CN101005859B - 灭病毒生物液体的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种对生物材料进行消毒的方法。具体而言，本发明涉及一种清除加入到生物材料中的去污剂和/或溶剂的新方法。本发明提供了一种安全有效和经济的方法，该方法通过疏水作用色谱清除病毒灭活汇集血浆中的杀病毒剂，即溶剂和去污剂。

Description

灭病毒生物液体的制备方法

相关申请的交叉引用

本申请要求2004年6月29日提交的申请号为No.695/MUM/2004的临时印度临时专利申请案的优先权。

技术领域

本发明涉及将杀病毒物质从生物样本中安全清除的方法。具体而言，本发明涉及将去污剂和/或溶剂从生物材料中清除的方法。

背景技术

人血浆是获得有价值蛋白质的来源。来源于人血浆的有治疗作用的蛋白质已被用于治疗多种疾病，包括原发性免疫缺陷(免疫球蛋白G)、危重病包括血容量减少(白蛋白)、伤口愈合(纤维蛋白原)和遗传性缺陷症如血友病A(因子VIII)、血友病B(因子IX)、冯维勒布兰德氏病(vWF)和由α-1蛋白酶抑制剂(AIPI)缺乏引起的先天性肺气肿。人全血浆除了可用作分离极有价值蛋白质的原材料外，它依然是凝血因子缺乏症患者的凝血因子替代疗法的主要来源。每年，人血浆及来源于其中的治疗性蛋白质可用于治疗全球约一百多万名患者。全球对该治疗法的需求显著高于当前的供应水平。

对需要全血浆治病的患者而言，该全血浆可以新鲜冷冻血浆形式或液体血浆形式提供。新鲜冷冻血浆(FFP)是从全血单位中分离得到、并在血液收集8小时内以单一供者血浆单位形式在-18℃或低于-18℃的温度下冷冻的血浆。液体血浆在血液收集4小时内于4-8℃下保存，并在血液收集48小时内与红细胞分离。这其中的每一种血浆单位均来自单一供者，并分别进行病毒标记测试，就病毒传播而言，单一供者被认为是安全的。但是，依然存在小量的但是确定的病毒传播的风险。因为这种血浆单位通常并不进行病毒灭活处理以杀死病毒如HIV、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒以及其它可能会潜在地引起疾病的知之甚少的病毒。

为得到治疗性蛋白质，从不同供者收集大量新鲜冷冻血浆单位。而从大量血浆库制造用于治疗用途的人血浆蛋白已经进行了50多年。但是，对单一供者或汇集的血浆最重要的关注之一是灭病毒。尽管在捐血或捐血浆前，对每个为血浆库捐血的供者分别进行了病毒测试，，包括HIV、HBV、HCV等，但是，由于“空窗期捐献”，依然存在被病毒感染的风险。该“空窗期捐献”是指获得感染之初到用现有诊断学发现测试阳性结果期间的捐献，这是由于固有技术的局限性造成的。即使是一名感染病原体的供者，在筛选后仍不不能被检测出被感染，可能污染整个血浆库，并感染很多或者所有暴露于该库的受血者。因此，有必要强调对汇集血浆或来源于其中的治疗性蛋白质灭病毒感染。

为使血浆或血浆来源治疗性蛋白质灭病毒感染，已尝试采用各种方法清除或灭活病毒。就病毒灭活而言，将有关生物液体进行物理处理如巴斯德灭菌，其中汇集血浆在约60℃的温度下湿热约10小时，或用干热处理，其间有关产品用80℃的较高温度下处理长达约72小时。在这种对生物样本能够有效灭活病毒的条件下，通常发现这些处理方法会损害、变性或改变有价值的蛋白因子，特别是不稳定凝血组分。在此灭活过程中，哺乳动物血浆的不稳定凝血组分会失活或变性，高达未处理血浆的50-90％或更多。在这些处理方法中可能丢失的凝血组分包括有价值的血浆因子如因子II、V、VII、VIII、IX、X、血浆纤维蛋白原(因子I)、IgM、血红蛋白、干扰素等。因此，已尝试使用适当的方法保护有关的蛋白质。

其它病毒灭活的方法包括用β-丙酸内酯、甲醛、次氯酸钠等处理。但是，一般认为这些方法并不安全。这些方法不仅使有价值的蛋白组分变性，还对完全清除试剂如β-丙酸内酯增加了难度，因为该物质有毒，可使动物致癌，甚至对处理它的人员是危险的。

对血浆或血浆来源蛋白质产品的病毒灭活最为通常采用的方法之一是溶剂去污剂处理方法。经溶剂去污剂处理的血浆已证明可用于治疗患有确定的凝血因子缺失症病人，并且该凝血因子尚无浓缩制剂，包括原发性单因子因子I、V、VII、XI和XIII缺失症和获得性多凝血因子缺失症；逆转华法林效应的患者、和治疗患血栓性血小板减少性紫癜(TTP)的患者。溶剂去污剂处理冷冻血浆(SDFP)的费用效益分析计算出每个质量调整寿命年(QALY)节省了$289,300的费用(Jackson et al.JAMA.1999；282：329)。溶剂去污剂处理方法对包膜病毒如水泡性口炎病毒(VSV)、伪狂犬病病毒(PRV)、塞姆利基森林病毒(SFV)和牛病毒性腹泻病毒(BVDV)尤其有效(Seitz et al.Biologicals，30(3)：197-205(9)(2002))。溶剂去污剂处理方法主要用于降低从供者捐献的病毒传播的新鲜冷冻血浆，在现在已知病毒感染的感染和血清反应阴性空窗期的风险，并且当前并不被认为具有输血安全性风险的脂包膜病毒()有充分理由在将来成为潜在风险。

在病毒灭活的溶剂去污剂处理方法中，含有蛋白质的组合物与磷酸二烷基酯或磷酸三烷基酯，优选磷酸三烷基酯的混合物相接触，然后通常在除去磷酸二烷基酯或磷酸三烷基酯之后与去污剂接触(参见美国专利No.4,540,573)。该“573”专利使用的磷酸二烷基酯或磷酸三烷基酯的量介于约0.01mg/ml和约100mg/l之间。根据“573”专利，所使用的去污剂的量介于约0.001％到约10％之间。类似地，美国专利No.4,314,997使用去污剂的浓度范围在0.25％和高至约10％之间。

另一种病毒灭活的去污剂方法是让血浆蛋白产品与非变性两亲化合物长时间接触(参见美国专利No.4,314,997)。两亲化合物可为阴离子型、阳离子型、非离子型去污剂。该去污剂分子一端疏水，另一端亲水，这使得它可用于纯化治疗性血液蛋白质。离子型去污剂，不管是阳离子型还是阴离子型，均比非离子型去污剂更有活性。尽管去污剂可有效破坏病毒，但是它们也易于破坏或损害活细胞。去污剂不仅能破坏病毒，还能破坏其它生活的基于脂质的结构如生物膜，该生物膜围绕并形成每一个动物细胞和植物细胞的重要的内部结构组分。另外，较高浓度的去污剂能损害和使存在于生物样本中和/或希望从生物样本中分离的蛋白质变性。将血浆、血浆来源的治疗性蛋白质、血浆冷沉淀物或血浆冷上清液与这种高浓度的去污剂一同培养，不仅会损害血浆成分，还会损害生物膜。另外，高浓度去污剂在静脉内注射时极其有害，因此这种去污剂处理血浆不适合注射。为避免对活细胞和蛋白的损害，可使用较低浓度的去污剂，但是要冒病毒灭活不能有效进行的风险。因此，为确保活细胞和蛋白不被损害，同时又能有效病毒灭活，清除去污剂非常必要。

通常采用的清除去污剂的方法包括亲和色谱法或离子交换色谱法。这些方法繁长耗时，并包括多个步骤。正如本领域的技术人员所理解的那样，每一个回收步骤通常伴随着所需蛋白质的丢失，因此产率较低。并且这些方法仅适用于作为终端产品的特定的蛋白因子而不适合全血浆。为将其应用于全血浆，需要在每种因子被成功分离和纯化之后重新构建血浆。在每一个步骤之后，就会损失一定的时间和产品，这将最终导致显著的总损耗。

在溶剂去污剂处理后，可通过采用选自如下的几个步骤去除去污剂：透析过滤、吸附在色谱支持物或亲和色谱支持物上、沉淀和冷冻干燥等。通常通过用甘氨酸和氯化钠沉淀蛋白质除去磷酸二烷基酯或磷酸三烷基酯(参见美国专利No.4,540,573)。由于与磷酸三烷基酯一起使用的非离子型去污剂是通过非增溶作用或冷冻干燥经透析过滤清除的，因此’573专利的方法特别耗时。本领域的技术人员认为这些方法繁琐、昂贵、耗时，并且/或者导致血浆重要成分的丢失。

另外，清除去污剂和溶剂可通过将蛋白质溶液分配到诸如蓖麻油或黄豆油的有机液体中进行。去污剂和溶剂被分配到有机液体中，并由此被除去。然后通过色谱法除去油性有机液体。该方法设计血浆的分配以及回收或更换色谱组分，这将非常繁琐、耗费时间并且费用昂贵。

另一种清除病毒灭活化学品和/或去污剂的方法是通过高盐析效应(参见美国专利No.5,817,765)。在这种方法中，根据霍夫迈斯特序列，浓度大于0.5 M、具有较高盐析效应的盐被加入血浆蛋白质水溶液以形成含有病毒灭活化学品和/或去污剂的囊泡。通过例如相分离或过滤法将该囊泡从水相中除去。但是，相分离技术，特别是针对囊泡的相分离技术是特别费劲、不精确和困难的，在大规模操作中会非常繁琐，因为有许多操作需要完成，如清洁、消毒、方法验证等。另外，从水溶液回收蛋白质的步骤将引起蛋白质最终产率的损失。残留在血浆产品中的任何微量盐也是不需要的，因为它不适用于大部分的治疗。

溶剂/去污剂的清除也可通过使用活性炭形式或药用碳形式的碳进行。例如，专利号为CN1371992的中国专利使用含有活性碳的固相材料作为从水溶液中清除用作病毒灭活剂的有机溶剂和/或去污剂的吸附剂。美国专利No.5,834,420采用在含有酸性pH的氨基酸溶液中对病毒灭活组分进行沉淀和过滤。优选地，该过滤步骤通过活性炭滤器进行，其中AKS-4和AKS-7最适合。但是，碳是一种非特异性吸附剂，在用于吸附病毒灭活剂和/或去污剂时，它也会从血浆中吸收一些所需的重要肽成分。碳的使用导致终产物缺乏这些有用成分。

美国专利No.6,610,316公开了通过结合到惰性基质上显示不溶性的“糖去污剂”。在’316专利中所描述的方法需要将去污剂结合到树脂上。另外，它还需要其它测试方法检查或确保去污剂的充分结合，以免去污剂泄漏到血液中。没有充分结合到树脂上的去污剂会污染血液产品，这使得它在所需使用中不安全。另外，’316专利中所公开的方法是针对血液或含有血细胞的水性液体，并且并未证明这种方法对血浆或血浆来源蛋白质的适用性。

基于上述原因，很显然用病毒灭活剂处理血浆或血浆衍生物以保证治疗的安全性势在必行。同时，通过将用于灭活病毒的杀病毒剂清除到临床应用所需可接受的水平，改善灭病毒血浆或血浆衍生物也是很重要的。但是针对上述方法存在的缺点，仍需要提供一种简单且可重复的方法，该方法不耗时和高产率，并且易于对包括血浆或血浆衍生物在内的改善灭病毒生物液体进行验证，对灭病毒生物液体的改善可通过简单有效的方法，在不显著影响血浆组成的条件下，将杀病毒剂如去污剂和溶剂清除到可接受水平。

发明内容

本发明提供一种通过将杀病毒剂清除到所需水平和/或可药用水平以改善灭病毒生物材料的方法，所述生物材料包括但不限于血浆、血浆来源蛋白质、血浆冷沉淀物、血浆冷上清液、血液产品和任何其它的生物液体。

本发明的另一个内容是提供了一种通过将杀病毒剂清除到所需水平和/或可药用水平以改善灭病毒生物材料的简单有效的仅含单一步骤的方法。

本发明还涉及一种通过将杀病毒剂清除到所需水平以改善灭病毒生物材料的方法，该方法基本不会损害血浆或生物液体中的不稳定成分。

本发明还涉及一项发明，该发明提供了通过将杀病毒剂清除到所需水平和/或可药用水平以改善灭病毒生物材料，并可应用到实验室规模的方法。

本发明还涉及一种通过清除杀病毒剂到所需水平和/或可药用水平以改善灭病毒生物材料的、适用商业大规模生产的方法。

本发明还涉及一种通过清除杀病毒剂到所需水平和/或可药用水平以改善灭病毒生物材料的方法，该方法易于验证并可重复。

本发明还涉及一种通过清除杀病毒剂到如官方药典专著中所建议的所需水平和/或药用水平，以改善灭病毒生物材料的方法，使得该生物液体可用于治疗性临床给药。

本发明还涉及一种通过采用适用于所述目的的手段，将杀病毒剂清除到所需水平和/或可药用水平以改善灭病毒生物材料的方法。

本发明还涉及一种通过将杀病毒剂清除到所需水平和/或可药用水平以改善灭病毒生物材料的方法，采用不会将杀病毒剂泄漏到产品溶液中，因而降低产品被该杀病毒剂污染的风险的手段进行。

本发明还涉及一种通过将杀病毒剂清除到所需水平和/或可药用水平以改善灭病毒生物材料的方法，该方法通过为实现所述目的可重复用于不同批次生物材料的手段进行。

本发明还涉及一种通过清除杀病毒试剂至所需水平和/或可药用水平以改善灭病毒生物材料的方法，通过不会明显地改变血浆或生物材料的组成，因而基本保持原有组成的手段进行。

附图说明

图1为处理5升一个批次的血浆的实施例流程图。

具体实施方式

本发明提供了从生物材料清除和/或灭活病毒污染物的新方法。

定义

在此，用于本发明目的的“灭病毒生物材料”是指任何已进行过病毒灭活处理的生物材料，如用溶剂和/或去污剂将病毒基本灭活的生物液体。当达到至少为“10的4次幂”的程度时，就实现了基本灭活，即病毒被灭活到由传染性研究所确定的程度，此时病毒以这样一个浓度存在于未处理血清：即使被稀释到10⁴，病毒活力也可被测量到。或者说，可通过某种方法实现基本灭活，当有10的6次幂(10⁶个传染单位)的病毒存在时，在处理结束后可回收到小于10的2次幂的病毒。

在此，用于本发明目的的“杀病毒剂”是指任何一种试剂，如溶剂、去污剂和/或其组合，它们具有将生物材料中的病毒，尤其是脂包裹或被膜的病毒基本灭活的能力。

在此，用于本发明目的的“清除”是指除去或减少杀病毒剂。

本发明涉及一种通过清除杀病毒剂到所需水平和/或可药用水平，将病毒污染物从生物材料中去除以形成灭病毒生物材料的新方法。

本发明涉及一种清除病毒灭活试剂的方法，该病毒灭活试剂用于抗脂包膜病毒，包括但不限于HIV、乙型肝炎病毒和丙型肝炎病毒以及其它病毒，包括但不限于巨细胞病毒、Epstein Bar病毒、乳酸脱氢酶升高病毒(如动脉炎病毒)、疱疹类病毒、杆状病毒、白血病病毒、粘液病毒、α病毒、虫媒病毒(B型)、副粘液病毒、沙粒病毒和冠状病毒。

在一项实施例中，根据本发明处理的生物材料包括但不限于血浆、血浆浓缩物、血浆来源蛋白质、血浆冷沉淀物、血浆上清液、疫苗、血液产品或任何这类生物液体。

在另一项实施例中，本方法用于处理血液的固体组分、裂解物或细胞分泌的蛋白质。因而还包括对如下物质的处理：血小板浓缩物、白细胞(白血球)浓缩物和不含白细胞的浓缩红细胞以及富含血小板的血浆浓缩物、血小板浓缩物和不含血小板的血浆，包括含有由浓缩红细胞上的白细胞组成的白细胞血沉棕黄层的浓缩细胞团，以及对粒细胞、单核细胞、干扰素和转移因子的浓缩物团块的处理。

在另一个实施方案中，该方法被用于灭活存在于正常细胞或癌细胞产品中的病毒。例如，通过相同处理方法，可以灭活存在于使用正常细胞或癌细胞、其渗出物、杂交瘤细胞生产得到的产品和基因剪接得到的产品中的病毒。用于生产所需产品的细胞可为哺乳动物以及非哺乳动物的细胞。

本发明的一项实施例提供了一种制备基本不含溶剂-去污剂的血浆并且基本不改变血浆的重要成分的方法。重要成分包括但不限于纤维蛋白原、因子VIII、备解素、IgG、IgM、IgA、β-脂蛋白、凝血酶原、纤溶酶原、纤溶酶抑制剂、凝血酶、同种凝集素、因子V、因子VII、因子IX、因子X、cerutoplasmin、α-和β-球蛋白、白蛋白、α-1-蛋白酶抑制剂、vWF、α-1脂蛋白、转移酶和甲状腺结合球蛋白。

对既用于需要凝血因子治疗的患者又作为治疗性蛋白质因子来源的汇集血浆，通常用杀病毒剂如溶剂去污剂进行处理，以灭活病毒，使该血浆安全用于临床应用上，或改进来自该血浆的凝血因子的安全性。但是考虑到溶剂去污剂的有害作用，需要将它们从灭病毒生物液体清除到可接受水平。终产品可接受的药用量，磷酸三正丁酯为小于2mcg/ml，Triton

-X 100为小于5mcg/ml。

本发明的一项实施例提供了一种将杀病毒剂清除到官方药典制定的所需水平和/或可药用水平，从而改善其临床性应用的方法。由美国食品和药品管理部颁布的指南可通过互联网在www.fda.gov/cber/guidelines.htm获得。本发明清除杀病毒剂的新方法简单快捷，仅包括一个步骤，它不同于迄今为止所公开的用于相同目的的方法。本发明方法的其它优点是方便验证并可重复。

本发明还用于制备灭病毒血浆、血浆浓缩物、血浆来源蛋白质、血浆冷沉淀物、血浆上清液、血液产品或任何这类已由杀病毒剂处理的生物液体，或者用于所述生物液体在经过病毒灭活处理之后，使其灭病毒。

为了灭活病毒，可用杀病毒剂如溶剂和/或去污剂处理生物液体。

可用作杀病毒剂的溶剂可选自磷酸二烷基酯、磷酸三烷基酯、或其组合，它们具有含1到10个碳原子的支链或直链、取代或未取代烷基基团。也可使用各种磷酸二烷基酯的混合物以及各种磷酸三烷基酯的混合物。磷酸二烷基酯和磷酸三烷基酯的混合物也在本发明的范围内。可使用的磷酸三烷基酯可选自烷基基团为正丁基、叔丁基、正己基、2-乙基己基和正癸基、或其组合的磷酸三烷基酯。优选的病毒灭活溶剂为磷酸三正丁酯(TNBP)。

可用作杀病毒剂的去污剂包括非离子型去污剂，如聚氧乙烯醚，如TRITON

，或聚氧乙烯山梨醇脂肪酸酯，如聚氧乙烯-(20)-山梨醇单月桂酸酯或聚氧乙烯-(20)-山梨醇单油酸酯，脱氧胆酸钠，被称为“磺基三甲铵乙内酯”的合成的两性离子

去污剂，如N-十二烷基-N，N-2-铵基-1-乙烷磺酸酯及其同源物，或非离子型去污剂如辛基-β-D-吡喃葡萄糖苷。一种适合的去污剂是TRITON

X-100。

病毒灭活处理包括将杀病毒剂即溶剂和去污剂加入到有关的水性溶液中。溶剂和去污剂的量根据待处理溶液的体积而确定。溶剂可使用高达约2％(重量比)的浓度。去污剂可加到高达约2％(重量比)的浓度。病毒灭活处理可在约4℃到约50℃下进行约1小时到约16小时。

根据本发明，对已由杀病毒剂进行病毒灭活处理的灭病毒生物液体进行一步清除杀病毒剂处理。本发明人意外地发现本发明所公开的单一步骤清除法能同时去除去污剂和溶剂。

在本发明的一项实施例中，诸如有机基质的材料被用于清除杀病毒剂。将生物液体与具有充分表面积的有机基质接触一定时间。杀病毒剂物理性地被吸附到有机基质的表面，并且对上清液的分离可获得杀病毒剂被清除到有效水平的生物液体。

清除杀病毒剂的方法可在实验室水平以及商业生产水平上成功应用。图1为制备清除杀病毒剂的方法的实施例。同时，该方法既可以批量模式进行，也可以过柱模式进行。

在本发明清除杀病毒剂方法的一项实施例中，以批量模式在容器中进行，其中含有病毒灭活处理后存留有杀病毒剂的灭病毒生物液体，经搅拌，在约10-40℃，优选18-30℃的下，以预定比率与有机基质接触约0.1小时到4小时，优选约0.15小时到约2小时。通过采用任何合适的技术如简单过滤、真空过滤、离心等技术除去有机基质，将上清液从有机基质中分离出来。物理性吸附到有机基质上的杀病毒剂从生物液体中的被清除到有效水平。

在本发明清除杀病毒剂方法的另一项实施例中，以过柱模式在预先装有有机基质的柱中进行，被杀病毒剂污染的生物液体流经该柱。将有关生物液体和有机树脂的接触时间调整在约0.1小时-4小时，优选约0.15小时-2小时。所使用的柱高为1-25cm，优选4-16cm，直径根据被处理的生物液体的体积进行调整。

用于清除杀病毒剂这个本发明的目的有机基质选自合成型聚合物，这些合成型聚合物为聚芳香族或甲基丙烯酸酯类的树脂，它们一般不会泄漏到被处理溶液中。用于本发明目的所需的聚芳香族树脂选自聚苯乙烯-二乙烯基苯共聚物一树脂，优选是具有较高表面积等级的树脂。聚苯乙烯-二乙烯基苯共聚物树脂可选自HP20、HP20 SS、SP 285等。甲基丙烯酸酯类树脂选自HP2MG、SP70、SP 207等。更进一步说，可实现本发明目的的任何其它具有充分吸附病毒灭活试剂能力的吸附基质都可使用。

回收和消毒处理之后，有机基质可重复使用于不同批次。树脂与有待处理的灭病毒生物液体的比率为1∶1到1∶40，优选在1∶2到1∶25，更优选在1∶3到1∶10。

通过清除杀病毒剂改善灭病毒生物液体的方法可有效用于来源于血浆的单组分蛋白质或单一单位新鲜冷冻血浆单位或汇集血浆的全血浆自身，它们可治疗凝血因子缺失、获得性多凝血因子缺失的患者，也可治疗需要逆转华法林效应、血小板减少、长凝血酶原时间、头损伤、关节出血、牙出血、硬膜下血肿、血尿、胃肠出血、腹腔出血等任何诸如此类病症的患者。

该方法在用于制备灭病毒血浆时并不改变血浆的重要组分。因此，根据本发明处理的血浆的组成几乎与原有血浆相同。因此，根据本发明的方法获得的改进了的灭病毒血浆具有较低水平的免疫原性，因为高度保守的蛋白质具有相当低的免疫原性，因此在治疗上更为有用。

本领域的技术人员应该理解，上述说明书旨在说明本发明的本质，而非限定，在不背离本发明的精神和性质的情况下可以具体形式体现本发明，并且各种修正和改变都在本发明的范围内。

将溶剂-去污剂从病毒灭活汇集血浆中去除在所给出的实施例中阐述，并且所收集的列表数据反映了筛选最为有益和优选的化合物的过程。

用以下述所的具体研究内容来说明本发明的方法，但并不表明限制本发明的范围。

实施例

下述实施例为本领域技术人员提供如何制作和使用本发明的完整公开和描述，无意于限制发明人所认为的范围，也无意于表示下述实验是所进行的全部和唯一的实验。虽然已努力确保所使用的数字(如量、温度等)的准确性，但难免有一些实验误差和偏差。如果没有特别指出，重量为份，分子量为重均分子量，温度为摄氏度，压力为大气压或近似大气压。

实施例1：实验内容：

步骤1：溶剂和去污剂的病毒灭活

从-20℃冰箱取出特定组次的供者血浆，在30℃水浴锅中融化，并进行测试。在解冻和经AP 25微孔过滤后收集血浆。

用溶剂磷酸三正丁酯(TNBP)和去污剂Triton X-100将该汇集血浆在30℃处理4小时。这种类型的去污剂和溶剂，众所周知用于灭活包膜病毒(包括HIV、HBV、HCV)。

用上述溶剂和去污剂进行的这种类型的病毒灭活已是熟知的方法(参见美国专利NO.4,540,573)。

步骤2：清除溶剂和去污剂

现有技术使用昂贵、耗时的方法将溶剂和去污剂从步骤1所获得的病毒灭活血浆中去除。与之不同的是，本发明的方法是通过合成聚合物使用疏水作用色谱进行的。

该合成聚合物选自聚苯乙烯类二乙烯共聚物。这些高度多孔性和疏水性的聚合物专门购自Mitsubishi Chemical Corporation(日本)，商品名为SEPABEADS

，有不同等级，如SP70、HS20 SS、SP 825、SP850、SP207等。(Itochu Chemicals America，Inc.，White Plains，New York)通过合成聚合物树脂清除溶剂去污剂

用常规方法活化和平衡树脂，如SP 825。

将1g树脂加入4ml溶剂去污剂处理的血浆中，即1∶4(w/v)，并在30℃轻微搅拌30分钟。使用软棉布分离树脂，并单独收集血浆。

然后将基本不含溶剂和去污剂的血浆流过深度滤板(Microfilt，India)，然后通过0.22μ滤器。

所获得的最终产品符合官方英国药典对汇集血浆病毒灭活产品的规定，其中可接受的上限Triton X-100是5ppm，磷酸三正丁酯是2ppm(参见英国药典，H.M.Printing Office，London)。

实施例2：树脂对去污剂和因子VIII水平的影响的分析

对不同比率的树脂和所得到的因子VIII含量及残留去污剂(ppm)的研究结果列在下表中：

表1：

树脂	比率	时间	温度	Triton(ppm)	因子VIII(IU/ml)
						血浆					0.9
HP20	1∶4	30min	4℃	44	0.82
						SP207	1∶6	30min	4℃	25	0.65
HP2MG	1∶8	30min	4℃	15	0.51
						SP70	1∶4	30min	4℃	5	0.72
SP825	1∶4	30min	4℃	6.16	0.82

已发现Triton在HP 20、SP 207和HP2 MG中超过了可接受限度。SP70和SP 825能更有效地将Triton清除到低于可接受限度5ppm。同时，SP 825树脂可有效除去去污剂，而且因子VIII的回收量很高，并且没有任何凝血因子的丢失/失活。

实施例3：采用SP 825树脂清除溶剂去污剂以及因于VIII水平的最优化 温度

对SP 825用于优化工艺参数如温度以及树脂与血浆比率已做了大量的研究。

表2：

树脂∶血浆(gm∶ml)	时间(min)	温度℃	因子VIII(IU/ml)	Triton(ppm)
					血浆			0.83	0
1∶4	30	30	0.83	3.7
					1∶4	30	4	0.74	6.1
1∶6	60	30	0.83	4.2
					1∶6	60	4	0.73	13.7

在30℃时，树脂与血浆之比为1∶4对因子VIII和Triton为可接受的结果。但在4℃时残留去污剂超过5ppm，并且因子VIII的回收较少。

因此，推测有效清除溶剂和去污剂的最优选温度是范围在20-30℃的室温。

实施例4：有效清除溶剂和去污剂的样本与树脂的最优化接触时间

为有效清除去污剂，研究血浆与SP 825树脂的不同接触时间间隔。

表3：

树脂∶血浆(gm∶ml)	温度℃	树脂接触时间(min)	残留Triton(ppm)
				1∶4	30	10	8
1∶4	30	20	6
				1∶4	30	30	0.45
1∶4	30	40	0.38

树脂和血浆比率为1∶4在30℃时，接触30-40分钟是清除溶剂去污剂的最佳条件。

实施例5：树脂对pH的影响的分析

如以下所提供的实验证据，树脂处理后的pH没有明显变化。

表4：

样本	树脂处理前的pH	树脂处理后的pH
			S-D血浆	6.7	6.8
S-D血浆	7.0	7.05
			S-D血浆	7.2	7.15

实施例6：过柱模式清除S-D

通过下述步骤研究树脂在过柱模式和批量模式中的性能。

1.称取10gm树脂并装入XK 16(Amersham Biosciences，GEHealthcare，UK)柱中。

2.称取10gm树脂并放入玻璃烧杯中。

3.将40ml溶剂去污剂(S-D)处理的血浆加入烧杯中的树脂用于批量模式。

4.在室温下将40ml S-D处理的血浆过柱。

5.用量筒检测流速，一般为2.5ml/min。

6.线流速为75cm/hr。

7.将S-D处理的血浆过柱5次，并在每次过柱时收集样本用于分析。

表5：

样本	模式	Triton ppm
			第1次过柱	柱	3.89

溶剂和去污剂可通过过柱模式被清除掉，流速为45-75cm/hr，优选为60cm/hr的线流速，温度为20-30℃。

实施例7：树脂的回收

每次运行之后，可通过下述方法回收树脂，该方法由制造商Mitsubishi在其Labion TM的数据表格中给出。

注射水清洗树脂两次以除去任何残留血浆。

然后用三倍体积的3％氢氧化钠溶液在缓慢搅拌的条件下，于25-30℃将树脂处理15分钟，然后缓缓倒出并用三倍体积水洗涤。

在将水完全除去之后，用三倍体积的80％异丙醇处理树脂，最后在室温下保存。

分析树脂样本在280nm处异丙醇和蛋白质的光密度。

该回收树脂只有在充分清洗、验证和调节许可后才可重复使用。

实施例8：5L中试的制备方法

该制备方法包括下述步骤，如图1流程图所示。

将从自愿供血者收集到的、在15小时内冷冻的血浆取出、汇集并在不超过35℃的温度下解冻。将该产物进行1.0μm过滤并转移到工艺舱中。通过加入0.3％TNBP和1％Triton X-100对所调节的汇集血浆进行病毒灭活。将该混合物在30±2℃下培养4小时。TNBP和Triton X-100通过如下方法被清除：在20-30℃用疏水作用色谱处理30min，然后进行深层过滤和0.22μm过滤。然后将该产物装入指定袋子中，标记并在-20℃保存。

使用上述树脂清除溶剂去污剂，实验室规模扩大到中试，表明该方法可应用到工业上，结果如下。

表6：

批次	血液组	体积(ml)	Triton(ppm)
				血浆	B+ve	100
1	B+ve	100	0.48
				2	B+ve	100	0.55
3	B+ve	100	0.53
				批次	血液组	体积(ml)	Triton(ppm)	TnBP(ppm)
血浆1	B+ve	1000
				1	B+ve	1000	1.24	低于可检测限度
血浆2	O+ve	1000
				2	O+ve	1000	0.59	0.44
血浆3	A+ve	1000
				3	A+ve	1000	0.81	低于可检测限度

实施例9：Triton和磷酸三正丁酯的分析方法

(a)用于残留Triton分析的样本制备：

在C-18固相萃取管柱用75％异丙醇(v/v)提取HIC树脂处理后的S-D处理血浆。通过在样本中加入已知量的Triton检测提取方法。几乎99％的Triton被回收。

(b)HPLC分析法：

将提取样本上样到C-8固相萃取管柱上并使用UV检测器在280nm处检测残留的Triton。

(c)用于磷酸三正丁酯分析的样本制备：

用己烷提取最终样本。加入乙醇以获得澄清上清。1μl上清液样本被用于气相色谱分析。通过加入已知量的TNBP检测该提取方法，回收量几乎为99％。

带有FID检测器的HP-5柱用于分析。检测温度为250℃。

对所得到的产物进行表征，发现与人冷冻血浆初始材料的生物化学相似。

该分析方法由Kaliappanadar等人报道，“Validation of a simpleand sensitive gas chromatographic method of analysis of Tri-n-butylphosphate from virally inactivated human Immunoglobulin″J.Chromatography B，757：181-189(1993)”。

产品说明书：

采用本发明方法获得的溶剂去污剂处理的汇集血浆产品，达到了英国药典的限度或规定。

测试	限度	第一批	第二批
				抗HIV1&2的抗体	无	无	无
HCV	无	无	无
				Hbs Ag	无	无	无
奥克特洛尼测验	人源	达标	达标
				渗透度	240mosmol/kg	达标	达标
柠檬酸盐	25mmol/L	13.075	11.10
				钙	5mmol/L	1.35	1.27
钾	5mmol/L	0.09	0.115
				钠	200mmol/L	163	123.9
热原	兔测试	达标	达标
				无菌度	应该通过	可通过	-可通过
TNBP	2ppm	0	0.44
				Triton	5ppm	1.2	0.59
SDS-Page	相同条带	达标	达标
				血球凝集素A&B	组特异性	B	0
pH	6.5-7.6	6.9	7.3
				谢尔达尔法测定的总蛋白	最小值，45gm/L	56	57.75
活化凝血因子	≥150sec	153s	155s
				甲肝病毒Ab	最小值，2IU/ml	达标	达标
不规则红细胞	无	达标	达标
				因子VIII	≥0.5IU/ml	0.623	0.712
因子V	≥0.5IU/ml	0.98	1.02

本说明书中所引用的所有公开出版物和专利申请在此作为本发明的参考，每一篇公开出版物或专利申请被专门地和分别地援引，作为本发明的参考。

尽管用解释和实施例的方式对上述发明进行了某些详细的描述，但是本领域技术人员都明白，根据本发明的教导，对本发明做某些修正或改变是可行的，但都没有背离所附权利要求的精神或范围。

Claims (13)

1.一种制备病毒灭活血浆的方法，包括：

提供被怀疑含有病毒的血浆；

将所述血浆与一定量的溶剂-去污剂在足以基本灭活病毒的条件下相接触；和

用合成聚合物在20℃-30℃单一步骤处理10-60分钟，从而清除血浆中的溶剂-去污剂，

其中所述溶剂为选自由正丁基、叔丁基、正己基、2-乙基己基和正癸基组成的烷基组的磷酸三烷基酯，所述去污剂选自聚氧乙烯醚；所述合成聚合物为聚苯乙烯类二乙烯基苯共聚物；所述合成聚合物与溶剂去污剂处理的血浆的比率为1∶1-1∶8，所述比率为w/v。

2.根据权利要求1所述的方法，其中从溶剂-去污剂病毒灭活血浆中清除溶剂和去污剂，包括：

在能基本清除溶剂和去污剂的条件下，将溶剂-去污剂病毒灭活血浆用含所述合成聚合物的疏水作用色谱处理。

3.根据权利要求1所述的方法，其中所述溶剂为磷酸三正丁酯，去污剂为

X-100。

4.根据权利要求1所述的方法，其中所述聚苯乙烯类二乙烯基苯共聚物选自HP 20、HP20SS和SP 285组成的组。

5.根据权利要求4所述的方法，其中所述聚苯乙烯类二乙烯基苯共聚物是SP 285。

6.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述合成聚合物与溶剂-去污剂处理的血浆的比率为1∶4-1∶6。

7.根据权利要求1所述的方法，其中所述病毒灭活血浆用合成聚合物处理30分钟。

8.根据权利要求1或2所述的方法，其中该方法用于中试规模或用于工业规模。

9.根据权利要求1或2所述的方法，其中合成聚合物在使用后回收。

10.根据权利要求1或2所述的方法，其中所得血浆基本不含溶剂-去污剂，血浆组成中的重要组分基本没有改变。

11.制备灭病毒生物材料的方法，其包括：

提供被怀疑含有病毒的生物材料；

将所述生物材料与一定量的溶剂-去污剂在足以基本灭活病毒的条件下相接触；和

用合成聚合物在20℃-30℃单一步骤处理10-60分钟，从而清除生物材料中的溶剂-去污剂，

其中所述溶剂为选自由正丁基、叔丁基、正己基、2-乙基己基和正癸基组成的烷基组的磷酸三烷基酯，所述去污剂选自聚氧乙烯醚；所述合成聚合物为聚苯乙烯类二乙烯基苯共聚物；所述合成聚合物与溶剂-去污剂处理的生物材料的比率为1∶1-1∶40，所述比率为w/v，

其中所述生物材料选自如下组成的组：

血浆、血浆浓缩物、血浆来源蛋白、血浆冷沉淀物、血浆上清液、疫苗、血液产品、血清、生物液体、血液的固体组分、裂解物、细胞分泌的蛋白质、血小板浓缩物、白细胞(白血球)浓缩物、不含白细胞的压积红细胞、富含血小板的血浆、血小板浓缩物、不含血小板的血浆、由压积红细胞上的白细胞组成的白细胞血沉棕黄层的压积细胞团，以及含有一种或多种粒细胞、单核细胞、干扰素和转移因子的浓缩物的团块。

12.根据权利要求1或2所述的方法，其用于制备溶剂-去污剂被清除的病毒灭活血浆。

13.根据权利要求12所述的方法，其中所述病毒为包膜病毒。