ES2272096T3 - Purificacion de compuestos ciclopeptidicos de equinocandina. - Google Patents
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Abstract
Un procedimiento de separación y purificación de compuestos de equinocandina desacilados que comprende las etapas de: (i) proporcionar una mezcla que comprende un compuesto de equinocandina desacilado que tiene unido al mismo al menos un grupo amino protonable; (ii) adsorción de dicha mezcla sobre un medio cromatográfico de fase inversa, hidrófobo; (iii) elución del compuesto de equinocandina desacilado con un gradiente de ácido acético casi lineal continuo que varía de ácido acético al 0, 1% a ácido acético al 10, 0% en volumen en agua; y (iv) recuperación de dicho compuesto de equinocandina desacilado.
Description
Purificación de compuestos ciclopeptídicos de
equinocandina.
La presente invención se refiere a un
procedimiento para purificación de compuestos de equinocandina que
contienen al menos un grupo amino protonable, en particular, el
procedimiento se refiere a la purificación de un compuesto tipo
equinocandina mediante adsorción sobre un medio cromatográfico de
fase inversa, hidrófobo y eluyendo con un gradiente casi lineal
continuo creciente de ácido acético. Se proporciona también un
procedimiento de purificación para eliminación de forma selectiva
de un sub-producto
tripéptido-aldehído del procedimiento de
fermentación de equinocandina para dar un compuesto de equinocandina
de mayor pureza.
Los ciclopéptidos de equinocandina son productos
naturales que han demostrado tener actividades antifúngicas.
Incluidos en la familia de ciclopéptidos de equinocandina se
encuentran los productos naturales tales como equinocandina B
(ECB), equinocandina C, aculeacina A\gamma, mulundocandina,
esporiofungina A, pneumocandina A_{0}, WF11899A y pneumocandina
B_{0}. Los productos naturales se producen típicamente mediante
cultivo de diversos microorganismos. Por ejemplo, la equinocandina
B es producida a partir de la fermentación del hongo,
Aspergillus nidulans.
En la búsqueda de materiales más activos se han
modificado los productos naturales en una variedad de formas. Una
de las modificaciones más comunes ha sido la sustitución de la
cadena lateral de N-acilo sobre el producto natural
para producir un derivado semi-sintético. Por
ejemplo, las patentes de estados Unidos números 4.293.489;
4.320.052; 5.166.135; y 5.541.160, y EP 359259; 448353; 447186;
462531 y 561639 describen una variedad de compuestos de
equinocandina derivatizados de N-acilo que
proporcionan grados variables de actividad antifúngica.
Los derivados de N-acilo son
producidos mediante desacilación del producto natural seguido de
reacilación con un grupo acilo diferente. La desacilación se
consigue de forma típica por medio de un enzima (por ejemplo,
enzima desacilasa). El enzima desacilasa se puede obtener del
microorganismo Actinoplanes utahensis o especies de
Pseudomonas. Véase, entre otros, las patentes de Estados
Unidos números 4.293.482; y 4.304.716, y el documento EP 460.882,
Boek y col., Japonese Journal of Antibiotics, 1989, XLII (3): 382 a
388 también describe la desacilación de equinocandina B mediante
Actionoplanes utahensis. El compuesto desacilado se designa
de forma típica como el núcleo del producto natural correspondiente
(es decir, el producto desacilado de equinocandina B se designa
como el núcleo de equinocandina B (ECBN)). Desafortunadamente, tanto
los procedimientos de fermentación como de desacilación producen
varios subproductos que son difíciles de eliminar y disminuyen la
pureza del núcleo de péptido cíclico desacilado deseado.
La patente de Estados Unidos número 4.874.843
describe un procedimiento cromatográfico que usa resinas no
funcionales en un modo inverso para purificar productos de tipo
equinocandina. Incluso a pesar de que el procedimiento mejoró la
pureza de productos derivados de un procedimiento de fermentación,
son aún necesarias más mejoras para eliminar contaminantes que son
difíciles de separar tanto del núcleo desacilado del intermedio como
de los compuestos farmacéuticamente activos acilados finales.
Debido a que la potencia del producto farmacéutico final depende de
la pureza de los intermedios usados para hacer el producto final,
son muy deseables mejoras en la pureza en cualquier fase del
procedimiento de fabricación. De forma ideal, los contaminantes son
eliminados en la fase más temprana posible en el procedimiento de
fabricación.
Se pueden encontrar análisis generales de
resinas no funcionales y sus aplicaciones en separaciones
cromatográficas líquidas en J. Chromatography, 201,
287 a 292 (1980) y Grieser, M.D. y col., Analytical
Chemistry, 45, 1348 a 1353 (1973). Se describe el uso de
cualquier etapa o gradientes continuos; sin embargo, los eluyentes
contienen cantidades significativas de disolventes orgánicos. En un
procedimiento de fabricación, el uso de disolventes orgánicos
ocasiona varias complicaciones tales como normativa ambiental (por
ejemplo, normas de emisión de calidad del aire), requerimientos de
manipulación especiales (por ejemplo, normas de inflamabilidad) y
limitaciones en la eliminación (por ejemplo, normativa sobre
residuos tóxicos). Por tanto, hay una necesidad de un sistema
eluyente que minimice el uso de disolventes orgánicos, que separe
también de forma eficiente mezclas en sus componentes puros.
La presente invención proporciona un
procedimiento para la separación y purificación de una amplia
variedad de compuestos de tipo equinocandina desacilados que
contienen al menos un grupo amino protonable a partir de su
fermentación o caldos mixtos y corrientes de procedimiento
parcialmente purificadas mediante adsorción de la mezcla sobre un
medio cromatográfico de fase inversa, hidrófobo, y eluyendo con un
gradiente de ácido acético casi lineal continuo que varía de ácido
acético al 0,1% a ácido acético al 10,0% en volumen en agua,
preferiblemente de 0,5% (pH = 5,5) a ácido acético al 4,0% (pH =
2,5).
De forma particular, la invención proporciona un
procedimiento para la separación y purificación de compuestos de
equinocandina desacilados que comprende las etapas de: (i)
proporcionar una mezcla que comprende un compuesto de equinocandina
desacilado que tiene unido al mismo al menos un grupo amino
protonable, (ii) adsorción de dicha mezcla sobre un medio
cromatográfico de fase inversa, hidrófobo; iii) elución del
compuesto de equinocandina desacilado con un gradiente de ácido
acético casi lineal continuo que varía de ácido acético al 0,1% a
ácido acético al 10,0% en volumen en agua, y iv) recuperación de
dicho compuesto de equinocandina desacilado.
En otra realización la invención proporciona un
procedimiento para la purificación de compuestos de equinocandina
desacilados de una mezcla que contiene un subproducto
tripéptido-aldehído que comprende las etapas de: (i)
proporcionar una mezcla de un compuesto de equinocandina desacilado
y un subproducto tripéptido-aldehído; (ii) adición
de un agente derivatizante a dicha mezcla para producir un producto
tripéptido-aldehído derivatizado; y (iii)
separación de dicho compuesto de equinocandina desacilado de dicho
producto tripéptido-aldehído derivatizado usando
cromatografía de fase inversa hidrófoba y eluyendo con un gradiente
de ácido acético casi lineal, continuo.
Tal como se usa en esta invención, el término
"agente derivatizante" se refiere a un reactivo capaz de
reaccionar con la funcionalidad aldehído del subproducto tripéptido
para producir un intermedio que es suficientemente diferente en
hidrofobicidad para permitir la separación del intermedio tripéptido
del compuesto de tipo equinocandina deseado.
El término "grupo amino protonable" se
refiere a un grupo amino que sufre protonación cuando se somete a
las condiciones de elución de la presente invención (es decir,
ácido acético al 0,1% a ácido acético al 10% en volumen en
agua).
El término "compuestos de tipo
equinocandina" se refiere a compuestos que tienen la siguiente
estructura general incluyendo cualquier derivado simple de los
mismos:
en la que R1 es -H u -OH; R2 es -H
o CH_{3}; R3 es -H, -CH_{3}, -CH_{2}CONH_{2} o
-CH_{2}CH_{2}NH_{2}; R4 es -H u -OH; R5 es -OH, -OPO3H2, u
-OSO_{3}H; R6 es -H u -OSO_{3}H y R7 es CH_{3}. "Núcleo de
equinocandina" se refiere al compuesto de equinocandina
desacilado donde R es un hidrógeno. "ECBN" se refiere al núcleo
de equinocandina B donde R1, R4 y R5 son grupos hidroxilo, R2, R3 y
R7 son grupos metilo; y R1 y R6 son
hidrógenos.
El término "alquilo" se refiere a un
radical hidrocarburo de fórmula general C_{n}H_{2n+1} que
contiene de 1 a 30 átomos de carbono a menos que se indique otra
cosa. El radical alcano puede ser lineal (por ejemplo, metilo,
etilo, propilo, butilo, etc.), ramificado (por ejemplo, isopropilo,
isobutilo, butilo terciario, neopentilo, etc.), cíclico (por
ejemplo, ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo, metilciclopentilo,
ciclohexilo, etc.), o multi-cíclico (por ejemplo,
biciclo[2.2.1]heptano,
espiro[2.2]pentano, etc.). El radical alcano puede
estar sustituido o no sustituido. De forma similar, la parte
alquilo de un grupo alcoxi o alcanoato tiene la misma definición
que anteriormente.
El término "alquenilo" se refiere a un
hidrocarburo acíclico que contiene al menos un enlace doble
carbono-carbono. El radical alqueno puede ser
lineal, ramificado, cíclico o multi-cíclico. El
radical alqueno puede estar sustituido o no sustituido.
El término "alquinilo" se refiere a un
hidrocarburo acíclico que contiene al menos un enlace triple
carbono-carbono. El radical alquino puede ser
lineal o ramificado. El radical alquino puede estar sustituido o no
sustituido.
El término "arilo" se refiere a restos
aromáticos que tienen sistemas de anillo simples (por ejemplo,
fenilo) o condensados (por ejemplo, naftaleno, antraceno,
fenantraceno, etc.). Los grupos arilo pueden estar sustituidos o no
sustituidos.
El término "heteroarilo" se refiere a
restos aromáticos que contienen al menos un heteroátomo dentro del
sistema de anillo aromático (por ejemplo, pirrol, piridina, indol,
tiofeno, furano, benzofurano, imidazol, pirimidina, purina,
bencimidazol, quinolina, etc.) El resto aromático puede comprender
un sistema de anillo simple o condensado. Los grupos heteroarilo
pueden estar sustituidos o no sustituidos.
\newpage
Dentro del campo de la química orgánica y en
particular dentro del campo de la bioquímica orgánica, se entiende
ampliamente que la sustitución significativa de compuestos es
tolerada o incluso útil. En la presente invención, por ejemplo, el
término grupo alquilo permite sustituyentes que sean un alquilo
clásico, tal como metilo, etilo, propilo, hexilo, isooctilo,
dodecilo, estearilo etc. El término "grupo" considera de forma
específica y permite sustituciones en alquilos que son comunes en
la técnica, tales como hidroxi, halógeno, alcoxi, carbonilo, ceto,
éster, carbamato, etc., así como también incluye el resto alquilo no
sustituido. Sin embargo, se entiende en general por los expertos en
la técnica que los sustituyentes deberían seleccionarse de modo que
no afecten de forma adversa las características farmacológicas del
compuesto o interfieran de forma adversa con el uso del
medicamento. Sustituyentes adecuados para cualquiera de los grupos
definidos anteriormente incluyen alquilo, alquenilo, alquinilo,
arilo, halo, hidroxi, alcoxi, ariloxi, mercapto, alquiltio, ariltio,
mono- y di-aquilamino, sales de amonio cuaternario,
aminoalcoxi, hidroxialquilamino, aminoalquiltio, carbamilo,
carbonilo, carboxi, glicolilo, glicilo, hidrazino, guanilo y
combinaciones de los mismos.
Los caldos de fermentación y mixtos contienen
una serie de subproductos que son muy difíciles de separar del
producto ciclopeptídico deseado. "Caldo mixto" se refiere a una
mezcla de conversión donde el caldo de fermentación se trata
directamente con un enzima desacilante sin purificación para
producir el producto desacilado (por ejemplo, ECBN). Se ha usado en
el pasado cromatografía líquida de fase inversa con éxito razonable;
sin embargo, la necesidad de compuestos de mayor pureza demanda más
procedimientos de purificación mejorados. Los solicitantes han
descubierto que la separación de subproductos de fermentación del
producto de fermentación deseado que contiene un grupo amino
protonable se puede mejorar usando un medio cromatográfico de fase
inversa en combinación con un esquema de elución con ácido acético
en gradiente casi lineal, continuo.
Medios cromatográficos hidrófobos adecuados
incluyen sílices de fase inversa, y polímeros orgánicos tales como
copolímeros de estireno y divinilbenceno, polímero de metacrilato.
Se encuentran comercialmente disponibles una variedad de sílices de
fase inversa de distribuidores tales como BTR, E. Merck, Eka Nobel,
Millipore, Phenomenex, Whatman, o YMC. Las sílices se derivatizan
con hidrocarburos de alquilo de cadena lineal que varían en
longitud de C_{1} a C_{18} (siendo C_{1}, C_{4}, C_{8} y
C_{18} los más comunes) u otros ligandos hidrófobos de este tipo
(por ejemplo, fenilo o ciano). Se encuentran también disponibles una
variedad de resinas de estireno/divinilbenceno diseñadas para
cromatografía líquida de fase inversa tales como Diaion^{TM} HP y
resinas SP (disponibles en Mitsubishi Chemical Industries Limited,
Tokio, Japón) y resinas Amberlite XAD-2,4, y 16
(disponibles en Rohm y Haas Chemical Co., Philadelphia, PA) y las
resinas Amberchrom CG-161, 300 y 1000 de Toso Haas
(Montgomeryville, PA). Las resinas no funcionales se caracterizan en
general por su volumen de poro (0,5-4,5 ml/g), área
superficial específica (200-800 m^{2}/g), diámetro
de poro (40 a 1300 \ring{A}), distribución de tamaño de poro y/o
distribución de tamaño de partícula. Las resinas no funcionales
preferidas incluyen Diaion HP-20 que tiene un área
superficial de 500 m^{2}/g, un tamaño de poro de 200 a 300
\ring{A} y tamaño de partícula de 200-800 \mum;
SP-825 que tiene un área superficial de 1000
m^{2}/g, tamaño de poro de 50- 60 \ring{A} y tamaño de partícula
de 250-600 \mum; SP-207 (versión
brominada de HP-20) que tiene un área superficial
de 630 m^{2}/g, tamaño de poro de 100-200
\ring{A} y tamaño de partícula de 200-800 \mum;
y CG-161CD que tiene un área superficial de 900
m^{2}/g, tamaño de poro de 110 a 175 \ring{A}, y tamaño de
partícula de 80-160 \mum. Son más preferidas las
resinas SP-20 y SP-825.
Inicialmente se proporciona una solución bruta o
parcialmente purificada que contiene el compuesto peptídico cíclico
deseado que tiene al menos un grupo amino protonable. Por lo general
el grupo amino se puede protonar durante el curso del gradiente de
ácido acético que limita el intervalo de pH de 5,5 a 2,5.
Preferiblemente el grupo amino es una amina primaria; sin embargo,
el grupo amino puede ser una amina secundaria o amina terciaria
siempre que los sustituyentes adicionales sobre el átomo de
nitrógeno no sean suficientemente hidrófobos de modo que superen la
polaridad de la amina cargada positivamente. La solución puede
originarse a partir de un procedimiento de fermentación o un
procedimiento sintético. Por ejemplo, se pueden preparar los
compuestos peptídicos cíclicos mediante los procedimientos
sintéticos descritos en la patente de Estados Unidos número
5.696.084; J. Am. Chem. Soc., 108, 6041 (1986); Evans,
D.A., y col., J. Am. Chem. Soc., 109, 5151 (1987);
J. Med. Chem., 35, 2843 (1992); y Kurokawa, N., y col.,
Tetrahedron, 49, 6195 (1993). La solución bruta es
normalmente un caldo mixto. De forma alternativa se puede usar el
procedimiento para purificar adicionalmente (o refinar) material
parcialmente purificado.
Dependiendo del procedimiento de fermentación
determinado usado, puede ser deseable filtrar previamente la
solución para eliminar constituyentes particulados que pueden
interferir con el procedimiento cromatográfico. La filtración se
puede realizar mediante cualquier número de medios conocidos por los
expertos en la materia incluyendo filtración por gravedad,
filtración a vacío a través de un filtro de cerámica que puede o no
puede incluir un adyuvante de filtro Celite^{TM}, etc. También se
pueden eliminar sólidos en el caldo de fermentación mediante
centrifugación seguida de decantación del líquido de los
sólidos.
La solución de fermentación se puede concentrar
si se desea usando una variedad de medios que son también bien
conocidos por los expertos en la técnica tales como concentración
evaporativa, liofilización, etc. El concentrado se puede filtrar
una segunda vez para eliminar cualquier precipitado que pueda
haberse formado durante el procedimiento de concentración.
La solución bruta o parcialmente purificada se
carga en una columna cromatográfica empaquetada con uno de los
medios cromatográficos hidrófobos descritos anteriormente. El
producto peptídico cíclico deseado se eluye luego del medio
cromatográfico usando un gradiente casi lineal continuo que varía de
ácido acético aproximadamente al 0,1% a ácido acético
aproximadamente al 10%, preferiblemente de ácido acético
aproximadamente al 0,5% (pH = 5,5) a ácido acético aproximadamente
al 4% (pH = 2,5). El extremo superior del intervalo de concentración
de ácido acético seleccionado está basado en la estabilidad del
medio cromatográfico usado y en la estabilidad del compuesto que se
purifica a ese pH. El extremo inferior del intervalo se selecciona
sobre la base del pH cuando el grupo amino se trotona y a la
concentración de ácido acético requerida para eluir el producto de
la superficie hidrófoba. Los expertos en la técnica apreciarán que
el gradiente no tiene que ser perfectamente lineal. Dentro del
significado de "casi lineal" se incluye un gradiente convexo o
cóncavo plano.
Al final de la etapa del procedimiento de
elución con gradiente se usa de forma típica un volumen adicional
de la solución de ácido acético con más concentración para completar
la elución. Al final del procedimiento, la columna se puede
regenerar de modo que la columna se pueda reutilizar para ciclos de
purificación adicionales. La etapa de regeneración incluye de forma
típica el lavado de la columna con mezclas de un disolvente orgánico
y agua tanto a pH neutro como alcalino para eliminar cualquier
material residual que quede en la matriz de la columna. Disolventes
adecuados incluyen acetonitrilo, metanol, isopropanol y acetona. El
esquema de elución de ácido acético en gradiente lineal no sólo
proporciona buena selectividad (véase, entre otros, el ejemplo 1
siguiente), sino que también limita el uso de disolventes orgánicos
para la etapa de regeneración de la operación en columna. Por
tanto, se minimiza tanto la cantidad absoluta de disolvente orgánico
usado como el volumen del efluente de la columna que se debe tratar
antes de la eliminación.
El producto de fermentación se puede recuperar
del eluido usando una variedad de procedimientos. Procedimientos de
recuperación adecuados incluyen cristalización, concentración
evaporativa y liofilización.
El caldo de fermentación para equinocandina B
contiene cantidades variables de un subproducto
tripéptido-aldehído
(Asn-Gln-Leu-H) que
tiene la siguiente estructura química (Ia). El
sub-producto tripéptido-aldehído
sufre desacilación así como también la equinocandina B durante el
procedimiento de desacilación enzimática formando el
correspondiente tripéptido-aldehído (Ib)
desacilado.
en la que R es
C(O)CH_{2}CH(OH)C_{9}H_{19} (Ia -
subproducto de fermentación) o un hidrógeno (Ib - subproducto de
desacilación de un caldo
mixto).
De forma sorprendente, el tiempo de retención
del tripéptido-aldehído desacilado es muy similar a
ECBN en cromatografía líquida de fase inversa, incluso en
condiciones de elución óptimas, haciendo así muy difícil separar
tripéptido-aldehído (Ib) desacilado del ECBN
deseado. Si no se elimina el tripéptido entonces el grupo amino
libre del tripéptido compite con el grupo amino libre del compuesto
ECBN durante el procedimiento de reacilación. En consecuencia se
debe añadir un exceso de compuesto acilante para asegurar la
acilación completa del compuesto ECBN. El contaminante tripéptido
no sólo consume materiales de partida necesarios sino que también
produce un subproducto acilado que es difícil de eliminar en la
purificación subsiguiente del compuesto ECB acilado.
Preferiblemente, el subproducto tripéptido se elimina antes de la
reacilación del compuesto ECBN.
El subproducto
tripéptido-aldehído se puede eliminar bien de la
mezcla de fermentación o bien del caldo mixto (es decir, mezcla de
desacilación) haciendo reaccionar el aldehído con un agente
derivatizante antes de la purificación cromatográfica. El agente
derivatizante se puede añadir a la funcionalidad aldehído para
cambiar el tiempo de retención cromatográfico del
tripéptido-aldehído en relación con el compuesto ECB
deseado. Agentes derivatizantes adecuados incluyen bisulfito de
sodio, hidroxilamina y clorhidrato de semicarbazida. Algunas
ventajas de usar agentes derivatizantes en oposición a otros medios
de modificación de los tiempos de retención cromatográficos son la
selectividad de los agentes derivatizantes por la funcionalidad
aldehído y las condiciones suaves en las que tiene lugar la
reacción. Si la reacción entre el agente derivatizante y el
tripéptido-aldehído es reversible, entonces el
aldehído se puede recuperar fácilmente mediante eliminación del
agente derivatizante. El tripéptido recuperado se puede usar luego
para otros fines.
\newpage
Se usan las siguientes abreviaturas a lo largo
de los ejemplos para representar los materiales respectivos
enumerados:
ACN - acetonitrilo
TFA - ácido trifluoroacético
HP-20 - resina de
estireno/divinilbenceno que tiene un área superficial de 500
m^{2}/g, un tamaño de poro de 200 a 300 \ring{A} y tamaño de
partícula de 200 a 800 \mum;
SP-825 - resina de
estireno/divinilbenceno que tiene un área superficial de 1000
m^{2}/g, tamaño de poro de 50 a 60 \ring{A} y tamaño de
partícula de 250 a 600 \mum.
SP-207 - resina de
estireno/divinilbenceno bromada que tiene un área superficial de 630
m^{2}/g, tamaño de poro de 100 a 200 \ring{A} y tamaño de
partícula de 200 a 800 \mum.
CG-161CD - resina de
estireno/divinilbenceno que tiene un área superficial de 900
m^{2}/g, tamaño de poro de 110 a 175 \ring{A}, y tamaño de
partícula de 80 a 160 \mum.
Se usaron columnas de vidrio que varían en
tamaño de 0,2 a 5 litros. Las matrices cromatográficas estudiadas
incluyeron HP-20, SP-825 y
SP-207 (todos disponibles en Mitsubishi) y
CG-161cd (disponible en Toso Haas). Se lavaron las
matrices en lotes con agua/ACN 50/50, hidróxido de sodio 0,1 M y
finalmente con acetonitrilo puro (ACN) antes de empaquetar la
columna. Se empaquetó la matriz de elección en la columna de tamaño
apropiado usando técnicas de asentamiento de la suspensión simples.
Columnas de tamaños inferiores a un litro se operaron usando
instrumentación FPLC convencional (disponible en Pharmacia). Se
llevaron a cabo los experimentos en columna de cinco litros usando
un sistema controlador Waters Delta Prep 3000.
Se clarificaron las mezclas de ECBN mediante
filtración usando filtros Cuno 30S antes de cargar en las columnas
respectivas. Se equilibraron previamente las columnas de
HP-20 y SP-825 en ácido acético al
0,5% (HOAc), se ajustaron a un pH de 5,5 con hidróxido de sodio
(NaOH) y se cargaron con la solución de ECBN clarificada. Se
cargaron las columnas de HP-20 hasta aproximadamente
5 a 5,5 g de ECBN/litro de resina empaquetada mientras que las
columnas de SP-825 se cargaron a aproximadamente 11
a 12 g/litro. Después de cargar se lavaron las columnas con 5
volúmenes de columna (VC), del tampón de equilibrado. Se eluyó el
producto usando 5 VC continuos, variando el gradiente lineal de
HOAc al 0,5% (pH = 5,5) hasta HOAc al 4% (pH = 2,5). Al final del
gradiente se usó 2 VC adicionales de la solución de HOAc al 4% para
completar la elución. Durante la elución del producto se recogieron
fracciones de 0,2 VC. Se caracterizaron las fracciones mediante una
variedad de procedimientos de HPLC de fase inversa
(RP-HPLC), las fracciones apropiadas se combinaron
para dar la agrupación de corriente principal. Se regeneraron las
columnas mediante lavado con una mezcla 60/40 de 3 VC de ACN y agua,
seguido de una mezcla 60/40 de 3 VC de ACN y NaOH 0,1 M. Los
caudales usados durante la operación fueron 2 VC/hora (150 cm/hora)
para carga, lavado, regeneración y re-equilibrado y
1 VC/hora (75 cm/hora) para elución. Se concentraron las
agrupaciones de corriente principal.
Para comparación se estudiaron las siguientes
condiciones de fase móvil (modificador orgánico y pH) y perfiles de
elución en gradiente además del tipo de matriz.
Modificador de ACN: ejemplos 1 a 3 usaron un
gradiente de ACN lineal de 5 VC (pH 5,5 con un tampón de
acetato).
Elución con ácido acético: además de las
condiciones descritas previamente, la concentración de ácido acético
se aumentó hasta 5% (ejemplo 10). Se compararon también un
gradiente en etapas y gradiente convexo con el gradiente lineal
continuo descrito anteriormente tanto en columnas de
HP-20 como de SP-825 (ejemplos 13 a
19).
Se evaluaron la calidad y cantidad de muestras
cromatográficas de ECBN usando los siguientes procedimientos
analíticos.
Sistema de fosfato: se eluyó una columna de
partículas de 3,5 micrómetros, C-18 de Zorbox SB
(0,46 cm de diámetro interno x 15 cm) con una fase móvil de ácido
fosfórico al 0,2%/ACN a un caudal de 1,0 ml/minuto. Se operó la
columna a 40ºC y se controló el efluente a 210 nm. Se equilibra la
columna en ACN al 1% y tras inyección de muestra se usó un
gradiente que varía de 1 a 18,5% de ACN durante 9 minutos para eluir
ECBN. Después de la elución se lavó la columna con ACN al 50% para
eluir cualquier componente fuertemente retenido.
Sistema de fosfato/ácido octanosulfónico (OSA):
este sistema es similar al sistema de fosfato descrito
anteriormente, con la excepción de que la fase móvil contiene OSA
30 mM. Se equilibra la columna con ACN al 9%. Una vez se inyecta la
muestra se consigue la elución de ECBN con un gradiente que varía de
9 a 24% de ACN durante 9 minutos. Se lavó luego la columna con ACN
al 50% para eluir los componentes fuertemente retenidos. El caudal
de la columna y la longitud de onda del detector fueron como
anteriormente, mientras que la temperatura de la columna fue de
50ºC. Este sistema es particularmente útil para cuantificación del
componente tripéptido-aldehído
Asn-Gln-Leu-H.
Sistema de TFA: se usó una columna de 3,5
micrómetros, C-18 de Vydac (0,46 x 25 cm) para el
ensayo. La fase móvil contenía TFA al 0,1% y se consiguió la
elución usando un gradiente de ACN lineal de 0 a 10% durante 20
minutos, seguido de un lavado de la columna del 50%. Caudal de la
columna, temperatura y longitud de onda del detector fueron los
mismos que para el sistema de fosfato descrito anteriormente.
Se llevaron también a cabo análisis de
aminoácido (AAA) sobre muestras como un procedimiento alternativo
para la determinación del contenido en tripéptido. Se hidrolizaron
con ácido las muestras, y se determinaron los moles de Asn, Gln, y
Thr en el hidrolizado mediante cromatografía de intercambio de iones
y derivatización con ninhidrina. Se usó la recuperación de Thr para
determinar los moles de ECBN en la muestra, mientras que el
contenido en Gln representó los niveles de tripéptido. El % en moles
(%M) del tripéptido
Asn-Gln-Leu-H
frente a ECBN se calculó usando la siguiente ecuación:
%M
Asn-Gln-Leu-H =
2x[Gln]/[Thr]
Las medidas de densidad óptica (DO) se llevaron
a cabo en muestras seleccionadas a la longitud de onda especificada
para estimar la turbidez de muestra relativa (DO a 550 nm) o
contenido de proteína total (DO a 280 nm).
Se proporcionan los siguientes ejemplos para
ilustrar, pero no limitar, la invención reivindicada.
El ejemplo 1 compara los procedimientos
cromatográficos por RP-HPLC usando un esquema de
elución con acetonitrilo con un esquema de elución con ácido
acético en combinación con una variedad de resinas no funcionales.
La tabla 1 resume los resultados observados usando los esquemas de
elución designados y medios de columna.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(Tabla pasa a página
siguiente)
En la tabla 1, * ejemplos comparativos, ^{a}
medido en gramos de ECBN por litro de resina; ^{b} impureza de
desmetilo se refiere a una mezcla de dos compuestos ECBN donde el
grupo metilo no aparece en las unidades de péptido trenonina y
metilprolina, respectivamente.
El esquema de modificador (ACN) proporcionó
rendimientos, pureza total y resolución de los componentes de
desmetilo buenos; sin embargo, el acetonitrilo es un disolvente
orgánico. La tabla 1 muestra claramente que el ácido acético
proporciona una alternativa al tradicional esquema de elución con
disolvente orgánico. Los datos también muestran que un gradiente
continuo de ácido acético mejora de forma significativa la
resolución en comparación con un gradiente en etapas o gradiente
convexo de ácido acético. Incluso a pesar de que el rendimiento en
producto para el ejemplo 5 (gradiente lineal) es ligeramente
inferior y el volumen de corriente principal mayor en comparación
con el ejemplo 4 (gradiente en etapas), la pureza de ECBN total es
mayor (83% frente a 71%) y el contenido en desmetilo es inferior
(2% frente a 11%).
Se cree que la elución de de ECBN de la matriz
hidrófoba que usa el procedimiento de elución con ácido acético se
consigue de dos formas: (1) el ácido acético actúa como un
modificador orgánico, con lo que se aumenta la resistencia a la
elución de la fase móvil; y (2) el pH inferior del disolvente B
(disolvente de fuerte elución, pH = 2,5) sirve para protonar la
funcionalidad amina de ECBN haciéndolo así más polar y por tanto
menos retenido por la fase estacionaria hidrófoba. El modificador
orgánico y el pH que influyen en la solución de ácido acético al 4%
son aparentes al comparar ejemplos 8 y 9. En el ejemplo 9 se
sustituyó ácido fosfórico 100 mM (pH = 2,5) por el HOAc al 4% (pH =
2,5) como el disolvente B. Si la elución del ECBN era dependiente
sólo del pH de la fase móvil, la posición de elución y recuperación
de ECBN debería ser similar a la observada en el ejemplo 8. De
hecho, la elución de fosfato dio lugar sólo a aproximadamente el 50%
de la recuperación de ECBN y el pico de producto mostró un grado
significativo de formación de cola. Por tanto, el HOAc al 4% puede
dar lugar a elución tanto reduciendo el pH de la fase móvil como
aumentando la resistencia a la elución de la fase móvil actuando
como un modificador orgánico.
El ácido acético también proporciona mayor
selectividad que el acetonitrilo. Cuando se comparan cromatogramas
de RP-HPLC para corrientes principales recogidas de
columnas de HP-20 eluídas con ACN frente a HOAc
(ejemplos 1 y 5, respectivamente), se observó una ausencia de
impurezas extrañas en la corriente principal eluída usando HOAc. En
el esquema de elución de HOAc estos componentes no eluyeron hasta
que se regeneraba la columna.
El ejemplo 2 compara procedimientos
cromatográficos que usan un esquema de elución con ácido acético en
gradiente lineal/columna única (descrito anteriormente) con un
esquema de elución con acetonitrilo en gradiente convexo/columna
doble. Además se describe una comparación entre lotes no tratados de
ECBN (ejemplos 2 a 8 y 2 a 10) con lotes de ECBN tratados con
metabisulfito de sodio antes de la purificación en la columna
(ejemplos 2 a 7 y 2 a 9). Se llevó a cabo el
pre-tratamiento con metabisulfito de sodio mediante
adición simple de 10 mM de metabisulfito de sodio a la carga de la
columna y dejando la solución agitar durante un periodo de 6 a 18
horas. El procedimiento en columna única es el mismo que se
describió anteriormente usando un esquema de elución con ácido
acético en gradiente lineal.
El procedimiento en columna doble comparativo
usa dos columnas de HP-20 que operan en una
configuración de columna principal-secundaria. Se
carga un caldo de fermentación en dos columnas de
HP-20 conectadas en serie. Algo de ECBN que no es
retenido por la primera columna se concentra en la segunda columna.
Se cree que el ECBN se distribuye en proporciones aproximadamente
iguales entre las dos columnas. Después de cargar, la columna
principal se desconecta y se lava con 3,8 volúmenes de columna (VC)
de agua. La elución de la columna principal se lleva a cabo
mediante lavado con 3,3 VC de HOAc al 5%. La corriente principal de
la primera columna se ajusta a un pH de 5,0 y se caga en la segunda
columna (secundaria) parcialmente cargada. La columna se lava con
6,3 VC de agua antes de la elución. Se usa un gradiente de
acetonitrilo convexo (0 a 9,4% durante aproximadamente 5 VC que
contienen HOAc al 0,5%) para eluir la columna. El efluente de la
columna se fracciona y se reúnen fracciones que tienen la pureza
deseada (más del 75% de pureza de pico principal según HPLC de fase
inversa y menos del 10% de componente de desmetilo) como la
corriente principal. La solución reunida se concentró luego.
La tabla 2 compara los resultados observados
para el procedimiento cromatográfico con columna única frente al
procedimiento cromatográfico con columna doble, y los caldos de
fermentación de ECBN tratados frente a no tratados.
En la tabla 2, ^{a} valores indicados
representan la media de dos cristalizaciones y determinaciones
analíticas independientes; ^{b} % de área de pico principal
frente a área de pico total de RP-HPLC; ^{c} %
impurezas de desmetilo; ^{d} ECBN/DO = gramos de ECBN
(RP-HPLC)/gramos según DO totales; donde gramos
según DO es DO a 280 nm y suponiendo E_{0,1%} de 1,0; ^{e} uno
de los dos lotes tenía gran contenido de agua; por tanto se redujo
la potencia media.
Los resultados analíticos indicados
anteriormente para la pureza de ECBN se obtuvieron tras haberse
concentrado las corrientes principales. Tanto la pureza del pico
principal por HPLC de fase inversa como los niveles de desmetilo
son similares para experimentos en columna única de
HP-20 y SP-825. Sin embargo, la
operación en HP-20 única da de forma consistente
una reducción ligeramente mayor en el componente de desmetilo. En
general la pureza según HPLC de fase inversa de ECBN del
procedimiento en columna única es equivalente a o mejor que la
pureza de ECBN del procedimiento en dos columnas proporcionando así
un medio más económico de purificación.
Ninguno de los esquemas de purificación en
columna fueron capaces de reducir de forma significativa la cantidad
del tripéptido; sin embargo, el pre-tratamiento con
bisulfito de sodio redujo de forma significativa la cantidad de
impurezas de tripéptido. La pureza de ECBN/DO del producto de los
estudios con columna única era equivalente a o superior que la
obtenida en los estudios con dos columnas. Aunque el valor de
ECBN/DO no representa una medida absoluta de pureza, este
proporciona una buena comparación relativa de la pureza de ECBN
resultante de las diversas operaciones en columna. Todas las
operaciones con columna dieron un aumento de 10 a 15 veces en
pureza de ECBN/DO cuando los valores para soluciones de carga de la
columna (datos no mostrados) se comparan con las corrientes
principales concentradas.
Claims (16)
1. Un procedimiento de separación y purificación
de compuestos de equinocandina desacilados que comprende las etapas
de:
- (i)
- proporcionar una mezcla que comprende un compuesto de equinocandina desacilado que tiene unido al mismo al menos un grupo amino protonable;
- (ii)
- adsorción de dicha mezcla sobre un medio cromatográfico de fase inversa, hidrófobo;
- (iii)
- elución del compuesto de equinocandina desacilado con un gradiente de ácido acético casi lineal continuo que varía de ácido acético al 0,1% a ácido acético al 10,0% en volumen en agua; y
- (iv)
- recuperación de dicho compuesto de equinocandina desacilado.
2. El procedimiento de la reivindicación 1, en
el que dicho gradiente de ácido acético varía de ácido acético al
0,5% a ácido acético al 4,0% en volumen en agua.
3. El procedimiento de la reivindicación 1 ó 2,
en el que dicho compuesto de equinocandina desacilado está
representado por la siguiente estructura:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
en la que R1 es -H u -OH, R2 es -H
o CH_{3}; R3 es -H, -CH_{3}, -CH_{2}CONH_{2} o
-CH_{2}CH_{2}NH_{2}; R4 es -H u -OH; R5 es -OH,
-OPO_{3}H_{2}, u -OSO_{3}H, R6 es -H u -OSO_{3}H y R7 es
CH_{3}.
4. El procedimiento de cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3, en el que dicho medio de fase inversa,
hidrófobo es un polímero orgánico.
5. El procedimiento de la reivindicación 4, en
el que dicho polímero orgánico es un copolímero de estireno y
divinilbenceno o un polímero de metacrilato.
6. El procedimiento de la reivindicación 4 ó 5
en el que dicho polímero orgánico es una resina de
estireno/divinil-
benceno que tiene un área superficial de 500 m^{2}/g, un tamaño de poro de 200-300 \ring{A} y tamaño de partícula de 200-800 \mum; o una resina de estireno/divinilbenceno que tiene un área superficial de 1000 m^{2}/g, tamaño de poro de 50-60 \ring{A} y tamaño de partícula de 250-600 \mum.
benceno que tiene un área superficial de 500 m^{2}/g, un tamaño de poro de 200-300 \ring{A} y tamaño de partícula de 200-800 \mum; o una resina de estireno/divinilbenceno que tiene un área superficial de 1000 m^{2}/g, tamaño de poro de 50-60 \ring{A} y tamaño de partícula de 250-600 \mum.
7. El procedimiento de cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, en el que dicha mezcla es un producto
de un caldo mixto.
8. Un procedimiento para la purificación de
compuestos de equinocandina desacilados de una mezcla que contiene
un subproducto tripéptido-aldehído que comprende las
etapas de:
- (i)
- proporcionar una mezcla de un compuesto de equinocandina desacilado y un subproducto tripéptido-aldehído;
- (ii)
- adición de un agente derivatizante a dicha mezcla para producir un producto tripéptido-aldehído derivatizado; y
- (iii)
- separación de dicho compuesto de equinocandina desacilado de dicho producto tripéptido-aldehído derivatizado usando cromatografía de fase inversa hidrófoba y eluyendo con un gradiente de ácido acético casi lineal, continuo.
9. El procedimiento de la reivindicación 8, en
el que el gradiente de ácido acético casi lineal, continuo es un
gradiente que varía de ácido acético al 0,1% a ácido acético al
10,0% en volumen en agua.
10. El procedimiento de la reivindicación 8 ó 9,
en el que dicha etapa de separación (iii) comprende:
- (a)
- adsorber dicha mezcla de producto tripéptido-aldehído derivatizado y compuesto de equinocandina desacilado sobre un medio cromatográfico de fase inversa, hidrófobo y
- (b)
- elución del compuesto de equinocandina desacilado con un gradiente de ácido acético casi lineal continuo que varía de ácido acético al 0,1% a ácido acético al 10,0% en volumen en agua.
11. El procedimiento de cualquiera de las
reivindicaciones 8 a 10, en el que dicho compuesto de equinocandina
desacilada está representado por la siguiente estructura:
en la que R1 es -H u -OH, R2 es -H
o CH_{3}; R3 es -H, -CH_{3}, -CH_{2}CONH_{2} o
-CH_{2}CH_{2}NH_{2}; R4 es -H u -OH; R5 es -OH,
-OPO_{3}H_{2}, u -OSO_{3}H, R6 es -H u -OSO_{3}H y R7 es
CH_{3}.
12. El procedimiento de cualquiera de las
reivindicaciones 8 a 11, en el que dicho subproducto aldehído está
representado por la siguiente estructura:
en la que R es
-C(O)CH_{2}CH(OH)C_{9}H_{10} o un
hidrógeno.
13. El procedimiento de cualquiera de las
reivindicaciones 8 a 12, en el que dicha mezcla es un producto de
un caldo de fermentación.
14. El procedimiento de cualquiera de las
reivindicaciones 8 a 13, en el que dicha mezcla es un producto de
un caldo de fermentación mixto.
15. El procedimiento de cualquiera de las
reivindicaciones 8 a 14, en el que dicho agente derivatizante se
selecciona del grupo constituido por bisulfito de sodio,
hidroxilamina y clorhidrato de semicabazida.
16. El procedimiento de las reivindicación 15,
en el que dicho agente derivatizante es bisulfito de sodio.
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