JP2013538832A - 環状リポペプチド化合物又はその塩の精製方法 - Google Patents

Abstract

各ステップ：（１）式Ｉの粗化合物をマクロポーラス吸着樹脂にチャージングすること、（２）洗浄液として水、有機溶媒、または有機溶媒と水の混合溶液を用いて、マクロポーラス吸着樹脂を洗浄すること、（３）溶出液として水、有機溶媒、または有機溶媒と水の混合溶液を用いて、マクロポーラス吸着樹脂から式Ｉの化合物を溶出すること、を含む、環状リポペプチド化合物又はその塩の精製方法である。精製方法は、有機溶媒の使用量が少なく、シリカゲルを使用せず、環境に対してほとんど害をおよぼさないという利点を有し、収集される式Ｉの化合物の純度も従来開示された方法よりも向上した。
【化１】

Description

発明の詳細な説明

［技術分野］
本発明は有機化学分野に関し、特に、式Ｉの環状リポペプチド化合物又はその塩の精製方法に関する。
［背景技術］
真菌感染は、免疫不全患者において発症率と死亡率が高まる主な要因になっている。過去２０年の間に、真菌感染の発症率は顕著に高まってきた。真菌感染のハイリスク集団は、重症患者、外科患者、およびＨＩＶ感染患者、血液癌や他の腫瘍疾病有する患者を含む。さらに臓器移植を受けた患者も真菌感染のハイリスク集団である。

エキノカンジンは新規な抗真菌薬であり、カンジダ菌やアスペルギルスによる感染の治療に対して効果があり、エキノカンジン抗真菌薬の例としては、カスポファンギンとミカファンギンがある。エキノカンジンは、１，３−βグリコシド結合の形成を阻害することにより真菌を抑制することで、高い効果を維持するとともに、生体に対する毒性や副作用を低減させる。それゆえ、エキノカンジンを使用する場合は、従来の抗真菌薬と比較して安全である。

ＦＫ４６３（ミカファンギン）は、式ＩＩＩの化合物であり、式ＩＩＩの化合物は、式ＩＩの化合物ＦＲ９０１３７９（Ｍ０）の側鎖を切断することにより式Ｉの化合物ＦＲ１７９６４２（Ｍ１）を形成すること、および合成にて式Ｉの化合物に側鎖を付加することによって得られるものである。したがって、高純度の式Ｉの化合物は高純度のミカファンギンを得るために重要である。

次の株、ストレプトマイセス、例えばストレプトマイセス・アヌラツス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｎｕｌａｔｕｓ）４８１１号株、ストレプトマイセス・アヌラツス８７０３号株、ストレプトマイセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．）６９０７号株、およびＩＦ０１３２４４株，ＩＦ０６７９８株，ＩＦ０３１９６３株，ＩＦ０９９５１株，ＮＲＲＬ１２０５２株等は、式ＩＩの化合物のアシル側鎖を脱アシル化することによって式ＩＩの化合物を式Ｉの化合物へ変換させることが報告されていた。ＵＳ５３７６６３４は、式Ｉの化合物を精製する方法が開示されており、式Ｉの化合物を精製する方法は、次のステップを含む：式ＩＩの化合物を酵素反応により式Ｉの化合物へ変換し、その変換液をろ過し、式Ｉの化合物を、活性炭カラムに通しその後シリカゲルカラムに通して精製し、減圧濃縮し、式Ｉの化合物を白色固体で得た。このような方法は、使用される有機溶媒の量が大きく、および使用する活性炭とシリカゲルをリサイクルできず、それゆえこのような方法は環境を汚染し、取扱者の心身健康に害になるだろうし、大量生産に適合しない。

よって、上記従来技術における欠点を解消するだけでなく、式Ｉの化合物の純度を向上させることができる精製方法、大量の溶媒またはシリカゲルを使用しない精製方法をみつけることが当技術分野において切迫している。
［発明の内容］
本発明の要旨は、式Ｉの化合物の精製方法を提供することにある。

本発明は、式Ｉの化合物又はその塩の精製方法を提供し、前記方法は、次のステップ：
（１）式Ｉの粗化合物をマクロポーラス吸着樹脂にロードすること、
（２）水、有機溶媒、または有機溶媒と水の混合溶液を洗浄液として用いて、マクロポーラス吸着樹脂を洗浄すること、
（３）溶出液として水、有機溶媒、または有機溶媒と水の混合溶液を用いて、マクロポーラス吸着樹脂から式Ｉの化合物を溶出すること、
を含む。

本発明により提供された上記精製方法において、前記マクロポーラス吸着樹脂は、スチレンとジビニルベンゼンから重合された非極性の芳香族吸着樹脂と、該樹脂構造においてメタクリレート単位を有する中等極性のメタクリル吸着樹脂と、から選ばれる。

他の好ましい例において、前記吸着樹脂は、ＸＡＤ−１、ＸＡＤ−２、ＸＡＤ−３、ＸＡＤ−４、ＸＡＤ−５、ＸＡＤ−１６、ＸＡＤ−１６ＨＰ、ＨＰ−１０、ＨＰ−２０、ＨＰ−２０ｓｓ、ＨＰ−２１、ＨＰ−３０、ＨＰ−４０、ＨＰ−５０、ＳＰ−８２５、ＳＰ−８５０、ＳＰ−７０、ＳＰ−７００、ＳＰ−２０７、ＸＡＤ−６、ＸＡＤ−７、ＸＡＤ−７ＨＰ、ＸＡＤ−８、ＨＰ−２ＭＧ、またはそれらの混合物から選ばれる。

他の好ましい例において、前記吸着樹脂は、ハロゲンを含有し、および化学結合を介してスチレン重合体マトリックスと結合される。
他の好ましい例において、前記吸着樹脂は、臭素を含有し、および化学結合を介してスチレン重合体マトリックスと結合される。

他の好ましい例において、前記吸着樹脂は、ＳＰ−２０７、ＳＰ２０７ｓｓ、またはそれらの混合物から選ばれる。
他の好ましい例において、前記ステップ（１）は、式Ｉの粗化合物を含む溶液をマクロポーラス吸着樹脂で充填されたクロマトグラフィーカラムに流すようにし、または式Ｉの粗化合物を含む溶液をマクロポーラス吸着樹脂と混合することで、式Ｉの粗化合物をマクロポーラス吸着樹脂にロードすることであり、流速は１時間当たり０．１〜１０カラム体積である。

他の好ましい例において、前記式Ｉの粗化合物を含む溶液は、電離可能な塩を含む。マクロポーラス吸着樹脂は、スチレンとジビニルベンゼンから重合された非極性の芳香族吸着樹脂と、該樹脂構造においてメタクリレート単位を有する中等極性のメタクリル吸着樹脂から選ばれる。電離可能な塩は、硫酸塩、硝酸塩、ハロゲン含有塩、リン酸塩、酢酸塩、炭酸塩、クエン酸塩、ケイ酸塩、過硫酸塩、クロム酸塩、乳酸塩、シュウ酸塩等、またはそれらの混合物から選ばれる。

本発明により提供された上記精製方法において、工程（２）では、洗浄液の総体積に対して、有機溶媒の体積百分率は０〜３％、好ましくは０〜２％である。
本発明により提供された上記精製方法において、工程（３）では、溶出液の総体積に対して、有機溶媒の体積百分率は０〜２０％、好ましくは０〜５％である。

本発明により提供された上記精製方法において、工程（１）では、式Ｉの粗化合物とマクロポーラス吸着樹脂の重量比は０．１〜１５（ｇ／Ｌ）、好ましくは５〜１０（ｇ／Ｌ）である。

本発明により提供された上記精製方法において、有機溶媒は、Ｃ_１−４アルコール、Ｃ_１−４ケトンから選ばれ、好ましくはメタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール、アセトン、ブタノン、またはそれらの混合物から選ばれ、最も好ましくはメタノール、エタノールまたはアセトンから選ばれる。

よって、本発明によれば、大量の溶媒およびシリカゲルを使用しない精製方法が提供され、従来技術における欠点を解消するだけでなく、式Ｉの化合物の純度を向上させる。

は、実施例１における式Ｉの粗化合物１のＨＰＬＣクロマトグラムを表す。 は、実施例６で精製された式Ｉの化合物のＨＰＬＣクロマトグラムを表す。

［詳細な実施形態］
本発明者は大量の試験で、次のことを見出した。すなわち、芳香族系マクロポーラス吸着樹脂、具体的には例えば該樹脂骨格に結合された臭素を有する芳香族樹脂のような芳香族誘導体樹脂は、疎水吸着力が強化され、式Ｉの化合物のような強い親水性を有する物質に対して強い吸着能を示すだろう。芳香族系マクロポーラス吸着樹脂は、関連のある不純物を有する式Ｉの化合物を精製することに際して著しい効果がある。通常のスチレンとジビニルベンゼンから重合された非極性の芳香族吸着樹脂、または該樹脂構造においてメタクリレート単位を有する中等極性のメタクリル吸着樹脂は、疎水吸着力が弱く、それゆえ式Ｉの化合物のような親水性の強い物質に対する吸着能は強くないであろう。しかしながら、本発明者は式Ｉの化合物をマクロポーラス吸着樹脂に吸着する場合に、創造的に電離可能な塩は、目的物質の疎水性を向上させるために付加されることができ、したがって式Ｉの化合物は、より樹脂に吸着されることができ、それゆえ式Ｉの化合物を精製するという驚くべき発見をした。

本発明により提供された式Ｉの化合物の精製方法は、以下のステップ：
第１ステップでは、式Ｉの粗化合物をマクロポーラス吸着樹脂にロードすること：
第２ステップでは、洗浄液として水、有機溶媒、または有機溶媒と水の混合溶液を用いて、マクロポーラス吸着樹脂を洗浄すること；および
第３ステップでは、溶出液として水、有機溶媒、または有機溶媒と水の混合溶液を用いて、マクロポーラス吸着樹脂から式Ｉの化合物を溶出すること
を含む。

第１ステップは、式Ｉの粗化合物の溶液をマクロポーラス吸着樹脂と接触させることで実施することができる。接触は、ａ．吸着樹脂をそのまま式Ｉの粗化合物を含む溶液に投入し、結果として生じる混合物を５〜１２０分攪拌すること、またはｂ．吸着樹脂をクロマトグラフィーカラムなどのクロマトグラフィー装置に充填し、式Ｉの粗化合物を含む溶液をクロマトグラフィーカラムに流すようにし、流速は１時間当たり０．１〜１０カラム体積とすることができる。

本発明の一つの実施例において、精製方法は、以下のステップ：
Ａ．吸着樹脂をそのまま式Ｉの粗化合物を含む溶液に投入し、そして結果として生じる混合物を５〜１２０分攪拌すること；
Ｂ．式Ｉの粗化合物を含む溶液を樹脂から分離すること；
Ｃ．洗浄液として水、有機溶媒、または有機溶媒と水の混合溶液を用いて、工程Ｂにおけるマクロポーラス吸着樹脂を洗浄すること；
Ｄ．溶出液として水、有機溶媒、または有機溶媒と水の混合溶液を用いて、工程Ｃで得られた洗浄された吸着樹脂を溶出し、その後式Ｉの化合物を含む溶出液を収集することにより精製された式Ｉの化合物を得ること、
を含む。

ステップＢにおいて、分離は、ろ過、遠心などにより樹脂とろ液とを分離することを含む。
本発明により提供されたすべての精製方法において、有機溶媒は、Ｃ_１−４アルコール、Ｃ_１−４ケトンまたはそれらの混合物から選ばれ、好ましくはメタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール、アセトン、ブタノン、またはそれらの混合物から選ばれる。

本発明により提供されたすべての精製方法において、吸着樹脂は、スチレンとジビニルベンゼンから重合された非極性の脂肪族吸着樹脂と、該樹脂構造においてメタクリレート単位を有する中等極性のメタクリル吸着樹脂とから選ばれる。好ましくは、ＸＡＤシリーズ吸着樹脂（ローム・アンド・ハース（ＲｏｈｍＨａａｓ）社製、米国）、ダイアイオンＨＰ（Ｄｉａｉｏｎ ＨＰ）シリーズ吸着樹脂（三菱化学社製、日本）、並びに臭素を含有し且つ化学結合を介してスチレン重合体マトリックスに結合する吸着樹脂から選ばれる。より好ましくは、樹脂は、ＸＡＤ−１、ＸＡＤ−２、ＸＡＤ−３、ＸＡＤ−４、ＸＡＤ−５、ＸＡＤ−６、ＸＡＤ−７、ＸＡＤ−７ＨＰ、ＸＡＤ−８、ＸＡＤ−１６、ＸＡＤ−１６ＨＰ、ＨＰ−１０、ＨＰ−２０、ＨＰ−２０ｓｓ、ＨＰ−２１、ＨＰ−３０、ＨＰ−４０、ＨＰ−５０、ＨＰ−２ＭＧ、ＳＰ−８２５、ＳＰ−８５０、ＳＰ−７０、ＳＰ−７００、ＳＰ２０７、ＳＰ２０７ｓｓ、またはそれらの混合物から選ばれる。最も好ましくは、樹脂はＨＰ２０、ＸＡＤ-１６、ＸＡＤ-１６ＨＰ、ＳＰ２０７、またはそれらの小粒子化産物から選ばれ、例えばＨＰ−２０ｓｓ、ＳＰ２０７ｓｓは、それらの粒子径が０．０６３ｍｍ〜０．１５０ｍｍで、分離性能がより向上した。

さらに、本発明者は、ハロゲンを含有し且つ化学結合を介してスチレン重合体マトリックスに結合する吸着樹脂は、より高い吸着力と分離効率有することを発見した。臭素を含有しおよび化学結合を介してスチレン重合体マトリックスと結合する吸着樹脂が好ましく、最も好ましい吸着樹脂はＳＰ−２０７、ＳＰ２０７ｓｓ、またはそれらの混合物である。現在市販されている、ハロゲンを含有し且つ化学結合を介してスチレン重合体マトリックスと結合する吸着樹脂は、主にＳＰ−２０７、ＳＰ２０７ｓｓ（三菱化学社製、日本）があるが、この二つの型に限定されない。

ハロゲンを含有しない吸着樹脂に関しては、ローディング液の電気伝導率と目的物質である式Ｉの化合物の疎水性を向上させるために、式Ｉの粗化合物をロードする前に、式Ｉの粗化合物は電離可能な塩と混合される。電離可能な塩は、硫酸塩、硝酸塩、ハロゲン含有塩、リン酸塩、酢酸塩、炭酸塩、クエン酸塩、ケイ酸塩、過硫酸塩、クロム酸塩、乳酸塩、シュウ酸塩等、またはそれらの混合物から選択される。好ましくは、電離可能な塩は通常用いられる塩：ハロゲン含有塩、硫酸塩、リン酸塩、酢酸塩、炭酸塩、およびクエン酸塩からなる群の一種又は一種以上から選択される。最も好ましくは、ＮａＣｌ、ＫＣｌおよび（ＮＨ_４）_２Ｓ０_４から選ばれる。

本発明により提供される精製方法の第２工程において、洗浄液における有機溶媒の濃度は０〜３％、好ましくは０〜２％である。洗浄液にも電離可能な塩を加えることができる。電離可能な塩は、硫酸塩、硝酸塩、ハロゲン含有塩、リン酸塩、酢酸塩、炭酸塩、クエン酸塩、ケイ酸塩、過硫酸塩、クロム酸塩、乳酸塩、シュウ酸塩等、またはそれらの混合物を含む。好ましくは、電離可能な塩は、通常用いられる塩：ハロゲン含有塩、硫酸塩、リン酸塩、酢酸塩、炭酸塩、およびクエン酸塩からなる群の一種又は一種以上から選択される。最も好ましくは、樹脂はＮａＣｌ、ＫＣｌおよび（ＮＨ_４）_２Ｓ０_４から選ばれる。

本発明により提供される精製方法の第３工程において、溶出液における有機溶媒の濃度は０〜２０％、好ましくは０〜５％である。
本発明により提供される精製方法において、洗浄は１回、２回、又は３回行ってもよい。洗浄速度は１時間当たり０．１〜１０カラム体積であることができる。溶出速度は１時間当たり０．１〜１０カラム体積であることができる。

本願に用いられるように、「式Ｉの化合物」又は「化合物Ｉ」は交換して用いられることができ、いずれも以下の構造式を有する化合物又はその薬学的に許容される塩のことを指す。

本願に用いられるように、「薬学的に許容される塩」とは、次の塩：ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウム、アルミニウム等のような無機塩基；メチルアミン、エチルアミン、エタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、シクロヘキサノールアミン、リシン、オルニチン等のような有機塩基；または他の薬学的に許容される塩に関する塩基；から形成される塩を意味する。

本願に用いられるように、「式Ｉの化合物の純度」、「化合物Ｉの純度」又は「化合物ＩのＨＰＬＣ純度」は交換して用いられることができ、いずれも本発明によって提供される高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）検出条件下で測定される化合物Ｉのピーク面積と全ピーク面積の合計との百分率のことを指す。

本願に用いられるように、「式Ｉの粗化合物」又は「粗化合物Ｉ」は交換して用いられることができ、いずれも本発明によって提供される高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）検出条件下で、化合物Ｉの含有量＜８０％の混合物のことを指す。当技術分野で適切な方法、例えばＥＰ０４３１３５０Ｂ１の実施例１に記載の方法に限定されないが、ＥＰ０４３１３５０Ｂ１の実施例１に記載の方法では、コレオフォーマ エスピー（Ｃｏｌｅｏｐｈｏｍａ ｓｐ．） Ｆ−１１８９９（ＦＥＲＭ ＢＰ２６３５）の発酵によって粗化合物Ｉを得ることができ、その後菌体を有機溶媒で抽出する。好ましくは、抽出は、発酵培養液をそのまま２倍体積の有機溶媒に加えることによって行われる。好ましい有機溶媒は、メタノール、エタノールまたはアセトンから選ばれる。

本願に用いられるように、「式Ｉの粗化合物を含む溶液」および「粗化合物Ｉを含む溶液」は交換して用いられることができ、いずれも目的化合物Ｉと１種又は複数種の非目的化合物とを含有する溶液のことを指す。溶液は、粗化合物Ｉを水又は緩衝溶液に溶解して得られることができ、任意の方法から得られる式Ｉの化合物を含む反応液であることができる。当技術分野で知られている任意の方法から化合物Ｉを含む反応溶液を用いることができる（ＣＮ１０４０５４１Ｃ実施例１を参照）。例えば、（限定されないが）溶液は、化合物Ｉを含む変換液に所定量の水又は有機溶媒を加えることで得られる。粗化合物Ｉの溶液における有機溶媒の濃度は０％〜２％である。

本願に用いられるように、「ロードする」とは、粗化合物Ｉを含む溶液をマクロポーラス吸着樹脂と接触させることで、粗化合物Ｉをマクロポーラス吸着樹脂に吸着させる方法を指す。「接触する」は、マクロポーラス吸着樹脂をそのまま溶液に投入し、そして攪拌し吸着することを含み、またはマクロポーラス吸着樹脂をクロマトグラフィー装置に充填し、溶液をクロマトグラフィーカラムに流すことを含む。

マクロポーラス吸着樹脂を「洗浄する」するとは、適切な緩衝液を、マクロポーラス吸着樹脂の中または上に通すことを指す。
本願に用いられるように、「洗浄緩衝液」とは、目的化合物Ｉを溶出する前に、マクロポーラス吸着樹脂（主に有機相の除去のため）を洗浄するための緩衝液のことを指す。必ずしも必須ではないが、便宜のため、洗浄緩衝液とローディング緩衝液は同じ極性であり得る。

マクロポーラス吸着樹脂から分子を「溶出する」とは、分子を、マクロポーラス吸着樹脂の周囲の緩衝液の極性を変化することによりマクロポーラス吸着樹脂から除去することを意味する。極性によって緩衝液は、分子とマクロポーラス吸着樹脂上における吸着部位を競争することができる。

本願に用いられるように、「溶出緩衝液」とは、固相から目的化合物Ｉを溶出するために使用される。溶出緩衝液は、マクロポーラス吸着樹脂から目的化合物Ｉを溶出することができる。

目的化合物Ｉと１種又は複数種の非目的化合物とを含有する組成物から化合物Ｉを「精製する」とは、組成物から少なくとも１種の非目的化合物を（完全にまたは部分的に）除去することにより、組成物における化合物Ｉの純度を向上させることを意味する。

本発明で説明された上述の特徴、または実施例で説明された特徴を任意に組み合わせることができる。本願で開示されるすべての特徴は、任意の組み合わせで使用され得る。いずれの組成物の様態とも併用することができ、明細書で開示された各特徴は、いずれも同じ、同等または類似の目的を果たす任意の代替特徴にそれぞれ替え得る。そのため、特に説明しない限り、開示される特徴は同等または類似の特徴の一般的な例にすぎない。

本発明の主な利点は：
１．環状リポペプチド化合物、具体的にはエキノカンジン化合物を精製する新規な低コスト方法が提供される、
２．本発明により提供される方法における精製ステップの利点は、簡潔なルート、緩和な条件、高精製収率、少量の使用される有機溶媒、簡潔な処理、環境に対する低い汚染などの特徴があり、方法に対する取り扱いや設備の要求を相当に低減し、したがってコストを低減する、
３．安定な目的産物本発明により提供される方法を通して得ることができ、したがって最終生成物の品質管理および大規模生産を容易にする
ことを含む。

次の具体的な実施例に関してさらに本発明を説明するだろう。これらの実施例は本発明を説明しようとするだけでなく、本発明の範囲を制限しないと理解される。次の実施例において、具体的な条件がない実験方法は、通常条件下、またはメーカーによって指示されるように行われた。別の説明がない限り、すべての百分率、比率、比例または部は、重量によるものである。

本発明における重量／体積百分率の単位は当業者にとって熟知で、例えば１００ｍＬの溶液における溶質の重量である。
別の定義がない限り、本願に用いられるすべての科学用語と技術用語は、当業者に通常知られている意味と同様である。また、本願に記載の内容と類似または同等の方法または材料を、いずれも本発明の方法に用いることができる。本願で記載の好ましい実施形態及び材料は例示のためだけに提供される。

次の実施例において、化合物Ｉ（式Ｉの化合物）はＨＰＬＣにより検出される：
Ｗａｔｅｒｓ解析ＨＰＬＣ系に基づいて解析を行った。ＦＲ１７９６４２、エキノカンジンＢおよび他の類縁物の検出には、逆相ＨＰＬＣ解析が用いられた。逆相解析に用いられる材料および条件を、次のように記載する；ＰＬＡＴＩＳＩＬ ＯＤＳクロマトグラフィーカラム（粒子径５μｍ，４．６ｍｍｉ．ｄ×２５０ｍｍ）；温度：３０℃；移動相：３％アセトニトリル／０．５％リン酸二水素ナトリウム；流速：１ｍｌ／分；２１０ｎｍＵＶ下で検出。

［実施例１］
式Ｉの粗化合物１の調製
ＵＳ５３７６６３４の実施例１にしたがって、化合物Ｉを含む反応溶液を得た。溶液中において、化合物Ｉの含有量は７．３ｇ／Ｌであり、化合物のＨＰＬＣ純度が７３．９１％であった。ＨＰＬＣパターンは、図１と表１に示す。

［実施例２］
［化合物Ｉの精製］
実施例１で得られた粗化合物Ｉを含む溶液５００ｍＬがこの実施例で使用され、溶液には化合物Ｉを３．６５ｇ含有した。

粗溶液にＮａＣｌ ２５ｇを加えた。溶解して、ＨＰ２０ｓｓ樹脂３７０ｍｌで充填されたクロマトグラフィーカラムに粗溶液をロードした。ロードする流速は、１時間当たり１カラム体積であった。ロードが終了した後、３％塩化ナトリウム水溶液（２×カラム体積）は、１時間当たり１カラム体積を洗浄する流速でカラムを洗浄するために使用された。洗浄が終了した後、純水１０００ｍｌを溶出液として使用し、溶出する流速は、１時間当たり１カラム体積とした。化合物Ｉを含有する画分を収集して混合した。溶出液中の化合物Ｉの含有量はＨＰＬＣによって３．４ｇ（収率９３．２％）として決定され、純度は９７．２％であった。

［実施例３］
［化合物Ｉの精製］
実施例１で得られた粗化合物Ｉを含む１Ｌ溶液がこの実施例で使用され、溶液には化合物Ｉの７．３ｇを含有した。

粗溶液にＫＣｌ ４０ｇを加えた。溶解して、ＸＡＤ−１６樹脂０．８Ｌで充填されたクロマトグラフィーカラムに粗溶液をロードした。ロードする流速は、１時間に当たり１カラム体積であった。ロードが終了した後、純水（５×カラム体積）は、１時間当たり１カラム体積を洗浄する流速でカラムを洗浄するために使用された。洗浄が終了した後、３％メタノール２．５Ｌを溶出液として使用し、溶出する流速は、１時間当たり１カラム体積とした。化合物Ｉを含有する画分を収集して混合した。溶出液中の化合物Ｉの含有量はＨＰＬＣによって６．６ｇ（収率９０．４％）として決定され、純度は９６．５％であった。

［実施例４］
［化合物Ｉの精製］
実施例１で得られた粗化合物Ｉを含む１Ｌ溶液がこの実施例で使用され、溶液には化合物Ｉの７．３ｇを含有した。

粗溶液を５Ｌのプラスチック投薬カップに加えた。投薬カップに、ＸＡＤ−１６ＨＰ樹脂１．４Ｌと５０ｇの（ＮＨ_４）_２Ｓ０_４を加えた。結果として生じる混合物を室温下で１２０分間攪拌した後、ろ紙を敷いたブフナー漏斗でろ過した。ろ液を捨て、樹脂をクロマトグラフィーカラムにロードした。純水３Ｌはカラムを洗浄するために使用された。洗浄が終了した後、５Ｌの４％含水アセトンを溶出液として使用した。化合物Ｉを含有する画分を収集した。収集液をＨＰＬＣで検出したところ、溶出液中の化合物Ｉの含有量はＨＰＬＣによって６．７ｇ（収率９２．５％）として決定され、純度は９７．３％であった。

［実施例５］
［化合物Ｉの精製］
実施例１で得られた粗化合物Ｉを含む０．５Ｌ溶液がこの実施例で使用され、溶液には化合物Ｉの４．６ｇを含有した。

粗溶液をＳＰ２０７ｓｓ樹脂３００ｍＬで充填されたクロマトグラフィーカラムにロードし、ロードする流速は１時間当たり５カラム体積とした。ロードが終了した後、１％含水エタノール（２×カラム体積）は、１時間当たり１カラム体積洗浄するための流速でカラムを洗浄するために使用された。その後２％含水エタノール（２×カラム体積）は、１時間当たり１カラム体積を洗浄する流速でカラムを洗浄するために使用された。洗浄が終了した後、３％含水エタノール３．６Ｌを溶出液として使用し、溶出する流速は１時間当たり１カラム体積である。化合物Ｉを含有する画分を収集して混合した。溶出液中の化合物Ｉの含有量はＨＰＬＣによって４．３３ｇ（収率９４．２％）として決定され、純度は９９．０％であった。ＨＰＬＣクロマトグラムは、図２と表２に示す。

［実施例６］
［化合物Ｉの精製］
実施例１で得られた粗化合物Ｉを含む０．５Ｌ溶液がこの実施例で使用され、溶液には化合物Ｉの４．６ｇを含有した。

粗溶液をＳＰ２０７ｓｓ樹脂６００ｍＬで充填されたクロマトグラフィーカラムにロードし、ロードする流速は１時間当たり５カラム体積とした。ロードが終了した後、純水（２×カラム体積）は、１時間当たり１カラム体積洗浄する流速でカラムを洗浄するために使用された。洗浄が終了した後、２％含水エタノール７．２Ｌを溶出液として使用し、溶出する流速は１時間当たり２カラム体積である。化合物Ｉを含有する画分を収集して混合した。溶出液中の化合物Ｉの含有量はＨＰＬＣによって４．４ｇ（収率９５．６％）として決定され、純度は９９．０％であった。

［実施例７］
［化合物Ｉの精製］
実施例１で得られた、粗化合物Ｉを含む０．５Ｌ溶液がこの実施例で使用され、溶液には化合物Ｉの４．６ｇを含有した。

粗溶液をＳＰ２０７樹脂４６Ｌで充填されたクロマトグラフィーカラムにロードし、ロードする流速は１時間当たり５カラム体積とした。ロードが終了した後、純水（２×カラム体積）は、１時間当たり１カラム体積洗浄する流速でカラムを洗浄するために使用された。洗浄が終了した後、２０％含水エタノール１５０Ｌを溶出液として使用し、溶出する流速は１時間当たり２カラム体積である。化合物Ｉを含有する画分を収集して混合した。溶出液中の化合物Ｉの含有量はＨＰＬＣによって４．０２ｇ（収率８７．４％）として決定され、純度は９８．１％であった。

［実施例８］
化合物Ｉの精製
実施例１で得られた、粗化合物Ｉを含む０．５Ｌ溶液がこの実施例で使用され、溶液には化合物Ｉの４．６ｇを含有した。

粗溶液をＳＰ２０７樹脂４６０ｍｌで充填されたクロマトグラフィーカラムにロードし、ロードする流速は１時間当たり５カラム体積とした。ロードが終了した後、１％含水エタノール（２×カラム体積）は、１時間当たり１カラム体積洗浄する流速でカラムを洗浄するために使用された。洗浄が終了した後、５％含水エタノール３．０Ｌを溶出液として使用し、溶出する流速は１時間当たり１カラム体積である。化合物Ｉを含有する画分を収集して混合した。溶出液中の化合物Ｉの含有量はＨＰＬＣによって４．４ｇ（収率９５．６％）として決定され、純度は９７．９％であった。

［比較実施例１］
［化合物Ｉの精製］
実施例１で得られた粗化合物Ｉを含む５００ｍｌ溶液がこの実施例で使用され、溶液には化合物Ｉの３．６５ｇを含有した。

粗溶液をＨＰ２０ｓｓ樹脂３７０ｍｌで充填されたクロマトグラフィーカラムにロードし、ロードする流速は１時間当たり１カラム体積であった。その後、１０００ｍＬの純水を溶出液として使用し、溶出する流速は１時間当たり１カラム体積とした。化合物Ｉを含有する画分を収集して混合した。溶出液中の化合物Ｉの含有量はＨＰＬＣによって３．４ｇ（収率９３．２％）として決定され、純度は７５．２％であった。

［比較実施例２］
実施例１で得られた粗化合物Ｉを含む１Ｌ溶液がこの実施例で使用され、溶液には化合物Ｉの７．３ｇを含有した。粗溶液をＸＡＤ−１６樹脂０．８Ｌで充填されたクロマトグラフィーカラムにロードし、ロードする流速は１時間当たり１カラム体積とした。ロードが終了した後、純水（５×カラム体積）は、１時間当たり１カラム体積洗浄する流速でカラムを洗浄するために使用された。その後、３％含水メタノール２．５Ｌを溶出液として使用し、溶出する流速は１時間に当たり１カラム体積とした。化合物Ｉを含有する画分を収集して混合した。溶出液中の化合物Ｉの含有量はＨＰＬＣによって６．６ｇ（収率５０．４％）として決定され、純度は７９．５％であった。

上記の実施例は本発明の好ましい実施例だけで、本発明の範囲を限定するものではない。本発明に関する実質の技術内容は広義的に請求の範囲に定義される。そして、上記実体または方法が請求の範囲に定義されたのと同じであるならば、他の人によって達成された実体または方法は、請求の範囲に定義されたような範囲と同等及び範囲に含まれるとして見なされるべきである。

Claims (15)

1. 式Ｉの化合物又はその塩の精製方法であって、
   前記方法は次のステップ：
   （１）式Ｉの粗化合物をマクロポーラス吸着樹脂にロードすること；
   （２）洗浄液として水、有機溶媒、または有機溶媒と水の混合溶液を用いて、マクロポーラス吸着樹脂を洗浄すること、
   （３）溶出液として水、有機溶媒、または有機溶媒と水の混合溶液を用いて、マクロポーラス吸着樹脂から式Ｉの化合物を溶出すること、
   を含む式Ｉの化合物又はその塩の精製方法。
   
2. ステップ（１）において、前記式Ｉの粗化合物を含む溶液を前記マクロポーラス吸着樹脂が充填されたクロマトグラフィーカラムに流すこと、または前記式Ｉの粗化合物を含む溶液を前記マクロポーラス吸着樹脂と混合することで、前記式Ｉの粗化合物を前記マクロポーラス吸着樹脂にロードする、請求項１に記載の精製方法。
3. 流速は１時間当たり０．１〜１０カラム体積である請求項２に記載の精製方法。
4. 前記マクロポーラス吸着樹脂は、スチレンとジビニルベンゼンから重合された非極性の芳香族吸着樹脂、または該樹脂構造においてメタクリレート単位を有する中等極性のメタクリル吸着樹脂から選ばれる請求項１〜３のいずれか１項に記載の精製方法。
5. 前記マクロポーラス吸着樹脂は、ＸＡＤ−１、ＸＡＤ−２、ＸＡＤ−３、ＸＡＤ−４、ＸＡＤ−５、ＸＡＤ−１６、ＸＡＤ−１６ＨＰ、ＨＰ−１０、ＨＰ−２０、ＨＰ−２０ｓｓ、ＨＰ−２１、ＨＰ−３０、ＨＰ−４０、ＨＰ−５０、ＳＰ−８２５、ＳＰ−８５０、ＳＰ−７０、ＳＰ−７００、ＳＰ−２０７、ＳＰ２０７ｓｓ、ＸＡＤ−６、ＸＡＤ−７、ＸＡＤ−７ＨＰ、ＸＡＤ−８、ＨＰ−２ＭＧ、またはそれらの混合物から選ばれる請求項４に記載の精製方法。
6. 前記吸着樹脂は、ハロゲンを含有し、かつ、化学結合を介してスチレン重合体マトリックスに結合される請求項４に記載の精製方法。
7. 前記吸着樹脂は、臭素を含有し、かつ、化学結合を介してスチレン重合体マトリックスに結合される請求項６に記載の精製方法。
8. 前記吸着樹脂は、ＳＰ−２０７、ＳＰ２０７ｓｓ、またはそれらの混合物から選ばれる請求項７に記載の精製方法。
9. 前記式Ｉの粗化合物を含む溶液は、電離可能な塩を含み、前記マクロポーラス吸着樹脂は、スチレンとジビニルベンゼンとから重合された非極性の芳香族吸着樹脂、または該樹脂構造においてメタクリレート単位を有する中等極性のメタクリル吸着樹脂から選ばれる請求項２に記載の精製方法。
10. 前記電離可能な塩は、硫酸塩、硝酸塩、ハロゲン含有塩、リン酸塩、酢酸塩、炭酸塩、クエン酸塩、ケイ酸塩、過硫酸塩、クロム酸塩、乳酸塩、シュウ酸塩等、またはそれらの混合物から選択される請求項９に記載の精製方法。
11. 前記有機溶媒は、Ｃ_１−４アルコール、Ｃ_１−４ケトンから選ばれる請求項１〜３のいずれか１項に記載の精製方法。
12. 前記有機溶媒は、メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール、アセトン、ブタノン、またはそれらの混合物から選ばれる請求項１１に記載の精製方法。
13. ステップ（２）において、洗浄液の総体積に対して、有機溶媒の体積百分率は０〜３％、好ましくは０〜２％である請求項１〜３のいずれか１項に記載の精製方法。
14. ステップ（３）において、溶出液の総体積に対して、有機溶媒の体積百分率は０〜２０％、好ましくは０〜５％である請求項１〜３のいずれか１項に記載の精製方法。
15. ステップ（１）において、前記式Ｉの粗化合物のマクロポーラス吸着樹脂に対する重量比は０．１〜１５（ｇ／Ｌ）である請求項１〜３のいずれか１項に記載の精製方法。