MXPA01005688A - Purificacion de compuestos ciclopeptidicos de equinocandina - Google Patents
Purificacion de compuestos ciclopeptidicos de equinocandinaInfo
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Abstract
Se describe unmétodo para separar y purificar una amplia variedad de productos ciclopeptidicos de fermentación, que contienen al menos un grupo amino protonable (incluyendo los compuestos del tipo Equinocandina desacilada), de sus caldos de fermentación o caldos mixtos y corrientes de proceso parcialmente purificadas, mediante la adsorción de la mezcla sobre medios hidrofóbicos de cromatografía de fase inversa y eluyendo con un gradiente lineal, continuo, deácido acético, de 0.1%deácido acético a 10.0%deácido acético, en volumen, en agua. También se describe un proceso para remover los subproductos de tripéptido / aldehído, de los productos de fermentación, mediante un agente de derivación.
Description
PURIFICACIÓN DE COMPUESTOS CICLOPEPTIDICOS DE EQUINOCANDINA
CAMPO DE LA. INVENCIÓN
La presente invención se refiere a un proceso para la purificación de compuestos ciclopetidicos que contienen al menos un grupo amino protonable, en particular el proceso se refiere a la purificación de un compuesto del tipo Equinocandina, mediante la adsorción sobre medios hidrofóbicos para cromatografía de fase inversa y eluyendo con un gradiente continuo, casi lineal, de cantidades crecientes de ácido acético. También se proporciona un proceso de purificación para eliminar selectivamente un subproducto de tripéptido-aldehido del proceso de fermentación de la Equinocandina, para producir un compuesto de Equinocandina de mayor pureza.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
Los ciclopéptidos de Equinocandina son productos naturales que, según se ha demostrado, tienen actividades antifúngicas . Incluidos en la familia de ciclopéptidos de Equinocandina se encuentran los productos naturales tales como la Equinocandina B(ECB), Equinocandina C, Aculeacina Ay, Mulundocandina, Esporiofungina A,
REF.: 130308
Neumocandina A0, WF11899A, y Neumocandina B0. Los productos naturales se producen típicamente cultivando varios microorganismos. Por ejemplo, la Equinocandina B se produce a partir de la fermentación del hongo Aspergill us nidulans . En la búsqueda de materiales más activos, los productos naturales se han modificado en una variedad de formas. Una de las modificaciones más comunes ha sido el reemplazo de la cadena lateral N-acilo en el producto natural, para producir un derivado se isintético. Por ejemplo, las Patentes Norteamericanas Números: 4,293,489; 4,320,052; 5,166,135; y 5,541,160; y EP 359529; 448353; 447186; 462531; y 561639, describen una variedad de compuestos de Equinocandina derivados de N-acilo, que proporcionan varios grados de actividad antifúngica. Los derivados de N-acilo se producen desacilando el producto natural, seguido de la reacilación con un grupo acilo diferente. La desacilación se consigue típicamente mediante una enzima (por ejemplo, la enzima desacilasa) . La enzima desacilasa se puede obtener a partir del microorganismo Actinoplanes utahensis o especies de Pseudomonas . Ver las Patentes Norteamericanas Números: 4,293,482; y 4,304,716; y EP 460,882. Al compuesto desacilado se hace típicamente referencia como el núcleo del producto natural correspondiente (es decir, al producto desacilado de la Equinocandina B se hace referencia como
núcleo de Equinocandina B (ECBN) ) . Desafortunadamente, tanto los procesos de fermentación como de desacilación producen varios subproductos que son difíciles de eliminar y disminuyen la pureza del núcleo de péptido cíclico desacilado, deseado. La Patente Norteamericana No. 4,874,843 describe un proceso cromatográfico que usa resinas no funcionales, en un modo inverso, para purificar productos del tipo Equinocandina. Aún cuando el proceso mejoró la pureza de los productos derivados a partir de un proceso de fermentación, todavía se necesitan mejoras adicionales para eliminar los contaminantes que son difíciles de separar tanto del núcleo desacilado intermedio como de los compuestos adiados, finales, farmacéuticamente activos. Dado que la potencia del producto farmacéutico final es dependiente de la pureza de los intermediarios usados para fabricar el producto final, son altamente deseables mejoras en la pureza en cualquier etapa del proceso de fabricación. Idealmente, los contaminantes se eliminan en la etapa más temprana posible en el proceso de fabricación. Análisis generales de resinas no funcionales y sus aplicaciones en separaciones por cromatografía de líquidos, se pueden encontrar en J. Ch orna togr aphy, 201, 287-292 (1980) y Grieser, M. D. et al, Analytical Chemistry, 45, 1348-1353 (1973) . Se analiza el uso de gradientes, ya
sea escalonados o continuos; sin embargo, los eluyentes contienen cantidades significativas de solventes orgánicos.
En un proceso de fabricación, el uso de solventes orgánicos da lugar a varias preocupaciones tales como normas ambientales (por ejemplo, estándares de emisiones para la calidad del aire) , requisitos especiales de manipulación
(por ejemplo, estándares de inflamabilidad) y limitaciones en la eliminación de los desechos (por ejemplo, normas para desechos tóxicos) . Por lo tanto, existe la necesidad de un sistema de eluyentes que minimice el uso de solventes orgánicos pero que separe efectivamente mezclas en sus componentes puros.
DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN
La presente invención proporciona un método para separar y purificar una amplia variedad de productos de ciclopéptidos de fermentación que contienen al menos un grupo amino protonable (incluyendo los compuestos del tipo Equinocandina, desacilados) de sus caldos mixtos o de fermentación y corrientes de proceso parcialmente purificadas, mediante la adsorción de la mezcla sobre medios hidrofóbicos para cromatografía de fase inversa y eluyendo con un gradiente continuo, casi lineal, de ácido acético, que varié desde 0.1% de ácido acético hasta 10.0% de ácido
acético en volumen, en agua, preferentemente desde 0.5% (pH = 5.5) a 4.0% (pH = 2.5) de ácido acético. En otra modalidad de la presente invención se proporciona un proceso para purificar compuestos del tipo Equinocandina (incluyendo derivados simples de los mismos) en donde un subproducto de aldehido (en particular, un subproducto de tripéptido-aldehido) en la mezcla de fermentación o en la mezcla parcialmente purificada, se hace reaccionar con un agente de derivación. Preferentemente, el caldo de fermentación o caldo mixto se hace reaccionar con el agente de derivación, antes de la purificación del núcleo de Equinocandina correspondiente, usando el método descrito anteriormente . Como se usa en la presente, el término "agente de derivación" se refiere a un reactivo capaz de reaccionar con la funcionalidad aldehido del subproducto tripéptido, para producir un intermediario que sea de hidrofobicidad lo suficientemente diferente, para permitir la separación del intermediario tripéptido del compuesto de tipo Equinocandina, deseado. El término "grupo amino protonable" se refiere a un grupo amino que sufre protonación cuando se somete a las condiciones de elución de la presente invención (es decir, de 0.1% de ácido acético a 10% de ácido acético en volumen, en agua) .
El término "compuestos del tipo Equinocandina" se refiere a compuestos que tienen la siguiente estructura general, incluyendo algunos derivados simples de los mismos:
en donde R es un hidrógeno o -C(0)R' donde R' es un grupo alquilo, un grupo alquenilo, un grupo de alquinilo, un grupo arilo, o grupo heteroarilo que tiene unido al mismo al menos un grupo amino protonable; Rl es -H o -OH; R2 es -H o -CH3; R3 es -H, -CH3, -CH2CONH2 o CH2CH2NH2; R4 es -H o -OH; R5 es -OH, -OPO3H2, o -OSO3H; y R6 es -H o -OSO3H. "Núcleo de Equinocandina" se refiere al compuesto de Equinocandina desacilado en donde R es un hidrógeno. "ECBN" se refiere al
núcleo de Equinocandina B en donde Rl, R4 y R5 son grupos hidroxilo, R2, R3, y R7 son grupos metilo; y Rl y R6 son hidrógenos. El término "alquilo" se refiere al radical de hidrocarburo de la fórmula general CnH2n+? que contiene de 1 a 30 átomos de carbono, al menos que se indique de otra manera. El radical alcano puede ser recto (por ejemplo, metilo, etilo, propilo, butilo, etc.), ramificado (por ejemplo, isopropilo, isobutilo, butilo terciario, neopentilo, etc.), cíclico (por ejemplo, ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo, metilciclopentilo, ciclohexilo, etc.) o multiciclico (por ejemplo, biciclo [2, 2, 1] heptano, espiro [2, 2]pentano, etc.). El radical alcano puede ser sustituido o insustituido. De manera similar, la porción alquilo de un grupo alcoxi o alcanoato tiene la misma definición que anteriormente. El término "alquenilo" se refiere a un hidrocarburo aciclico que contiene al menos un doble enlace carbono-carbono. El radical alqueno puede ser recto, ramificado, cíclico o multiciclico. El radical alqueno puede ser sustituido o insustituido. El término "alquinilo" se refiere a un hidrocarburo aciclico que contiene al menos un triple enlace carbono-carbono. El radical alquino puede ser recto o ramificado. El radical alquino puede ser sustituido o
insustituido. El término "arilo" se refiere a porciones aromáticas que tienen sistemas de anillos sencillos (por ejemplo, fenilo) o fusionados (por ejemplo, naftaleno, antraceno, fenantreno, etc.). Los grupos arilo pueden ser sustituidos o insustituidos. El término "heteroarilo" se refiere a porciones aromáticas que contienen al menos un heteroátomo dentro del sistema de anillos aromáticos (por ejemplo, pirrol, piridina, indol, tiofeno, furano, benzofurano, imidazol, pirimidina, purina, benzimidazol, quinolina etc.). La porción aromática puede consistir de un sistema de anillos sencillos o fusionados. Los grupos heteroarilo pueden ser sustituidos o insustituidos. Dentro del campo de la química orgánica y particularmente dentro del campo de la bioquímica orgánica, se entiende ampliamente que una sustitución significativa de los compuestos se tolera o inclusive es útil. En la presente invención, por ejemplo, el término grupo alquilo permite sustituyentes que sean un alquilo clásico, tal como metilo, etilo, propilo, hexilo, isooctilo, dodecilo, estearilo, etc. El término "grupo" comprende específicamente y permite sustituciones en alquilos que sean comunes en la técnica, tales como hidroxi, halógeno, alcoxi, carbonilo, ceto, éster, carbamato, etc., asi como también incluyendo la
porción alquilo no sustituida. Sin embargo, los experimentados en la técnica comprenden en general que los sustituyentes podrían seleccionarse a fin de no afectar adversamente las características farmacológicas del compuesto o interferir adversamente con el uso del medicamento. Los sustituyentes apropiados para cualesquiera de los grupos definidos anteriormente incluyen el alquilo, alquenilo, alquinilo, arilo, halo, hidroxi, alcoxi, ariloxi, mercapto, alquiltio, ariltio, monoalquilamino y dialquilamino, sales de amonio cuaternario, aminoalcoxi, hidroxialquilamino, aminoalquiltio, carbamilo, carbonilo, carboxi, glicolilo, glicilo, hidrazino, guanilo y combinaciones de los mismos.
EL MEJOR MODO PARA LLEVAR A CABO LA INVENCIÓN
Los caldos mixtos y de fermentación contienen cierto número de subproductos que son muy difíciles de separar del producto ciclopeptidico deseado. "Caldo mixto" se refiere a una mezcla de conversión en donde el caldo de fermentación se trata directamente con una enzima de desacilación, sin purificación, para producir el producto desacilado (por ejemplo, ECBN) . La cromatografía de líquidos de fase inversa se ha usado en el pasado con éxito razonable; sin embargo, la necesidad de compuestos con mayor
pureza demanda métodos de purificación más mejorados. Los solicitantes han descubierto que la separación de los subproductos de fermentación a partir del producto de fermentación deseado que contiene un grupo amino protonable, pueden mejorarse usando medios para cromatografía de fase inversa, en combinación con un esquema de elución continua, casi lineal, con ácido acético. Los medios cromatográficos, hidrofóbicos, apropiados, incluyen los sílices para fase inversa y polímeros orgánicos tales como copolimeros de estireno y divinilbenceno y polimero de metacrilato. Una variedad de sílices para fase inversa se encuentran disponibles comercialmente de vendedores tales como BTR, E. Merck, Eka Nobel, Millipore, Phenomenex, Whatman o YMC. Los sílices se derivan con hidrocarburos alquilicos de cadena recta que tengan una longitud que varié de 1 a 18 átomos de carbono (siendo los más comunes de 1 átomo de carbono, 4 átomos de carbono, 8 átomos de carbono y 18 átomos de carbono) u otros ligandos hidrofóbicos (por ejemplo, fenilo o ciano) . También se encuentra disponible comercialmente una variedad de resinas de estireno/divinilbenceno, diseñadas para cromatografía de líquidos de fase inversa, tales como las resinas DiaionMR HP y SP (disponible de Mitsubishi Chemical Industries Limited, Tokio, Japón) , y las resinas Amberlite XAD-2,4 y 16 (disponibles de Rohm and Haas Chemical Co . ,
Filadelfia, PA) y las resinas CG-161, 300 y 1000 Amberchrom de Toso Haas (Montgomeryville, PA) . Las resinas no funcionales se caracterizan generalmente por su volumen de poros (0.5-4.5 ml/g), área superficial especifica (200-800 m2/g) , diámetro del poro (40-1300 Á) , distribución del tamaño de poro y/o distribución del tamaño de perla. Las resinas no funcionales, preferidas, incluyen el Diaion HP-20 que tienen un área superficial de 500 m2/g, un tamaño de poro de 200-300 A y tamaño de partícula de 200-800 µm; la SP-825 que tiene un área superficial de 1,000 m2/g, tamaño de poro de 50-60 A y tamaño de partícula de 250-600 µm; SP-207 (versión bromada de HP-20) que tiene un área superficial de 630 m2/g, tamaño de poro de 100-200 Á y tamaño de partícula de 200-800 µm; y CG-161CD que tiene una área superficial de 900 m2/g, tamaño de poro de 110-175 Á y tamaño de partícula de 80-160 um. Las resinas más preferidas son las resinas HP-20 y SP-825. Inicialmente se proporciona una solución cruda o parcialmente purificada que contiene el compuesto peptidico, cíclico, deseado, que tenga al menos un grupo amino protonable. Generalmente, el grupo amino puede ser protonado durante el curso del gradiente con ácido acético que abarca el intervalo de pH de 5.5 a 2.5. Preferentemente el grupo amino es una amina primaria; sin embargo, el grupo amino puede ser una amina secundaria o amina terciaria,
siempre y cuando los sustituyentes adicionales en el átomo de nitrógeno no sean lo suficientemente hidrofóbicos, de manera tal que superen la polaridad de la amina cargada positivamente. La solución puede originarse a partir de un proceso de fermentación o de un proceso sintético. Por ejemplo, los compuestos peptidicos, cíclicos, se pueden preparar a través de los métodos de síntesis descritos en la Patente Norteamericana No. 5,696,084; J. Am. Chem. Soc . , 108, 6041 (1986); Evans, D. A., et al., J. Am. Chem. Soc , 109, 5151 (1987); J. Med. Chem. , 35, 2843 (1992); y Kurokawa, N., et al., Tetrahedron, 49, 6195 (1993). La solución cruda es usualmente un caldo mixto. Alternativamente el proceso se puede usar para purificar (o refinar) adicionalmente, material parcialmente purificado. Dependiendo del proceso de fermentación particular que se use, puede ser deseable filtrar previamente la solución para eliminar partículas que puedan interferir con el proceso cromatográfico. La filtración se puede llevar a cabo a través de cierto número de medios conocidos por los experimentados en la técnica, que incluyen la filtración por gravedad, filtración con vacio a través de un filtro cerámico que pueda o no incluir la ayuda de un filtro de CeliteMR etc. Los sólidos que se encuentran en el caldo de fermentación se pueden remover por centrifugación seguida de decantación del liquido de los sólidos.
La solución de fermentación se puede concentrar si se desea, usando una variedad de medios que son también conocidos por los experimentados en la técnica, tal como la concentración por evaporación, liofilización, etc. El concentrado se puede filtrar una segunda vez para remover cualquier precipitado que puede haberse formado durante el proceso de concentración. La solución cruda o parcialmente purificada se carga a una columna cromatográfica empacada con uno de los medios cromatográficos, hidrofóbicos, descritos anteriormente. El producto peptidico, cíclico, deseado, se eluye después con los medios cromatográficos usando un gradiente continuo, casi lineal, que varié desde aproximadamente de 0.1% de ácido acético hasta aproximadamente 10% de ácido acético, preferentemente desde aproximadamente 0.5% de ácido acético (pH = 5.5) hasta aproximadamente 4% de ácido acético (pH = 2.5). El extremo superior del intervalo de concentración de ácido acético, seleccionado, se basa en la estabilidad de los medios cromatográficos usados y en la estabilidad del compuesto que se purifique a ese pH. El extremo inferior del intervalo se selecciona en base al pH, en donde el grupo amino sea protonado y la concentración de ácido acético sea la requerida para eluir el producto de la superficie hidrofóbica. Los experimentados en la técnica apreciarán que
el gradiente no tiene que ser perfectamente lineal. Dentro del significado de "casi lineal" se incluye un gradiente convexo o cóncavo plano . Al final de la etapa del proceso de elución con gradiente, típicamente se usa un volumen adicional de la solución de ácido acético más concentrada, para finalizar la elución. Al finalizar el proceso, la columna se puede regenerar de manera tal que la columna pueda volverse a usar para ciclos de purificación adicionales. La etapa de regeneración involucra típicamente el lavado de la columna con mezclas de un solvente orgánico y agua, a un pH tanto neutro como alcalino, para remover cualesquiera materiales residuales que hayan quedado sobre la matriz de la columna. Los solventes apropiados incluyen el acetonitrilo, metanol, isopropanol y acetona. El esquema de elución lineal con ácido acético proporciona no únicamente buena selectividad (ver el Ejemplo 1 posterior), sino que también limita el uso de solventes orgánicos para la etapa de regeneración de la operación en colurana. De esta manera, se minimiza tanto la cantidad absoluta de solvente orgánico usado, como el volumen del efluente de la columna que debe tratarse antes de su desecho. El producto de fermentación se puede recuperar del eluato, usando una variedad de métodos. Los métodos de recuperación apropiados incluyen la cristalización,
concentración por evaporación y liofilización. El caldo de fermentación para la Equinocandina B contiene niveles variables de un subproducto de tripéptido-aldehido (Asn-Gln-Leu-H) que tiene la siguiente estructura química (la). El subproducto de tripéptido-aldehido sufre la desacilación asi como la Equinocandina B durante el proceso de desacilación enzimática, para formar el tripéptido-aldehido desacilado, correspondiente (Ib) .
(I)
en donde R es C (O) CH2CH (OH) C9H?9 (la-subproducto de fermentación) o un hidrógeno (Ib-subproducto de desacilación de un caldo mixto) . Sorprendentemente, el tiempo de retención del tripéptido-aldehido desacilado es muy similar al del ECBN en cromatografía de líquidos de fase inversa, inclusive bajo
condiciones de elución óptimas, haciendo asi muy dificil separar el tripéptido-aldehido desacilado (Ib) del ECBN. Si el tripéptido no se remueve, entonces el grupo amino libre del tripéptido compite con el grupo amino libre del compuesto ECBN durante el proceso de reacilación. Como un resultado, debe adicionarse un exceso del compuesto de acilación, para asegurar la acilación completa del compuesto ECBN. EL contaminante tripéptido no únicamente consume materiales de partida necesarios, sino que también produce un subproducto adiado que es dificil de remover en la purificación subsiguiente del compuesto ECB adiado. Preferentemente, el subproducto tripéptido se remueve antes de la reacilación del compuesto ECBN. El subproducto de tripéptido-aldehido puede removerse, ya sea de la mezcla de fermentación o del caldo mixto (es decir, la mezcla de desacilación) haciendo reaccionar el aldehido con un agente de derivación, antes de la purificación cromatográfica. El agente de derivación puede adicionarse a la funcionalidad aldehido para cambiar el tiempo de retención cromatográfico del tripéptido-aldehido, con relación al compuesto ECB deseado. Los agentes de derivación apropiados incluyen el bisulfito de sodio, hidroxilamina y clorhidrato de semicarbazida. Algunas ventajas de usar agentes de derivación, a diferencia de otros medios de modificación de los tiempos de retención
cromatográficos son la selectividad de los agentes de derivación para la' funcionalidad aldehido y las condiciones moderadas bajo las cuales ocurre la reacción. Si la reacción entre el agente de derivación y el tripéptido-aldehido es reversible, entonces, el aldehido se puede recuperar fácilmente removiendo el agente de derivación. El tripéptido recuperado puede usarse después para otro propósito.
EJEMPLOS
Las siguientes abreviaturas se usan a través de todos los ejemplos para representar los materiales listados, respectivos: ACN-acetonitrilo TFA- ácido trifluoroacético HP-20- resina de estireno/divinilbenceno, que tiene un área superficial de 500 m2/g, un tamaño de poro de 200-300 A y tamaño de partícula de 200-800 µm. SP-825- resina de estireno/divinilbenceno, que tiene un área superficial de 1,000 m2/g, tamaño de poro de 50-60 Á y tamaño de partícula de 250-600 µm. SP-207- resina de estireno bromado/divinilbenceno, que tiene un área superficial de 630 m2/g, tamaño de poro de 100-200 Á y tamaño de partícula de 200-800 µm.
CG-161CD - resina de estireno/divinilbenceno, que tiene un área superficial de 900 m2/g, un tamaño de poro de 110-175 A y tamaño de partícula de 80-160 µm.
Preparación Cromatográfica y procedimientos de purificación del ECBN:
Se usaron columnas de vidrio cuyo tamaño variaba de 0.2 a 5 litros. Las matrices cromatográficas estudiadas incluyeron la HP-20, SP-825 y SP-207 (todas disponibles de Mitsubishi) y CG-161 cd (disponible de Toso Haas) . Las matrices se lavaron por lotes con agua/ACN, 50/50, hidróxido de sodio 0.1 M. y finalmente con acetonitrilo puro (ACN) antes del empaque de la columna. La matriz de elección se empacó en la columna de tamaño apropiado usando técnicas simples de sedimentación de pasta liquida. Tamaños de columna menores que 1 litro se trabajaron usando instrumentación FPLC convencional (disponible de Pharmacia) . Los experimentos en columnas de cinco litros se llevaron a cabo utilizando un sistema controlador Waters Delta Prep 3000. Las mezclas de ECBN se clarificaron por filtración usando filtros Cuno 30S antes de cargarse a las columnas respectivas. Las columnas HP-20 y SP-825 se equilibraron previamente en ácido acético (HOAc) al 0.5%, se
ajustaron a un pH de 5.5 con hidróxido de sodio (NAOH), y se cargaron con la solución de ECBN clarificada. Las columnas HP-20 se cargaron a razón de aproximadamente 5 a 5.5 g de ECBN/litro de resina empacada, mientas que las columnas SP-825 se cargaron a razón de aproximadamente 11 a 12 g/litro. Después del cargado, las columnas se lavaron con cinco volúmenes de columna (CV) de la solución reguladora para equilibrar. El producto se eluyó usando un gradiente lineal continuo de 5 CV, que variaba de 0.5 % de HOAc (pH = 5.5) a 4 % de HOAc (pH =2.5). Al final del gradiente, se usaron, para finalizar la elución, 2 CV adicionales de la solución de HOAc al 4 %. Durante la elución del producto se recolectaron fracciones de 0.2 CV. Las fracciones se caracterizaron por una variedad de métodos de HPLC de fase inversa (RP-HPLC) , las fracciones apropiadas se combinaron para producir la recolección de la corriente principal. Las columnas se regeneraron lavando con una mezcla de ACN y agua, 60/40, de 3 CV, seguido de una mezcla de ACN y NaOH 0.1 M, 60/40, de 3 CV. Los flujos usados durante la operación fueron de 2 CV/hora (150 cm/hora) para la carga, lavado, regeneración y reequilibrio y 1 CV/hora (75 cm/hora) para la elución. Las recolecciones de la corriente principal se concentraron. Por comparación, las siguientes condiciones de la fase móvil (modificador orgánico y pH) y perfiles de
elución con gradiente, se estudiaron además del tipo de matriz . Modificador de ACN: los ejemplos 1-3 usaron un gradiente de ACN lineal de 5 CV (pH de 5.5 con una solución reguladora de acetatos) . Elución con Ácido Acético: además de las condiciones descritas anteriormente, la concentración del ácido acético se incrementó hasta 5 % (ejemplo 10) . También se compararon un gradiente escalonado y un gradiente convexo con el gradiente lineal, continuo, descrito anteriormente, tanto en las columnas HP-20 y SP-825 (Ejemplos 13-19) .
Caracterización analítica de muestras:
La cantidad y calidad de las muestras cromatográficas de ECBN se evaluaron usando los siguientes métodos analíticos. Sistema de fosfatos: una columna con partículas de 3.5 µm, Zorbox SB C-18 (0.46 cm de diámetro interno X 15 cm) , se eluyó con una fase móvil de ácido fosfórico al 0.2 %/ACN, con un flujo de 1.0 ml/min. La columna se trabajó a 40°C y el efluente se inspeccionó a 210 nm. La columna se equilibró en ACN al 1.0 % y después de la inyección de la muestra se usó un gradiente que variaba de 1 a 18.5 % de ACN durante 9 minutos para eluir el ECBN.
Después de la elución de lavó la columna con ACN al 50 % para eluir cualquiera de los componentes muy retenidos. Sistema de fosfatos/ácido octansulfónico (OSA) : Este sistema es similar al sistema de fosfatos analizado anteriormente, con la excepción de que la fase móvil contiene 30 mM de OSA. La columna se equilibró con ACN al 9 %. Después de que se inyectó la muestra, la elución del ECBN se llevó a cabo con un gradiente que variaba de 9 a 24% de ACN durante 9 minutos. La columna se lavó después con ACN al 50% para eluir los componentes muy retenidos. El flujo y la longitud de onda del detector, de la columna, fueron como anteriormente, mientras que la temperatura de la columna fue de 50°C. El sistema es particularmente útil para cuantificar el componente de tripéptido-aldehido, Asn-Gln-Leu-H. Sistema de TFA: Para el ensayo se usó una columna de 3.5 micrones, Vydac C-18 (0.46 x 25 cm) . La fase móvil contenia TFA al 0.1 % y la elución se llevó a cabo usando un gradiente lineal de ACN de 0 a 10 % durante 20 minutos, seguido de un lavado de la columna del 50 %. El flujo, temperatura y longitud de onda del detector, de la columna, fueron los mismos que para el sistema de fosfatos descrito anteriormente. El análisis de aminoácidos (AAA) se llevó a cabo también en muestras como un método alternativo para determinar el contenido de tripéptido. Las muestras se
hidrolizaron con ácido y los moles de Asn, Gln y Thr en el hidrolizado se determinaron por cromatografía de intercambio iónico y por derivación de ninhidrina. La recuperación de Thr se usó para determinar los moles de ECBN en la muestra, mientras que el contenido de Gln representó los niveles del tripéptido. El % en mol (%M) del tripéptido Asn-Gln-Leu-H versus el ECBN se calculó usando la siguiente ecuación: M% Asn-Gln-Leu-H = 2x [Gln] / [Thr] Se llevaron a cabo mediciones de la densidad óptica (OD) en muestras seleccionadas, a la longitud de onda especificada, para estimar la turbidez relativa de la muestra (OD a 550 nm) o contenido de proteina total (OD a 280 nm) . Los siguientes ejemplos se proporcionan para ilustrar pero no para limitar la invención reivindicada.
Ejemplo 1
El ejemplo 1 compara procesos cromatográficos de RP-HPL usando un esquema de elución con acetonitrilo, con un esquema de elución con ácido acético, en combinación con una variedad de resinas no funcionales. La Tabla 1 resume los resultados observados usando los esquemas de elución y los medios de columna, designados.
Tabla 1
Tabla 1 (Continuación)
Tabla 1 (Continuación)
Tabla 1 (Continuación)
En la tabla 1, *ejemplos Comparativos; hedido en gramos de ECBN por litro de resina; bimpureza de Desmetilo se refiere a una mezcla de dos compuestos ECBN en donde el grupo metilo está ausente en las unidades peptidicas de la treonina y la metilprolina, respectivamente. El esquema modificador (ACN) proporcionó buen rendimiento, pureza global y separación de los componentes de desmetilo; sin embargo, el acetonitrilo es un solvente orgánico. La tabla 1 muestra claramente que el ácido acético proporciona una alternativa para el esquema de elución tradicional con solventes orgánicos. Los datos muestran
también que un gradiente continuo de ácido acético aumenta significativamente la separación, al compararse, ya sea con un gradiente escalonado o con un gradiente convexo de ácido acético. Aun cuando el rendimiento del producto para el ejemplo 5 (gradiente lineal) es ligeramente menor y el volumen de la corriente principal es ligeramente mayor, comparado con el ejemplo 4 (gradiente escalonado), la pureza global de ECBN es superior (83% vs . 71%) y el contenido de desmetilo es menor (2% vs . 11%). Se cree que la elución del ECBN de la matriz hidrofóbica, usando el proceso de elución con ácido acético, se lleva a cabo en dos formas: (1) el ácido acético actúa como un modificador orgánico, incrementando por ello la fuerza de elución de la fase móvil; y (2) el menor pH del solvente B (solvente de elución fuerte, pH = 2.5) sirve para protonar la funcionalidad amina del ECBN, haciéndolo asi más polar y por lo tanto es menos retenido por la fase estacionaria hidrofóbica. Tanto el modificador orgánico como el pH que se afectan de la solución acética al 4% son evidentes al comparar los ejemplos 8 y 9. En el ejemplo 9, el ácido fosfórico 100 mM (pH = 2.5) se sustituyó por el HOAc al 4% (pH = 2.5) como el solvente B. Si la elución del ECBN fue dependiente únicamente del pH de la fase móvil, la posición de elución y recuperación del ECBN deberían ser similares a las observadas en el ejemplo 8. En efecto, la
elución con fosfatos dio por resultado una recuperación únicamente de aproximadamente 50% de ECBN y el pico del producto mostró un grado de prolongación de amortiguación de la señal, significativo. De esta manera, el HOAc al 4% puede llevar a cabo la elución, tanto haciendo descender el pH de la fase móvil como incrementando la fuerza de elución de la fase móvil, al actuar como un modificador orgánico. El ácido acético proporciona también mayor selectividad que el acetonitrilo. Cuando se comparan los cromatrogramas de RP-HPLC para las corrientes principales recolectadas de las columnas HP-20 eluidas con ACN versus HOAc (Ejemplos 1 y 5, respectivamente), se observó una ausencia de las impurezas del lado posterior en la corriente principal eluida usando HOAc. En el esquema de elución con HOAc estos componentes no se incluyen hasta que se regenera la columna.
Ejemplo 2
El ejemplo 2 compara los procesos cromatográficos usando un esquema de elución lineal con ácido acético, en una sola columna (descrito anteriormente) con un esquema de elución convexa con acetonitrilo, en dos columnas. Además se describe una comparación entre lotes de ECBN, no tratados (Ejemplos 2-8 y 2-10) con lotes de ECBN
tratados con metabisulfito de sodio, antes de la purificación en la columna (Ejemplos 2-7 y 2-9) . El pretratamiento con metabisulfito de sodio se llevó a cabo simplemente adicionando 10 mM de metabisulfito de sodio a la carga de la columna y permitiendo que la solución fuera agitada por un periodo de 6-18 horas. El proceso en una sola columna es el mismo descrito anteriormente, usando un esquema de elución con ácido acético, con gradiente lineal. El proceso comparativo en dos columnas usa dos columnas HP-20 que funcionan en una configuración guia-arrastre. Se carga un caldo de fermentación a las dos columnas HP-20 conectadas en serie. Cualquier cantidad de ECBN que no es retenida por la primera columna se concentra en la segunda columna. Se cree que el ECBN se distribuirá aproximadamente en iguales proporciones entre las dos columnas. Después de la carga, la columna guia se desconecta y lava con 3.8 volúmenes de columna (CV) de agua. La elución de la columna guia se lleva a cabo lavando con 3.3 CV de HOAc al 5%. La corriente principal de la primera columna se ajusta a un pH de 5.0 y se carga sobre la segunda columna (de arrastre) cargada parcialmente. La columna se lava con 6.3 CV de agua, antes de la elución. Se usa un gradiente convexo de acetonitrilo (0-9.4% sobre aproximadamente 5 CV que contienen HOAc al 5%) para eluir la columna. El efluente de la columna se fracciona y las fracciones que tienen la
pureza deseada (mayor que 75% de pureza en el pico principal por HPLC de fase inversa y menos de 10% del componente de desmetilo) se recolectan como la corriente principal. La solución recolectada se concentra posteriormente. La tabla 2 compara los resultados observados para la columna individual versus el proceso cromatográfico en dos columnas, y los caldos de fermentación de ECBN tratados versus no tratados.
En la tabla 2, los valores reportados
representan el promedio de dos cristalizaciones y determinaciones analíticas independientes; b% del pico principal versus el área total del pico de RP-HPLC; c% de impurezas de desmetilo; dECBN/OD = gramos de ECBN (RP-HPLC)/ gramos de OD totales; en donde gramos de OD es la OD a 280 nm y asumiendo E0.?. de 1.0; euno de los dos lotes tuvo alto contenido de agua; por lo tanto, se redujo la potencia promedio . Los resultados analíticos reportados anteriormente para la pureza del ECBN se obtuvieron después de que se hablan concentrado las corrientes principales. Tanto la pureza del pico principal de HPLC de fase inversa, como los niveles de desmetilo, son similares para los experimentos en una sola columna HP-20 y SP-825. Sin embargo, la operación en una sola columna HP-20 produjo consistentemente una reducción ligeramente mayor en el componente de desmetilo. En general, la pureza HPLC de fase inversa del ECBN, del proceso en una sola columna, es equivalente o mejor que la pureza del ECBN a partir del proceso en dos columnas, proporcionando asi un medio de purificación más económico. Ninguno de los esquemas de purificación en columna fueron capaces de reducir significativamente el nivel del tripéptido; sin embargo, el pretratamiento con bisulfito de sodio redujo significativamente la cantidad de
impurezas de tripéptido. La pureza ECBN/OD del producto, a partir de los estudios en una sola columna, fue equivalente o mayor que la obtenida en los estudios con dos columnas. Aunque el valor ECBN/OD no representa una medida de pureza absoluta, proporciona una buena comparación relativa de la pureza del ECBN, que resulta de operaciones en varias columnas. Todas las operaciones en columnas proporcionaron un incremento de 10 a 15 veces en la pureza del ECBN cuando los valores para las soluciones de carga a la columna (no se muestran los datos) se comparan con los de aquellas corrientes principales concentradas. Todas las referencias citadas aqui se incorporan en la presente. Aunque la invención precedente ha sido descrita con cierto detalle, a manera de ilustración y ejemplo, para los propósitos de claridad y comprensión, será evidente, para los experimentados en la técnica, que se pueden llevar a la practica ciertos cambios y modificaciones. Por lo tanto, no deberán considerarse la descripción y los ejemplos como limitativos del alcance de la invención, el cual se encuentra delineado por las reivindicaciones anexas. Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.
Claims (1)
1.
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US60/111,524 | 1998-12-09 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
MXPA01005688A true MXPA01005688A (es) | 2001-12-13 |
Family
ID=
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