WO2021017793A1 - 一种化学合成酸性多肽的制备方法 - Google Patents

一种化学合成酸性多肽的制备方法 Download PDF

Info

Publication number
WO2021017793A1
WO2021017793A1 PCT/CN2020/101513 CN2020101513W WO2021017793A1 WO 2021017793 A1 WO2021017793 A1 WO 2021017793A1 CN 2020101513 W CN2020101513 W CN 2020101513W WO 2021017793 A1 WO2021017793 A1 WO 2021017793A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
mobile phase
acetonitrile
eluent
solution
elution
Prior art date
Application number
PCT/CN2020/101513
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
付玉清
李新宇
屈文杰
舒遂智
吴丽芬
Original Assignee
深圳市健元医药科技有限公司
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 深圳市健元医药科技有限公司 filed Critical 深圳市健元医药科技有限公司
Publication of WO2021017793A1 publication Critical patent/WO2021017793A1/zh

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01D—SEPARATION
    • B01D15/00—Separating processes involving the treatment of liquids with solid sorbents; Apparatus therefor
    • B01D15/08—Selective adsorption, e.g. chromatography
    • B01D15/26—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism
    • B01D15/32—Bonded phase chromatography
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
    • C07K1/16—Extraction; Separation; Purification by chromatography
    • C07K1/18—Ion-exchange chromatography
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
    • C07K1/16—Extraction; Separation; Purification by chromatography
    • C07K1/20—Partition-, reverse-phase or hydrophobic interaction chromatography
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/575—Hormones
    • C07K14/605—Glucagons
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
    • Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
    • Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
    • Y02P20/55—Design of synthesis routes, e.g. reducing the use of auxiliary or protecting groups

Definitions

  • the invention relates to a method for preparing chemically synthesized acidic polypeptides, in particular to a method for purifying acidic polypeptide compounds synthesized by a chemical method by using reverse phase preparative chromatography.
  • the chemically synthesized peptide compounds have extremely high biological activity.
  • Pharmaceutical peptide compounds need to have extremely high compound purity and very low impurity content to effectively avoid clinically uncomfortable reactions caused by impurities to patients.
  • a series of deletion, hydrolysis, and racemization impurities will be produced. These impurities may be toxic to drugs due to their toxicity during clinical use, or they may have biological activities inconsistent with the expected peptides. Side effects, and these impurities are very similar in nature to the target compound and are difficult to separate, which is a very severe test in industrial preparation.
  • acidic peptide compounds are separated and purified by preparative chromatography.
  • Most of the existing chromatographic column packings have limited tolerance to acid and alkali, and alkaline elution is used.
  • the loss of the chromatographic column is very serious when the liquid is eluted, and the use of acidic eluents is difficult to achieve the purpose of separating high-purity target compounds.
  • Acidic compounds have lower solubility in acidic solutions than alkaline solutions.
  • the polypeptide shown in formula I has very strong hydrophobicity due to its long peptide chain and long side chain containing long alkyl modifications and the presence of hydrophobic amino acids. Its solubility in acidic systems is very small, and it is very difficult to purify using acidic buffer systems. .
  • Patent CN103275209A uses 0.1% TFA/water solution-0.1% TFA/acetonitrile solution as the eluent
  • the patent CN 201210029818.7 adopts the isopropanol aqueous solution containing 0.1 to 0.2% trifluoroacetic acid as phase A.
  • Acetonitrile containing 0.1-0.2% trifluoroacetic acid is used as the first purification step for B.
  • Patent CN201410001671.X uses phase A: 0.1% TFA; phase B: acetonitrile as the first purification condition, and patent CN201810663478.0 uses phosphoric acid as the flow phase.
  • the present invention provides a chemical synthesis method using reversed-phase preparative chromatography. Method for purification of acidic peptide compounds.
  • a method for purifying and preparing high-purity acidic polypeptides from a mixture containing the acidic polypeptides and related impurities is a high-performance liquid chromatography method that is purified by RP-HPLC in two or three steps.
  • the solvent used for elution is mainly composed of ion pair reagents and organic modifiers.
  • the elution solvent is eluted in a gradient elution manner.
  • the ion pair reagent is selected from NH 4 Cl, HCOOH, NH 4 HCO 3 , TEAP solution;
  • the organic modifier is selected from methanol, ethanol, n-propanol, isopropanol, and acetonitrile.
  • impurities are mainly by-products, intermediates, degradation products, oxidation products, salts and various protective groups in the reaction process.
  • deletion peptides and racemic peptides are the main need to remove impurities.
  • the acidic polypeptide has the following structure:
  • the acidic polypeptide shown in Formula I has a long peptide chain, a complex branched chain structure, and many impurities generated during the synthesis process. When used as a pharmaceutical active ingredient with high purity requirements, the purity needs to be strictly controlled, and the synthesized crude peptide Purify.
  • the acidic polypeptides of the present invention particularly refer to weakly acidic polypeptides that contain amino acids with strong hydrophobicity in the peptide sequence and have longer alkyl side chain modifications resulting in poor solubility. It is difficult to elute during the purification process, causing loss, increasing the difficulty of purification, and affecting the purification yield of acidic peptides.
  • the present invention adopts RP-HPLC, which is mainly composed of ion pair reagents and organic modifiers alternately to form an elution solution for elution. Purification is carried out in two or three steps. Gradient elution can remove the crude peptide to be purified.
  • the combination scheme of organic modifiers, and by changing the combined concentration of organic modifiers, the concentration ratio of organic modifiers to ion pair reagents can be changed to achieve certain impurities in the compound and target compounds in reversed phase preparation. Maximum separation effect.
  • the elution solvent is a mixed solution of NH 4 Cl aqueous solution and any one or more organic modifiers among methanol, ethanol, n-propanol, isopropanol, and acetonitrile.
  • the elution solvent is a mixed solution of HCOOH aqueous solution and any one or more organic modifiers of methanol, ethanol, n-propanol, isopropanol, and acetonitrile.
  • the elution solvent is a mixed solution of NH 4 HCO 3 aqueous solution and any one or more organic modifiers of methanol, ethanol, n-propanol, isopropanol, and acetonitrile.
  • the elution solvent is a mixed solution of TEAP solution and any one or more organic modifiers of methanol, ethanol, n-propanol, isopropanol, and acetonitrile.
  • RP-HPLC purification is carried out in two steps, eluent 1 is a mixed solution of NH 4 Cl aqueous solution and organic modifier, and eluent 2 is a mixed solution of HCOOH aqueous solution and organic modifier. Solution.
  • RP-HPLC purification is carried out in three steps, eluent 1 is a mixed solution of TEAP solution and organic modifier, and eluent 2 is a mixed solution of TEAP solution and organic modifier.
  • Deliquation 3 is a mixed solution of NH 4 HCO 3 aqueous solution and organic modifier.
  • RP-HPLC purification is carried out in three steps, eluent 1 is a mixed solution of NH 4 Cl aqueous solution and organic modifier, and eluent 2 is a mixed solution of TEAP solution and organic modifier. , Eluent 3 is a mixed solution of NH 4 HCO 3 aqueous solution and organic modifier.
  • RP-HPLC purification is carried out in three steps, eluent 1 is a mixed solution of HCOOH aqueous solution and organic modifier, and eluent 2 is a mixed solution of NH 4 Cl aqueous solution and organic modifier. , Eluent 3 is a mixed solution of NH 4 HCO 3 aqueous solution and organic modifier.
  • RP-HPLC purification is carried out in three steps, eluent 1 is a mixed solution of NH 4 Cl aqueous solution and organic modifier, and eluent 2 is a mixed solution of HCOOH aqueous solution and organic modifier. , Eluent 3 is a mixed solution of NH 4 HCO 3 aqueous solution and organic modifier.
  • the eluent 1 refers to the eluent used as the mobile phase in the stepwise purification of RP-HPLC; the eluent 2 refers to the second step in the purification of RP-HPLC. It is used as the eluent of the mobile phase in the step of purification; the eluent 3 refers to the eluent of the mobile phase in the step of purification by RP-HPLC, and the eluent in the third step of purification, and so on.
  • the pH is 7.0 to 10.0.
  • the volume concentration is 50 mmoL/L.
  • the pH is 2.5.
  • the pH is 7.0.
  • the mass concentration is 0.1-10%.
  • the volume concentration is 1-100 mmoL/L.
  • the organic modifier of the eluent 1 or 2 is one or two of acetonitrile, n-propanol, and isopropanol.
  • the organic modifier of the eluent 3 is n-propanol and/or isopropanol.
  • isopropanol or n-propanol is used for separation and purification after the last ion-pair reagent.
  • Isopropanol or n-propanol has lower toxicity. It can be used to replace acetonitrile, which is commonly used in reversed-phase peptide purification, and can avoid the clinical risk of drugs.
  • the pH of the ion pair reagent used is at least 1 pH unit higher than the pKa value of the isolated acidic polypeptide compound.
  • the ion-pair reagent passes through different pH values, and the pH of the ion-pair reagent used is in the compound
  • the pka value is more than 1 pH value to ensure the structural properties of the compound.
  • the content ranges from 0% to 70%.
  • the gradient of the mobile phase containing the organic modifier ranges from 20% to 60% (60 min).
  • the packing of the chromatographic column of the reversed-phase high performance liquid chromatography system is C4, C6, C8 and C18 bonded silica gel or high molecular polymer.
  • the invention can separate and purify crude acidic polypeptides that have not undergone any purification in the total synthesis and intermediate process, especially weakly acidic polypeptides with poor solubility, to obtain high-purity final products, and ensure high purification yields.
  • the method is simple and easy to operate. , Saving resources, especially suitable for industrial scale preparation.
  • Figure 1 is the HPLC profile of the crude peptide of Example 1.
  • Figure 2 is the HPLC chart of the refined peptide of Example 1.
  • Figure 3 is the HPLC chart of the refined peptide of Example 16.
  • Figure 4 is the HPLC chart of the refined peptide of Example 17
  • the filtered crude peptide solution is loaded onto the chromatographic column through the injection pump.
  • the chromatographic column has a size of 30*250mm and contains 10 ⁇ m C8 bonded silica filler.
  • the chromatographic column has a size of 30*250mm and is equipped with a 10 ⁇ m C8 bonded silica filler.
  • the filtered crude peptide solution is loaded onto the chromatographic column through the injection pump.
  • the chromatographic column has a size of 30*250mm and contains 10 ⁇ m C8 bonded silica filler.
  • the chromatographic column has a size of 30*250mm and is equipped with a 10 ⁇ m C8 bonded silica filler.
  • the filtered crude peptide solution is loaded onto the chromatographic column through the injection pump.
  • the chromatographic column has a size of 30*250mm and contains 10 ⁇ m C8 bonded silica filler.
  • the chromatographic column has a size of 30*250mm and is equipped with a 10 ⁇ m C8 bonded silica filler.
  • the filtered crude peptide solution is loaded onto the chromatographic column through the injection pump.
  • the chromatographic column has a size of 30*250mm and contains 10 ⁇ m C8 bonded silica filler.
  • the chromatographic column has a size of 30*250mm and is equipped with a 10 ⁇ m C8 bonded silica filler.
  • the filtered crude peptide solution is loaded onto the chromatographic column through the injection pump.
  • the chromatographic column has a size of 30*250mm and contains 10 ⁇ m C8 bonded silica filler.
  • the chromatographic column has a size of 30*250mm and is equipped with a 10 ⁇ m C8 bonded silica filler.
  • the filtered crude peptide solution is loaded onto the chromatographic column through the injection pump.
  • the chromatographic column has a size of 30*250mm and contains 10 ⁇ m C8 bonded silica filler.
  • the chromatographic column has a size of 30*250mm and is equipped with a 10 ⁇ m C8 bonded silica filler.
  • the filtered crude peptide solution is loaded onto the chromatographic column through the injection pump.
  • the chromatographic column has a size of 30*250mm and contains a 10 ⁇ m C18 bonded silica filler.
  • the chromatographic column has a size of 30*250mm and is equipped with a 10 ⁇ m C8 bonded silica filler.
  • the filtered crude peptide solution is loaded onto the chromatographic column through the injection pump.
  • the chromatographic column has a size of 30*250mm and contains 10 ⁇ m C8 bonded silica filler.
  • the chromatographic column has a size of 30*250mm and contains a 10 ⁇ m C8 bonded silica gel filler.
  • the chromatographic column has a size of 30*250mm and contains a 10 ⁇ m C8 bonded silica gel filler.
  • the filtered crude peptide solution is loaded onto the chromatographic column through the injection pump.
  • the chromatographic column has a size of 30*250mm and contains 10 ⁇ m C8 bonded silica filler.
  • the chromatographic column has a size of 30*250mm and contains a 10 ⁇ m C8 bonded silica gel filler.
  • the chromatographic column has a size of 30*250mm and contains a 10 ⁇ m C8 bonded silica gel filler.
  • the filtered crude peptide solution is loaded onto the chromatographic column through the injection pump.
  • the chromatographic column has a size of 30*250mm and contains 10 ⁇ m C8 bonded silica filler.
  • the chromatographic column has a size of 30*250mm and contains a 10 ⁇ m C8 bonded silica gel filler.
  • the chromatographic column has a size of 30*250mm and contains a 10 ⁇ m C8 bonded silica gel filler.
  • the filtered crude peptide solution is loaded onto the chromatographic column through the injection pump.
  • the chromatographic column has a size of 30*250mm and contains 10 ⁇ m C8 bonded silica filler.
  • the chromatographic column has a size of 30*250mm and contains a 10 ⁇ m C8 bonded silica gel filler.
  • the chromatographic column has a size of 30*250mm and contains a 10 ⁇ m C8 bonded silica gel filler.
  • the filtered crude peptide solution is loaded onto the chromatographic column through the injection pump.
  • the chromatographic column has a size of 30*250mm and contains 10 ⁇ m C8 bonded silica filler.
  • the chromatographic column has a size of 30*250mm and contains a 10 ⁇ m C8 bonded silica gel filler.
  • the chromatographic column has a size of 30*250mm and contains a 10 ⁇ m C8 bonded silica gel filler.
  • the chromatographic column has a size of 30*250mm and contains 10 ⁇ m C8 bonded silica packing.
  • the chromatographic column has a size of 30*250mm and contains a 10 ⁇ m C8 bonded silica gel filler.
  • the chromatographic column has a size of 30*250mm and contains a 10 ⁇ m C8 bonded silica gel filler.
  • the filtered crude peptide solution is loaded onto the chromatographic column through the injection pump.
  • the chromatographic column has a size of 30*250mm and contains 10 ⁇ m C8 bonded silica filler.
  • the chromatographic column has a size of 30*250mm and contains a 10 ⁇ m C8 bonded silica gel filler.
  • the chromatographic column has a size of 30*250mm and contains a 10 ⁇ m C8 bonded silica gel filler.
  • the filtered crude peptide solution is loaded onto the chromatographic column through the injection pump.
  • the chromatographic column has a size of 30*250mm and contains 10 ⁇ m C8 bonded silica filler.
  • the chromatographic column has a size of 30*250mm and contains a 10 ⁇ m C8 bonded silica gel filler.
  • the chromatographic column has a size of 30*250mm and contains a 10 ⁇ m C8 bonded silica gel filler.
  • the filtered crude peptide solution is loaded onto the chromatographic column through the injection pump.
  • the chromatographic column has a size of 30*250mm and contains 10 ⁇ m C8 bonded silica filler.
  • the elution flow rate is 25 mL/min.
  • the gradient elution method is: within 60 minutes, the gradient changes from 63% A + 37% B (V/V) It is 43%A+57%B(V/V), start the mobile phase elution, collect the spectrum, observe the change of the absorption value, collect the main peak and use the analytical liquid to check the purity, collect and sample the sample after rotary evaporation and concentration to remove the acetonitrile, the formula
  • the pure acidic polypeptide shown in I has a detection purity of 96.39 and a maximum single impurity of 2.65% (see Figure 3 for HPLC detection and Table 3 for map data).
  • the filtered crude peptide solution is loaded onto the chromatographic column through the injection pump.
  • the chromatographic column has a size of 30*250mm and contains 10 ⁇ m C8 bonded silica filler.
  • the elution flow rate is 25 mL/min.
  • the gradient elution method is: within 60 min, the gradient changes from 65% A + 35% B (V/V) 45%A+55%B(V/V), start the mobile phase elution, collect the spectrum, observe the change of the absorption value, collect the main peak and use the analytical liquid to detect the purity, collect and sample the sample after rotary evaporation and concentration to remove the acetonitrile, the formula
  • the pure acidic polypeptide shown in ⁇ has a purity of 93.05% and a maximum single impurity of 2.60% (see Figure 4 for HPLC detection and Table 4 for map data).

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

一种化学合成酸性多肽的制备方法，主要解决酸性化多肽化合物纯化杂质困难、收率低的缺点。该方法是一种高效液相色谱法，分两步或三步进行RP-HPLC纯化，作为流动相用于洗脱的溶剂主要由离子对试剂和有机改性剂组成，洗脱溶剂以梯度洗脱的方式进行洗脱。该方法能将全合成、中间过程未进行任何纯化的酸性多肽粗品，尤其是溶解性差的弱酸性多肽进行分离纯化，得到高纯度终产品，并且保证较高的纯化收率，方法简捷，易操作，节约资源，特别适合于工业化规模制备。

Description

一种化学合成酸性多肽的制备方法 技术领域
本发明涉及一种化学合成酸性多肽的制备方法，特别涉及一种利用反相制备色谱对化学方法合成的酸性多肽化合物进行纯化。
技术背景
化学合成的多肽化合物的生物活性极高，要求药用的多肽化合物，需要具有极高的化合物纯度，极低的杂质含量，以有效避免在临床上因杂质对患者引起的不适反应。在多肽的化学合成过程中会产生一系列的缺失、水解、消旋杂质，这些杂质在药物临床使用时因其毒性，或者其可能存在与期望多肽不符的生物活性，可能会造成药物诸多的毒副作用，而这些杂质与目标化合物的性质十分相近，难于分离，在工业制备中是非常严峻的考验。
现阶段酸性多肽化合物，特别是分子量较大的、溶解性较差的弱酸性多肽在采用制备色谱进行分离纯化时，现有色谱柱填料大多对酸碱的耐受范围有限，采用碱性洗脱液进行洗脱时对色谱柱的损耗十分严重，而采用酸性洗脱液又很难达到分离出高纯度目标化合物的目的。酸性化合物在酸性溶液下，溶解度较碱性溶液小。如式Ι所示的多肽由于其肽链长且侧链含有较长的烷基修饰、疏水氨基酸的存在导致疏水性非常强，其在酸性体系下溶解度非常小，使用酸性缓冲体系纯化难度非常大。
在已有的文献中，如专利CN103275209A采用0.1％TFA/水溶液-0.1％TFA/乙腈溶液作为洗脱液，专利CN 201210029818.7采用，以含有0.1～0.2％三氟醋酸的异丙醇水溶液为A相，含有0.1～0.2％三氟醋酸的乙腈为B进行第一步纯化，专利CN201410001671.X采用A相：0.1％TFA；B相：乙腈作为第一次纯化条件，专利CN201810663478.0采用磷酸作为流动相。这些方法中大多采用醋酸、三氟乙酸、磷酸作为流动相的组成部分，但是因洗脱过程中样品吸附在填料上，导致回收率偏低等问题，不适合作为制备流动相体系；同时制备收集的馏分放置一段时间之后样品析出,很难再溶清，不适合工业化生产。也有文献报道采用碱性流动相进行纯化，但不可避免地需要采取特殊的色谱柱，涉及到的色谱柱子的填料品种较多并且有的填料非常昂贵。不适合大规模工业化生产。
发明内容
有鉴于此，本发明为解决现有技术中酸性多肽化合物，尤其是溶解度差、弱酸性化多肽化合物纯化杂质困难、收率低的缺点，提供了一种利用反相制备色谱对化学方法合成的酸性多肽化合物进行纯化的方法。
为实现上述目的，本发明提供的技术方案如下：
一种用于从包含所述酸性多肽和相关杂质的混合物中纯化制备高纯度酸性多肽的方法，所述方法是一种高效液相色谱法，分两步或三步进行RP-HPLC纯化，用于洗脱的溶剂主要由 离子对试剂和有机改性剂组成，所述洗脱溶剂以梯度洗脱的方式进行洗脱，
其中，所述离子对试剂选自NH 4Cl，HCOOH，NH 4HCO 3，TEAP溶液；
其中，所述有机改性剂选自甲醇、乙醇、正丙醇、异丙醇、乙腈。
多肽化学合成中，杂质主要为反应过程中的副产物、中间体、降解产物、氧化产物、盐及各种保护基。其中，缺失肽和消旋肽为主要的需要去除杂质。
本发明的一些实施例中，酸性多肽具有如下结构：
Figure PCTCN2020101513-appb-000001
如式Ι所示的酸性多肽，肽链较长、支链结构复杂，在合成过程中产生的杂质多，在作为高纯度要求的药物活性成分时，需要严格控制纯度，必须对合成的粗肽进行纯化。
本发明所述的酸性多肽，尤其指肽序中含有疏水性较强的氨基酸、有较长的烷基侧链修饰而造成溶解性较差的弱酸性多肽。纯化过程中难以洗脱，造成损失，增加了纯化难度，影响了酸性多肽的纯化收率。本发明通过RP-HPLC，采用主要由离子对试剂和有机改性剂交替使用，组成洗脱溶液进行洗脱，分两步或三步进行纯化，梯度洗脱，可以将待纯化的粗肽中的大部分异构体杂质和其他难以分离的杂质分离、去除；之后采用碳酸氢铵盐溶液作为流动相，进行梯度洗脱，去除难除、微小杂质并有效解决了难洗脱、收率低的问题。实验结果证实，本发明提供的纯化方法所得酸性多肽纯度高、收率高，并且操作简便，有利于实现酸性多肽的规模化制备。
有机改性剂的组合搭配方案，以及通过改变有机改性剂的组合浓度，改变有机改性剂与离子对试剂的浓度比，以达到化合物中的某些特定杂质和目标化合物在反相制备达到最大的分离效果。
优选地，本发明提供的纯化方法中，洗脱溶剂为NH 4Cl水溶液和甲醇、乙醇、正丙醇、异丙醇、乙腈中任一种或多种有机改性剂的混合溶液。
优选地，本发明提供的纯化方法中，洗脱溶剂为HCOOH水溶液和甲醇、乙醇、正丙醇、异丙醇、乙腈中任一种或多种有机改性剂的混合溶液。
优选地，本发明提供的纯化方法中，洗脱溶剂为NH 4HCO 3水溶液和甲醇、乙醇、正丙醇、异丙醇、乙腈中任一种或多种有机改性剂的混合溶液。
优选地，本发明提供的纯化方法中，洗脱溶剂为TEAP溶液和甲醇、乙醇、正丙醇、异丙醇、乙腈中任一种或多种有机改性剂的混合溶液。
本发明的一些实施例中，分两步进行RP-HPLC纯化，洗脱液1为NH 4Cl水溶液和有机改性剂的混合溶液，洗脱液2为HCOOH水溶液和和有机改性剂的混合溶液。
本发明的一些实施例中，分三步进行RP-HPLC纯化，洗脱液1为TEAP溶液和有机改性剂的混合溶液，洗脱液2为TEAP溶液和有机改性剂的混合溶液，洗脱液3为NH 4HCO 3水溶液和有机改性剂的混合溶液。
本发明的一些实施例中，分三步进行RP-HPLC纯化，洗脱液1为NH 4Cl水溶液和有机改性剂的混合溶液，洗脱液2为TEAP溶液和有机改性剂的混合溶液，洗脱液3为NH 4HCO 3水溶液和有机改性剂的混合溶液。
本发明的一些实施例中，分三步进行RP-HPLC纯化，洗脱液1为HCOOH水溶液和有机改性剂的混合溶液，洗脱液2为NH 4Cl水溶液和有机改性剂的混合溶液，洗脱液3为NH 4HCO 3水溶液和有机改性剂的混合溶液。
本发明的一些实施例中，分三步进行RP-HPLC纯化，洗脱液1为NH 4Cl水溶液和有机改性剂的混合溶液，洗脱液2为HCOOH水溶液和有机改性剂的混合溶液，洗脱液3为NH 4HCO 3水溶液和有机改性剂的混合溶液。
本发明中所述洗脱液1指分步进行RP-HPLC纯化时，第一步纯化时作为流动相的洗脱液；所述洗脱液2指分步进行RP-HPLC纯化时，第二步纯化时作为流动相的洗脱液；所述洗脱液3指分步进行RP-HPLC纯化时，第三步纯化时作为流动相的洗脱液，以此类推。
作为优选，分步进行RP-HPLC纯化中，NH 4Cl作为流动相时，pH为7.0-10.0。
作为优选，分步进行RP-HPLC纯化中，NH 4Cl作为流动相时，体积浓度为50mmoL/L。
作为优选，分步进行RP-HPLC纯化中，TEAP作为流动相时，pH为2.5。
作为优选，分步进行RP-HPLC纯化中，TEAP作为流动相时，pH为7.0。
作为优选，分步进行RP-HPLC纯化中，HCOOH作为流动相时，质量浓度为0.1～10％。
作为优选，分步进行RP-HPLC纯化中，NH 4HCO 3作为流动相时，体积浓度为1～100mmoL/L。
本发明的一些实施例中，分步进行RP-HPLC纯化中，洗脱液1或2的有机改性剂为乙腈、 正丙醇、异丙醇中的一种或两种。
本发明的一些实施例中，其中分步进行RP-HPLC纯化中，洗脱液3的有机改性剂为正丙醇和/或异丙醇。
经过一种或两种离子对试剂分离纯化后，再经过最后一种离子对试剂进行分离纯化时采用异丙醇或者正丙醇进行分离纯化，异丙醇或者正丙醇具有较低的毒性，用来替代反相多肽纯化过程中常用毒性较高的乙腈，可以避免药物的临床风险。
优选地，本发明提供的纯化方法中，纯化酸性多肽时，使用的离子对试剂的pH大于所分离的酸性多肽化合物pKa值至少1个pH单位。
采用反相层析的原理，利用反相硅胶分辨率高的特点，结合一种离子对试剂组合的方案，离子对试剂通过不同的pH值的变换，并且所使用的离子对试剂的pH在化合物pka值的1个pH值以上，以保证化合物的结构性质。
优选地，本发明提供的纯化方法中，有机改性剂作为流动相时，含量范围为0％～70％。
优选地，本发明提供的纯化方法中，含有有机改性剂的流动相梯度范围为20％～60％(60min)。
优选地，本发明提供的纯化方法中，反相高效液相色谱系统(RP-HPLC)的色谱柱的填料为C4、C6、C8和C18键合硅胶或高分子聚合物。
本发明能将全合成、中间过程未进行任何纯化的酸性多肽粗品，尤其是溶解性差的弱酸性多肽进行分离纯化，得到高纯度终产品，并且保证较高的纯化收率，方法简捷，易操作，节约资源，特别适合于工业化规模制备。
附图说明
图1为实施例1粗肽的HPLC图谱。
图2为实施例1精肽的HPLC图谱。
图3为实施例16精肽的HPLC图谱。
图4为实施例17精肽的HPLC图谱
具体实施例
下面结合具体实施例对本发明的制备方法作进一步详细的说明以便于本领域的技术人员进一步地理解本发明，而不构成对其权利的限制。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明内。
实施例1：式Ι所示的酸性多肽的制备
(1)粗肽的溶解和过滤
称取1.03g粗肽，碾碎后加入200mL溶剂(乙腈：纯化水＝20：80的体积比例混合)超 声溶解，加入三乙胺至完全溶清，再用TFA调pH7.51，然后放置40℃水浴1.5h，使用0.45μm有机滤膜过滤，检测粗肽溶液，粗肽HPLC纯度71.86％(HPLC检测见图，表1)。
表1粗肽HPLC图谱数据
峰号 保留时间 面积 面积％
1 7.477 113114 1.72
2 7.863 8691 0.13
3 7.990 8802 0.13
4 8.220 25467 0.39
5 8.643 5967 0.09
6 9.106 11030 0.17
7 9.607 16395 0.25
8 9.734 8424 0.13
9 10.019 7246 0.11
10 10.215 8641 0.13
11 10.635 111312 1.69
12 11.624 20236 0.31
13 12.091 96973 1.47
14 12.557 49926 0.76
15 12.86 89864 1.36
16 13.071 39795 0.60
17 13.529 23147 0.35
18 13.761 93692 1.42
19 14.499 4738261 71.86
20 14.854 16524 0.25
21 15.228 38227 0.58
22 15.663 23598 0.36
23 15.885 119872 1.82
24 16.514 92744 1.41
25 16.993 22970 0.35
26 17.510 23341 0.35
27 18.024 77706 1.18
28 18.713 18458 0.28
29 18.893 40006 0.61
30 19.579 28362 0.43
31 20.356 1576 0.02
32 20.808 4456 0.07
33 21.628 425596 6.45
34 22.734 5783 0.09
35 23.525 177785 2.70
(2)氯化铵/乙腈为流动相进行第一次冲洗
将上述过滤后的粗肽溶液通过进样泵加载到色谱柱上，色谱柱的规格为30*250mm，内装10μm的C8键合硅胶填料。
以50mM氯化铵pH8.5为流动相A，以50mM氯化铵pH8.5：乙腈＝300:700作为流动相B，洗脱流速为25mL/min，梯度洗脱洗脱方式为：60min内，梯度由50％A+50％B(V/V)变为40％A+60％B(V/V)，启动流动相洗脱，采集图谱，观察吸收值的变化，收集主峰并用分析液相检测纯度，收集、并样、旋蒸浓缩去除乙腈后，得到式Ι所示的酸性多肽中间体浓缩液。
(3)HCOOH/乙腈+正丙醇为流动相进行第二次冲洗
将上述中间体浓缩液通过进样泵加载到色谱柱上，色谱柱的规格为30*250mm，内装10μm的C8键合硅胶填料。
以0.1％HCOOH为流动相A，以正丙醇：乙腈＝1:1(V/V)作为流动相B，洗脱流速为25mL/min，梯度洗脱洗脱方式为：60min内，梯度由67％A+33％B(V/V)变为37％A+63％B(V/V)，启动流动相洗脱，采集图谱，观察吸收值的变化，收集主峰并用分析液相检测纯度，收集纯度＞98％的馏分合并，并样、旋蒸浓缩后冷冻干燥，得到式Ι所示的酸性多肽纯品205.3mg，纯度为99.46％，最大单杂为0.19％(HPLC检测见图2)，图谱数据见表2，总收率为76.3％。
表2精肽HPLC图谱数据
峰号 保留时间 面积 面积％
1 10.400 373 0.02
2 10.967 1144 0.07
3 11.771 2589 0.15
4 12.292 1707706 99.46
5 12.913 3259 0.19
6 13.321 1156 0.07
7 13.942 813 0.05
实施例2：式Ι所示的酸性多肽的制备
(1)粗肽的溶解和过滤
称取1.05g粗肽，碾碎后加入200mL溶剂(乙腈：纯化水＝20：80的体积比例混合)超声溶解，加入三乙胺至完全溶清，再用TFA调pH7.55，然后放置40℃℃水浴1.5h，使用0.45μm有机滤膜过滤，检测粗肽溶液，粗肽HPLC纯度71.76％。
(2)氯化铵/乙腈为流动相进行第一次冲洗
将上述过滤后的粗肽溶液通过进样泵加载到色谱柱上，色谱柱的规格为30*250mm，内装10μm的C8键合硅胶填料。
以50mM氯化铵pH7.0为流动相A，以50mM氯化铵pH7.0：乙腈＝300:700作为流动相B，洗脱流速为25mL/min，梯度洗脱洗脱方式为：60min内，梯度由48％A+52％B(V/V)变为38％A+62％B(V/V)，启动流动相洗脱，采集图谱，观察吸收值的变化，收集主峰并用分析液相检测纯度，收集并样旋蒸浓缩去除乙腈后，得到式Ι所示的酸性多肽中间体浓缩液。
(3)HCOOH/乙腈+正丙醇为流动相进行第二次冲洗
将上述中间体浓缩液通过进样泵加载到色谱柱上，色谱柱的规格为30*250mm，内装10μm的C8键合硅胶填料。
以0.1％HCOOH为流动相A，以正丙醇：乙腈＝1:1(V/V)作为流动相B，洗脱流速为25mL/min，梯度洗脱洗脱方式为：60min内，梯度由67％A+33％B(V/V)变为 37％A+63％B(V/V)，启动流动相洗脱，采集图谱，观察吸收值的变化，收集主峰并用分析液相检测纯度，收集纯度＞98％的馏分合并，并样旋蒸浓缩后冷冻干燥，检测冻干后样品纯度为99.02％，最大单杂为0.34％，(HPLC检测结果图与图2相似)。
实施例3：式Ι所示的酸性多肽的制备
(1)粗肽的溶解和过滤
称取1.02g粗肽，碾碎后加入200mL溶剂(乙腈：纯化水＝20：80的体积比例混合)超声溶解，加入三乙胺至完全溶清，再用TFA调pH7.49，然后放置40℃水浴1.5h，使用0.45μm有机滤膜过滤，检测粗肽溶液，粗肽HPLC纯度71.56％。
(2)氯化铵/乙腈为流动相进行第一次冲洗
将上述过滤后的粗肽溶液通过进样泵加载到色谱柱上，色谱柱的规格为30*250mm，内装10μm的C8键合硅胶填料。
以50mM氯化铵pH10.0为流动相A，以50mM氯化铵pH10.0：乙腈＝300:700作为流动相B，洗脱流速为25mL/min，梯度洗脱洗脱方式为：60min内，梯度由52％A+48％B(V/V)变为42％A+58％B(V/V)，启动流动相洗脱，采集图谱，观察吸收值的变化，收集主峰并用分析液相检测纯度，收集并样旋蒸浓缩去除乙腈后，得到式Ι所示的酸性多肽中间体浓缩液。
(3)HCOOH/乙腈+正丙醇为流动相进行第二次冲洗
将上述中间体浓缩液通过进样泵加载到色谱柱上，色谱柱的规格为30*250mm，内装10μm的C8键合硅胶填料。
以0.1％HCOOH为流动相A，以正丙醇：乙腈＝1:1(V/V)作为流动相B，洗脱流速为25mL/min，梯度洗脱洗脱方式为：60min内，梯度由67％A+33％B(V/V)变为37％A+63％B(V/V)，启动流动相洗脱，采集图谱，观察吸收值的变化，收集主峰并用分析液相检测纯度，收集纯度＞98％的馏分合并，并样旋蒸浓缩后冷冻干燥，检测冻干后样品纯度为98.88％，最大单杂为0.30％，(HPLC检测结果图与图2相似)。
实施例4：式Ι所示的酸性多肽的制备
(1)粗肽的溶解和过滤
称取1.00g粗肽，碾碎后加入200mL溶剂(乙腈：纯化水＝20：80的体积比例混合)超声溶解，加入三乙胺至完全溶清，再用TFA调pH7.52，然后放置40℃水浴1.5h，使用0.45μm有机滤膜过滤，检测粗肽溶液，粗肽HPLC纯度71.76％。
(2)氯化铵/乙腈为流动相进行第一次冲洗
将上述过滤后的粗肽溶液通过进样泵加载到色谱柱上，色谱柱的规格为30*250mm，内装10μm的C8键合硅胶填料。
以50mM氯化铵pH8.5为流动相A，以50mM氯化铵pH8.5：乙腈＝300:700作为流动相B，洗脱流速为25mL/min，梯度洗脱洗脱方式为：60min内，梯度由50％A+50％B(V/V)变为40％A+60％B(V/V)，启动流动相洗脱，采集图谱，观察吸收值的变化，收集主峰并用分析液相检测纯度，收集并样旋蒸浓缩去除乙腈后，得到式Ι所示的酸性多肽中间体浓缩液。
(3)HCOOH/乙腈+正丙醇为流动相进行第二次冲洗
将上述中间体浓缩液通过进样泵加载到色谱柱上，色谱柱的规格为30*250mm，内装10μm的C8键合硅胶填料。
以5％HCOOH为流动相A，以正丙醇：乙腈＝1:1(V/V)作为流动相B，洗脱流速为25mL/min，梯度洗脱洗脱方式为：60min内，梯度由70％A+30％B(V/V)变为40％A+60％B(V/V)，启动流动相洗脱，采集图谱，观察吸收值的变化，收集主峰并用分析液相检测纯度，收集纯度＞98％的馏分合并，并样旋蒸浓缩后冷冻干燥，检测冻干后样品纯度为98.88％，最大单杂为0.30％，(HPLC检测结果图与图2相似)。
实施例5：式Ι所示的酸性多肽的制备
(1)粗肽的溶解和过滤
称取1.00g粗肽，碾碎后加入200mL溶剂(乙腈：纯化水＝20：80的体积比例混合)超声溶解，加入三乙胺至完全溶清，再用TFA调pH7.85，然后放置40℃℃水浴1.0h，使用0.45μm有机滤膜过滤，检测粗肽溶液，粗肽HPLC纯度71.46％。
(2)氯化铵/乙醇为流动相进行第一次冲洗
将上述过滤后的粗肽溶液通过进样泵加载到色谱柱上，色谱柱的规格为30*250mm，内装10μm的C8键合硅胶填料。
以50mM氯化铵pH8.5为流动相A，以50mM氯化铵pH8.5：乙醇＝300:700作为流动相B，洗脱流速为25mL/min，梯度洗脱洗脱方式为：60min内，梯度由42％A+58％B(V/V)变为32％A+68％B(V/V)，启动流动相洗脱，采集图谱，观察吸收值的变化，收集主峰并用分析液相检测纯度，收集并样旋蒸浓缩去除乙腈后，得到式Ι所示的酸性多肽中间体浓缩液。
(3)HCOOH/乙腈+正丙醇为流动相进行第二次冲洗
将上述中间体浓缩液通过进样泵加载到色谱柱上，色谱柱的规格为30*250mm，内装10μm的C8键合硅胶填料。
以0.1％HCOOH为流动相A，以正丙醇：乙腈＝1:1(V/V)作为流动相B，洗脱流速为25mL/min，梯度洗脱洗脱方式为：60min内，梯度由72％A+28％B(V/V)变为42％A+58％B(V/V)，启动流动相洗脱，采集图谱，观察吸收值的变化，收集主峰并用分析液相检测纯度，并样旋蒸浓缩后冷冻干燥，检测冻干后样品纯度为98.59％，最大单杂为0.41％， (HPLC检测结果图与图2相似。)。
实施例6：式Ι所示的酸性多肽的制备
(1)粗肽的溶解和过滤
称取1.00g粗肽，碾碎后加入200mL溶剂(乙腈：纯化水＝20：80的体积比例混合)超声溶解，加入三乙胺至完全溶清，再用TFA调pH7.25，然后放置40℃水浴2.0h，使用0.45μm有机滤膜过滤，检测粗肽溶液，粗肽HPLC纯度71.86％。
(2)氯化铵/甲醇为流动相进行第一次冲洗
将上述过滤后的粗肽溶液通过进样泵加载到色谱柱上，色谱柱的规格为30*250mm，内装10μm的C8键合硅胶填料。
以50mM氯化铵pH8.5为流动相A，以50mM氯化铵pH8.5：甲醇＝300:700作为流动相B，洗脱流速为25mL/min，梯度洗脱洗脱方式为：60min内，梯度由35％A+65％B(V/V)变为25％A+75％B(V/V)，启动流动相洗脱，采集图谱，观察吸收值的变化，收集主峰并用分析液相检测纯度，收集并样旋蒸浓缩去除乙腈后，得到式Ι所示的酸性多肽中间体浓缩液。
(3)HCOOH/乙腈+正丙醇为流动相进行第二次冲洗
将上述中间体浓缩液通过进样泵加载到色谱柱上，色谱柱的规格为30*250mm，内装10μm的C8键合硅胶填料。
以0.1％HCOOH为流动相A，以正丙醇：乙腈＝1:1(V/V)作为流动相B，洗脱流速为25mL/min，梯度洗脱洗脱方式为：60min内，梯度由67％A+33％B(V/V)变为37％A+63％B(V/V)，启动流动相洗脱，采集图谱，观察吸收值的变化，收集主峰并用分析液相检测纯度，收集纯度＞98％的馏分合并，并样旋蒸浓缩后冷冻干燥，检测冻干后样品纯度为98.88％，最大单杂为0.30％，(HPLC检测结果图与图2相似)。
实施例7：式Ι所示的酸性多肽的制备
(1)粗肽的溶解和过滤
称取1.02g粗肽，碾碎后加入200mL溶剂(乙腈：纯化水＝20：80的体积比例混合)超声溶解，加入三乙胺至完全溶清，再用TFA调pH7.5±0.5，然后放置40℃水浴1.5h，使用0.45μm有机滤膜过滤，检测粗肽溶液，粗肽HPLC纯度71.56％。
(2)氯化铵/乙腈为流动相进行第一次冲洗
将上述过滤后的粗肽溶液通过进样泵加载到色谱柱上，色谱柱的规格为30*250mm，内装10μm的C18键合硅胶填料。
以50mM氯化铵pH8.5为流动相A，以50mM氯化铵pH8.5：乙腈＝300:700作为流动相B，洗脱流速为25mL/min，梯度洗脱洗脱方式为：60min内，梯度由50％A+50％B(V/V)变为 40％A+60％B(V/V)，启动流动相洗脱，采集图谱，观察吸收值的变化，收集主峰并用分析液相检测纯度，收集并样旋蒸浓缩去除乙腈后，得到式Ι所示的酸性多肽中间体浓缩液。
(3)NH 4HCO 3/乙腈为流动相进行第二次冲洗
将上述中间体浓缩液通过进样泵加载到色谱柱上，色谱柱的规格为30*250mm，内装10μm的C8键合硅胶填料。
以10mM碳酸氢铵为流动相A，以乙腈：纯化水＝800:200(V/V)作为流动相B，洗脱流速为25mL/min，梯度洗脱洗脱方式为：60min内，梯度由60％A+40％B(V/V)变为50％A+50％B(V/V)，启动流动相洗脱，采集图谱，观察吸收值的变化，收集主峰并用分析液相检测纯度，收集纯度＞98％的馏分合并，并样旋蒸浓缩后冷冻干燥，得到式Ι所示的酸性多肽纯品198.6mg,检测冻干后样品纯度为98.49％，最大单杂为0.63％，(HPLC检测结果图与图2相似)。
实施例8：式Ι所示的酸性多肽的制备
(1)粗肽的溶解和过滤
称取1.03g粗肽，碾碎后加入200mL溶剂(乙腈：纯化水＝20：80的体积比例混合)超声溶解，加入三乙胺至完全溶清，再用TFA调pH7.95，然后放置40℃水浴1.5h，使用0.45μm有机滤膜过滤，检测粗肽溶液，粗肽HPLC纯度71.86％。
(2)1％TEAP pH7.0/乙腈为流动相进行第一次冲洗
将上述过滤后的粗肽溶液通过进样泵加载到色谱柱上，色谱柱的规格为30*250mm，内装10μm的C8键合硅胶填料。
以1％TEAP pH7.0为流动相A，以1％TEAP pH7.0：乙腈＝300:700作为流动相B，洗脱流速为25mL/min，梯度洗脱洗脱方式为：60min内，梯度由45％A+55％B(V/V)变为40％A+60％B(V/V)，启动流动相洗脱，采集图谱，观察吸收值的变化，收集主峰并用分析液相检测纯度，收集并样旋蒸浓缩去除乙腈后，得到式Ι所示的酸性多肽中间体浓缩液1。
(3)1％TEAP pH2.5/正丙醇为流动相进行第二次冲洗
将上述中间体浓缩液1通过进样泵加载到色谱柱上，色谱柱的规格为30*250mm，内装10μm的C8键合硅胶填料。
以1％TEAP pH2.5为流动相A，以1％TEAP pH2.5:正丙醇＝300:700(V/V)作为流动相B，洗脱流速为25mL/min，梯度洗脱洗脱方式为：60min内，梯度由62％A+38％B(V/V)变为52％A+48％B(V/V)，启动流动相洗脱，采集图谱，观察吸收值的变化，收集主峰并用分析液相检测纯度，收集并样旋蒸浓缩去除乙腈后，得到式Ι所示的酸性多肽中间体浓缩液2。
(4)NH 4HCO 3/乙腈为流动相进行第三次冲洗
将上述中间体浓缩液2通过进样泵加载到色谱柱上，色谱柱的规格为30*250mm，内装10μm的C8键合硅胶填料。
以10mM碳酸氢铵为流动相A，以乙腈：纯化水＝800:200(V/V)作为流动相B，洗脱流速为25mL/min，梯度洗脱洗脱方式为：60min内，梯度由60％A+40％B(V/V)变为50％A+50％B(V/V)，启动流动相洗脱，采集图谱，观察吸收值的变化，收集主峰并用分析液相检测纯度，收集纯度＞98％的馏分合并，并样旋蒸浓缩后冷冻干燥，得到式Ι所示的酸性多肽纯品178.5mg,检测冻干后样品纯度为98.56％，最大单杂为0.49％(HPLC检测结果图与图2相似)。
实施例9：式Ι所示的酸性多肽的制备
(1)粗肽的溶解和过滤
称取1.04g粗肽，碾碎后加入200mL溶剂(乙腈：纯化水＝20：80的体积比例混合)超声溶解，加入三乙胺至完全溶清，再用TFA调pH7.38，然后放置40℃水浴1.0h，使用0.45μm有机滤膜过滤。检测粗肽溶液，粗肽HPLC纯度70.86％。
(2)1％TEAP pH2.5/正丙醇为流动相进行第一次冲洗
将上述过滤后的粗肽溶液通过进样泵加载到色谱柱上，色谱柱的规格为30*250mm，内装10μm的C8键合硅胶填料。
以1％TEAP pH2.5为流动相A，以1％TEAP pH2.5:正丙醇＝300:700(V/V)作为流动相B，洗脱流速为25mL/min，梯度洗脱洗脱方式为：60min内，梯度由62％A+38％B(V/V)变为52％A+48％B(V/V)，启动流动相洗脱，采集图谱，观察吸收值的变化，收集主峰并用分析液相检测纯度，收集并样旋蒸浓缩去除乙腈后，得到式Ι所示的酸性多肽中间体浓缩液1。
(3)1％TEAP pH7.0/乙腈为流动相进行第二次冲洗
将上述中间体浓缩液1通过进样泵加载到色谱柱上，色谱柱的规格为30*250mm，内装10μm的C8键合硅胶填料。
以1％TEAP pH7.0为流动相A，以1％TEAP pH7.0：乙腈＝300:700作为流动相B，洗脱流速为25mL/min，梯度洗脱洗脱方式为：60min内，梯度由45％A+55％B(V/V)变为40％A+60％B(V/V)，启动流动相洗脱，采集图谱，观察吸收值的变化，收集主峰并用分析液相检测纯度，收集并样旋蒸浓缩去除乙腈后，得到式Ι所示的酸性多肽的制备中间体浓缩液2。
(4)NH 4HCO 3/乙腈为流动相进行第三次冲洗
将上述中间体浓缩液2通过进样泵加载到色谱柱上，色谱柱的规格为30*250mm，内装10μm的C8键合硅胶填料。
以10mM碳酸氢铵为流动相A，以乙腈：纯化水＝800:200(V/V)作为流动相B，洗脱流 速为25mL/min，梯度洗脱洗脱方式为：60min内，梯度由60％A+40％B(V/V)变为50％A+50％B(V/V)，启动流动相洗脱，采集图谱，观察吸收值的变化，收集主峰并用分析液相检测纯度，收集纯度＞98％的馏分合并，并样旋蒸浓缩后冷冻干燥，检测冻干后样品纯度为98.56％，最大单杂为0.49％(HPLC检测结果图与图2相似)。
实施例10：式Ι所示的酸性多肽的制备
(1)粗肽的溶解和过滤
称取1.03g粗肽，碾碎后加入200mL溶剂(乙腈：纯化水＝20：80的体积比例混合)超声溶解，加入三乙胺至完全溶清，再用TFA调pH7.68，然后放置40℃水浴1.5h，使用0.45μm有机滤膜过滤，检测粗肽溶液，粗肽HPLC纯度71.66％。
(2)氯化铵/乙腈为流动相进行第一次冲洗
将上述过滤后的粗肽溶液通过进样泵加载到色谱柱上，色谱柱的规格为30*250mm，内装10μm的C8键合硅胶填料。
以50mM氯化铵pH8.5为流动相A，以50mM氯化铵pH8.5：乙腈＝300:700作为流动相B，洗脱流速为25mL/min，梯度洗脱洗脱方式为：60min内，梯度由50％A+50％B(V/V)变为40％A+60％B(V/V)，启动流动相洗脱，采集图谱，观察吸收值的变化，收集主峰并用分析液相检测纯度，收集并样旋蒸浓缩去除乙腈后，得到式Ι所示的酸性多肽中间体浓缩液1。
(3)1％TEAP pH7.0/乙腈为流动相进行第二次冲洗
将上述中间体浓缩液1通过进样泵加载到色谱柱上，色谱柱的规格为30*250mm，内装10μm的C8键合硅胶填料。
以1％TEAP pH7.0为流动相A，以1％TEAP pH7.0：乙腈＝300:700作为流动相B，洗脱流速为25mL/min，梯度洗脱洗脱方式为：60min内，梯度由45％A+55％B(V/V)变为40％A+60％B(V/V)，启动流动相洗脱，采集图谱，观察吸收值的变化，收集主峰并用分析液相检测纯度，收集并样旋蒸浓缩去除乙腈后，得到式Ι所示的酸性多肽中间体浓缩液2。
(4)NH 4HCO 3/乙腈为流动相进行第三次冲洗
将上述中间体浓缩液2通过进样泵加载到色谱柱上，色谱柱的规格为30*250mm，内装10μm的C8键合硅胶填料。
以10mM碳酸氢铵为流动相A，以乙腈：纯化水＝800:200(V/V)作为流动相B，洗脱流速为25mL/min，梯度洗脱洗脱方式为：60min内，梯度由60％A+40％B(V/V)变为50％A+50％B(V/V)，启动流动相洗脱，采集图谱，观察吸收值的变化，收集主峰并用分析液相检测纯度，收集纯度＞98％的馏分合并，并样旋蒸浓缩后冷冻干燥，检测冻干后样品纯度为98.85％，最大单杂为0.34％(HPLC检测结果图与图2相似)。
实施例11：式Ι所示的酸性多肽的制备
(1)粗肽的溶解和过滤
称取1.01g粗肽，碾碎后加入200mL溶剂(乙腈：纯化水＝20：80的体积比例混合)超声溶解，加入三乙胺至完全溶清，再用TFA调pH7.5±1.0，然后放置40℃±10℃水浴1.5±0.5h，使用0.45μm有机滤膜过滤，检测粗肽溶液，粗肽HPLC纯度72.46％。
(2)氯化铵/乙腈为流动相进行第一次冲洗
将上述过滤后的粗肽溶液通过进样泵加载到色谱柱上，色谱柱的规格为30*250mm，内装10μm的C8键合硅胶填料。
以50mM氯化铵pH8.5为流动相A，以50mM氯化铵pH8.5：乙腈＝300:700作为流动相B，洗脱流速为25mL/min，梯度洗脱洗脱方式为：60min内，梯度由50％A+50％B(V/V)变为40％A+60％B(V/V)，启动流动相洗脱，采集图谱，观察吸收值的变化，收集主峰并用分析液相检测纯度，收集并样旋蒸浓缩去除乙腈后，得到式Ι所示的酸性多肽中间体浓缩液1。
(3)1％TEAP pH2.5/正丙醇为流动相进行第二次冲洗
将上述中间体浓缩液1通过进样泵加载到色谱柱上，色谱柱的规格为30*250mm，内装10μm的C8键合硅胶填料。
以1％TEAP pH2.5为流动相A，以1％TEAP pH2.5:正丙醇＝300:700(V/V)作为流动相B，洗脱流速为25mL/min，梯度洗脱洗脱方式为：60min内，梯度由62％A+38％B(V/V)变为52％A+48％B(V/V)，启动流动相洗脱，采集图谱，观察吸收值的变化，收集主峰并用分析液相检测纯度，收集并样旋蒸浓缩去除乙腈后，得到式Ι所示的酸性多肽中间体浓缩液2。
(4)NH 4HCO 3/乙腈为流动相进行第三次冲洗
将上述中间体浓缩液2通过进样泵加载到色谱柱上，色谱柱的规格为30*250mm，内装10μm的C8键合硅胶填料。
以10mM碳酸氢铵为流动相A，以乙腈：纯化水＝800:200(V/V)作为流动相B，洗脱流速为25mL/min，梯度洗脱洗脱方式为：60min内，梯度由60％A+40％B(V/V)变为50％A+50％B(V/V)，启动流动相洗脱，采集图谱，观察吸收值的变化，收集主峰并用分析液相检测纯度，收集纯度＞98％的馏分合并，并样旋蒸浓缩后冷冻干燥，并样旋蒸浓缩后冷冻干燥，检测冻干后样品纯度为98.97％，最大单杂为0.34％(HPLC检测结果图与图2相似)。
实施例12：式Ι所示的酸性多肽的制备
(1)粗肽的溶解和过滤
称取1.03g粗肽，碾碎后加入200mL溶剂(乙腈：纯化水＝20：80的体积比例混合)超声溶解，加入三乙胺至完全溶清，再用TFA调pH7.58，然后放置45℃水浴1.5h，使用0.45 μm有机滤膜过滤。检测粗肽溶液，粗肽HPLC纯度71.16％。
(2)HCOOH/乙腈为流动相进行第一次冲洗
将上述过滤后的粗肽溶液通过进样泵加载到色谱柱上，色谱柱的规格为30*250mm，内装10μm的C8键合硅胶填料。
以0.1％HCOOH为流动相A，以正丙醇：乙腈＝1:1(V/V)作为流动相B，洗脱流速为25mL/min，梯度洗脱洗脱方式为：60min内，梯度由67％A+33％B(V/V)变为37％A+63％B(V/V)，启动流动相洗脱，采集图谱，观察吸收值的变化，收集主峰并用分析液相检测纯度，收集并样旋蒸浓缩去除乙腈后，得到式Ι所示的酸性多肽中间体浓缩液1。
(3)氯化铵/乙腈为流动相进行第二次冲洗
将上述中间体浓缩液1通过进样泵加载到色谱柱上，色谱柱的规格为30*250mm，内装10μm的C8键合硅胶填料。
以50mM氯化铵pH8.5为流动相A，以50mM氯化铵pH8.5：乙腈＝300:700作为流动相B，洗脱流速为25mL/min，梯度洗脱洗脱方式为：60min内，梯度由50％A+50％B(V/V)变为40％A+60％B(V/V)，启动流动相洗脱，采集图谱，观察吸收值的变化，收集主峰并用分析液相检测纯度，收集并样旋蒸浓缩去除乙腈后，得到式Ι所示的酸性多肽中间体浓缩液2。
(4)NH 4HCO 3/乙腈为流动相进行第三次冲洗
将上述中间体浓缩液2通过进样泵加载到色谱柱上，色谱柱的规格为30*250mm，内装10μm的C8键合硅胶填料。
以10mM碳酸氢铵为流动相A，以乙腈：纯化水＝800:200(V/V)作为流动相B，洗脱流速为25mL/min，梯度洗脱洗脱方式为：60min内，梯度由60％A+40％B(V/V)变为50％A+50％B(V/V)，启动流动相洗脱，采集图谱，观察吸收值的变化，收集主峰并用分析液相检测纯度，收集纯度＞98％的馏分合并，并样旋蒸浓缩后冷冻干燥，得到式Ι所示的酸性多肽纯品198.7mg,检测冻干后样品纯度为99.14％，最大单杂为0.31％(HPLC检测结果图与图2相似)。
实施例13：式Ι所示的酸性多肽的制备
(1)粗肽的溶解和过滤
称取1.02g粗肽，碾碎后加入200mL溶剂(乙腈：纯化水＝20：80的体积比例混合)超声溶解，加入三乙胺至完全溶清，再用TFA调pH7.68，然后放置45℃水浴1.5h，使用0.45μm有机滤膜过滤。检测粗肽溶液，粗肽HPLC纯度71.06％。
(2)氯化铵/乙腈为流动相进行第一次冲洗
将上述过滤后的粗肽溶液通过进样泵加载到色谱柱上，色谱柱的规格为30*250mm，内 装10μm的C8键合硅胶填料。
以50mM氯化铵pH8.5为流动相A，以50mM氯化铵pH8.5：乙腈＝300:700作为流动相B，洗脱流速为25mL/min，梯度洗脱洗脱方式为：60min内，梯度由50％A+50％B(V/V)变为40％A+60％B(V/V)，启动流动相洗脱，采集图谱，观察吸收值的变化，收集主峰并用分析液相检测纯度，收集并样旋蒸浓缩去除乙腈后，得到式Ι所示的酸性多肽中间体浓缩液1。
(3)HCOOH/乙腈为流动相进行第二次冲洗
将上述中间体浓缩液1通过进样泵加载到色谱柱上，色谱柱的规格为30*250mm，内装10μm的C8键合硅胶填料。
以0.1％HCOOH为流动相A，以正丙醇：乙腈＝1:1(V/V)作为流动相B，洗脱流速为25mL/min，梯度洗脱洗脱方式为：60min内，梯度由67％A+33％B(V/V)变为37％A+63％B(V/V)，启动流动相洗脱，采集图谱，观察吸收值的变化，收集主峰并用分析液相检测纯度，收集并样旋蒸浓缩去除乙腈后，得到式Ι所示的酸性多肽中间体浓缩液2。
(4)NH 4HCO 3/乙腈为流动相进行第三次冲洗
将上述中间体浓缩液2通过进样泵加载到色谱柱上，色谱柱的规格为30*250mm，内装10μm的C8键合硅胶填料。
以10mM碳酸氢铵为流动相A，以乙腈：纯化水＝800:200(V/V)作为流动相B，洗脱流速为25mL/min，梯度洗脱洗脱方式为：60min内，梯度由60％A+40％B(V/V)变为50％A+50％B(V/V)，启动流动相洗脱，采集图谱，观察吸收值的变化，收集主峰并用分析液相检测纯度，收集纯度＞98％的馏分合并，并样旋蒸浓缩后冷冻干燥，得到式Ι所示的酸性多肽纯品203.6mg,检测冻干后样品纯度为99.62％，最大单杂为0.13％(HPLC检测结果图与图2相似)。
实施例14：式Ι所示的酸性多肽的制备
(1)粗肽的溶解和过滤
称取1.01g粗肽，碾碎后加入200mL溶剂(乙腈：纯化水＝20：80的体积比例混合)超声溶解，加入三乙胺至完全溶清，再用TFA调pH7.55，然后放置45℃水浴1.5h，使用0.45μm有机滤膜过滤。检测粗肽溶液，粗肽HPLC纯度72.06％。
(2)氯化铵/乙腈为流动相进行第一次冲洗
将上述过滤后的粗肽溶液通过进样泵加载到色谱柱上，色谱柱的规格为30*250mm，内装10μm的C8键合硅胶填料。
以50mM氯化铵pH8.5为流动相A，以50mM氯化铵pH8.5：乙腈＝300:700作为流动相B，洗脱流速为25mL/min，梯度洗脱洗脱方式为：60min内，梯度由50％A+50％B(V/V)变为 40％A+60％B(V/V)，启动流动相洗脱，采集图谱，观察吸收值的变化，收集主峰并用分析液相检测纯度，收集并样旋蒸浓缩去除乙腈后，得到式Ι所示的酸性多肽中间体浓缩液1。
(3)HCOOH/乙腈为流动相进行第二次冲洗
将上述中间体浓缩液1通过进样泵加载到色谱柱上，色谱柱的规格为30*250mm，内装10μm的C8键合硅胶填料。
以0.1％HCOOH为流动相A，以正丙醇：乙腈＝1:1(V/V)作为流动相B，洗脱流速为25mL/min，梯度洗脱洗脱方式为：60min内，梯度由67％A+33％B(V/V)变为37％A+63％B(V/V)，启动流动相洗脱，采集图谱，观察吸收值的变化，收集主峰并用分析液相检测纯度，收集并样旋蒸浓缩去除乙腈后，得到式Ι所示的酸性多肽中间体浓缩液2。
(4)NH 4HCO 3/正丙醇为流动相进行第三次冲洗
将上述中间体浓缩液2通过进样泵加载到色谱柱上，色谱柱的规格为30*250mm，内装10μm的C8键合硅胶填料。
以10mM碳酸氢铵为流动相A，以纯化水：正丙醇＝1:1(V/V)作为流动相B，洗脱流速为25mL/min，梯度洗脱洗脱方式为：60min内，梯度由61％A+39％B(V/V)变为41％A+59％B(V/V)，启动流动相洗脱，采集图谱，观察吸收值的变化，收集主峰并用分析液相检测纯度，收集纯度＞98％的馏分合并，并样旋蒸浓缩后冷冻干燥，得到式Ι所示的酸性多肽纯品209.9mg,检测冻干后样品纯度为99.55％，最大单杂为0.12％(HPLC检测结果图与图2相似)。
实施例15：式Ι所示的酸性多肽的制备
(1)粗肽的溶解和过滤
称取1.05g粗肽，碾碎后加入200mL溶剂(乙腈：纯化水＝20：80的体积比例混合)超声溶解，加入三乙胺至完全溶清，再用TFA调pH7.63，然后放置45℃水浴1.5h，使用0.45μm有机滤膜过滤。检测粗肽溶液，粗肽HPLC纯度70.86％。
(2)氯化铵/乙腈为流动相进行第一次冲洗
将上述过滤后的粗肽溶液通过进样泵加载到色谱柱上，色谱柱的规格为30*250mm，内装10μm的C8键合硅胶填料。
以50mM氯化铵pH8.5为流动相A，以50mM氯化铵pH8.5：乙腈＝300:700作为流动相B，洗脱流速为25mL/min，梯度洗脱洗脱方式为：60min内，梯度由50％A+50％B(V/V)变为40％A+60％B(V/V)，启动流动相洗脱，采集图谱，观察吸收值的变化，收集主峰并用分析液相检测纯度，收集并样旋蒸浓缩去除乙腈后，得到式Ι所示的酸性多肽中间体浓缩液1。
(3)HCOOH/乙腈+和正丙醇为流动相进行第二次冲洗
将上述中间体浓缩液1通过进样泵加载到色谱柱上，色谱柱的规格为30*250mm，内装10μm的C8键合硅胶填料。
以0.1％HCOOH为流动相A，以正丙醇：乙腈＝1:1(V/V)作为流动相B，洗脱流速为25mL/min，梯度洗脱洗脱方式为：60min内，梯度由67％A+33％B(V/V)变为37％A+63％B(V/V)，启动流动相洗脱，采集图谱，观察吸收值的变化，收集主峰并用分析液相检测纯度，收集并样旋蒸浓缩去除乙腈后，得到式Ι所示的酸性多肽中间体浓缩液2。
(4)NH 4HCO 3/异丙醇为流动相进行第三次冲洗
将上述中间体浓缩液2通过进样泵加载到色谱柱上，色谱柱的规格为30*250mm，内装10μm的C8键合硅胶填料。
以10mM碳酸氢铵为流动相A，以纯化水：异丙醇＝1:1(V/V)作为流动相B，洗脱流速为25mL/min，梯度洗脱洗脱方式为：60min内，梯度由55％A+45％B(V/V)变为35％A+65％B(V/V)，启动流动相洗脱，采集图谱，观察吸收值的变化，收集主峰并用分析液相检测纯度，收集纯度＞98％的馏分合并，并样旋蒸浓缩后冷冻干燥，得到式Ι所示的酸性多肽纯品208.8mg,检测冻干后样品纯度为99.62％，最大单杂为0.14％(HPLC检测结果图与图2相似)。
实施例16：式Ι所示的酸性多肽的制备
(1)粗肽的溶解和过滤
称取1.02g粗肽，碾碎后加入200mL溶剂(乙腈：纯化水＝20：80的体积比例混合)超声溶解，加入三乙胺至完全溶清，再用TFA调pH7.76，然后放置45℃水浴1.5h，使用0.45μm有机滤膜过滤。检测粗肽溶液，粗肽HPLC纯度72.06％。
(2)0.1％TFA/乙腈为流动相进行冲洗
将上述过滤后的粗肽溶液通过进样泵加载到色谱柱上，色谱柱的规格为30*250mm，内装10μm的C8键合硅胶填料。
以0.1％TFA为流动相A，以乙腈作为流动相B，洗脱流速为25mL/min，梯度洗脱洗脱方式为：60min内，梯度由63％A+37％B(V/V)变为43％A+57％B(V/V)，启动流动相洗脱，采集图谱，观察吸收值的变化，收集主峰并用分析液相检测纯度，收集并样旋蒸浓缩去除乙腈后，得到式Ι所示的酸性多肽纯品，检测纯度为96.39，最大单杂为2.65％(HPLC检测见图3，图谱数据见表3)。
表3精肽HPLC图谱数据
峰号 保留时间 面积 面积％
1 12.617 5778 0.30
2 13.563 4190 0.22
3 14.297 1844527 96.39
4 15.263 50656 2.65
5 16.784 6460 0.34
6 17.319 2069 0.11
实施例17：式Ι所示的酸性多肽的制备
(1)粗肽的溶解和过滤
称取1.05g粗肽，碾碎后加入200mL溶剂(乙腈：纯化水＝20：80的体积比例混合)超声溶解，加入三乙胺至完全溶清，再用TFA调pH7.59，然后放置45℃水浴1.5h，使用0.45μm有机滤膜过滤。检测粗肽溶液，粗肽HPLC纯度72.86％。
(2)0.1％磷酸/乙腈为流动相进行冲洗
将上述过滤后的粗肽溶液通过进样泵加载到色谱柱上，色谱柱的规格为30*250mm，内装10μm的C8键合硅胶填料。
以0.1％磷酸为流动相A，以乙腈作为流动相B，洗脱流速为25mL/min，梯度洗脱洗脱方式为：60min内，梯度由65％A+35％B(V/V)变为45％A+55％B(V/V)，启动流动相洗脱，采集图谱，观察吸收值的变化，收集主峰并用分析液相检测纯度，收集并样旋蒸浓缩去除乙腈后，得到式Ι所示的酸性多肽纯品，检测纯度为93.05％，最大单杂为2.60％(HPLC检测见图4，图谱数据见表4)，。
表4精肽HPLC图谱数据
峰号 保留时间 面积 面积％
1 7.400 1108 0.08
2 7.819 1237 0.09
3 8.875 1395 0.10
4 9.108 1267 0.09
5 9.404 3010 0.22
6 9.715 3143 0.23
7 10.306 1794 0.13
8 11.689 6891 0.49
9 12.440 6216 0.45
10 12.792 10026 0.72
11 13.198 11802 0.85
12 14.074 1296929 93.05
13 14.871 36274 2.60
14 16.268 8933 0.64
15 18.726 2253 0.16
16 21.184 1602 0.11

Claims (23)

  1. 一种用于从包含所述酸性多肽和相关杂质的混合物中纯化制备高纯度酸性多肽的方法，其特征在于，所述方法是一种高效液相色谱法，分两步或三步进行RP-HPLC纯化，作为流动相用于洗脱的溶剂主要由离子对试剂和有机改性剂组成，所述洗脱溶剂以梯度洗脱的方式进行洗脱，
    其中，所述离子对试剂选自NH 4Cl，HCOOH，NH 4HCO 3，TEAP溶液；
    其中，所述有机改性剂选自甲醇、乙醇、正丙醇、异丙醇、乙腈。
  2. 根据权力要求1的方法，其特征在于，所述酸性多肽具有如下结构：
    Figure PCTCN2020101513-appb-100001
  3. 根据权力要求1的方法，其特征在于，所述洗脱溶剂为NH 4Cl水溶液和甲醇、乙醇、正丙醇、异丙醇、乙腈中任一种或多种有机改性剂的混合溶液。
  4. 根据权力要求1的方法，其特征在于，所述洗脱溶剂为HCOOH水溶液和甲醇、乙醇、正丙醇、异丙醇、乙腈中任一种或多种有机改性剂的混合溶液。
  5. 根据权力要求1的方法，其特征在于，所述洗脱溶剂为NH 4HCO 3水溶液和甲醇、乙醇、正丙醇、异丙醇、乙腈中任一种或多种有机改性剂的混合溶液。
  6. 根据权力要求1的方法，其特征在于，所述洗脱溶剂为TEAP溶液和甲醇、乙醇、正丙醇、异丙醇、乙腈中任一种或多种有机改性剂的混合溶液。
  7. 根据权力要求1的方法，其特征在于，分两步进行RP-HPLC纯化，洗脱液1为NH 4Cl水溶液和有机改性剂的混合溶液，洗脱液2为HCOOH水溶液和和有机改性剂的混合溶液。
  8. 根据权力要求1的方法，其特征在于，分三步进行RP-HPLC纯化，洗脱液1为TEAP溶液和有机改性剂的混合溶液，洗脱液2为TEAP溶液和有机改性剂的混合溶液，洗脱液3为NH 4HCO 3水溶液和有机改性剂的混合溶液。
  9. 根据权力要求1的方法，其特征在于，分三步进行RP-HPLC纯化，洗脱液1为NH 4Cl水溶液和有机改性剂的混合溶液，洗脱液2为TEAP溶液和有机改性剂的混合溶液，洗脱液3为 NH 4HCO 3水溶液和有机改性剂的混合溶液。
  10. 根据权力要求1的方法，其特征在于，分三步进行RP-HPLC纯化，洗脱液1为HCOOH水溶液和有机改性剂的混合溶液，洗脱液2为NH 4Cl水溶液和有机改性剂的混合溶液，洗脱液3为NH 4HCO 3水溶液和有机改性剂的混合溶液。
  11. 根据权力要求1的方法，其特征在于，分三步进行RP-HPLC纯化，洗脱液1为NH 4Cl水溶液和有机改性剂的混合溶液，洗脱液2为HCOOH水溶液和有机改性剂的混合溶液，洗脱液3为NH 4HCO 3水溶液和有机改性剂的混合溶液。
  12. 根据权力要求1的方法，其特征在于，分步进行RP-HPLC纯化中，NH 4Cl作为流动相时，pH为7.0-10.0。
  13. 根据权力要求1的方法，其特征在于，分步进行RP-HPLC纯化中，NH 4Cl作为流动相时，体积浓度为50mmoL/L。
  14. 根据权力要求1的方法，其特征在于，分步进行RP-HPLC纯化中，TEAP作为流动相时，pH为2.5±1.0。
  15. 根据权力要求1的方法，其特征在于，分步进行RP-HPLC纯化中，TEAP作为流动相时，pH为7.0±1.0。
  16. 根据权力要求1的方法，其特征在于，分步进行RP-HPLC纯化中，HCOOH作为流动相时，质量浓度为0.1～10％。
  17. 根据权力要求1的方法，其特征在于，分步进行RP-HPLC纯化中，NH 4HCO 3作为流动相时，体积浓度为1～100mmoL/L。
  18. 根据权力要求1的方法，其特征在于，分步进行RP-HPLC纯化中，洗脱液1或2的有机改性剂为乙腈、正丙醇、异丙醇中的一种或两种。
  19. [根据细则91更正 10.09.2020]　
    根据权力要求1的方法，其特征在于，分步进行RP-HPLC纯化中，洗脱液3的有机改性剂为正丙醇和/或异丙醇。
  20. 根据权力要求1的方法，其特征在于，使用的离子对试剂的pH大于所分离的酸性多肽化合物pKa值至少1个pH单位。
  21. 根据权力要求1的方法，其特征在于，所述有机改性剂作为流动相时，含量范围为0％～70％。
  22. 根据权力要求1任一项的方法，其特征在于，含有有机改性剂的流动相梯度范围为20％～60％(60min)。
  23. 根据权力要求1任一项的方法，其特征在于，反相高效液相色谱系统的色谱柱的填料为C4、C6、C8和C18键合硅胶或高分子聚合物。
PCT/CN2020/101513 2019-07-27 2020-07-11 一种化学合成酸性多肽的制备方法 WO2021017793A1 (zh)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910685613.6A CN112279895B (zh) 2019-07-27 2019-07-27 一种化学合成酸性多肽的制备方法
CN201910685613.6 2019-07-27

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2021017793A1 true WO2021017793A1 (zh) 2021-02-04

Family

ID=74228192

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/CN2020/101513 WO2021017793A1 (zh) 2019-07-27 2020-07-11 一种化学合成酸性多肽的制备方法

Country Status (2)

Country Link
CN (1) CN112279895B (zh)
WO (1) WO2021017793A1 (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114405298A (zh) * 2021-12-27 2022-04-29 苏州艾博生物科技有限公司 纯化聚乙二醇类缀合脂质的方法

Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102584982A (zh) * 2012-02-10 2012-07-18 深圳翰宇药业股份有限公司 一种纯化固相合成利拉鲁肽粗肽的方法
CN103080128A (zh) * 2010-06-21 2013-05-01 益普生制药股份有限公司 Glp-1类似物的反相hplc纯化
CN103275209A (zh) * 2013-05-27 2013-09-04 成都圣诺生物制药有限公司 制备利拉鲁肽的方法
CN103980358A (zh) * 2014-01-03 2014-08-13 杭州诺泰制药技术有限公司 一种制备利拉鲁肽的方法
CN105017381A (zh) * 2015-07-20 2015-11-04 吉尔生化（上海）有限公司 一种纯化利拉鲁肽的方法
WO2016046753A1 (en) * 2014-09-23 2016-03-31 Novetide, Ltd. Synthesis of glp-1 peptides
WO2017162653A1 (en) * 2016-03-23 2017-09-28 Bachem Holding Ag Purification of glucagon-like peptide 1 analogs
CN108047301A (zh) * 2017-12-08 2018-05-18 福州博中技术开发有限公司 一种纯化有机酸肽的方法
CN108640985A (zh) * 2018-06-25 2018-10-12 杭州诺泰澳赛诺医药技术开发有限公司 一种纯化索玛鲁肽的方法

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP6991196B2 (ja) * 2016-03-23 2022-02-03 バッヘン・ホールディング・アクチエンゲゼルシャフト グルカゴン様ペプチドを製造するための方法

Patent Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103080128A (zh) * 2010-06-21 2013-05-01 益普生制药股份有限公司 Glp-1类似物的反相hplc纯化
CN102584982A (zh) * 2012-02-10 2012-07-18 深圳翰宇药业股份有限公司 一种纯化固相合成利拉鲁肽粗肽的方法
CN103275209A (zh) * 2013-05-27 2013-09-04 成都圣诺生物制药有限公司 制备利拉鲁肽的方法
CN103980358A (zh) * 2014-01-03 2014-08-13 杭州诺泰制药技术有限公司 一种制备利拉鲁肽的方法
WO2016046753A1 (en) * 2014-09-23 2016-03-31 Novetide, Ltd. Synthesis of glp-1 peptides
CN105017381A (zh) * 2015-07-20 2015-11-04 吉尔生化（上海）有限公司 一种纯化利拉鲁肽的方法
WO2017162653A1 (en) * 2016-03-23 2017-09-28 Bachem Holding Ag Purification of glucagon-like peptide 1 analogs
CN108047301A (zh) * 2017-12-08 2018-05-18 福州博中技术开发有限公司 一种纯化有机酸肽的方法
CN108640985A (zh) * 2018-06-25 2018-10-12 杭州诺泰澳赛诺医药技术开发有限公司 一种纯化索玛鲁肽的方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
KNUDSEN, L. B. ET AL.: "Potent Derivatives of Glucagon-like Peptide-1 with Pharmacokinetic Properties Suitable for Once Daily Administration", J.MED.CHEM., vol. 43, no. 9, 18 April 2000 (2000-04-18), XP002336011, DOI: 20200922102417A *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114405298A (zh) * 2021-12-27 2022-04-29 苏州艾博生物科技有限公司 纯化聚乙二醇类缀合脂质的方法
CN114405298B (zh) * 2021-12-27 2024-05-14 苏州艾博生物科技有限公司 纯化聚乙二醇类缀合脂质的方法

Also Published As

Publication number Publication date
CN112279895B (zh) 2023-03-14
CN112279895A (zh) 2021-01-29

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP2076528B1 (en) Purification processes of echinocandin-type compounds
EP2813514B1 (en) Method for purifying solid-phase synthetic crude liraglutide
WO2015062168A1 (zh) 一种高纯度盐酸万古霉素的分离纯化方法
KR101514904B1 (ko) 사이클릭 리포펩타이드 화합물 또는 그의 염의 정제방법
CN109369783B (zh) 一种多肽rdp1及其提纯方法与应用
CN106167522A (zh) 一种大规模分离纯化特立帕肽（Teriparatide）的方法
WO2021017793A1 (zh) 一种化学合成酸性多肽的制备方法
TWI488862B (zh) Separation and Purification of Cyclohexyl Compounds and Their Salts
CN102408468A (zh) 一种阿加曲班化合物及其制法
EP0955308A1 (de) Verfahren zur einstufigen Umsalzung und Aufreinigung von Oligopeptiden
EP1997826A2 (en) Synthetic ligands for immunoglobulins and pharmaceutical compositions containing them
CN105153284B (zh) 一种利那洛肽的纯化方法
US20170275335A1 (en) Improved process for preparation of amorphous linaclotide
CN105223296A (zh) 一类多肽的纯化方法
CN104945468B (zh) Mmaf手性异构体的制备方法及其应用
CN113624898B (zh) 一种手性镇痛类多肽药物的纯化方法
WO2021129016A1 (zh) 一种多肽脱盐的方法
CN109748948A (zh) 一种棕榈酰四肽-7的纯化方法
CN109748954A (zh) 一种地加瑞克的纯化方法
CN113683663A (zh) 一种机体保护多肽粗品的纯化方法
CN111320673A (zh) Fitc标记的帕西瑞肽衍生物及其制备方法和应用
CN107163102A (zh) 一种亲水性多肽纯化的方法
CN116162136A (zh) 一种抗合胞病毒膜融合抑制剂
CN102351767B (zh) 一种前列地尔化合物及其制法
CN114405065B (zh) 一种利用动态热力学平衡纯化制备手性多肽型药物的方法

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 20846506

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

122 Ep: pct application non-entry in european phase

Ref document number: 20846506

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1