JPH02198561A - 疎水相互作用クロマトグラフィーを用いて不安定な生体物質混合物から加工用化学物質を除去する方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は、疎水相互作用クロマトグラフィーを用いて不
安定な生体材料混合物から加工用化学物質を除去する方
法に関する。更に特定すれば、本発明は、例えば血漿、
その低温沈澱物、および血漿由来の治療用製剤中のウィ
ルスの不活化に用いられる化学物質など、脂溶性の加工
用化学物質の除去に関する。

［従来の技術］ 血液には、Ｂ型肝炎ウィルス（ＨＢＶ）、非Ａ非Ｂ肝炎
ウィルス（ＮＡＮＢＨＶ）　、シトメガロウイルス、お
よび免疫不全症ウィルスなど、またそれ以外にも何種類
かの異なるウィルスが、それぞれ含まれていることがあ
る。血液産物を製剤化する過程において、また、血液お
よびその分画を治療に適用する前には、これらのウィル
スを不活化しておくことが強く望まれる。咄乳類の血液
およびその分画中のＨＢＶのようなウィルスの不活化に
は、物理的方法（加熱、放射線照射など）、および化学
的方法（アルデヒド、有機溶媒、洗浄剤など）の両者が
用いられている。不活化によって、ウィルスは伝染性と
病原性とを失うのである。

補乳類、特にヒトの血漿中の、Ｂ型肝炎ウィルス（ＨＢ
Ｖ）のようなウィルスを不活化するために、多数の試み
がなされている。ある国々で実施されているのは、Ｂ型
肝炎ウィルスの蛋白質部分と架橋形成し、あるいはこの
ウィルスの核酸と作用し合う、ウィルス不活化剤に血漿
を接触させることによって、血漿中のＢ型肝炎ウィルス
を不活化することである。例えば、Ｂ型肝炎ウィルスは
、ホルムアルデヒドのようなアルデヒドとの接触によっ
て不活化されることが知られている。

ウィルス不活化の方法としては、界面活性剤を加えた脂
質溶媒を用いる方法〔プリンス（Ａ、Ｍ。

Ｐｒ１ｎｃｅ）　、ホロヴイツツ（Ｂ、Ｈｏｒｏｗｉｔ
ｚ）　、ブロードマン（Ｂ、　Ｂｒｏｔｍａｎ　）　、
ら：「トウィーン８０およびエーテルとの接触によるＢ
型肝炎ウィルス、および非Ａ非Ｂ肝炎ウィルスのハッチ
ンソン株の不活化（Ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ　ｏｆ　
Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ　Ｂ　ａｎｄＨｕｔｓｃｈｉｎｓｏ
ｎ　　５ｔｒａｉｎ　　ｎｏｎ−Ａ、　　ｎｏｎ−Ｂ　
　ＨｅｐａｔｉｔｉｓＶｉｒｕｓｅｓ　ｂｙ　Ｅｘｐｏ
ｓｕｒｅ　ｔｏ　Ｔｗｅｅｎ　８０　ａｎｄ　Ｅｔｈｅ
ｒｌＪ。

ボックス・サンギニス（Ｖｏｘ　Ｓａｎｇｕｉｎｉｓ）
　、第４６巻（１９８４年）３６〜４３ページニブリン
ス、ホロヴイッッ、およびブロードマン＝「トリ（ｎ−
ブチル）燐酸塩およびコール酸ナトリウムとの接触によ
る肝炎ウィルスおよびＨＴＬＶ−ＩＩ［ウィルスの殺菌
（５ｔｅｒｉｌＬｓａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｈｅｐａｔｉｔ
ｉｓａｎｄ　ＩＩＴＬＶ−ｍ　　Ｖｉｒｕｓｅｓ　ｂｙ
　Ｅｘｐｏｓｕｒｅ　ｔｏ　Ｔｒｉ（ｎ−Ｂｕｔｙｌ　
）　Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ　ａｎｄ　Ｓｏｄｉｕｍ　Ｃｈ
ｏｌａｔｅ　）Ｊ、ザ・ランセット（Ｔｈｅ　Ｌａｎｃ
ｅｔ　）　、１９８６年３月２９日号、７０６〜７）０
ページＪ、および、界面活性剤を加えずに脂質溶媒を用
いる方法〔ファインストーン（Ｓ、Ｍ、Ｆｅ１ｎｓｔｏ
ｎｅ　ｌ、ミハリク（Ｋ。

Ｂ、賛１ｈａｌｉｋ　）　、上材ら＝［クロロホルムに
よるＢ型肝炎ウィルスおよび非Ａ非Ｂ肝炎ウィルスの不
活化（Ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｈｅｐａｔｉ
ｔｉｓ　Ｂ　Ｖｉｒｕｓ　ａｎｄｎｏｎ−Ａ、　ｎｏｎ
−Ｂ　　Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ　ｂｙ　Ｃｈｌｏｒｏｆｏ
ｒｍ　）Ｊ、インフェクション・アンド・イミユニティ
−（Ｉｎｆｅｃｔ、　Ｉｍｍｕｎ、　）　、第４１巻（
１９８３年）８１６〜８２１ベージ；ブラッドレ−（Ｄ
Ｊ。

Ｂｒａｄｌｅｙ　）　、メイナード（Ｊ、Ｅ、Ｍａｙｎ
ａｒｄ）　、ポツパー（Ｉｌ、Ｐｏｐｐｅｒ　）ら：［
輸血後の非Ａ非Ｂ肝炎：別個の２剤の生理化学的特性（
Ｐｏ５ｔｔｒａｎｓｆｕ−ｓｉｏｎ　　　ｎｏｎ−Ａ、
　　ｎｏｎ−Ｂ　　　１ｌｅｐａｔｉｔｉｓ　　：　　
　Ｐｈｙｓｉａ−ｃｈｅｍｉｃａｌ　　Ｐｒｏｐｅｒｔ
ｉｅｓ　　ｏｆ　　Ｔｗｏ　　ＤｉｓｔｉｎｃｔＡｇｅ
ｎｔｓｌ　Ｊ、ジャーナル・才ブ・インフエクシャス・
ディジージズ（Ｊ、Ｉｎｆｅｃｔ、Ｄｉｓ、）　、第１
４８巻（１９８３年）２５４〜２６５ページ］がある。

その内容全体が参照文献として本明細書に取り入れられ
ている、米国特許第４．４８１．１８９号明細書および
第４．５４０．５７３号明細書には、有機溶媒と洗浄剤
とを対合させて用いることによって、血漿および血漿産
物に含まれ、あるいはこれに加えられた肝炎ウィルス、
その他の特定ウィルスの伝染力が、数桁程度減少すると
の記載がある。そのような対合の例としては、有機溶媒
としてトリーローブチル燐酸塩（ＴＮＢＰ）　、および
、非イオン性洗浄剤としてトリトン（ＴＲＩＴＯＮ）Ｘ
−１００があげられる。

適切な温度および接触時間の条件下での溶媒および洗浄
剤を用いた処理は、脂質と結合した外皮蛋白質を有する
ウィルスを効果的に分解し、しかも、感受性に富む血漿
蛋白質分子の高次構造および生物学的活性に対して及ぼ
す影響は無視し得る程である。有機溶媒および洗浄剤の
双方の存在によって、ウィルスを分解し、減毒する上で
のそれぞれの独立した作用を強化することができる。ウ
ィルスを不活化するために血液に適用される薬剤として
は、他にもメロシアニン、βプロピオラクトン、および
シスプラチンが存在するが、不活化は外皮の破断以外の
機構によってなされる。

有機溶媒、洗浄剤、その他のウィルス不活化剤のうちの
特定の物質に対して、ヒト、あるいはその他の１例えば
組織培養など、その物質が用いられる生物学的な系の耐
容性が不充分な場合は、生物学的産物からこれを除去す
る必要がある。血液凝固■因子のような血漿蛋白質の純
化、あるいは、これらの蛋白質混合物の選択的分離に際
しては、しばしば精製過程によって、ウィルス不活化剤
からの所望の産物の分離が促進される。したがって、所
望の蛋白質を沈澱させ、あるいは、産物に特異的な固定
化リガンドを用いて積極的にこれを吸着すれば、残存す
る薬剤の大部分を洗い流せるようにすることによって、
しばしばその濃度を「耐容可能な」までに減少させるこ
とが可能となる。

膜・蛋白質複合体から脂質・洗浄剤ミセルを除去するの
に用いられる別な方法を、血漿産物その他の生物学的産
物からのそれらの除去に応用することもできる。これら
は、分子の大きさ、浮遊密度、電荷、結合親和力、相分
配、および溶媒分配の差異に基づいて行われる〔ヘレニ
ウス（Ａ。

Ｈｅ１ｅｎｉｕｓ）およびサイナス（に、５ｉｎｏｕｓ
　）　　：　ｒ洗浄剤を用いた膜の溶解（５ｏｌｕｂｉ
ｌｉｚａｔｉｏｎ　　ｏｆＭｅＬＩｌｂｒａｎｅｓ　ｂ
ｙ　Ｄｅｔｅｒｇｅｎｔｓ　ＩＪ、ビオキミカーエト・
ビオフィジ力・アクタ（Ｂｉｏｃｈｉｍ、　Ｂｉｏｐｈ
ｙｓ。

Ａｃｔａ　ｌ、第４１５巻（１９７５年）２９〜７９ペ
ージ】。

全血漿、血清、低温析出後の血漿、あるいは低温沈澱物
を輸血に直接用いる場合は、ウィルス殺菌のための有機
溶媒および洗浄剤による方法は実施されない。これらの
物質の調製に際しては、分画、純化、あるいは精製の段
階が含まれないので、上記の方法による不活化側除去を
行う適当な機会がないからである。更に、製剤の組成お
よび生物学的活性が実質的に損なわれないようにする必
要性からも、効果的な除去方法が強く要請される。

ウィルス滅菌済みの血漿、および低温沈澱物の調製に際
しては、処理後に血漿を濾過して、不安定な蛋白質およ
び生物学的活性を失うことなく無菌性を維持するという
困難が別に存在する。

このように、ウィルス滅菌の手法が全血漿その他に対し
ては適用されないという理由で、輸血の際のウィルス感
染の危険性は、Ｂ型肝炎については０．０５％、非Ａ非
Ｂ肝炎については３％も存在するものと推定されている
。

生体材料混合物には、生合成を刺激し、これに含まれる
ウィルスを不活化し、かつ、混合物中に存在する所望の
成分を安定化し、あるいは純化するだめに、しばしば外
部から化学物質を添加することがある。所望の成分の構
造および機能には影響を及ぼすことなく、これらの化学
物質を除去することが望ましい。例えば、細胞培養にお
いては、所望するある種の生物学的産物の合成は、培養
液にホルボールエステルを加えることによって誘導、あ
るいは促進することができる。例えば、メゼレイン（ｍ
ｅｚｅｒｅｉｎ　）は、培養白血球によるγインターフ
エロン生産の誘導に［イップ（Ｙ。

Ｈ，Ｙｉｐ　）　、パン（Ｒ，Ｈ，Ｌ、Ｐａｎｇ　）　
、オッペンハイム（Ｊ、０．０ｐｐｅｎｈｅｉｍ）　、
ナシユバ−（Ｍ、Ｓ。

Ｎａ５ｈｂａｒ　）　、ヘンリフセン（Ｄ、Ｈｅｎｒｉ
ｋｓｅｎ）、ツェレベツキーーエックハルト（Ｔ、Ｚｅ
ｒｅｂｅｃｋｙｊ−Ｅｃｋｈａｒｄｔ）およびヴイルチ
ェク（Ｊ、Ｖｉｌｃｅｋ　）　　：「ジテルペンエステ
ルによるヒトγインターフエロン生産の刺激（Ｓｔｉｍ
ｕｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｌｌｕｍａｎ　ＧａｍｍａＩｎ
ｔｅｒｆｅｒｏｎ　Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　ＩＪ、イン
フエクション０アンド・イミユニティ−１第３９巻（１
９８１年）１３１−１３９ページ］、あるいは、腫瘍壊
死因子の生産細胞によるその分泌の促進に〔ウィリアム
スン（Ｂ、Ｄ、Ｗｉｌｌｉａｍｓｏｎ　）　、カーズウ
ェル（Ｅ、Ａ、Ｃａｒｓｗｅｌｌ）　、ルピン（Ｂ、Ｙ
、Ｒｕｂｉｎ）　、ブレンダガスト（Ｊ、Ｓ、Ｐｒｅｎ
ｄｅｒｇａｓｔ）　、およびオールド（Ｈ，Ｊ、０１ｄ
）　　：　ｒヒトＢ細胞の細胞系によって生産されるヒ
ト腫瘍壊死因子：ヒトインターフェロンとの相乗的細胞
障害性相互作用（ＨｕｍａｎＴｕｍｏｒ　Ｎｅｃｒｏｓ
ｉｓ　Ｆａｃｔｏｒ　Ｐｒｏｄｕｃｅｄ　ｂｙ　Ｈｕｍ
ａｎ　　Ｂ−ｃｅｌｌｓ　Ｌｉｎｅｓ　　：　　Ｓｙｎ
ｅｒｇｉｓｔｉｃ　ＣｙｔｏｔｏｘｉｃＩｎｔｅｒａｃ
ｔｉｏｎ　ｗｉｔｈ　Ｈｕｍａｎ　Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏ
ｎ　ＩＪ、プロシーデインゲス・オブ・ナショナル・ア
カデミ−・オブ・サイエンセズ・オブ・ザ・ユナイテド
・ステープ・オブ・アメリカ（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ、　
Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ、ＵＳＡ）、第８０巻（１９８３年）５．３９７
〜５．４０１ページ］用いられることがある。

ホルボールエステルには発癌性があるので、リンホカイ
ン製剤からは、これをヒトに用いる前にこれらの化合物
を除去しなければならない。従来、ホルボールエステル
は、沈澱、クロマトグラフィー、あるいは分子排除を用
いた処理法によって除去されてきた〔ルピン、アンダー
ソン（Ｓ。

Ｌ、Ａｎｄｅｒｓｏｎ　ｌ、サリパン（Ｓ、Ａ、５ｕｌ
ｌｉｖａｎ　）　、ウィリアムスン、カーズウェル、オ
ールド（Ｌ、Ｊ。

０１ｄｌ　、ｒ　Ｌｕｋ　　ＩＩなる細胞由来のヒト腫
瘍壊死因子の純化と特性記述（Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏ
ｎ　　ａｎｄＣｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ　　ｏ
ｆ　　ａ　　Ｈｕｍａｎ　　Ｔｕ＋ａｏｒ　　Ｎｅｃｒ
ｏｓｉｓＦａｃｔｏｒ　ｆｒｏｍ　ｔｈｅ　Ｌｕｋ　Ｉ
［（：ｅｌｌ　Ｌｉｎｅ）　、プロシーデインゲス・オ
プ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンセズ・オ
ブ・ザ・ユナイテド・ステーゾ・オブ・アメリカ、第８
２巻（１９８５年）６、６３７〜６．６４１ベージ１゜ 例えば大豆油のような植物油を用いた抽出によって、生
体材料の複雑な混合物からＴＮＢＰその他の脂溶性の加
工用化学物質を除去する方法が。

１９８６年３月３１日付は米国特許出願第８４６゜３７
４号に記載されている。洗浄剤は、この方法によっては
ほとんど除去されない。

長鎖アルコール、あるいはハロゲン化エステルを用いた
抽出によって、ＴＮＢＰ、洗浄剤その他の脂溶性化学物
質を除去する同様な方法は、１９８７年１２月３０日に
出願して係属中の米国特許出願第０７／１３９．５０２
号出願書に記載されている。この方法の短所は、高価ま
たは有害な化学物質が必要なこと、また、何らかの残存
抽出剤を耐容可能な濃度にまで下げるためには、必要な
段階を追加しなければならないことである。できればＴ
ＮＢＰおよび洗浄剤を効果的に除去し、このような問題
を起こさないような代替え方法が望ましい。

疎水相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）は、生化学
者が会得している分子分離手法の中でも一般的に用いら
れる方法である。ＨＩＣの原理に関する説明は、ヒエル
チン（Ｓ、Ｈｊｅｒｔｅｎ　　）による「疎水相互作用
クロマトグラフィーの一般的様相のい（つか（Ｓｏｍｅ
　Ｇｅｎｅｒａｌ　Ａｓｐｅｃｔｓ　ｏｆＨｙｄｒｏｐ
ｈｏｂｉＣＩｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ　Ｃｈｒｏｍａｔｏ
ｇｒａｐｈｙ　１〕〔ジャーナル・オブ・クロマトグラ
フィー（Ｊ。

Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）　、第８７巻（１９７
３年）３２５〜３３１ページ］においてなされている。

簡単に述べると、不活性マトリックスに結合したアルキ
ル鎖のような脂質様の部分を用い、相互の親和力を利用
して、圧似した疎水性領域を含む分子を水溶液から分画
するのである。アルキル鎖の長さは、炭素数で２〜２４
の範囲にわたり、直鎖または側鎖を有し、かつ、フェニ
ル環のような他の疎水基を含み、またはこれを末端に有
していてもよい、鎖の長さが増大すると、媒質の疎水性
も増大することになる。

実施に際しては、疎水的相互作用の強さは、溶媒のイオ
ン強度、ｐＨ、および極性によっても影響される。例え
ば、溶媒中に高濃度（すなわち４モルの）硫酸アンモニ
ウムが存在すると、樹脂と溶質蛋白質の疎水性領域との
間の疎水的相互作用が、したがってまた結合が強まる。

吸収の後、よりイオン強度が低く、カオトロピックイオ
ンが含まれる緩衝液、または、それとともにエチレング
リコールや洗浄剤のような極性を低下させる添加剤を用
いて、蛋白質を樹脂から溶出させることができる。厳密
に疎水性によって反応する樹脂に加え、疎水性とイオン
相互作用との組み合わせを介して作用するアミノヘキシ
ル・セファローズ（５ｅｐｈａｒｏｓｅｌ　［ニューシ
ャーシー州ビス力タウエー所在エル・ケー・ビー／ファ
ルマシア（ＬＫＢ／　Ｐｈａｒ＋ｗａｃｉａ　）社製］
のような材料もあり、これは、活性を有する官能基とし
ての６員アルキル鎖の末端でアミノ基１個を取り込むの
である。これらの方法を用いて純化されている数多くの
血漿蛋白質の中には、アルブミン、トランスフェリン、
チログロブリン、乳酸デヒドロゲナーゼ、βリポ蛋白質
、凝固因子、免疫グロブリンなどがある。

ＨＩＣ媒質の調整の際に疎水基と結合させられる不活性
マトリックスは、アガロースのような多糖類、あるいは
、シリカその他の高分子で構成することができる。アガ
ロースを基本とする媒質は比較的軟らかいので、典型的
なりロマトグラフイー系においては流速を遅くする必要
があり、分離過程が長引くことになる。シリカを基本と
する媒質は圧縮性がな（、典型的には高圧クロマトグラ
フィーに用いられるが、比較的速い、流速で低圧系にお
いて用いることもできる。

ＨＩＣは、−数的には、生体材料の複雑な混合液から蛋
白質、ホルモン、その他の生体分子を単離するのに用い
られるが、幕を分解するのに洗浄剤が用いられる、ある
種の生物学的標本から洗浄剤を除去するにも利用されて
いる０例えば、ラット脳のホモジネートからトリトンｘ
−ｔｏｏ、蛋白質、塩類、その他の干渉化合物を除去し
て、組織抽出物中のイノシトールの測定を容易にするこ
とを目的として、イオン交換カラムやカートリッジに充
填された炭素数１８のＨＩＣ媒質〔セブバック（５ｅｐ
−Ｐａｋ）　、マサチューセッツ州ミルフォード所在つ
ォーターズ・アソシエーツ（ＷａｔｅｒｓＡｓｓｏｃｉ
ａｔｅｓ）社製］が用いられている［ローセン（３，Ｅ
、１ａｕｒｓｅｎｌ、ナル（Ｈ，Ｒ，にｎｕｌｌ）　、
ベルクナップ（Ｊ、に、Ｂｅ１ｋｎａｐｌ　　：　ｒイ
ノシトール測定用試料の作成：洗浄剤除去におけるセブ
パックＣ１８の利用（Ｓａｍｐｌｅ　Ｐｒｅｐａｒａｔ
ｉｏｎ　ｆｏｒ　Ｉｎｏｓｉｔｏ１Ｍｅａｓｕｒｅｎ＋
ｅｎｔ　：　　５ｅｐ−Ｐａｋ　（：１８　Ｕｓｅ　ｉ
ｎ　ＤｅｔｅｒｇｅｎｔＲｅｍｏｖａｌ　１４．アナリ
ティカル・バイオケミストリー　（Ａｎａｌ、　Ｂｉｏ
ｃｈｅｎ＋、　）　、第１５３巻（１９８６年）３８７
〜３９０ページ１゜ ［発明が解決しようとする課題］ 全く意外なことに、生物学的製剤からの蛋白質、ホルモ
ン、その他の物質の単離用に装填する溶媒中の塩類の濃
度が高いというような、厳しい条件において実施される
のが通例であるＨＩＣが、穏やかな、すなわち、生体液
中の蛋白質、塩類、その他の生理学的成分が生体濃度で
あるという条件下においても、混入したウィルスの不活
化を目的として加えられた有機溶媒および洗浄剤の抽出
に用いることができることを見出した。

更に、疎水性媒質による変性、不活化、あるいは吸着を
特別に受けやすい蛋白質である、凝固因子その他の酵素
のような、血漿、低温沈澱物などに含まれるある種の成
分は、本発明によりウィルス不活化剤を除去した後でも
高濃度で、かつ高い生物活性を保って存在することを見
出したのも意外であった。

また、長鎖アルコール、特に２−オクタツル、または、
ハロゲン化エーテル、特にイソフルラン、あるいはその
両者の組み合わせを生体材料の純化に用いて、ウィルス
不活化剤を抽出する場合、ＨＩＣの適用によって、これ
らの化合物の残存量を痕跡程度にまで減少させることが
できるという知見も驚（べきことである。

本発明の目的は、所望の成分の特性を損なうことなく、
ウィルス不活化溶媒及び／又は洗浄剤、及び／又は、ホ
ルボールエステルのようなその他の加工用化学物質を生
体材料から除去する方法の提供にある。

［課題を解決するための手段１ 上記およびその他の目的は本発明によって達成されるの
であって、それによれば、例えばウィルス不活化溶媒、
またはある種の洗浄剤、またはホルボールエステルなど
、脂溶性の加工用化学物質を含有する、例えば不安定な
生体材料などの生体材料を、炭素数６〜２４の樹脂を充
填剤とする疎水相互作用クロマトグラフィー（ＨＩ　Ｃ
）のカラムを通過させることによって、上記の脂溶性の
加工用化学物質が上記の生体材料から除去される。

この疎水的相互作用クロマトグラフィーは、シリカマト
リックスの支持剤に結合させたオクタデシル（炭素数１
８）鎖のものを用いて行うのが望ましい。本発明による
方法は、血漿、低温沈澱物、あるいは抗血友病因子濃縮
物のような複雑な生体材料混合物から、凝固因子活性の
損失が僅少または皆無であり、かつ蛋白質組成の変化が
最小限であるようにして、トリーローブチル燐酸塩（Ｔ
ＮＢＰ）および「トリトンＸ系」洗浄剤を除去するのに
特に有用である。

本発明による方法においては、生体材料の活性は実質的
に保持される。更に、カラム通過中に吸着される生体材
料は僅少または皆無である。

本発明は、ウィルスに対する減毒性溶媒が添加された生
体材料から、そのような溶媒を除去する方法に関する。

また、本発明は、溶媒とともに、あるいはそれを用いず
に、ウィルスに対するある種の減毒性洗浄剤が添加され
た生体材料から、該洗浄剤を除去する方法にも関する。

更に、本発明は５生体材料からその他の殺ウイルス剤を
除去する方法にも関する。

また、本発明は、安定化剤として生体材料に添加された
加工用化学物質を除去する方法にも関する。

また、本発明は、生体材料の純化の際に用いられた加工
用化学物質を除去する方法にも関する。

また、本発明は、人為的でなく生ずる脂質、および、そ
の他の内因性または、例えば［トリトンＸ　＝４５　Ｊ
およびＴＮＢＰのような、外因性の脂溶性化合物を生体
材料から除去し、しかもその除去の結果、該物質の特性
、例えば濾過可能性、安定性などが改善され、あるいは
、ウィルス殺菌用試薬の効果が高められるような方法に
も関する。

したがって、本発明は、外因性または内因性の脂溶性化
合物を含有する生体材料から該脂溶性化合物を除去する
ことによって、生物体液の濾過可能性または安定性を改
善する方法に関し、しかもこの方法は、生物学的活性を
有し、かっ脂溶性化合物を含有する生体材料を、炭素数
６〜２４の樹脂を含む疎水的相互作用クロマトグラフィ
ーのカラムを通過させる段階から成り、その生物学的活
性が実質的に保持され、かつ、該カラム通過中に吸着さ
れる生体材料が僅少または皆無である。

また１本発明は、生体材料から、リンホカイン誘導性の
ホルボールエステル（すなわち、リンホカイン合成の誘
導物質）のような化学的誘導物質を除去する方法にも関
する。

さらに、本発明は、血液細胞に添加された加工用薬剤を
、細胞を破裂させることなく除去する方法にも関する。

血液は、固形物（細胞、すなわち赤血球、白血球、およ
び血小板）と液体（血漿）とから成っている。細胞には
ヘモグロビンのような潜在的価値の高い物質が含まれて
おり、これらの物質を誘導して、インターフェロン、成
長因子、その他の生体応答調節剤のような、潜在的価値
の高い他の物質を生成させることができる。血漿は、主
として水、塩類、脂質、および蛋白質で構成されている
。蛋白質は、フィブリノーゲン、血清グロブリン、およ
び血清アルブミンとよばれる群に分類される。ヒトの血
漿中に見出される典型的な抗体（免疫グロブリン）とし
ては、流行性肝炎、Ｈ型インフルエンザなどに対する抗
体がある。

血液中に見出される細胞としては、赤血球、各種白血球
、および血小板がある。細胞型の分別には、典型的には
遠心分離が利用されるが、ヒドロキシエチル澱粉のよう
な連銭形成促進剤の添加、免疫学的特異性に基づく分離
など、他の形態の分画沈降法が必要な場合もある。

ヒトの血漿中に見出される蛋白質としては、プレアルブ
ミン、レチノール結合蛋白質、アルブミン、αグロブリ
ン、βグロブリン、γグロブリン（免疫血清グロブリン
）、血液凝固蛋白質〔アンチトロンビン■、プロトロン
ビン、プラスミノーゲン、抗血友病因子（凝固■因子）
、フィブリン安定化因子（凝固層因子ン、フィブリノー
ゲン］、免疫グロブリン［免疫グロブリン　（Ｉｇ　Ｉ
Ｇ、Ａ、Ｍ、Ｄ、およびＥｌ、および補体成分がある。

かつて記載されたことのある血漿蛋白質は、現在１００
種類を越えている。より詳細なリストはプトナム（Ｆ、
Ｗ−Ｐｕｔｎａｍ　）　ｍ、　　ｒザ・プラズマ・プロ
ティン（Ｔｈｅ　Ｐｌａｓｍａ　ＰｒｏｔｅｉｎｌＪ　
［ニューヨーク所在アカデミツク・プレス（Ａｃａｄｅ
ｍｉｃＰｒｅｓｓ　）社発行（１９７５年）〕に見るこ
とができる。

血球分画に見出される蛋白質としては、ヘモグロビン、
フィブロネクチン、フィブリノーゲン、炭水化物および
蛋白質の代謝に関わる酵素、血小板由来増殖因子などが
ある。更に、インターフェロンや成長因子のような他の
蛋白質の生合成が誘導されることもある。

誘導可能な白血球蛋白質の詳細なリストは、スタンリー
・コーエン（５ｔａｎＬｅｙ　Ｃｏｈｅｎ）著、エドガ
ー・ビック（Ｅｄｇａｒ　Ｐｉｃｋ　）　、およびオッ
ペンハイム（Ｊ、Ｊ、Ｏｐｐｅｎｈｅｉｍ）、［バイオ
ロジー・オブ・ザ・リンホカイン合成 ＬｙｍｐｈｏｋｉｎｅｓｌＪ　　［アカデミツク・プレ
ス社発行（１９７９年）Ｊに見ることができる。

血漿の１分別には一般に、低温でエタノール、エーテル
、およびポリエチレングリコールのような有機溶媒を用
い、がっ、ｐＨ値を制御して、１種ないしそれ以上の血
漿蛋白質を含有する特定の分画を沈澱させる必要がある
。次いで、得られた上清自体を沈澱させることを繰り返
して、所望の程度の分別を最終的に達成することができ
る。最近では、クロマトグラフィー法に基づいて・分離
が行われる。血液分別に関しては、「カーク・オスマー
ズ・エンサイクロペディア・オブ・ケミカル・テクノロ
ジー（Ｋｉｒｋ−［’ｔｈｍｅｒ　ｓ　　Ｅｎｃｙｃｌ
ｏｐｅｄｉａｏｆ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｔｅｃｈｎｏｌ
ｏｇｙ　Ｊ　　第３版〔インターサイエンス・パブリッ
シャーズ（ＩｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅＰｕｂｌｉｓｈｅ
ｒ　）社発行、第４巻２５〜６２ページ］に優れた概説
が掲載されている。

低温エタノール分別による主要成分は下記のとおりであ
る。

一千二」ｉ−質 ■　　　　　フィブリノーゲン、低温不溶性グロブリン
、凝固■因子、プロベルジン ■およびＩＩＩ　　ＩｇＧ　、ＩｇＭ　、　ＩｇＡ　、
フィブリノーゲン、Ｂリボ蛋白質、プロトロンビ ン、プラスミノーゲン、プラスミン インヒビタ−１凝固Ｖ因子、凝固■ 因子、凝固■因子、凝固Ｘ因子、ト ロンビン、アンチトロンビン、同種 凝集素、セルロブラスジン、補体第 １成分、補体第３成分 ＩＶ−１αリボ蛋白質、セルロブラスジン、プラスミン
インヒビタ−１凝固■因 子、ペプチダーゼ、αおよびβグロ ブリン ＩＶ−４１−ランスフェリン、チロキシン結合グロブリ
ン、血清エステラーゼ、α リボ蛋白質、アルブミン、アルカリ 性ホスファターゼ ■　　　　　アルブミン、ａグロブリンＶｌ　　　　　
　（Ｉｌｌ酸性糖蛋白質、アルブミン上記分別体系は、
これを更に分別するための根拠として役立つ。例えば第
■分画および第■分画を更に分別して、免疫血清グロブ
＋７ン（ＩＳＧ）を得ることができる。

この他に、凍結血漿を用い、これを解凍してＡＨＦ　（
抗血友病因子）およびフィブロネクチン含有の低温沈澱
物および低温上清とする方法が用いられる分別体系もあ
る。次いで、低温沈澱物をフィブロネクチンと抗血友病
因子とに分別するのである。

本発明の方法は、血球、血漿、その血液分画、および上
述の血液蛋白質、低温沈澱物、低温析出後の血清などの
生体材料に適用することができ、より一般的には、例え
ば正常細胞、癌細胞、培地中で増殖させた癌細胞からの
滲出液、培地中で増殖させた正常細胞からの滲出液、ハ
イブリドーマ細胞、遺伝子スプライシングによる産物、
植物細胞濃縮物、植物細胞懸濁液、動物細胞の抽出物、
植物細胞の抽出物、および微生物のような、生体の細胞
および体液に適用可能である。

本発明に用いるための有機長鎖アルコールの例としては
、ヘキサノール、ヘプタツール、１−オクタノール、２
−オクタノール、■−ノナノール、■−デカノール、お
よびウンデカノールがあるが、これらに限られるわけで
はない。

本発明に用いるためのハロゲン化（例えば、弗素、塩素
、沃素、または臭素を含有する）炭化水素の例としては
、１．２．２−トリフルオロトリクロロエタン、［ニス
ラン（ＥＴＨＲＡＮＥ）Ｊ　　（エンフルラン、すなわ
ち２−クロロ−１，１，２−１−リフルオロエチルジフ
ルオロメチルエーテル）、「フォラン（ＦＯＲＡＮＥ）
Ｊ　　（イソフルオラン、すなわちｌ−クロロ−２，２
，２−）リフルオロエチルジフルオロメチルエーテル）
があるが、これらに限られるわけではない。本発明に好
適なハロゲン化炭化水素には、弗素、塩素、およびエー
テルが含まれる。

本発明を用いて除去される典型的な溶媒は、適用時の温
度では液相であって、抽出を受ける水溶液と混和せず、
適用時の条件下で蛋白質および細胞を変性させず、容易
に除去され、爆発性がな（、かつ、適用時の条件下で生
体溶液中に残留する量では無害な液体である。

本発明の方法を用いて除去されるジアルキル燐酸または
トリアルキル燐酸、洗浄剤、および界面活性剤は、米国
特許筒４．５４０．５７３号明細書、および米国特許筒
４．４８１．１８９号明細書に記載されている。

本発明によるＨＩＣに付される、処理された生体材料中
に存在する溶媒および洗浄剤の濃度範囲は下記の通りで
ある。

溶　　媒：　　１．０００〜２０．０００ｐｐａ＋洗浄
剤：１．ＯＯＯ〜１０．ＯＯＯｐｐｍとりわけ、本発明
は血漿、低温沈澱物、血漿分画などのような蛋白質含有
組成物の製造を特に志向したものであって、該組成物に
は伝染性ウィルスは実質的に存在せず、しかも、酵素学
的または生物学的活性を有する（未変性の）蛋白質が相
当量保持され、また、加工用化学物質が除去されている
ため、得られた組成物には、生理学的に許容可能な濃度
を超えるそのような加工用化学物質は存在しない。

本発明に用いられる生物体液としては、血漿、血漿分画
、血液分別による沈澱、および、血液分別による上清が
ある。また、全血球、赤血球、白血球、血小板、血小板
に冨む血漿、血小板に乏しい血漿などの濃縮物、および
、顆粒球、単球、またはリンパ球、あるいは、インター
フェロン、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）その他の免疫調節因
子またはリンホカインの生成が可能なその他の細胞など
の濃縮物、あるいは、そのような濃縮物または懸濁液か
ら分離された培養液などの処理も企図されている。

本発明によれば、蛋白質含有組成物、特に全血漿、ある
いは全血清の製造が企図されており、それらは、エイズ
ウィルス（ＨＩＶＩ）、Ｂ型肝炎ウィルス、および非Ａ
非Ｂ肝炎ウィルスのようなウィルスに対する（中和）対
数が６を上回る程度にまでウィルスを不活化し、生物活
性が特に高い蛋白質に対する機能的活性を少なくとも４
５％、好ましくは最低７５％、より好ましくは最低９５
％、そして最も好ましくは９８〜ｌＯＯ％保持し、かつ
、生理学的に許容可能な濃度を超える量の脂溶性の加工
用化学物質を含むことがない。

凝固因子活性は、その本来の水準の６０％を、好ましく
は７５〜８５％を、最も好ましくは９０〜９８％を上回
る活性が保持される。

本発明による（ウィルスが滅菌された）全血漿、血清、
低温沈澱物、あるいは低温析出後の血漿は、これを例え
ばヒトを始めとする哨乳類などの罹患動物に直接輸注す
ることができる。そのようにせずに１本発明による（ウ
ィルスが滅菌された）全血漿、血清、低温析出後の血漿
、あるいは低温沈澱物を分別して、精製血漿蛋白質誘導
体を製造することもできる（このような誘導体は、これ
を例えばヒトなどの患者に直接輸注することができる）
。

また、本発明による全血漿あるいは血清は、細胞培養の
際に、また品質管理用試薬として、これを用いることも
できる。

更に、血液に由来しないもの、例えば、正常な（非癌性
の）細胞または癌細胞、培地で増殖させた癌または正常
細胞からの滲出液、遺伝子スプライシングによるハイブ
リドーマおよび産物、植物細胞の濃縮物または懸濁液、
動植物組織抽出物、あるいは微生物などを５本発明にお
ける生物体液として用いることもできる。

本発明の方法は、材料および条件が蛋白質の吸着および
分離が最小限となり、かつ、記載の脂溶性の加工用化学
物質の除去が最大限となるように用いられるという点が
、他のＨＩＣの応用と異なる。

本発明に用いられる樹脂としては、粒子径が５５〜１０
５ミクロンで、孔径が１２０オングストロームのウォー
ターズ・アソシエーツ社製バルク（Ｂｕｌｋ）Ｃ−１８
充填剤が好適である。活性を有する官能基は、シリカマ
トリックスに結合させた炭素数１８の直鎖である。マト
リックスの未結合部位は、ジメチルシランで遮蔽してお
く。

この材料のトリトンＸ−１００なる洗浄剤との結合能力
は、乾燥樹脂１グラムあたり洗浄剤が約１６０ｍｇ　（
０，２５ミリモル）である。ボンダバック（Ｂｏｎｄａ
ｐａｃｋ　Ｉｃ　−１８またはメガボンド（Ｍｅｇａｂ
ｏｎｄ）　Ｃ−１８のような、同社の他のＣ−１８系樹
脂、あるいは他のメーカーのこれらと同等の樹脂によっ
ても、はぼ同じ能力がもたらされる。シリカマトリック
スの使用によって、より圧縮性の高いクロマトグラフィ
ー媒質を用いて達成されるよりも高い流速および圧力で
、抽出過程を進行させることができる。典型的には、ア
ガロースを基剤とする樹脂における毎時２５〜５０−７
０ｍ”に対して、毎時１２５〜１７５−７ｃｍ”ないし
それ以上という流速でカラムを通すことができる。

実用上は、樹脂はステンレス鋼またはガラス製のクロマ
トグラフィーカラムに充填するのが好ましい。カラムの
容積は、材料中の「トリトン」の濃度が１％（重量／容
積）である場合は、装填する材料の容積の少なくとも８
分の１であるのが好ましい。樹脂は、イソプロパノール
、次いで水を用いた洗浄によって活性化される。エタノ
ールおよびアセトニトリルは、樹脂の活性化および再生
に適した有機相である。装填に先立ち、カラムを食塩水
または適当な緩衝液を用いて平衡状態にしておくのが好
ましい。

この方法に対する温度範囲は４〜３７℃であるのが好ま
しく、２０〜２５℃であるのが最も好適である。

カラムに吸着させる生体材料は１５重量％を超えてはな
らず、５〜１０重量％以下であるのが好ましい。カラム
への吸着が２〜５重量％以下であるのが最も好適である
。

ウィルス不活化剤の吸収後は、水、および、１５％から
１００％へと次第に濃度を上昇させたエタノールまたは
イソプロパツール、次いで再び水を用いてカラムを洗浄
・再生するのが好ましい。エタノールを用いる場合、好
ましくは、この後更にカラム容積−杯の１００％イソプ
ロパツールを用いるべきである。

本発明によって処理される材料としては、例えば、ＴＮ
ＢＰおよび「トリトンｘ−１００」を含有する、血漿、
低温沈澱物、ＡＨＦ濃縮物、免疫グロブリン、およびプ
ロトロンビン複合体がある。ワクチン、凝固因子、血清
など、他の複合蛋白質混合物も、ここに記載の方法で処
理することができる。

〔実施例〕

次に、本発明を制約するものではない下記の実施例につ
いて本発明を説明する。

ｌ：ウィルスが　　しである血　の 新鮮な凍結血漿６単位を融解させ、溜めておく。トリ（
ｎ−ブチル）燐酸（ＴＮＢＰ）およびトリトンＸ−１０
０を１％（重量／容積）の濃度になるように加え、溶液
を穏やかに撹拌しつつ、３７℃で４時間温置する。温置
後、必要であればこの材料に１０．０００ｘＧで遠心分
離を施して、清澄化する。次いで、予めカラム容量の数
倍のイソプロパツール、次いで滅菌食塩水で洗っておい
たバルクＣ−１８媒体（マサチューセッツ州ミルフォー
ド所在つォーターズ・アソシェーツ社製）６０ｇを含む
カラムに血漿を通す、カラム中の流速は毎時的１５０　
ｒｄ　／　ｃｍ”とし、作業温度は２３〜２５℃とする
。血漿の処理後、食塩水、次いで１５％から９５％へと
漸増する濃度のエタノール、更に１００％のイソプロパ
ツールを用いた洗浄によって、カラムを再生する。下記
の第１表に、ＴＮＢＰおよびトリトンｘ−ｔｏｏの除去
効率、および、記載どおりに処理した血漿のバッチ８個
における凝固Ｖ因子および凝固■因子の回収率を示す。

活性化部分トロンボプラスチン時間（ＡＰＴＴ）は、血
餅形成因子活性の包括的な尺度である６第１表の結果は
、血餅形成因子活性の８０〜９５％が保持されているこ
とを示している。第２表は、蛋白質分画、酵素、および
その他の成分の数に関しては、溜めておいた血漿には記
載の処理の前後でわずかながら差が存在することを示し
ている。測定した成分すべての量は、概して正常な生理
的範囲内にある。しかしながら、脂質の含量は低く、そ
の結果、濾過可能性が増大している。

２：いくつかの産物−からのＴＮＢＰお各産物をＴＮＢ
Ｐ　（血漿および低温産物については１％、その他の産
物については０．３％）および１％トリトンＸ　−，１
００とともに最低３時間装置して、不活化する。必要で
あればｉｏ、ｏｏｏｘＧで遠心分離を施して、この材料
を清澄化し、その後カラムに装填する。カラムには、試
料の装填に先立ってカラム容量の数倍の有機相（イソプ
ロパノール、アセトニトリル、あるいはエタノールのい
ずれか）を用いて活性化し、次いで、数カラム容量の蒸
留水を用いて洗っておいたバルクＣ−１８充填剤（ウォ
ーター・アソシエーツ社製）１２ｇを詰めておく。下記
第３表に、回収率をカラム段階の歩留まりとして示す。

本明細書および請求項は、説明を目的として記載された
ものであって、制約を目的とするものではないこと、ま
た、本発明の趣旨および範囲力）ら逸脱することなく、
各種の変更および変形を行ｌ／）得ることは明らかであ
る。

７＜λ

Claims (19)

【特許請求の範囲】
1. （１）生物学的活性を有し、かつ脂溶性の加工用化学物
   質を含有する生体材料を、炭素数６〜２４の樹脂を充填
   した疎水相互作用クロマトグラフィーカラムを通過させ
   ることを含み、該生物学的活性が実質的に保持され、か
   つ、該カラム通過中に吸着される生体材料が僅少または
   皆無である、該生体材料から該脂溶性化学物質を除去す
   る方法。
2. （２）樹脂が、活性のある官能基およびその支持部分を
   含み、該活性官能基はオクタデシル鎖で構成され、該支
   持部分はシリカマトリックスで構成される請求項（１）
   記載の化学物質除去の方法。
3. （３）シリカマトリックスが、ジメチルシランでブロッ
   クされた未結合部位を有する請求項（２）記載の化学物
   質除去の方法。
4. （４）樹脂の活性化を、イソプロパノール、エタノール
   、およびアセトニトリルから成る群から選択された有機
   溶媒を用いて行う請求項（１）記載の化学物質除去の方
   法。
5. （５）カラムの操作を、毎時１２５〜１７５ｍｌ／ｃｍ
   ＾２の流速で行う請求項（１）記載の化学物質除去の方
   法。
6. （６）４〜３７℃の温度で実施する請求項（１）記載の
   化学物質除去の方法。
7. （７）２０〜２５℃の温度で実施する請求項（６）記載
   の化学物質除去の方法。
8. （８）脂溶性の加工用化学物質が、有機溶媒、洗浄剤、
   長鎖アルコール、およびハロゲン化エーテルから成る群
   から選択される請求項（１）記載の化学物質除去の方法
   。
9. （９）脂溶性の加工用化学物質がリンホカイン合成誘導
   物質の１種である請求項（１）記載の化学物質除去の方
   法。
10. （１０）生体材料を、全血漿、血清、低温析出後の血漿
    、および低温沈澱物から成る群から選択する請求項（１
    ）記載の化学物質除去の方法。
11. （１１）生体材料が細胞である請求項（１）記載の化学
    物質除去の方法。
12. （１２）生体材料を、血漿、血清、低温沈澱物、低温析
    出後の血清、第 I 分画、第II分画、第III分画、第IV−
    １分画、第IV−４分画、第Ｖ分画、第VI分画、フィブロ
    ネクチン、抗血友病因子、プレアルブミン、レチノール
    結合蛋白質、アルブミン、αグロブリン、βグロブリン
    、γグロブリン、抗トロンビンIII、プロトロンビン、
    プラスミノーゲン、フィブリノーゲン、凝固ＸIII因子
    、免疫グロブリンＧ、免疫グロブリンＡ、免疫グロブリ
    ンＭ、免疫グロブリンＤならびにＥ、プラスミンインヒ
    ビター、プロトロンビン、トロンビン、抗トロンビン、
    凝固Ｖ因子、凝固VII因子、凝固VIII因子、凝固IX因子
    、凝固Ｘ因子、正常細胞、癌細胞、培地中で増殖させた
    癌細胞の滲出液、培地中で増殖させた正常細胞の滲出液
    、ハイブリドーマ細胞、遺伝子スプライシング産物、植
    物細胞濃縮物、植物細胞懸濁液、動物組織抽出物、植物
    組織抽出物、および、微生物から成る群から選択する請
    求項（１）記載の化学物質除去の方法。
13. （１３）外因性または内因性の脂溶性化合物を含有する
    生体材料から該脂溶性化合物を除去することによって、
    生物体液の濾過可能性または安定性を改善する方法であ
    って、生物学的活性を有し、かつ該脂溶性化合物を含有
    する該生体材料を、炭素数６〜２４の樹脂を充填した疎
    水相互作用クロマトグラフィーカラムを通過させること
    を含み、該生物学的活性が実質的に保持され、かつ、該
    カラム通過中に吸着される生体材料が僅少または皆無で
    ある方法。
14. （１４）樹脂が、活性のある官能基およびその支持部分
    を含み、該活性官能基はオクタデシル鎖で構成され、該
    支持部分はシリカマトリックスで構成される請求項（１
    ３）記載の化学物質除去の方法。
15. （１５）シリカマトリックスが、ジメチルシランでブロ
    ックされた未結合部位を有する請求項（１４）記載の化
    学物質除去の方法。
16. （１６）樹脂の活性化を、イソプロパノール、エタノー
    ル、およびアセトニトリルから成る群から選択された有
    機溶媒を用いて行う請求項（１３）記載の化学物質除去
    の方法。
17. （１７）カラムの操作を、毎時１２５〜１７５ｍｌ／ｃ
    ｍ＾２の流速で行う請求項（１３）記載の化学物質除去
    の方法。
18. （１８）４〜３７℃の温度で実施する請求項（１３）記
    載の化学物質除去の方法。
19. （１９）２０〜２５℃の温度で実施する請求項（１８）
    記載の化学物質除去の方法。