CN111434675A - 一种米卡芬净母环的分离纯化方法 - Google Patents

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江必旺
王希
陈强强
李易
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    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/50—Cyclic peptides containing at least one abnormal peptide link
    • C07K7/54—Cyclic peptides containing at least one abnormal peptide link with at least one abnormal peptide link in the ring
    • C07K7/56—Cyclic peptides containing at least one abnormal peptide link with at least one abnormal peptide link in the ring the cyclisation not occurring through 2,4-diamino-butanoic acid

Abstract

本发明提供了一种高效分离纯化米卡芬净母环的方法，包括以下步骤，将米卡芬净母环粗提取物进行溶解、过滤；将上述过滤后的溶液上样到装有米卡芬净母环专用填料的层析柱中进行层析；采用盐溶液和有机溶剂作为流动相对目标产物进行洗脱；分段收集目的峰值的溶液，对符合要求的组份液进行汇总。本发明用于米卡芬净母环的深度精纯，仅需一步层析纯化即可做到米卡芬净母环杂质小于0.15％，纯度大于99％，纯化收率高而稳定，同时本发明分离方法简单方便，可用于规模化生产，大大降低生产成本。

Description

一种米卡芬净母环的分离纯化方法
技术领域
本发明涉及药物纯化领域，特别是一种高效分离纯化米卡芬净母环(FR179642)的方法。
背景技术
米卡芬净(Micafungin)是通过对Coleophoma empetri的天然产物进行改造，化学合成得到的新型棘白菌素类抗真菌药物；它对念珠菌如白念珠菌、光滑念珠菌、热代念珠菌、克柔念珠菌和近平滑念珠菌有较好的抑制活性，对于曲霉也有良好的体外抑制活性，但对于新生隐球菌、镰刀菌、接合菌和白吉利毛孢子菌等无抑制活性。米卡芬净(Micafungin)由日本藤泽公司开发，于2002年12月在日本上市，商品名为Fungusrd，2005年3月通过美国FDA认证，目前仅被批准用于治疗食道念珠菌感染、骨髓移植及ADS患者中性粒细胞减少症的预防治疗。
FR901379是合成米卡芬净类药物的重要前体物质，由C.empetri经突变后获得的高产菌株发酵所得。FR901379通过脱酰酶脱除侧链后得到米卡芬净母核FRi79642，FR179642经过化学修饰得到米卡芬净钠。FR179642是合成米卡芬净母核，CAS登录号：168110-44-9，化学式：C35H52N8O20S，分子量：936.90。
其结构式如下：
Figure BDA0001942698110000021
目前国内外专利、文献等对米卡芬净母环的报道多为合成方法专利，分离纯化方法鲜有报道。CN201611064451.7提供了一种米卡芬净母环FR179642的制备方法，其中描述了采用大孔树脂分离纯化，是以醇类和水相作为流动相进行纯化，但该方提纯后纯度较低。因此有必要对米卡芬净母环的分离、纯化和制备做更进一步的研究。
发明内容
本发明的目的在于提供一种高效深度分离纯化米卡芬净母环FR179642的方法，仅需一步层析纯化即可做到杂质小于0.15％，纯度大于99％，纯化收率高而稳定，同时本发明分离方法简单方便，可用于规模化生产，大大降低生产成本。
为达到上述目的，本发明的技术方案如下：一种米卡芬净母环的分离纯化方法，其特征在于，将米卡芬净母环粗提取物进行溶解、过滤；将上述过滤后的米卡芬净母环溶液上样到装有米卡芬净母环专用填料的层析柱中进行层析；采用盐溶液和有机溶剂作为流动相对米卡芬净母环溶液进行洗脱；分段收集目的峰值的米卡芬净母环溶液，对符合要求的组份液进行汇总。
优选的，所述盐溶液为氯化钠溶液。
优选的，所述米卡芬净母环专用填料是弱疏水性的聚合物色谱填料。
优选的，所述米卡芬净母环专用填料型号为UniMicaF。
优选的，所述有机溶剂为甲醇、乙醇、乙腈、异丙醇。
优选的，上样前，对层析柱进行平衡，先用90％乙醇进行除杂，后用83％-88％的有机相进行平衡。
优选的，所述洗脱过程为，用83％-88％乙醇冲洗洗脱主峰。
优选的，所述米卡芬净母环粗提取物的纯度90％-95％。
优选的，所述纯化的米卡芬净母环的纯度大于99％。
优选的，所述纯化的米卡芬净母环的收率在75％以上。
所述米卡芬净母环是FR179642。
米卡芬净母环专用填料UniMicaF，是一种聚合物基质色谱填料，其聚合物基质的疏水性弱于传统的聚苯乙烯基质的微球，可以在含水相流动相中使用。该填料具有严格控制的粒径大小和孔径结构，同时具有特殊的表面功能团，使其在米卡芬净母环的分离纯化中，其作为色谱填料时具有很好的针对性。尤其在米卡芬净母环的工业化制备过程中，该色谱填料的聚合物基质，可以在比较高的碱性条件下冲洗，具有更优异的耐冲击性、耐碱性及耐老化性，远远优于传统硅胶基质的反相色谱填料。
本发明采用有机溶剂和含氯化钠的盐溶液作为流动相，用14个柱体积就可完成米卡芬净母环主峰的洗脱，因此本过程所用流动相相对安全、成本较低。
本发明采用米卡芬净母环专用填料作为固定相，仅需一步层析即可使米卡芬净母环纯度大于99％，单杂小于0.15％，收率可达75％以上。
因此，本发明方法分离纯化米卡芬净母环，不仅纯度高、收率高且稳定，而且操作简单方便，所用固定相可重复利用，所用流动相量相对较少，大大降低成本。
附图说明
图1为实施例1提纯前的米卡芬净母环粗提取物的高效液相色谱分析。
图2为实施例1纯化后的米卡芬净母环的高效液相色谱分析。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明的技术方案作进一步的描述，但本发明并不限于这些实施例。
一种米卡芬净母环的分离纯化方法，将米卡芬净母环粗提取物进行溶解、过滤；将上述过滤后的米卡芬净母环溶液上样到装有米卡芬净母环专用填料的层析柱中进行层析；采用盐溶液和有机溶剂作为流动相对米卡芬净母环溶液进行洗脱；分段收集目的峰值的米卡芬净母环溶液，对符合要求的组份液进行汇总。
优选的，所述盐溶液为氯化钠溶液。
优选的，所述米卡芬净母环专用填料是弱疏水性的聚合物色谱填料。
优选的，所述有机溶剂为甲醇、乙醇、乙腈、异丙醇。
优选的，上样前，对层析柱进行平衡，先用90％乙醇进行除杂，后用83％-88％的有机相进行平衡。
优选的，所述等度洗脱过程为，用83％-88％乙醇冲洗洗脱主峰。
实施例1
取纯度为93.98％的米卡芬净母环FR179642粗提取物，用85％乙醇-盐溶液溶解，溶液中米卡芬净母环浓度为1.5mg/mL。待溶液澄清后，用孔径为0.45μm滤膜过滤，收集滤液待用。采用15*310mm的色谱柱，米卡芬净母环专用填料UniMicaF(苏州纳微科技有限公司生产)作为层析柱填料，装柱体积为55ml。对层析柱进行柱前预处理，先用90％乙醇进行除杂，后用85％的有机相进行平衡，然后采用85％乙醇-盐溶液作为流动相进行等度洗脱。流速控制在0.5ml/min。分段收集目的峰值的溶液，对符合要求的组份液进行汇总，经高效液相色谱分析，洗脱液中米卡芬净母环的纯度99.6％，单杂均小于0.15％，收率79％。
图1是提纯前的米卡芬净母环粗提取物的高效液相色谱分析，可见有一定的杂质。图2是提纯后的米卡芬净母环高效液相色谱分析，可见杂质非常少，杂峰非常小。
实施例2
取纯度为94.23％的米卡芬净母环粗提取物，用90％乙腈-盐溶液溶解，溶液中米卡芬净母环浓度为1.5mg/mL。待溶液澄清后，用孔径为0.45μm滤膜过滤，收集滤液待用。采用15*310mm的色谱柱，用具有亲水性的硅胶填料作为层析柱填料，装柱体积为55ml。对层析柱进行柱前预处理，先用高浓度有机相进行除杂，后用90％的有机相进行平衡。然后采用90％乙腈-盐溶液(A相)和87％乙腈-盐溶液(B相)作为流动相进行洗脱，流速控制在0.5ml/min。洗脱过程为，先用100％的A相冲洗1个柱体积，后用100％B洗脱，分段收集目的峰值的溶液，对符合要求的组份液进行汇总，经高效液相色谱分析，洗脱液中米卡芬净母环的纯度98％，单杂小于0.5％，收率53％。
实施例3
取纯度为93.78％的米卡芬净母环粗提取物，用超纯水溶解，溶液中米卡芬净母环浓度为3.0mg/mL。待溶液澄清后，用孔径为0.45μm滤膜过滤，收集滤液待用。采用15*310mm的色谱柱，用UniPS作为层析柱填料，装柱体积为55ml。采用超纯水作为流动相进行等度洗脱，流速控制在0.5ml/min。分段收集目的峰值的溶液，对符合要求的组份液进行汇总，经高效液相色谱分析，未能将米卡芬净母环中后杂去除，效果不理想。
本发明用于米卡芬净母环的深度精纯，仅需一步层析纯化即可满足米卡芬净母环单杂小于0.15％的要求，纯化收率高而稳定，同时本发明分离方法简单方便，可用于规模化生产，大大降低生产成本。
以上所述的仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明创造构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。

Claims (11)

1.一种米卡芬净母环的分离纯化方法，其特征在于，包括以下步骤：将米卡芬净母环粗提取物进行溶解、过滤；将上述过滤后的米卡芬净母环溶液上样到装有米卡芬净母环专用填料的层析柱中进行层析；采用盐溶液和有机溶剂作为流动相对米卡芬净母环溶液进行洗脱；分段收集目的峰值的米卡芬净母环溶液，对符合要求的组份液进行汇总，得到纯化的米卡芬净母环。
2.如权利要求1所述的米卡芬净母环的分离纯化方法，其特征在于，所述盐溶液为氯化钠溶液。
3.如权利要求1所述的米卡芬净母环的分离纯化方法，其特征在于，所述米卡芬净母环专用填料是弱疏水性的聚合物色谱填料。
4.如权利要求3所述的米卡芬净母环的分离纯化方法，其特征在于，所述米卡芬净母环专用填料型号为UniMicaF。
5.如权利要求1所述的米卡芬净母环的分离纯化方法，其特征在于，所述有机溶剂为甲醇、乙醇、乙腈、异丙醇。
6.如权利要求1所述的米卡芬净母环的分离纯化方法，其特征在于，上样前，对层析柱进行平衡，先用90%乙醇进行除杂，后用83%-88%的有机相进行平衡。
7.如权利要求1所述的米卡芬净母环的分离纯化方法，其特征在于，所述洗脱过程为，用83%-88%乙醇冲洗洗脱主峰。
8.如权利要求1~6任一所述的米卡芬净母环的分离纯化方法，其特征在于，所述米卡芬净母环粗提取物的纯度90%-95%。
9.如权利要求1~6任一所述的米卡芬净母环的分离纯化方法，其特征在于，所述纯化的米卡芬净母环的纯度大于99%。
10.如权利要求1~6任一所述的米卡芬净母环的分离纯化方法，其特征在于，所述纯化的米卡芬净母环的收率在75%以上。
11.如权利要求1~6任一所述的米卡芬净母环的分离纯化方法，其特征在于，所述米卡芬净母环是FR179642。
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