−アルデヒド成分を定量するために、特に有用である。

【００３９】 ＴＦＡ系：Ｖｙｄａｃ Ｃ−１８（３．５ミクロンカラム（０．４６×２５ｃ
ｍ））をアッセイのために使用した。この移動相は、０．１％ＴＦＡを含み、そ
して２０分間にわたり、０〜１０％の直線ＡＣＮ勾配を使用して溶出を達成し、
続いて５０％のカラム洗浄をした。カラム流速、温度および検出器波長は、上記
のフォスフェート系に関して同様である。

【００４０】 アミノ酸分析（ＡＡＡ）もまた、トリペプチドの含有量を決定するための代替
的方法として、サンプルについて実施した。サンプルを酸加水分解し、そして加
水分解産物中のＡｓｎ、ＧｌｎおよびＴｈｒのモルを、イオン交換クロマトグラ
フィーおよびニンヒドリン誘導体化により決定した。このサンプル中のＥＣＢＮ
のモルを決定するためにＴｈｒ回収物を使用し、一方、Ｇｌｎ含有量は、トリペ
プチドレベルを示した。このＡｓｎ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｈトリペプチド対ＥＣＢ
Ｎのモル％（Ｍ％）を以下の式： Ｍ％Ａｓｎ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｈ＝２×［Ｇｌｎ］／［Ｔｈｒ］ を使用して計算した。光学密度（ＯＤ）測定を、相対的なサンプルの混濁（ＯＤ
＠５５０ｎｍ）または総タンパク質含有量（ＯＤ＠２８０ｎｍ）を測定するため
に特定の波長で選択サンプルについて実施した。

【００４１】 以下の実施例を、例示するために提供するが、特許請求の範囲の発明を限定し
ない。 （実施例１） 実施例１は、アセトニトリル溶出スキームを使用するＲＰ−ＨＰＬＣクロマト
グラフのプロセスを、種々の非機能樹脂と組み合わせる酢酸溶出スキームと比較
する。表１は、指定された溶出スキームを使用して観測された結果、およびカラ
ム媒体を要約する。

【００４２】

【表１】 表１において、^*比較実施例；^a１リットルの樹脂あたりのＥＣＢＮのグラムに
おいて測定される；^bデスメチル不純物は、２つのＥＣＢＮ化合物の混合物をい
い、ここでこのメチル基は、それぞれ、スレオニンおよびメチルプロリンペプチ
ドユニットで失われている。

【００４３】 この（ＡＣＮ）改変剤スキームは良い収率、全体純度およびデスメチル成分の
分離を提供する；しかし、アセトニトリルは、有機溶媒である。表１は、酢酸が
伝統的な有機溶媒溶出スキームに対して代替物を提供することを明白に示す。こ
のデータはまた、酢酸の連続勾配が、酢酸の階段勾配または凸型勾配の両方と比
較して、分離を有意に増強することを示す。実施例５（直線勾配）に対する生成
物の収率は、わずかに低く、そして実施例４（階段勾配）と比較して主流体積は
、大きいが、全体のＥＣＢＮ純度は、高く（７１％に対して８３％）、デスメチ
ル含有量は、低い（１１％に対して２％）。

【００４４】 酢酸溶出プロセスを使用する疎水性マトリックスからのＥＣＢＮの溶出は、２
つの方法で達成されると考えられる：（１）酢酸は、有機改変剤として作用し、
これにより移動相の溶出強度を増加する；および（２）Ｂ溶媒のより低いｐＨ（
強溶出溶媒、ｐＨ＝２．５）は、ＥＣＢＮのアミン機能性をプロトン化するため
に働き、従って、ＥＣＢＮをより極性にし、そして従って、疎水性固定相により
ほとんど保持されない。有機改変剤および４％酢酸溶液に影響を与えるｐＨの両
方は、実施例８および９を比較すると明らかである。実施例９において、１００
ｍＭのリン酸（ｐＨ＝２．５）は、Ｂ溶媒として４％ＨＯＡｃ（ｐＨ＝２．５）
と置換された。ＥＣＢＮの溶出が移動相のｐＨのみに依存するとしたら、この溶
出位置およびＥＣＢＮの回収は、実施例８で観測されたことと類似する。実際、
このフォスフェート溶出は、ＥＣＢＮの約５０％回収のみを生じ、そして生成物
ピークは、有意な度合いのテーリングを示した。従って、この４％ＨＯＡｃは、
有機改変剤として作用することによって、移動相のｐＨを下げること、および移
動相の溶出強度を増加することの両方により、溶出を引き起こし得る。

【００４５】 酢酸はまた、アセトニトリルよりも大きい選択性を提供する。ＨＯＡｃに対し
てＡＣＮ（それぞれ、実施例５および１）で溶出したＨＰ−２０カラムから収集
した主流について、ＲＰ−ＨＰＬＣクロマトグラムを比較する場合、ＨＯＡｃを
使用して溶出した主流中に後方の不純物の存在は、観測されなかった。ＨＯＡｃ
溶出スキームにおいて、これらの成分を、カラムを再生するまで溶出しない。

【００４６】 （実施例２） 実施例２は、一重カラム／直線酢酸溶出スキームを使用するクロマトグラフプ
ロセス（上記）を二重カラム／凸型アセトニトリル溶出スキームと比較する。さ
らに、カラムでの精製の前にメタ亜硫酸水素ナトリウムで処理したＥＣＢＮロッ
ト（実施例２〜７および２〜９）とＥＣＢＮの非処理ロット（実施例２〜８およ
び２〜１０）との比較を記載する。このメタ亜硫酸水素ナトリウムを使用した前
処理を、カラムチャージに１０ｍＭのメタ亜硫酸水素ナトリウムを単純に加え、
そして溶液を６〜１８時間にわたり攪拌することにより達成した。この一重カラ
ムプロセスは、直線勾配酢酸溶出スキームを使用する上記の場合と同様である。

【００４７】 比較二重カラムプロセスは、２つの先導−後続（ｌｅａｄ−ｔｒａｉｌ）形態
で作動するＨＰ−２０カラムを使用する。発酵ブロスを、直列して接続した２つ
のＨＰ−２０カラム上に装填する。第一のカラムにより保持されてない、いかな
るＥＣＢＮも、第二のカラムで濃縮される。このＥＣＢＮは、２つのカラムの間
で、おおよそ等しい比率で分散されると考えられる。装填後、この先導カラムを
切断し、３．８カラム容量（ＣＶ）の水を用いて洗浄した。先導カラムの溶出を
、３．３ＣＶの５％ＨＯＡｃを用いる洗浄により達成する。第一カラムからの主
流を、５．０のｐＨに調整し、部分的に装填された第二（後続）カラム上へチャ
ージする。このカラムを、溶出の前に６．３ＣＶの水を用いて洗浄する。凸型ア
セトニトリル勾配（０〜９．４％、０．５％ＨＯＡｃを含み、約５ＣＶを超える
）を、このカラムを溶出するために使用する。このカラム溶出物を分画し、所望
の純度（７５％を超える逆相ＨＰＬＣの主ピークの純度、および１０％未満のデ
スメチル成分）を有する画分を、主流としてプールする。次いで、このプールし
た溶液を濃縮する。

【００４８】 表２は、二重カラムクロマトグラフプロセスに対して一重カラムクロマトグラ
フプロセス、および非処理ＥＣＢＮ発酵ブロスに対して処理したＥＣＢＮ発酵ブ
ロスについて観測される結果を比較する。

【００４９】

【表２】 表２において、^a報告される値は、２つの独立した結晶化および分析決定の平
均を示し；^b（％）総ＲＰ−ＨＰＬＣピーク領域に対する主ピーク；^c（％）デス
メチル不純物；^dＥＣＢＮ／ＯＤ＝ＥＣＢＮ（ＲＰ−ＨＰＬＣ）のグラム／総Ｏ
Ｄのグラム；ここでＯＤグラムはＯＤ＠２８０ｎｍであり、そして１．０のＥ_{0. 1%} を想定し；^e２つのロットのうちの１つは高い水含有量を有し；従って、平均
力価は、減少した。

【００５０】 ＥＣＢＮの純度について上に報告するこの分析結果を、主流を濃縮した後に得
た。逆相ＨＰＬＣの主ピークの純度、およびデスメチルレベルの両方は、一重Ｈ
Ｐ−２０およびＳＰ−８２５カラム実験に似ている。しかし、この一重ＨＰ−２
０操作は、デスメチル成分において、わずかに多い減少を一貫して生じる。一般
的に、一重カラムプロセスのＥＣＢＮ逆相ＨＰＬＣ純度は、２つのカラムプロセ
スからのＥＣＢＮ純度に等しいか、またはより良い。従って、より経済的な精製
手段を提供する。

【００５１】 いかなるカラム精製スキームも、トリペプチドのレベルを有意に減少できなか
った；しかし、亜硫酸水素ナトリウムを用いる前処理は、トリペプチド不純物の
量を有意に減少した。一重カラムの研究からの生成物のＥＣＢＮ／ＯＤ純度は、
２つのカラムの研究において得られた純度に等しいか、またはより大きかった。
ＥＣＢＮ／ＯＤ値は、純度の絶対的な測定を示さないが、これは、種々のカラム
操作から生じるＥＣＢＮ純度の良い相対比較を提供する。カラムチャージ溶液に
関する値（データは示してない）を、これらの濃縮した主流と比較する場合、全
てのカラム操作は、ＥＣＢＮ／ＯＤ純度における１０〜１５倍の増加を与えた。

【００５２】 本明細書中で引用される全ての参考文献は、本明細書により本明細書中に援用
される。前述の発明は、幾分詳細に記載されているが、明確さおよび理解の目的
の図解および例示の目的で、任意の変化および改変が実行され得ることは、当業
者に明らかである。従って、この記載および実施例は、本発明の範囲を限定する
ように構築されるべきではなく、これは、添付の特許請求の範囲により描写され
る。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ， ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ， ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，Ｃ Ｚ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ， ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，Ｌ Ｔ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ， ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，Ｕ Ａ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者 ヴィチェンツィ， ジェフレイ トーマス アメリカ合衆国 インディアナ 46112， ブラウンズブルク， ティンバー レー ン 49 Ｆターム(参考） 4H045 AA10 AA20 BA34 EA29 FA73 GA25 HA02

Claims (20)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 シクロペプチド産物を分離および精製する方法であって、該
   方法は、以下の工程： （ｉ）連結した少なくとも１個のプロトン化可能なアミノ基を有するシクロペプ
   チド化合物を含む混合物を提供する工程； （ｉｉ）該混合物を疎水性の逆相クロマトグラフィー媒体上に吸着させる工程；
   および （ｉｉｉ）水中、０．１体積％の酢酸〜１０．０体積％の酢酸の範囲の連続した
   ほぼ直線的な酢酸勾配により溶出する工程、を含有する、方法。
2. 【請求項２】 前記酢酸勾配が、水中、０．５体積％の酢酸〜４．０体積％
   の酢酸の範囲である、請求項１に記載の方法。
3. 【請求項３】 請求項１に記載の方法であって、前記シクロペプチド化合物
   が、以下の構造： 【化１】 によって示され、ここで、Ｒは、水素または−Ｃ（Ｏ）Ｒ’であり、ここで、Ｒ
   ’は、連結した少なくとも１個のプロトン化可能なアミノ基を有するアルキル基
   、アルケニル基、アルキニル基、アリール基、またはヘテロアリール基であり；
   Ｒ１は、−Ｈまたは−ＯＨであり；Ｒ２は、−Ｈまたは−ＣＨ₃であり；Ｒ３は
   、−Ｈ、−ＣＨ₃、−ＣＨ₂ＣＯＮＨ₂または−ＣＨ₂ＣＨ₂ＮＨ₂であり；Ｒ４は、
   −Ｈまたは−ＯＨであり；Ｒ５は、−ＯＨ、−ＯＰＯ₃Ｈ₂、または−ＯＳＯ₃Ｈ
   であり；そしてＲ６は、−Ｈまたは−ＯＳＯ₃Ｈである、方法。
4. 【請求項４】 Ｒが、水素である、請求項３に記載の方法。
5. 【請求項５】 前記疎水性の逆相クロマトグラフィー媒体が、有機ポリマー
   である、請求項１に記載の方法。
6. 【請求項６】 前記有機ポリマーが、スチレンとジビニルベンゼンとのコポ
   リマーまたはメタクリレートポリマーである、請求項５に記載の方法。
7. 【請求項７】 請求項５に記載の方法であって、前記有機ポリマーが、５０
   ０ｍ²／ｇの表面積、２００〜３００Åのポアー径および２００〜８００μｍの
   粒径を有するスチレン／ジビニルベンゼン樹脂；または１，０００ｍ²／ｇの表
   面積、５０〜６０Åのポアー径および２５０〜６００μｍの粒径を有するスチレ
   ン／ジビニルベンゼン樹脂である、方法。
8. 【請求項８】 前記混合物が、混合ブロスの産物である、請求項１に記載の
   方法。
9. 【請求項９】 請求項１に記載の方法であって、該方法が、 （ｉｖ）前記シクロペプチド化合物を回収する工程、をさらに包含する、方法。
10. 【請求項１０】 アルデヒド副産物を含むＥｃｈｉｎｏｃａｎｄｉｎ型化合
    物を精製するためのプロセスであって、該プロセスが、以下の工程： （ｉ）Ｅｃｈｉｎｏｃａｎｄｉｎ型化合物とアルデヒド副産物との混合物を提供
    する工程； （ｉｉ）誘導体化剤を該混合物に添加して、誘導体化アルデヒド産物を生成する
    工程；および （ｉｉｉ）該誘導体化アルデヒド産物から該Ｅｃｈｉｎｏｃａｎｄｉｎ型化合物
    を分離する工程、を包含する、プロセス。
11. 【請求項１１】 前記分離工程（ｉｉｉ）が、請求項１に記載の方法を包含
    する、請求項１０に記載のプロセス。
12. 【請求項１２】 請求項１０に記載のプロセスであって、前記Ｅｃｈｉｎｏ
    ｃａｎｄｉｎ型化合物が、以下の構造： 【化２】 に示され、ここで、Ｒは、水素または−Ｃ（Ｏ）Ｒ’であり、ここで、Ｒ’は、
    連結した少なくとも１個のプロトン化可能なアミノ基を有するアルキル基、アル
    ケニル基、アルキニル基、アリール基、またはヘテロアリール基であり；Ｒ１は
    、−Ｈまたは−ＯＨであり；Ｒ２は、−Ｈまたは−ＣＨ₃であり；Ｒ３は、−Ｈ
    、−ＣＨ₃、−ＣＨ₂ＣＯＮＨ₂または−ＣＨ₂ＣＨ₂ＮＨ₂であり；Ｒ４は、−Ｈま
    たは−ＯＨであり；Ｒ５は、−ＯＨ、−ＯＰＯ₃Ｈ₂、または−ＯＳＯ₃Ｈであり
    ；およびＲ６は、−Ｈまたは−ＯＳＯ₃Ｈである、プロセス。
13. 【請求項１３】 Ｒが、水素である、請求項１２に記載のプロセス。
14. 【請求項１４】 前記分離工程（ｉｉｉ）が、請求項１に記載の方法を包含
    する、請求項１３に記載のプロセス。
15. 【請求項１５】 請求項１０に記載のプロセスであって、前記アルデヒド副
    産物が、以下の構造： 【化３】 により示され、ここで、Ｒが、−Ｃ（Ｏ）ＣＨ₂ＣＨ（ＯＨ）Ｃ₉Ｈ₁₉または水素
    である、プロセス。
16. 【請求項１６】 前記混合物が、発酵ブロスの産物である、請求項１０に記
    載のプロセス。
17. 【請求項１７】 前記混合物が、混合発酵ブロスの産物である、請求項１０
    に記載のプロセス。
18. 【請求項１８】 請求項１０に記載のプロセスであって、前記誘導体化剤が
    、重亜硫酸ナトリウム、ヒドロキシルアミンおよびセミカルバジドヒドロクロリ
    ドからなる群から選択される、プロセス。
19. 【請求項１９】 前記誘導体化剤が、重亜硫酸ナトリウムである、請求項１
    ５に記載のプロセス。
20. 【請求項２０】 前記分離工程（ｉｉｉ）が、請求項１に記載の方法を包含
    する、請求項１５に記載のプロセス。